MUTAGNESIS

Hidroxilamina como agente mutagnico para

Neurospora crassa
Induccin de mutantes en Escherichia coli
INSTITUTO POLITCNICO
NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


LABORATORIO DE GENTICA MICROBIANA

Grupo: 5QM2

Equipo:3 Seccin: 1
Gen: Unidad fundamental de
la herencia que ocupa un
locus en un cromosoma
concreto. Secuencia de DNA
que codifica para un
polipptido.
Cromosoma: molcula de
DNA o RNA que constituye el
genoma. Almacenan la
informacin gentica.
Locus: lugar de un cromosoma
en donde se localiza un gen
Alelo: Formas alternativas de
un gen.
Figura 1.Gen Eucaritico
Genoma: Conjunto de genes contenidos en los
cromosomas . Totalidad de la informacin gentica.
Genotipo: Constitucin gentica de un organismo.
Fenotipo: Propiedades observables de un
organismo controladas genticamente.
Haploide: Clula u organismo que tiene una sola
dotacin de cromosomas .
Diploide: Clula u organismo con dos complementos
cromosmicos.
Merodiploide: Organismo haploide que incorpora
un segmento de DNA del exterior, de manera que
ahora posee dos copias de ese gen.
MUTACIN
Cambio de la
secuencia nucleotdica
de una molcula de
DNA que es heredable
y NO se reproduce por
recombinacin.

Figura 4. Ejemplo de una mutacin.
IMPORTANCIA
Fuente primaria
de la variabilidad
gentica.
Materia prima de
la evolucin
Anlisis gentico
FRECUENCIA DE MUTACIN
Es el nmero de mutaciones que aparecen por divisin celular
en bacterias y organismos unicelulares


Ejemplo:
Los genes vricos y bacterianos padecen un promedio de
mutaciones espontaneas en 1 de cada 100 millones (10
-8
) de
divisiones celulares aproximadamente.


La frecuencia de mutaciones espontneas es de 10
-7
a 10
-10
.
Sin embargo, en las mutaciones inducidas aumenta a una
frecuencia de 10
-4
a 10
-7
.
POLIMORFISMO GENTICO
Variaciones en una posicin o
regin especfica en la
secuencia de ADN que se
presentan en al menos un 1%
de la poblacin.
Figura 2. Ejemplo de polimorfismo
gentico.
MARCADOR GENTICO
Segmento de ADN con una
ubicacin fsica identificable
(locus) en un cromosoma y
cuya herencia gentica se
puede rastrear.

Figura 3. Mapa gentico de tomate
basado en marcadores morfolgicos

Antibiticos

Enzima conocida

mutaciones

Deleccin

Insersin

Plsmido

Fenotipo


str
s
o str
r

hisG
+
o hisG
-

his G 47

D lac pro

lac::amp
s

his
-
, arg
-
/F, lac
+

His
+
o His
-


NOMENCLATURA DE GENES
En genotipo se escriben las tres iniciales del factor de crecimiento o
enzima de la que se trate con letras minsculas e italizadas his
+
o his
-


CLASIFICACIN
Grado de
lesin
Espontneas
Inducidas
Orgen
Macrolesiones
Microlesiones
Efecto
sobre el
fenotipo
Silenciosas
Sentido equivocado
Sin sentido
MUTACIONES ESPONTNEAS
Son cambios en la secuencia nucleotdica de los genes y no
parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^-7 a 10^10
(1 en 10 millones)
Errores por tautomerismo.

Daos oxidativos
TAUTOMRISMO
Los cambios tautomricos pueden resultar en cambios en
el emparejamiento de bases, o mutaciones.

