TCNICAS DE

MANIPULACIN
DEL DNA

Podemos obtener fragmentos de ADN en

cantidades ilimitadas, que llevar el gen
o los genes que se deseen.
Dicho ADN puede incorporarse a las
clulas de otros organismos en los que
se expresar la informacin de dichos
genes.

La tecnologa del DNA recombinante tiene

diferentes aplicaciones mdicas, entre
las ms importantes destacamos:
Obtencin de protenas
Obtencin de vacunas recombinantes
Diagnosticar enfermedades genticas

Se clonan los genes de ciertas

protenas humanas en
microorganismos adecuados para su
fabricacin comercial.
Un ejemplo tpico es la produccin de
insulina que se obtiene a partir de la
levadura Sacharomyces cerevisae, en
la cual se clona el gen de la insulina
humana.

Como la mayora de los factores

antignicos son protenas lo que se
hace es clonar el gen de la protena
correspondiente.

Si se conoce la secuencia de
nucletidos de un gen responsable de
cierta anomala, se puede diagnosticar
si este gen anmalo est presente en
cierto individuo.

 La modificacin y manipulacin de genes,

facilita la introduccin de genes en las clulas
eucariotas o procariota.
Muchas metodologas se basan en la reaccin
en cadena de la polimerasa PCR,
amplificando rpidamente regiones en el
ADN. Producindose ms fcilmente
protenas para uso clnico.

 El proceso en la comprensin de la
regulacin gentica requera de tcnicas que
permitieran cortar selectivamente el ADN en
trozos homogneos.
An siendo pequeos los genomas muy
purificados eran muy complejos para ser
descifrados.

 La identificacin, purificacin y
caracterizacin de endonucleasas de
restriccin que cortan con precisin las
molculas de ADN en secuencias especficas.
Reconocindose as genes y regiones de
regulacin.

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas

como endonucleasas, son enzimas que cortan los
enlaces fosfodiester del material gentico a partir
de una secuencia que reconocen.

Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble,

donde reconocen secuencias palindrmicas
(secuencias que se leen igual en ambas
direcciones).

Son extradas de organismos procariticos

(bacterias), donde actan como un mecanismo de
defensa, para degradar material gentico extrao
que entre en la clula. Las bacterias tienen la
capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para
distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio.
Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA
extranjero y no el DNA bacterial.

 Tipo I y Tipo III:

a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y
modificacin (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de
reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la
secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o
ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o
despus de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a travs de la
molcula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.


Tipo II:
a. Slo tienen actividad de restriccin.
b. Cortan de manera consistente y
predecible dentro de la secuencia que
reconocen.
c. Slo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.


Aplicaciones de las enzimas de restriccin:
1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o
bacterifago.
2. Fragmentar DNA genmico para separacin
de electroforesis y Southern Blot.
3. Generacin de fragmentos para ser usados
como sondas marcadas en Southerny
Northern blotting.
4. Generacin de fragmentos para ser
subclonados en los vectores apropiados,
creacin de DNA recombinante.

Las endonucleasas se nombran a partir de las

bacterias de las que son extradas, su nombre est
dado segn el gnero y la especie de la bacteria de
donde se aisl por primera vez esta enzima. La
primera letra representa el gnero de la bacteria, las
prximas dos indican la especie, una cuarta letra
indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad
de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:

Eco RI E = gnero Escherichia

co = especie coli

R = cepa RV 13

I = primera endonucleasa aislada de esta

cepa

1. Pureza del DNA la reaccin de enzimas es muy dependiente

de la pureza, contaminantes como protenas, fenol, cloroformo,
etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la
endonucleasa.
2. Temperatura y pH las enzimas son muy sensitivas a
temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilacin algunas endonucleasas son inhibidas
por metilacin.
7. Tipo de molcula de DNA si el DNA no tiene la secuencia que
es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el
material gentico (ej. si el DNA est superenrrollado el lugar de
restriccin no va a estar accesible para la enzima).
8. Buffer adecuado este provee el ambiente que necesita la
enzima para trabajar en condiciones ptimas.

