CITOGENÉTICA

CITOGENTICA
La citogentica es el campo de la gentica

que comprende el estudio de la estructura,
funcin y comportamiento de los
cromosomas. Incluye anlisis de bandeado
G en cromosomas, otras tcnicas de
bandeado citogentico, y tambin la
citogentica molecular de hibridacin por
fluorescencia in situ (FISH) e hibridacin
por genmica comparativa (CGH).
Esta tcnica es para sangre perifrica.

La muestra debe ser 5ml de sangre
venosa recogida en tubo con
anticoagulantes de heparina de litio. Se
coge la capa de leucocitos.
Se debe identificar el tubo y la historia clnica dndole un nmero de

registro.
El paciente no debe haber sido transfundido en los ltimos 2

meses. La extraccin debe hacerse en ayunas
(preferiblemente). Anotar en el mismo cuaderno, el da
de la siembra y si el cultivo va a ser de 48 o 72 horas.
Centrifugar la muestra durante 5 min a 1000 r.p.m.

Si la muestra est turbia muy ictericia hay que realizar un
lavado con suero fisiolgico, volviendo a centrifugar y
decantando el sobrenadante del lavado.
Preferiblemente hay que pasar a la fase de siembra en las
primeras 24 horas, si no es posible debe mantenerse la
muestra a 4 C en la nevera.
El medio RPMI se debe suplementar, por cada 100ml de medio

RPMI se aade:
11 ml de suero bovino fetal al 20% (para enriquecer el

medio).
0.75 ml de penicilina al 2% (para evitar la contaminacin).
1ml e glutamina al 2% (aa esencial para el crecimiento
celular).
1.5 ml de buffer hepes (para mantener el pH del medio).
En campana estril, y para cada cultivo coger 2 tubos de 10 ml

(especficos para cultivo), identificar cada tubo con el nmero
de registro y en uno de ellos se debe de poner Be (bromuro de
etidio, se le aade para obtener cromosomas con ms bandas).
Aadir a cada tubo 5 ml de medio.

Echar 0.5 ml de muestra en cada uno de los tubos.
Aadir 0.15 de fitohemaglutina PHA (mitgeno de linfocitos
T).
Homogeneizar, poner el tapn y colocarlos en una gradilla
inclinada. Meterlos en la estufa de cultivos a 37 C durante 72
horas; cada da se debern mover suavemente.
A las 72 horas de cultivo:

Aadir a cada tubo 0.25 ml de Colcemid (para la divisin celular en la
metafase). Adems, al tubo de Be se le aadir 0.1 ml de bromuro de
etidio.
Sacar los tubos de la estufa y centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10
min; decantar sobrenadante con una pipeta Pasteur dejando 1 ml.
Aadir a cada tubo 5 ml de solucin de KCl y ponerlos durante 18
min al bao (37 C). Es para realizar un choque hipotnico, para que
las clulas se hinchen.
Centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar el sobrenadante
con una pipeta evitando tocar el pellet celular.
Preparar la solucin fijadora Carnoy en l momento (metanol/ac
actico, en proporcin 1:3).
Realizar con la solucin de Carnoy 4 lavados del pellet, cada uno
seguido de centrifugacin y decantado. En el ltimo lavado, se
decanta y resuspende el botn manualmente, aadiendo 1-2 ml de
Carnoy, dependiendo del tamao del pellet celular.
Impregnar el portaobjetos con una solucin fijadora de Ac actico al 45%.

Realizar la extensin tirando la gota de muestra.
Con microscopio de contraste de fases y objetivo de 10X, se verifica la

calidad de las preparaciones. Una buena preparacin debe tener un
nmero suficiente de metafases bien extendidas y libres de
citoplasma. Influye la temperatura, la humedad y el choque
hipotnico. La alta temperatura y la humedad favorecen las buenas
extensiones, as como la altura desde la que se realiza la extensin.
Una vez realizadas las extensiones, se colocan a 371 C en estufa. Se
dejan envejecer 1 semana aproximadamente, hasta su posterior
tincin.
Una vez que las extensiones han envejecido en la estufa se procede a

tratarlas para su posterior anlisis.
Se coloca el porta en una solucin de sales de citrato de sodio

durante 10 min.
Se lavan con agua y se sumergen en tripsina durante 6 seg y se

vuelven a lavar.
Y se tien durante 1,5 min. El colorante se prepara con una mezcla

de 2 ml de Wrigh, 3 ml de Sorensen y 3 ml de buffer.
Se lavan, se dejan secar y se meten en xilol para limpiar la

preparacin de posibles residuos.
Se mira la preparacin en el microscopio con el objetivo de 10X.
Cuando se encuentra una metafase abierta se cambia de objetivo al de

100X con aceite de inmersin.
Se deben observar del orden de 15-30 metafases para ver si existe

alguna alteracin.
Cuando vayamos encontrando las metafases vamos apuntando en una

hoja las coordenadas para luego encontrarlas en el cytovisin.
En el cytovisin se coloca el porta y se pone en las coordenadas que

hemos apuntado antes.
Se mira con el microscopio de contraste de fases con el objetivo de 10X

y despus con el de 100X.
Con un programa informtico se hace una foto a lo que hay en el porta

y se ajusta la luz hasta que se vean claramente los cromosomas y sus
bandas.
El cariotipador se encarga de realizar un agrupamiento automtico,
pero no todos los cromosomas se agrupan correctamente, es entonces
cuando los tenemos que colocar manualmente.
Una vez realizado el cariotipo se imprime y se lleva a los mdicos
correspondientes.
Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a

su longitud y a la posicin del centrmero. De esta manera, el cariotipo
humano queda formado as:
Grupo A: Se encuentran los pares cromosmicos 1, 2 y 3. Se
caracterizan por ser cromosomas muy grandes, casi metacntricos. En
concreto, 1 y 3 metacntricos; 2 submetacntrico.
Grupo B: Se encuentran los pares cromosmicos 4 y 5. Se trata de
cromosomas grandes y submetacntricos (con dos brazos muy
diferentes en tamao).
Grupo C: Se encuentran los pares cromosmicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
X. Son cromosomas medianos submetacntricos.
Grupo D: Se encuentran los pares cromosmicos 13, 14 y 15. Se
caracterizan por ser cromosomas medianos acrocntricos con satlites.
Grupo E: Se encuentran los pares cromosmicos 16, 17 y

18. Son cromosomas pequeos, metacntrico el 16 y
submetacntricos 17 y 18.
Grupo F: Se encuentran los pares cromosmicos 19 y 20.
Se trata de cromosomas pequeos y metacntricos.
Grupo G: Se encuentran los pares cromosmicos 21, 22,
Y. Se caracterizan por ser cromosomas pequeos y
acrocntricos (21 y 22 con satlites).
Mediante el cariotipado se pueden analizar anomalas
numricas y estructurales, cosa que sera muy difcil de
observar mediante gentica mendeliana.
Trisomia del
Par 21.

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Esta tcnica es para sangre perifrica.

Se debe identificar el tubo y la historia clnica dndole un nmero de

El paciente no debe haber sido transfundido en los ltimos 2

Centrifugar la muestra durante 5 min a 1000 r.p.m.

El medio RPMI se debe suplementar, por cada 100ml de medio

11 ml de suero bovino fetal al 20% (para enriquecer el

En campana estril, y para cada cultivo coger 2 tubos de 10 ml

Aadir a cada tubo 5 ml de medio.

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Con microscopio de contraste de fases y objetivo de 10X, se verifica la

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