Ceto-enol en la Timina y Guanina

Amino-imino en la Citosina y Adenina
Figura 5. Formas normales y tautomricas de las bases del DNA. La Adenina y
la Citosina pueden existir en la forma amino o en la rara forma imino; la
guanina y la timina pueden presentarse en la forma ceto o en la mas rara enol.
Figura 6. Comparacin de las relaciones de emparejamiento de bases normales
con las disposiciones producidas como resultado de cambios tautomericos. Las
puntas de flecha sealan los sitios de unin del azcar pentosido.
MUTACIONES POR RADICALES LIBRES
Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el
perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) y los superxidos (O
2
)
generan rupturas en el enlace glicosdico por la oxidacin
del azcar generando sitios apurnicos o apirimidnicos .
Figura 7.efecto de radicales en bases nitrogenadas.
MUTACIONES INDUCIDAS
Mutgeno:
agente externo, puede ser fsico o
qumico, que interacta con el
DNA causando mutaciones.


Mutagnesis:
Proceso de formacin de un
organismo mutante.

Figura 8. Mutacin inducida
por radiacin UV
Agentes
mutagnicos.
Fsicos
Rayos UV, X
Humedad
Temperatura
extrema
pH
Biolgicos.
Qumicos.
RAYOS X Y RADIACIONES
IONIZANTES:
o Tienen mayor poder de
penetracin que los rayos UV

o Difcil manejo, por lo que se
emplean poco en bacterias

o Producen radicales libres de
hidroxilo hiperreactivos,
responsables de la abertura de
un anillo de una base, o
fracturas monocatenarias o
bicatenarias en el ADN, esto
puede ocasionar mutaciones
por delecin .

LUZ UV
Causa la unin o
dimerizacin de pirimidinas
adyacentes en el DNA.
Siendo los dimeros de timina
los de mayor incidencia.
Figura 9. Dmeros de timina
por radiacin UV
CURVA DE SOBREVIVENCIA DE UNA BACTERIA DESPUS DE
LA EXPOSICIN A LA RADIACIN ULTRAVIOLETA
La exposicin del material gentico a temperaturas superiores
a 37C produce mutaciones puntuales en el ADN. Ejemplos
de esas mutaciones son la prdida de bases pricas, proceso
que se denomina despurinizacin, o bien desaminaciones,
que consisten en la prdida de grupos aminos de las bases.
TEMPERATURA
Figura 11. mutaciones inducidas por una alta temperatura
como despurinizacin (izquierda) y desaminacin (derecha)
BIOLGICOS.

Transposones:

Los transposones son segmentos mviles de DNA.

Los transposones contienen cortas repeticiones invertidas
terminales que son esenciales para el mecanismo de
insercin y que se utilizan para definir los lmites del
transposn.

Todos los transposones activos contienen al menos un gen
que codifica una TRANSPOSASA, una enzima necesaria para
que se produzca el salto o transposicin


Figura 12. Esquema de accin de los transposones
DESPURINIZACIN
Prdida de purina en una molcula de doble cadena de DNA,
se produce por rompimiento del enlace glucosdico que une al
carbono 1 de la desoxirribosa a la posicin 9 del anillo de purina

Figura 13. Prdida de una purina en un desoxinucletido.

Rotura del enlace glicosdico entre la base nitrogenada y el
azcar al que esta unida con prdida de una A o una G.

Figura 14. Despurinizacin por prdida de una guanina.
DESAMINACIN:
Prdida de grupos amino.
La C se convierte en U y ste se
empareja con A producindose
transiciones: GCAT.


El U no forma parte del ADN,
la glucosidasa de uracilo se
encarga de detectar U en el
DNA y retirarlo producindose
una base apirimidnica.


La 5-Me-C por se convierte en T.
La T es una base normal en el
DNA y no se retira, por tanto estos
errores no se reparan.
Figura 15. Transformacin de algunas
bases por desaminacin
ANLOGOS DE BASES
Son compuestos qumicos que pueden remplazar a
una base determinada. Por ejemplo, el 5-Bromouracilo
(5BU) es anlogo de la Timina (T) y puede remplazarla.