 La secuenciacin de regiones reguladoras

defini secuencias encontradas en
promotores, potencializa dores y sitios para
protenas de regulacin. As todos los genes
poseen un promotores en el lado 5 al que se
una la RNA polimeraza, otras regiones
reguladoras se encuentras a miles de bases
de distancia.

 Reaccin en cadena de la polimerasa.

Endonucleasas de restriccin y mapas de
restriccin.
Secuencia del ADN:
-Mtodo de la rotura
qumica:Procedimiento de Maxam-Gilbert.
-Mtodo enzimtico interrumpido:
Procedimiento de Sanger

VECTOR DE EXPRESIN
Plsmidos fagos que
poseen regiones
promotores para expresar
las secuencias clonadas de
DNA
VECTOR DE CLONACIN
Molcula de DNA capaz de
replicarse autnomamente
en la clula husped y en la
cual se incorpora
covalentemente el
fragmento de DNA a
clonar.

 Se emplean para escindir el genoma en

pequeos fragmentos que se solapan y son
ms apropiados para tcnicas de
caracterizacin
Mapeo de restriccin y secuenciacin
CLONACIN: transferencia de una secuencia
de ADN especfica a una clula de un
microorganismo.

Preparacin de las secuencias inserto y vector

Secuencia de ADN clonada

Se replica a lo largo del ADN

complementario del husped

Puede generarse
considerable cantidad de
ADN para anlisis

Se cultivan grandes cantidades de

microorganismos

VECTOR CLONADO

Gentica molecular para

introducir modificaciones
especficas en la secuencia
clonada

Ligacin
Secuencia del inserto y del
vector

Se mezclan y se incuban con ligasa

de ADN

Une fragmentos de ADN

Cataliza la formacin de enlaces

fosfodister entre molculas de ADN
de doble cadena

Transformacin

Identificacin de clones que

contienen la secuencia que
incluye el ADN del inseto

Productos de ligacin se incuban

con clulas husped
competentes, algunas de las
cuales captarn el ADN.

Clulas transformantes se
siembran en medios selectivos
(slo crecen aquellas que
contienen la secuencia vector)

Clonacin por

PCR

PCR para generar ADN del

inserto
Cebadores con lugares de restriccin
apropiados
Producto es digerido por
la enzima de restcin

Ligacin

Amplificacin

El ADN de los insectos y

vectores se produce por la
digestin enzimtica con
enzimas de restriccin que
producen extremos
compatibles. Los plsmidos
contienen un origen de
replicacin (ori) y genes de
seleccin de
transformantes (bacterias
que han incorporado al
plsmido). El vector y el
insecto se ligan y se usan
para transformar clulas
competentes. Las clulas
formadas se siembran en
medios con ampicilina o
tetraciclina, de modo que
solo las clulas
competentes que han
incorporado la secuencia
vector pueden crecer.
Muchos clones diferentes
se producen en este
proceso; cada uno contiene
un fragmento de ADN
diferente.

 Los vectores de expresin son vectores de clonamiento

especializados, que aseguran la expresin del gen clonado
en la clula hospedante. Por lo tanto estos vectores deben
incluir secuencias regulatorias que estimulen la expresin
del gen, es decir, la transcripcin y luego la traduccin del
producto correspondiente. Entre estas secuencias
regulatorias estn:
promotores que deben ser fuertes (de tipo constitutivos
regulables)
secuencias de trmino de transcripcin
secuencias de trmino para la traduccin posterior del
RNAm.
Adems, despus del promotor debe existir una secuencia
llamada "polylinker" de unin, con sitios de
reconocimiento para diferentes enzimas de restriccin.

Gran coleccin de clones que abarcan todo el

ADN del genoma (genotecas genmicas) o
toda la secuencia expresada a partir de ARNm
del tejido del que se ha preparado la
genoteca (genoteca de ADNc).
oSe analizan para identificar los clones que
contienen el inserto especfico que interesa.
Clon apropiado se pueden generar grandes
cantidades del inserto para anlisis molecular
especfico.

Genmicas: clones utiles para

De ADNc: determina

producir un mapa de restriccin de una

regin especfica del genoma.

la secuencia codificante de un gen.