El 5-Bromouracilo puede provocar un error tras la
replicacin del DNA, es inestable y provoca
transiciones .
5-BROMOURACILO
Figura 16. Posibles apareamientos del 5-Bromouracilo.
2-AMINOPURINA
La 2-Aminopurina (2AP) es anlogo de la Adenina (A). La 2AP
aparea con la Timina (T) pero en su forma imno (2AP*) empareja
con la Citosina (C). Esta alteracin produce transiciones.
Figura 17. Posibles apareamientos de la 2-aminopurina
DESAMINANTES: HNO2
Provoca transiciones mediante la sustitucin de
grupos amino de nucletidos por grupos ceto, como
consecuencia la citocina de convierte en uracilo, la
adenina en hipoxantina y la guanina en xantina
Figura 18. Sustitucin del grupo amino por el grupo carbonilo en una
desaminacin con HNO2
Figura 19. Cambios provocados por la desaminacin con HNO2
HIDROXILAMINA HA.
NHOH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino es
reemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de la
citosina se aparea con adenina producindose transiciones
GC- AT.
Figura 20. Accin de la hidroxilamina en la citosina, provocando
un apareamiento con adenina
ALQUILANTES.
Etilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones:
transiciones y transversiones.

Nitrosoguanidina NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-
nitrosoguanidina : produce transiciones y transversiones
GCTA



Figura 21. Cambio en el apareamiento de guanina
provocado por la alquilacin.
INTERCALANTES
COLORANTES DE ACRIDINA
La proflavina y el naranja de acridina son planas, por lo que inician la
mutacin insertndose en la doble hlice del DNA, provocando su
deformacin; provocando adiciones y deleciones en la replicacin.
Figura 22. Molculas planas policclicas que se intercalan entre las bases.
Figura 23.Esquema de la accin de
los agentes intercalantes
Clasificacin de mutgenos por su dao, direccin y efecto
Mutgeno Clasificacin Dao Direccin Efecto
Luz UV Fsico Dmeros de
pirimdinas
Unidireccional Insercin,
delecin,
sustitucin
Hidroxilamina Qumico Hidroxilante Unidireccional Transiciones de
GC-AT
cido nitroso Qumico Desaminante Bidireccional Transiciones de
GC-AT y
trasversiones
AT-CG
EMS Qumico Alquilante Bidireccional Transiciones de
GC-AT, AT-GC
5-Bromouracilo Qumico Anlogo de base Bidireccional Transiciones de
GC-AT, AT-GC
Nitrosoguanidina Qumico Alquilante Unidireccional Transiciones de
GC-AT
ICR-170 Qumico Intercalante Bidireccional Insercin o
delecin
9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Insercin o
delecin
MUTACIN POR GRADO DE LESIN
Macrolesiones:
Alteraciones graves
en la molcula del
DNA o en un
segmento grande
En funcin de su magnitud, longitud o grado de lesin,
permite clasificarlas en:
Microlesiones:
Alteracin
producida en una o
pocas bases del
DNA.
MICROLESIONES (PUNTUALES)
Sustituciones
Transversiones
Transiciones
Inserciones
Deleciones
Alteran el marco de
lectura
SUSTITUCIN
Es aquella mutacin en la que donde debera haber una base se
encuentra otra del mismo tipo. Por ejemplo, en lugar de la
citosina se instala una timina.

Figura 22. Esquema de las posibles
transversiones y transiciones
INSERCIONES Y DELECIONES
Este tipo de mutacin produce un corrimiento en
el orden de lectura.

Pueden ser:

- Adiciones gnicas: Es la insercin de nucletidos
en la secuencia del gen.

- Deleciones gnicas: Es la prdida de nucletidos.

MARCOS DE LECTURA

ORF: Secuencia nucleotdica organizada en tripletes que
codifica una secuencia aminoacdica de un polipptido,
incluyendo un codn de inicio y un codn de terminacin.
Figura 23. Marco de lectura.
Figura 24. Esquema de las consecuencias de
una delecin y de una insercin en la traduccin
CORRIMIENTO DEL MARCO DE LECTURA.
Fig. 25 Mutacin por corrimiento del marco de lectura.
Mutacin Silenciosa:
Son cambios sutiles en las secuencias de DNA,
irrelevantes en un comienzo en cuanto a la
codificacin protenica, que poco a poco van
cobrando importancia siendo determinantes
en la enfermedad y la evolucin.
EFECTO SOBRE EL FENOTIPO
Figura 26. Esquema de una mutacin silenciosa donde se
sintetiza el mismo aa.
Mutacin Sin sentido
Son aquellas en las que tiene lugar una sustitucin
de bases en un codn dado, en donde en vez de
formar otro aminocido distinto, se crea uno de
los tres codones stop (UAA, UAG, UGA).


.
Fig. 27. Comparacin entre
un polipptido completo y
uno truncado debido a
una mutacin sin sentido al
cambiar una guanina por
una adenina. (Tomada de
Snyder & Champness,
2007, p. 157)
Mutacin En sentido errneo
Mutaciones que cambian la secuencia de un codn
dado, sustituyendo una base por otra, lo que puede
producir que el aminocido codificado no sea el que
se haba especificado antes.




.
Fig. 28. Cambio de una timina por
una citosina en una cadena de
DNA, produciendo una mutacin
en sentido errneo.(Tomada de
Snyder & Champness, 2007, p. 157)
SELECCIN DE MUTANTES.
Seleccin de auxtrofos.
Los organismos axtrofos son empleados con mayor
recurrencia para buscar un gen especfico
defectuoso, motivo por el cual no puede sintetizar sus
factores de crecimiento.


Seleccin de prottrofos.
Estos microorganismos son empleados para la
secuenciacin del genoma del organismo en su
forma silvestre.
Seleccin de microorganismos susceptibles a antibiticos.
Los organismos susceptibles a antibiticos son estudiados
para poder identificar los genes que confieren esta
susceptibilidad y poder seguir posibles resistencias
adquiridas


Seleccin de microorganismos resistentes a antibiticos
Son usados para estudio de los genes que confieren esta
resistencia, ya que por medio de dichos estudios se pueden
buscar algunas alternativas de tratamiento.
MUTACIONES NO REVERSIBLES (UNIDIRECIONALES)Y
REVERSIBLES (BIDIRECCIONALES).
Si se trata de una mutacin unidireccional no
reversible, puede reemplazar al alelo del que se
origin. (A
1
A
2
) pero muy a largo plazo.


Si se trata de una mutacin bidireccional
reversible, se puede establecer una situacin de
equilibrio que depende solo de las tasas de
mutacin (u) y retromutacin (v) (A
1
A
2
).





Es una segunda mutacin, se restaura total o
parcialmente el genotipo y/o fenotipo daado por la
primera mutacin.

REVERSIN.
Verdadera: mutante que a revertido a su genotipo
anterior, restauracin del genotipo (ADN) silvestre.
No verdadera (por supresin): reversin del fenotipo mutante
al silvestre a causa de una mutacin en otro lugar que
suprima o compense la deficiencia de la primera

Supresin intragnica: se produce cuando la segunda
mutacin se da dentro del mismo gen en que se dio la
primer mutacin.

Supresin intergnica: las segunda mutacin se da en un
gen diferente a donde se dio la primer mutacin.


ARTCULO:

HIDROXILAMINA COMO AGENTE
MUTAGNICO DE NEUROSPORA CRASSA

H. V. MALLING
Biology 3' Division,
Oak Ridge National Laboratory),
Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)
(Received June 21st, I966)
Neurospora crassa

o Es un hongo perteneciente a la divisin Ascomycota

o Es utilizado como organismo modelo por su haploida, su ciclo
de vida rpido y sencillo, y por la facilidad con la que se
puede cultivar.

o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de la
mutacin es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 son
morados y se detectan fcilmente.
Figura 29. Cultivo de
Neurospora crassa.
HA induce sustituciones en pares de bases GC- AT
La reaccin entre DNA y HA es con citocina y con
RNA con uracilo
A un pH de 6.1 la reaccin es mas rpida con
citocina que con uracilo
HA ha sido usada para inducir dao cromosmico
en clulas de mamferos
No se ha podido identificar la alteracin por HA en
eucariotes a nivel molecular
INTRODUCCIN
OBJETIVOS

Determinar la especificidad de HA para
producir reversiones en mutantes
dependientes de adenina.