Se producen:
1. Se dirige parcialmente el
ADN genmico
2. El vector se corta por una
enzima de restriccin
compatible
3. Se liga el ADN digerido y el
vector
4. Se transforma la clula
husped apropiada con el
ADN ligado
5. Se seleccionan y cultivan las
transformantes que
contienen el vector y el
inserto
Plsmidos, comidos, YAC y BAC

Representan todo el ARNm

producido en un determinado
tipo clula.
Plsmidos y bacterifago lambda

 La tcnica del ADN recombinante se utiliza en

estudios sobre la regulacin de la expresin
gnica, en la regulacin de la produccin
comercial de sntesis de protenas como la
Insulina o la hormona del crecimiento, en el
desarrollo de organismos transgnicos y en la
amplificacin del ADN, es decir, en obtener un
gran nmero de copias de un gen
determinado. En este ltimo caso, existe una
tcnica mejor, denominada con las siglas PCR.

La tcnica consiste en introducir el gen

seleccionado en el interior de un vector y ste, a
su vez, dentro de una clula, denominada clula
anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular,
el gen se expresa, sintetizndose as la protena
codificada en el gen. Adems, al dividirse la
clula, las nuevas clulas formadas contienen ese
gen que tambin sintetizan esa protena. Se
genera un grupo celular que contiene un genoma
distinto.

 Preparacin de la secuencia del ADN para su

clonacin
Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN
debe separarse y concentrarse.
Partimos de clulas con ncleo, que deben ser
lisadas (rotas).
Las protenas estructurales, enzimas, ARN y
restos moleculares deben separarse del ADN.
El ADN obtenido se concentra y se fragmenta
por accin de las enzimas de restriccin.
Se asla el ADN que se desea clonar, por
ejemplo, mediante cromatografa lquida o por
centrifugacin.
Si el ADN debe expresarse hay que aadir los
segmentos reguladores de la expresin gnica.

 Cortar el vector con enzimas de restriccin,

las mismas enzimas que se utilizaron para
cortar el ADN que se quiere insertar.
Unir el vector y el ADN que se va a clonar
mediante los llamados extremos cohesivos, o
pegajosos, o escalonados.
Una vez que el ADN ha sido introducido en el
vector se denomina ADN inserto, o
simplemente, inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen
ser plsmidos, virus como el fago l,
cromosomas creados de forma artificial y
quimeras.

 Uso de tcnicas qumicas o fsicas

Con el fin de inducir a las clulas para la
captacin de DNA
En Sistemas Bacterianos y
Clulas Animales
Transfeccin Transformacin

 Transfeccin qumica:
DNA + Cloruro de Calcio
Precipitado

Se asienta en membrana
plasmtica
Captado por endocitosis

 Tambin el DNA puede formar complejos

solubles con otras sustancias qumicas.
Sustancias qumicas

DEAEdextran

Detergente
polibreno

 Transfeccin mediada por liposomas:

DNA encapsulado
liposomas
Fusin con Membrana
plasmtica
Depositan su carga en citosol

 Lipofeccin:
Complejo lipoplex
Captado por endocitosis

Electroporacin :
Clula sometida a un pulso elctrico
Poros pasajeros

 Endocitosis mediada por receptor:

Se fija DNA a un receptor
mediante endocitosis
Liberacin en procesamiento
Pptidos adenovirales

 Es una molcula que proviene de la unin

artificial de 2 fragmentos de DNA
Creada en 1972 por el bilogo molecular Paul
Berg.
A travs de este DNA podemos distinguir:
DNA Recombinante Natural
DNA Recombinante Sinttico (DNA
Quimrico)

 Identificando el producto codificado por el

gen reportero
Cuando se clona todo el genoma de una
clula se obtiene una Biblioteca de DNA
Si los fragmentos a clonar se han obtenido
como cDNA, entonces se tiene una Biblioteca
de cDNA

Una de las aplicaciones ms valiosas es la

produccin de vacunas.
Ejemplo:
El gen que codifica para una protena de
superficie del virus de la hepatitis B se ha
clonado en un vector de expresin de levadura
donde posteriormente el producto se ha
extrado, purificado y comercializado.

Recombinacin Gentica
In Vitro

 Se basa en el conocimiento de los

mecanismos de replicacin del DNA, de la
estructura, organizacin y regulacin de
la expresin gnica.

Tambin es necesario conocer las enzimas

que actan sobre el DNA

 Aislar genes (o secuencias concretas de ADN)

analizando, modificando y reinsertando
dentro de un organismo).
Por tanto modificando la
constitucin gentica del
organismo.

a) Producir grandes cantidades del producto

codificado por el gen.
b) Estudiar las consecuencias que una
determinada modificacin del gen puede
ocasionar en le funcionamiento celular
c) Sustituir un gen defectuoso por otro
adecuado.

 Identificar un fragmento o fragmentos de

DNA que se desee clonar.
Un vehculo molecular capaz de replicarse los
ms utilizados son: bacterias, plsmidos y
fagos.
Insercin de los
fragmentos de DNA
en el vehculo molecular.

 Para generar fragmentos de DNA se suele

utilizar la digestin con enzimas de
restriccin
Otro mtodo es la sntesis enzimtica de
fragmentos de DNA a partir de moldes de
ARNm
Los fragmentos de DNA se pueden marcar
radiactivamente para utilizarse como sonda

 Gen introducido al interior de

una clula de un animal o una
planta. Puede presentarse en
algunos o todos los tejidos.
Los transgnes introducidos
pueden ser epismicos y
expresarse de manera
pasajera, o integrarse en los
cromosomas de la clula
husped.

Es cuando un gen que codifica para una

expresin fenotpica esta actuando o
generando mas copias de las debidas
generando que la clula sobreproduzca
por as decir, un " exceso de
informacin".
Ejemplos:
Protooncogn ( cncer de mama).
La sobre-expresin del ARN puede
causar leucemia.
Sobre-Expresin de la protena P53,
causa en la displasia cervical

 Mutante por ingeniera que causa la

perdida de la funcin de un gen bajo
ciertas circunstancias (p. ej.,
aumento de la temperatura), o en
algunas clulas, pero no en otras.

 Mtodo actualmente
obsoleto para
identificar a una
persona con propsitos
legales o forenses
basado en sondeos
Southern blot con una
sonda mini-satlite
hipervariable.

Existencia de 2 o ms variantes
(alelos, fenotipos, variantes de
secuencia, variantes de estructura
cromosmica) a frecuencias importantes
en la poblacin. Los usos mas laxos entre
genetistas moleculares incluyen:
1. Cualquier variante de secuencia que
se encuentra a una frecuencia mayor
a 1% en una poblacin.
2. Cualquier variante de secuencia no
patognica, prescindiendo de la
frecuencia.

 Marcador gentico que consiste en

tamaos variables de fragmentos de
restriccin allica que resultan de un
polimorfismo de secuencia de DNA.
Los RFLP se valoran originalmente
mediante Southern Blot; en la
actualidad por lo general se valoran con
PCR.

 Microsatlites, minisatlites y DNA

satlite son ordenamientos de secuencias
repetidas en tndem que con frecuencia
varan entre las personas en el numero
de unidades repetidas; el termino VNTR
se utiliza con frecuencia para indicar
minisatlites.

En la actualidad, la dotacin gentica de una clula

puede ser modificada mediante la introduccin de
un gen normal en el organismo diana que sustituya
al
gen defectuoso en su funcin; es lo que se
denomina
terapia gnica.
La terapia gnica se puede definir como
el conjunto de tcnicas que permiten vehiculizar
secuencias
de ADN o de ARN al interior de clulas diana,
con objeto de modular la expresin de
determinadas
protenas que se encuentran alteradas, revirtiendo
as el trastorno biolgico que ello produce.

 Actualmente, los ensayos de terapia gnica se realizan

solamente en clulas somticas, que comprenden todos
los tipos celulares, excepto esperma, vulos y sus
precursores.