Obtener informacin ms detallada
sobre los efectos de HA en Neurospora
Prueba de Ames
Se basa en la observacin de que la exposicin de
las bacterias mutantes a las sustancias mutagnicas
puede causar nuevas mutaciones que revierten el
efecto de la mutacin original.
Figura 30. Prueba de Ames para observar revertientes.
SELECCIN DE MUTANTES.
Figura 31. Seleccin de mutantes por auxotrofa y Pototrofa
RPLICA EN PLACA
sta tcnica
conocida como
rplica en placa,
(Joshua Lederberg),
es una tcnica de
deteccin que hace
posible determinar
rpidamente si una
determinada cepa
bacteriana es
auxtrofa para
dado metabolito
Figura 32. Tcnica de rplica en placa para
seleccin de auxtrofo a X metabolito.
MEDIO DE CULTIVO
Conidios
20ml de medio
glicerol
completo con
sulfato de
adenina
Incubados
1 da a
30C, 6-9
das a 25C
Conidios en
agitacin
con perlas
Rompimiento
de cadenas
suspendieron
en solucin
salina (0.9%)
Filtrado en malla
de platino
lavados 2
veces por
centrifugacin
Resuspender en
solucin salina
Se utilizaron 7 cepas mutantes inducidas con
cido nitroso y una cepa de origen
espontneo.
Mutantes Ad
-
3
difieren de las dems
por el desarrollo de
un pigmento
prpura en el micelio
y conidios cuando
crece en glicerol
completo
La acumulacin
de tal pigmento
se elimina al
agregar 250 mg
de sulfato de
adenina por
litro.
La densidad de suspensiones de conidios se
midi en un fotocolormetro y el punto
mximo de absorcin se encontr a 750m.
TRATAMIENTOS
Suspensin de conidios
en matraces de
Erlenmeyer en un
agitador rotatorio en
bao de agua a 25
5 min antes de
detener el
tratamiento.
Despus de
los
tratamientos
NA, EMS o
ICR-170
Resuspender en suspensin
salina mnima de Fries
ajustada a un pH de 8 con
NaOH.
Todos los tratamientos se
llevaron a cabo con
suspensiones conidiales
(2X107/ml) en matraces
Erlenmeyer en un agitador
rotatorio
TRATAMIENTO CON CIDO NITROSO
Conidios fueron
suspendidos en
0.05M de un
regulador de
acetato de sodio
de un pH de 4.5
Cf: 0.005M de
NaNO2 y el
tratamiento fue
inactivado como
ha sido descrito
pasados los 40
minutos.
% S R/ 10
8
S
TRATAMIENTO CON EMS
Los conidios fueron
suspendidos en 0.067 M
de un regulador de
fosfatos a un pH de 7.0.
El tratamiento se
inici al aadir
suficiente EMS
para dejar una
concentracin
final de 0.1M; el
tratamiento fue
suspendido 300
minutos despus.
% S R/

S
Abreviaturas: %S= Porcentaje de sobrevivientes
R/

S= Reversiones por cada 10

8
sobrevivientes
TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA
Antes del
tratamiento
HA, los conidios
fueron
suspendidos en
NaCl 3M
Dilucin 5 veces
en la mezcla de
reaccin HA
concentracin
final 1M
5 minutos antes de detener
el tratamiento, centrifug y
decantados y en el tiempo
de detener la reaccin (300
minutos despus de
iniciado el tratamiento)
Los conidios
fueron
resuspendidos
en NaCl 3M
los conidios fueron
resuspendidos en la
solucin salina mnima de
Fries ajustada a un pH de 8.
% S R/

S
Tratamiento
con ICR-170
Suspensin de
conidios
Suspender en regulador
de fosfato 0.067M pH 7
Adicin de un volumen de
ICR-170 a 49 volmenes de
suspensin de conidia
Concentracin
final de 10.58M
Tratamiento
terminado
130min.
Despus
Procedimiento realizado
en luz Roja, y las cajas
incubadas en oscuridad
% S R/

S
ESTIMACIN DE LA VIABILIDAD DE LOS CONIDIOS
TRATADOS Y NO TRATADOS.