La alteracin gentica de clulas somticas afecta

slo al paciente que se est tratando.
Por el contrario, la
modificacin de las clulas germinales afectara a todos
los descendientes del paciente en tratamiento, con todas
las consecuencias ticas y morales que ello conlleva. Se
han explorado diferentes tejidos somticos para ensayos
de terapia gnica, como mdula sea, fibroblastos,
msculo, piel, hgado, cerebro, etc. La eleccin
del tejido depende fundamentalmente de la enfermedad
que debe corregirse.

Terapia gnica in vivo: agrupa la tcnicas

en las que el material gentico se introduce
directamente en las clulas del organismo,
sin que se produzca su extraccin ni manipulacin in
vitro.
La gran ventaja de las tcnicas in vivo sobre la terapia
gnica in vitro es su mayor sencillez. Sin embargo, tienen
el inconveniente de que el grado de control sobre todo el
proceso de transferencia es menor, es difcil conseguir un
alto grado de especificidad tisular.

Terapia gnica ex vivo: comprende todos

aquellos protocolos en los que las clulas a
tratar son extradas del paciente, aisladas,
crecidas en cultivo y sometidas al proceso
de transferencia in vitro. Una vez que se
han seleccionado las clulas que han sido
efectivamente transducidas, se expanden
en cultivo y se introducen de nuevo en el
paciente.
Sus principales ventajas son el permitir la
eleccin del tipo de clula a tratar,
mantener un estrecho control sobre todo
el proceso, y la mayor eficacia de la
transduccin gentica. Los problemas ms
importantes de esta modalidad son la
mayor complejidad y coste de los
protocolos.

Modelo de transferencia gnica

in vivo mediado por liposomas
catinicos: introduccin del gen
que
codifica el regulador
transmembrana de la fibrosis
qustica (CFTR).

Modelo de transferencia gnica

ex vivo: introduccin del gen
que codifica el receptor
de LDL en el tratamiento de la
hipercolesterolemia familiar
monognica.

BIOMOLCULAS TERAPUTICAS
El principal requisito para el desarrollo de terapias gnicas
es la identificacin y caracterizacin de secuencias
nucleotdicas que podran estar directa o indirectamente
implicadas en procesos patolgicos. Ello incluye tanto genes
para el tratamiento de enfermedades genticas especficas,
como secuencias utilizadas para conferir nuevas
propiedades a clulas, para el tratamiento de enfermedades
adquiridas y del cncer.
Secuencias codificadoras de protenas
Las biomolculas ms utilizadas para terapia gnica
son copias de ADN complementario obtenidas a partir
de ARN mensajeros. stos, a su vez, provienen de genes
que codifican protenas de inters teraputico.

Las copias de ADN complementario se

insertan dentro de vectores, que son
elementos genticos que facilitan la
transferencia y la expresin de secuencias
eucariotas a las clulas diana.
Tambin se usan los llamados minigenes,
genes normales a los que se les ha eliminado
todos sus intrones (secuencias no
codificadoras), pero conservan tanto el
promotor, como la seal de terminacin de la
transcripcin y otros elementos
controladores de la actividad gnica.
Ocasionalmente se pueden utilizar incluso
largas secuencias de ADN genmico que
contienen un gen completo, incluyendo
zonas reguladoras, exones (secuencias
codificadoras) e intrones.

Sondas antisentido
La tecnologa de las sondas antisentido
se basa en la utilizacin de oligodesoxinucletidos (ODN)
de pequeo tamao para inhibir la expresin gnica.
La inhibicin de la expresin tiene lugar por hibridacin de los
ODN antisentido a la cadena complementaria codificadora
de ARN en el interior de la clula.
A la interaccin entre la sonda antisentido y
el ARN se aplican las reglas de apareamiento de bases de
Watson-Crick, lo cual permite disear ODN dirigidos a cualquier gen
de inters. En teora, una sonda antisentido de 15 nucletidos
de longitud tiene suficiente especificidad para interaccionar con
un determinado gen dentro del genoma humano completo. Debido
principalmente a su reducido tamao, las sondas antisentido suelen sintetizarse
qumicamente y se administran como un frmaco convencional, aunque tambin
se ha examinado su expresin in vivo mediante vectores vricos o plsmidos.

ADN triplex
Se denomina ADN triplex a la asociacin
colineal de tres cadenas de ODN.
Ello se produce cuando una cadena de ODN se une a la hendidura
o canal ancho de una doble hlice de ADN.
La tecnologa del ADN triplex, paralelamente a la de las
sondas antisentido, tiene un gran potencial teraputico
como modulador gnico. La unin de un ODN formador
de ADN triplex a un gen diana puede bloquear la transcripcin del ARN,
lo cual anulara su expresin. La diferencia de dicha tcnica con
las sondas antisentido radica en que en el primer caso el ODN se une
directamente al gen en lugar de unirse a su ARN mensajero.
Como el ADN triplex acta a nivel transcripcional, en teora slo son necesarias
unas pocas molculas de ODN para producir un efecto inhibidor.
El ODN formador de ADN triplex puede componerse de polipurinas o
polipirimidinas y se une a la cadena rica en purinas de la doble hlice mediante
puentes de hidrgeno.
La especificidad de unin resulta de la complementariedad de secuencia entre la
regin polipurnica de una de las hlices de ADN y el ODN formador de triplex.

Ribozimas
Los ribozimas son molculas de ARN con
capacidad de catalizar la escisin especfica
de otras molculas deARN. La especificidad de secuencia
del ribozima se determina por su capacidad para aparearse
o hibridarse con nucletidos complementarios de la molcula de
ARN diana cerca del sitio de escisin. Dicha escisin produce un
ARN mensajero incompleto e inestable, lo cual inhibe la expresin proteica.
En teora, los ribozimas se pueden sintetizar o manipular para actuar
sobre cualquier molcula de ARN comprendida en el conjunto del ARN celular.
Por lo tanto, cualquier ARN mensajero que codifique una protena asociada a una
determinada enfermedad puede escindirse selectivamente mediante ribozimas
expresados a partir de un vector de transferencia gnica adecuado.
Debido a su flexibilidad de diseo y su extraordinaria especificidad de secuencia, los
ribozimas llamados hammerhead y hairpin podran resultar muy tiles como agentes
teraputicos.

Los ribozimas tienen varias ventajas respecto a las protenas cuando se considera su uso en
aplicaciones de terapia gnica: a) el ARN es menos susceptible a provocar una respuesta
inmunitaria que la expresin de una protena exgena o modificada; b) los ribozimas son
molculas de pequeo tamao, lo que facilita su inclusin en los vectores utilizados para
terapia gnica, y c) en un nico vector se pueden insertar incluso varios ribozimas dirigidos
contra diferentes regiones de una molcula de ARN mensajero, o contra diferentes
molculas de ARN mensajero, lo cual puede ser til para actuar sobre los distintos dominios
de un genoma viral o sobre mltiples mediadores de un determinado estado patolgico.

ESTRATEGIAS
GNICA

MTODOS

DE

TRANSFERENCIA

Cuando se ha aislado y caracterizado un gen asociado a

una enfermedad concreta, se puede iniciar el estudio y
desarrollo de mtodos teraputicos que permitan la
administracin
segura y eficaz de su secuencia nucleotdica a las
clulas afectadas.
Para lograr introducir y expresar los genes en las
clulas o tejidos
diana se ha desarrollado una gran variedad de
vehculos de transferencia
o vectores.
Actualmente, no existe ningn vector de terapia gnica
que
resulte idneo para todas las enfermedades. Cada
vector tiene sus
ventajas e inconvenientes, por lo que la eleccin de un
determinado vector depender de las caractersticas
propias del tejido y de la enfermedad que deba
tratarse, de si la terapia gnica es ex vivo o in vivo ,y de
que la expresin del producto gnico pueda ser
transitoria o haya de ser permanente. Los vectores
vricos son muy tiles para alcanzar niveles
teraputicos del producto gnico deseado. Asimismo,
mtodos fsicos y qumicos de transferencia gnica muy
diversos, como la inyeccin directa de ADN, complejos
lpido-ADN, etc., pueden resultar adecuados si la
expresin del gen teraputico es suficiente durante un
perodo transitorio

Vectores vricos
La capacidad de algunos virus de ADN y
ARN de producir transformaciones tumorales
mediante la introduccin de su material
gentico
a clulas hospedadoras fue la que condujo
a su utilizacin
como vectores para transferencia gnica.
La lista de virus que se han estudiado como
vectores es considerable e incluye papovirus,
adenovirus, virus de la vacuna, adenovirus
asociados, virus del herpes, retrovirus, etc.