Medios de cultivo
Fueron sembrados en medio mnimo de
Westergaard suplementado con sorbosa
(15g/l), glucosa (0.5 g/l), fructosa (0.5 g/l),
cido casamino (200mg/l), una solucin
vitaminada en glicerol completo (1 ml/l),
y adenin sulfato (25 mg/l)
Para estimar el nmero de
revertores los conidios fueron
sembrados en el mismo sustrato
usado para los sobrevivientes
anotados pero suplementado con
0.2 mg/l de adenin sulfato en lugar
de 25mg/l de adenin sulfato.
CONTEO DE REVERTIENTES DESPUES
DEL TRATAMIENTO CON NA, EMS E
ICR-170
Conidios sembrados a una densidad de
10
6
/ml y 2X10
5
conidios/ml en un
volumen total de 100ml
CONTEO DE REVERTANTES
DESPUES DEL TRATAMIENTO
CON HA
La densidad de los conidios fue de
2X10
5
en volumen total de 500ml
DETERMINACIN DE
SOBREVICENCIA
La densidad de los conidios fue de 5-10
conidios por volumen de sustrato en
volumen total alrededor de 100 mL

Supresores

SE ANALIZARON 20 DIFERENTES MUTANTES INDUCIDOS EN EL
LOCI AD-3 PARA OBSERVAR LA INCIDENCIA DE SUPRESORES
EXTRAGNICOS Y NINGUNO FUE ENCONTRADO.

POR LO TANTO, SE PUDE ASUMIR QUE LA REVERSIN POR
SUPRESIN FUERA DE LOS LOCUS AD-3A AD-3B SON MUY
RAROS O NO OCURREN.

Alteraciones genticas inducidas por HA
Tabla 1: Porcentaje de sobrevivientes y frecuencias de
reversin de las cepas despus del tratamiento con
ICR-170, NA, EMS e Hidroxilamina.
Grafica 1: Incremento del nmero de reversiones (M)
despus del tratamiento con HA sobre el nmero de
mutaciones espontneas (Mo) contra el tiempo de
tratamiento con HA.
Grafica 2: Porcentaje de sobrevivientes contra el
tiempo de tratamiento con HA.

La frecuencia de reversin con Hidroxilamina no es proporcional al
tiempo en Neurospora, pero s para fagos.

Grafica 3: Cintica de las inducciones de reversiones por HA en la
sustitucin par base de la cepa 2-17-155.
Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes contra el
cuadrado del tiempo del tratamiento de HA.

Heterocarionte
Rpida penetracin
de HA.
Reaccin con citosina
ocurre en dos pasos

Conclusiones:
Se obtuvieron 8 veces mas mutantes en las cepas
tratadas con HA que en las espontneas.

El porcentaje de supervivientes no fue menor al 42%.

En Neurospora crassa la Hidroxilamina produce reversin
en las cepas que revierten por sustitucin de pb.

La alteracin gentica inducida por la Hidroxilamina en
Neurospora es la transicin par de base de GC a AT.

La frecuencia de la induccin por HA sigue una cintica
de segundo orden.
Prctica 2

Induccin de
mutantes en
Escherichia coli
OBJETIVOS
Conocer el manejo de algunas tcnicas para
producir mutaciones

Analizar algunos parmetros que caracterizan
el proceso de mutacin como la frecuencia
de mutacin y la relacin dosis-respuesta.

Caracterizar el dao producido por la luz UV y
HA mediante pruebas de reversin.
MAC CONKEY MEDIO MNIMO LACTOSA
Medio diferencial
Las bacterias capaces de
fermentar acidifican el
medio. Se forman
colonias rojas o rosadas.
Medio mnimo
Slo crecen
microorganismos
capaces de utilizar la
lactosa como fuente
de carbono.
Figura 30. Prueba positiva y
negativa de lactosa en
medio Mac Conkey
MEDIO LURIA (L)
Medio rico
Lac
+
Lac
-

MEDIOS DE CULTIVO
Se trata de una enterobacteria que se encuentra
generalmente en los intestinos animales, y por
ende en las aguas negras, pero se lo puede
encontrar en todos lados, dado que es un
organismo ubicuo.