Vectores retrovricos
Los vectores vricos ms estudiados provienen
de los retrovirus. Los retrovirus ms estudiados
son los oncovirus sencillos, como el virus del
sarcoma de Rous (VSR) y el virus de la leucemia
murina de Moloney (Mo-MLV).
Cada partcula retrovrica (virin) contiene dos
copias de ARN genmico vrico empaquetadas
dentro de un complejo proteico que, a su vez,
est rodeado por una envuelta proteolipdica. La
propiedad ms interesante de los retrovirus es
la produccin de transcriptasa inversa, una
polimerasa de ADN dependiente de ARN
Las principales ventajas de los vectores
retrovricos como vehculos de transferencia son
su extraordinaria eficiencia, que les permite
transducir cerca del 100 % de las clulas diana, y
su capacidad para integrar de manera estable en
los cromosomas celulares el material gentico
que contienen.

Vectores adenovricos
Los adenovirus son patgenos dbiles que afectan
principalmente las vas respiratorias y no se han
asociado a enfermedades malignas. Cada partcula
vrica contiene una molcula de ADN de doble cadena
de tamao considerable y entra en las clulas
mediante endocitosis mediada por receptores,
seguido de la rotura del correspondiente endosoma y
migracin del genoma adenovrico al ncleo donde
permanece en forma extracromosmica.
El genoma adenovrico comprende una serie de genes
que se expresan al principio de la infeccin y codifican
protenas reguladoras, y una serie de genes tardos,
que codifican protenas estructurales Cuando el
genoma vrico entra en la clula, se activan los genes
que se expresan inicialmente. Ellos a su vez activan
otros genes reguladores importantes.
En la segunda fase de replicacin se expresan los
genes tardos, produciendo ms virus que finalmente
provocan la muerte de la clula. El actual
conocimiento de la gentica molecular del adenovirus
posibilita su manipulacin como vehculo para terapia
gnica.

Deficiencia de adenosn-desaminasa
Inmunodeficiencia combinada grave
La deficiencia de adenosn-desaminasa (ADA) es una enfermedad gentica
poco frecuente en la que los nios afectados carecen de esta enzima
necesaria para la funcin normal de su sistema inmunitario.
En septiembre de 1990, una nia de 4 aos que sufra deficiencia de ADA
recibi una infusin de sus propios linfocitos T que haban sido manipulados
ex vivo para introducirles una copia normal del gen de la ADA. Se escogi
esta deficiencia de ADA como la primera enfermedad susceptible para
terapia gnica por varias razones: a) el gen haba sido clonado y su
correspondiente ADN complementario era del tamao adecuado para
insertarse fcilmente en un vector retrovrico; b) estudios previos de
trasplante de mdula sea sugeran que solamente era necesario corregir
los linfocitos T para curar la enfermedad; c) la cantidad de enzima necesaria
para mantener la funcin del sistema inmunolgico en determinados casos
puede ser el 5-10 % del nivel normal, y d) las clulas T corregidas tienen una
ventaja selectiva sobre las clulas deficientes en ADA.

A partir de dicho protocolo se demostr que los linfocitos de un paciente

con inmunodeficiencia se pueden aislar, pueden crecer en el laboratorio,
manipularse genticamente y ser devueltos al propio paciente sin mayor
riesgo Los dos primeros pacientes han respondido positivamente a la
terapia. El nmero total de linfocitos en su sangre ascendi a niveles
normales y en el primer nio tratado la cantidad de enzima ADA en sus
linfocitos T ascendi hasta el 25 % de los niveles normales. Adems, durante
una pausa de 6 meses y medio en su tratamiento, tanto el nmero de
linfocitos manipulados genticamente como los niveles de enzima ADA se
mantuvieron constantes. Ello sugera que la vida media de los linfocitos
corregidos era mayor de 6 meses y medio, y que dichos linfocitos
proliferaban creando un nivel teraputico de clulas corregidas.

Enfermedad de Gaucher
Est causada por una deficiencia de la enzima lisosmica
glucocerebrosidasa, que hidroliza glucosilceramidaen
ceramida y glucosa.
La acumulacin de dicho glucolpido se produce principalmente
en los macrfagos del sistema reticuloendotelial, lo cual produce
esplenomegalia, lesiones dolorosas en los huesos y en
determinados
casos lesiones neurolgicas.
Espordicamente se ha utilizado con xito el trasplante alognico
de mdula sea como modalidad teraputica. Al igual que para la
deficiencia de ADA, conocer la secuencia de ADN complementario del
gen que codifica la glucocerebrosidasa y el hecho de que el principal
tipo celular afectado derive del sistema hemopoytico, ha llevado a
proponer a la terapia gnica ex vivo utilizando vectores retrovricos
como tratamiento alternativo.
En este caso, las clulas diana son tambin las clulas hemopoyticas
precursoras con capacidad de producir macrfagos corregidos en el
paciente.

Fibrosis qustica
En la fibrosis qustica se ha observado un defecto
en el gen que
codifica para el canal de cloro conocido como CFTR, que resulta
en un transporte anormal de electrlitos en las glndulas exocrinas
y conduce
a una enfermedad crnica obstructora de los pulmones,
insuficiencia pancretica exocrina y aumento de la cantidad
de electrlitos en el sudor. Utilizando como transgn el gen
de CFTR y como clulas diana las clulas
del epitelio del tracto respiratorio, se han realizado estudios
utilizando liposomas y adenovirus como vectores.
Los riesgos de toxicidad parecen descartados en los primeros
intentos
y basta algo tan sencillo como un inhalador para conseguir la
expresin
del gen y aliviar en un 30%
los sntomas de la enfermedad.

 Un estudio de terapia gnica en el tratamiento del Parkinson ha

conseguido que la mitad de los pacientes que recibieron la terapia
mostraron una mejora significativa en los sntomas de la enfermedad
en los siguientes seis meses a la intervencin, segn un estudio del
Sistema de Salud Henry Ford en Detroit (Estados Unidos), que se
publica en la revista 'The Lancet Oncology'.

El estudio evalu la eficacia de una terapia

gnica conocida como NLX-P101 en 45 sujetos
con enfermedad de Parkinson entre moderada
y avanzada. Los pacientes, de entre 30 y 70 aos, fueron escogidos porque
sus sntomas no respondan bien a otros tratamientos.
Entre el grupo de estudio, cada paciente era asignado a recibir la terapia NLXP101 o una ciruga placebo falsa. Todos los procedimientos se realizaron con
anestesia local y la mayora de pacientes recibieron el alta en las 48 horas
siguientes a la intervencin.
En la enfermedad de Parkinson, la mayora de investigaciones y tratamientos
se han centrado en disminuir los niveles de dopamina en el cerebro. La
dopamina es un neurotransmisor que es integral en el control del
movimiento, el aprendizaje y el estado de nimo. El tratamiento estndar a
menudo inclua el uso de levodopa, un frmaco que estimula la produccin
de dopamina pero que causa reacciones adversas y complicaciones en
muchos pacientes.
La terapia gnica del estudio acta sobre un sistema de neurotransmisores
alternativo del cerebro que implica una sealizacin qumica llamada GABA.
Otro tratamiento implica el implante permanente de un dispositivo de
control nervioso mdico en el cerebro denominado estimulacin cerebral
profunda.
Segn sealan sus autores, el estudio de terapia gnica con NLX-P101 cumpli
con sus objetivos primarios y demostr que el tratamiento era seguro y bien
tolerado a lo largo del periodo de estudio de seis meses.

El procedimiento utilizado en el estudio no requera anestesia

general o la implantacin de un dispositivo mdico.