Escherichia coli W3350

Fenotipo: F
-
, Gal
-
, Su
-
, Sm
s


Escherichia coli
CEPA
DESARROLLO EXPERIMENTAL.
TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA
Colectar
clulas
cultivo
E. coli
W3350
4000 x g
10 min
5 ml
medio L
1 ml
9200 x g
3min
1 ml de
HA pH 6
Tubo [ HA] M
1 0.0
2 0.2
3 0.4
4 0.6
5 0.8
Tapar con
papel
aluminio.
Incubar a 37C
en agitacin
30 min.
9200 x g
3min
Condiciones
de
esterilidad
1 ml
sol.
Salina
Determinar el
numero de clulas
viables en cada
tubo con diluciones
decmales
0.5 ml
10
-1

4.5 ml
medio L
Tubo Dilucin
1 10
-5
, 10
-6

2 10
-5
, 10
-6

3 10
-4
, 10
-5

4 10
-4
, 10
-5

5 10
-4
, 10
-5

Sol.
salina
Por duplicado
0.1 ml
Mac
Conkey
Incubar
37C
18 h
Incubar tubos
con dilucin 10
-1

37C 18 h
DA 1. TRATAMIENTO CON LUZ ULTRAVIOLETA
Dilucin
1:20 E.
coli
W3350
Medio L
20 ml
Incubar a 37 con
agitacin hasta
obtener una densidad
ptica de 60 unidades
Klett equivalente a
As600nm =1.12 (aprx
15h)
4000 x g
15 min
Resuspender
6 ml Sol.
salina
500 ul
4.5 ml
medio L 10
-1

5.5 ml
Irradiar por 15, 30, 45 y 60 segundos
0.5 ml
4.5 ml
medio L
Tiempo de
irradiacin
Dilucin
0 10
-5
, 10
-6

15 10
-5
, 10
-6

30 10
-5
, 10
-6

45 10
-5
, 10
-6

60 10
-4
, 10
-5

Sol.
salina
0.1 ml
Mac
Conkey
Por duplicado
Incubar
37C
18 h
Incubar tubos
con dilucin 10
-1

37C 18 h
DA 2. CUENTA DE SOBREVIVIENTES Y SIEMBRA PARA SELECCIONAR MUTANTES
Cuenta de
sobrevivientes
colonias blancas
Lac
-

Calcular el ttulo
de sobrevivientes y
trazar grfica de %
de sobrevivencia
vs [HA] o tiempo
de irradiacin.
Prepara diluciones
10
-6
, 10
-7
y 10
-8
De la
dilucin 10
-1
Medio L
0.1 ml
Mac
Conkey
Sembrar una caja
de la dilucin 10
-6
y
dos de 10
-7
y 10
-8
incubar a 37C 18h
NO
picar las
colonias
Cuenta de
sobrevivientes
colonias blancas
Lac
-

DA 3. REVERSIN
NO
picar las
colonias
Calcular frecuencia de
mutacin (FM)
Elaborar la curva dosis-respuesta,
considerando la dosis del mutgeno
empleadas y las frecuencias de
mutacin calculadas.
DETERMINACIN DEL TIPO DE MUTACIN PRODUCIDO POR LA LUZ
UV Y HA
Una colonia
aislada Lac
-

0.5 ml medio L
Agar blando
fundido
0.1 mL
Medio Mnimo Lactosa
Papel filtro estril
Impregnar 20 ul
Estreptomicina y
9-aminoacridina
Nitrosoguanidina
y 5-bromouracilo
Hidroxilamina Nada
Incubar a 37C 5 das, observndolas diariamente para registrar la
aparicin de revertantes. De acuerdo a los resultados obtenidos y
tomando en cuenta el tipo de lesin que produce cada mutgeno,
proponer que tipo de lesiones produjeron la HA y la luz UV
BIBLIOGRAFA
Klug W.S. (et. Al.), Conceptos de gentica, 5
edicin, ED. PRENTICE HALL, Madrid (1999)
pg. 411-412, 423-430

http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pi
d=S0718-34292009000300009#img01
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisico
s.htm#_Toc59451628
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/16mutaci
on.htm#_Toc62545604
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