PURIFICACIN Y CONCENTRACIN

CONCENTRACIN

 Dependiendo si son enzimas extracelulares o intracelulares, la secuencia del proceso cambia:

ENZ. EXTRACELULARES
Fermentacin Torta Celular Residual Sep. Slido-Liquido Concentracin

ENZ. INTRACELULARES
Fermentacin Sep. Slido-Liquido
(Almacenamiento)

Caldo Gastado

Purificacin o Formulacin

Extraccin
Sep. Slido-Liquido Concentracin Purificacin o Formulacin

Tejido vegetal o animal

CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO
1er paso: Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas 2 paso: Eliminacin de restos celulares: Centrifugacin Filtracin 3er paso: Concentracin: Precipitacin Adsorcin Ultrafiltracin Secado Liofilizacin

EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

MATERIAL DE PARTIDA

ROTURA CELULAR

Detergente

Tratamiento con lcali

Tamizacin lquida

Agitacin con abrasivos

Tratamiento enzimtico

Choque osmtico

Tamizacin slida

ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

SEPARACIN SLIDO-LQUIDO

Centrifugacin CONCENTRACIN

Filtracin

Precipitacin

Adsorcin

Secado PURIFICACIN

Liofilizacin

Ultrafiltracin

Cromatografa

Sistemas en dos fases

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN
CONCENTRACIN
Precipitacin
Sulfato amnico Solventes orgnicos Polmeros de alto peso molecular

Adsorcin
Polisacridos aninicos Polisacridos catinicos Cromatografa de afinidad Otros

Ultrafiltracin Secado
Evaporacin rotatoria Secado en spray liofilizacin

PURIFICACIN
Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentracin diferencial de una protena o molcula de inters.

CARACTERSTICA DE LA ENZIMA PARA EL PROCEDIMIENTO REQUERIDO

CONCENTRACIN POR PRECIPITACIN

Principio general: Precipitacin (insolubilizacin) de un soluto por la accin de un agente precipitante con el fin de concentrarlo o separarlo de una mezcla. La solubilidad de una molcula : f (temperatura, fuerza inica, pH, constante dielctrica). Tericamente el soluto precipitado debe ser recuperado puro. La precipitacin se usa frecuentemente al inicio de las etapas de purificacin. El agente precipitante no debe desnaturalizar al soluto y en el mejor de los casos debe estabilizarlo. La precipitacin de las proteinas es una de las operaciones mas importantes en el proceso de purificacin.

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin.
desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo ruptura de los puentes de hidrgeno

Esto ocurre porque se facilita la agregacin intermolecular.

AGENTES PARA LA PRECIPITACIN

AJUSTANDO EL pH
La carga neta de las protena depende del contenido de aa cidos y de aa bsicos El valor del pH donde la carga neta de la protena es cero pI (punto isoelectrico) Solubilidad es mnina

Ej: contenido de aa cidos pI bajo (4-5)

 Ajustando el pH del extracto, de 7,0 hasta 4,0 o 5,0, se consigue muchas veces eliminar los componentes solubles de las paredes celulares y numerosas protenas no deseadas. Es evidente que este mtodo slo puede usarse en los casos en que el enzima deseado es estable y soluble a pH bajo. Ej. Para la purificacin inicial de nuclesido-5'fosfotransferasa de la zanahoria.

PRECIPITACIN POR SALES

Disminucin de las interacciones de carga entre el soluto y el solvente.

PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO

FUNDAMENTO: EFECTO DE LA FUERZA INICA

Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting in

Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contra iones ms soluble por > interaccin prot-solv
La solubilidad a alta fuerza inica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] Salting out

Capturan el H2O > interaccin entre enzimas.

La alta [sal] elimina la esfera de solvatacin de la protena
Las protenas en H2O tienden a formar COMPLEJOS electrostticos precipitan

100% % SOLUBILIDAD PROTENA MS SOLUBLE

50%
0%

PROTENA MENOS SOLUBLE

0%

50% 100% % SATURACIN CON (NH4)2 SO4

PROCEDIMIENTO
SUFALTO DE AMONIO: Altamente soluble en agua, muy pura, barata,no tiene efecto sobre la estructura de las protenas. Despus de la adicin de sal, protenas precipitadas se centrifugan y se redisuelven en buffer . Protenas solubles pueden precipitarse con una concentracin mayor de la misma sal. Protena precipitada es salted out. Sal retira la capa de molculas de agua que rodea a la superficie de la protena. Grupos hidrofbicos permiten que la protena se agregue y precipite.

 La adicin gradual del sulfato amnico slido hace que precipiten primero las protenas no deseadas y despus la que interesa. Las concentraciones altas de sulfato amnico pueden aumentar considerablemente la estabilidad de muchos enzimas. Provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan.

A muy gran escala, el uso del sulfato amnico puede presentar problemas de manejo y eliminacin: Altas concentraciones de esta sal pueden corroer el cemento e incluso el acero de alta calidad utilizado en las instalaciones a gran escala. El sulfato sdico no es corrosivo, pero su menor solubilidad requiere que se suba la temperatura por encima de los 35 C, para conseguir el mismo grado de precipitacin fraccionada.

PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO

AGUA

Sulfato de amonio (NH4)2 SO4

Protena soluble
Protena insoluble

PRECIPITACIN POR SOLVENTES ORGNICOS

Diferente solubilidad de las protenas en solucin acuosa a solventes orgnicos, disolventes neutros miscibles en agua : etanol, acetona, butanol. Se usan en distintas proporciones. Bajan el poder de solvatacin de las soluciones acuosas. Solvente: disminuye constante dielctrica del medio aumenta atraccin entre molculas cargadas y disminuye su interaccin con el agua. Solubilidad de la protena disminuye: grupos hidrofbicos son protegidos por solvente y grupos inicos son dominantes. Inverso a fraccionamiento con sales: grupos hidrofbicos son expuestos. Puede haber denaturalizacin y se pierde actividad.

 Los disolventes orgnicos son agentes de precipitacin eficaces y adecuados para el trabajo de laboratorio. Rara vez son empleados a gran escala, a causa de su inflamabilidad. La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos.

ADSORCIN
La adsorcin sobre materiales insolubles, por tandas, ha sido muy utilizada. El principio de adsorcin que se aplica es habitualmente el del intercambio inico, pero con algunos materiales, como la celita o el hidroxiapatito, la adsorcin es inespecfica. Tres tipos de materiales:
Resinas dextranos sustituidos o agarosa celulosas sustituidas.

 Las operaciones de adsorcin y elucin se suelen desarrollar por tandas, en vez de en columnas de cromatografa. Por la magnitud del volumen de extracto turbio que hay que procesar y problema de la compresibilidad del material de adsorcin; a pesar del relativamente bajo grado de resolucin obtenible.

RESINAS
Las resinas de intercambio inico: los poliestirenos sulfonados
resultan en la prctica de poca utilidad para la adsorcin de protenas, porque su alto grado de sustitucin puede causar la desnaturalizacin. La excepcin a esto es su uso con protenas de punto isoelctrico particularmente alto, como el citocromo c.

OTROS ADSORBENTES
Las celulosas sustituidas, los dextranos y las agarosas, aunque a gran escala tienden a resultar caras.

ADSORCIN NO ESPECFICA
Los materiales como la CELITA y el HIDROXIAPATITO, interaccionan con las protenas de modo relativamente inespecfico
Son muy utilizadas debido a su bajo coste. El HIDROXIAPATITO permite eluir de

manera diferencial las muchas protenas que retiene, aumentando progresivamente la concentracin de fosfato. Adems, como el cloruro no interviene en el intercambio inico, se puede realizar la adsorcin y la elucin a concentraciones de cloruro de hasta 1,0 M.

PROCEDIMIENTO
Los materiales adsorbentes tpicos se aaden al extracto y despus de remover durante un rato, se sedimentan en una centrfuga basculante (o incluso en la secadora centrfuga domstica). El material adsorbente se resuspende a continuacin en un medio de fuerza inica mayor o de pH distinto, o las dos cosas, y se vuelve a centrifugar de nuevo. Con una centrfuga con capacidad para 40 litros, es factible el procesado diario de hasta 2.000 litros. Durante el proceso de elucin, es ms eficaz dividir la cantidad total de lquido eluyente en dos o tres lotes, en vez de usarlo todo de una vez. Se puede realizar la adsorcin por tandas, y la elucin en columna. En resumen, la ganancia neta en este caso sera el tiempo que se ahorra y el inconveniente, una prdida en poder de resolucin.

 Protenas poseen aa cargados en su superficie, se adsorben sobre el intercambiador Protenas con carga negativa se absorben catinicos, neta a I.

La fuerza de adsorcin aumenta con el aumento de carga neta.

La carga de los aa depende del pH.

la carga neta depender del pH de una manera que es bastante especfica para cada protena individual.
El tamao de la fecha representa la fuerza de la adsorcin

CROMATOGRAFIA

TIPO DE MATRIZ

POROSIDAD

ADSORCIN NOESPECFICA Baja Baja Baja Baja

RIGIDEZ

ESTABILIDAD

FACILIDAD DE MODIFICAC IN buena buena buena buena

COSTE RELATIVO Bajo/medi o Medio Medio Medio

Dextrano con entrecruzados

enlaces

Baja Baja Alta

Baja Baja Baja Media

Buena Buena Deficiente Buena

Poliacrilamida con enlaces entrecruzados Agarosa Agarosa con entrecruzados enlaces

Alta

Compuesto poliacrilamida/dextrano
Compuesto poliacrilamida/agarosa Polmero acrlico hidroxilado Copolmero metacrilato Celulosa Slice porosa Polmero orgnico rgido etilenglicol-

Alta
Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta

Media
Baja Media Media Alta Alta Baja

Media
Media Media Media Baja Alta Alta

Buena
Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena

buena
buena buena buena buena deficiente buena

Medio
Medio/alt o Medio Medio Bajo Alto Alto

TIPOS DE CROMATOGRAFA
CARACTERSTICA MOLECULAR APROVECHADA TIPO DE CROMATOGRAFA Filtracin en gel

CARACTERSTICAS
Resolucin moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. Capacidad limitada por el volumen de la muestra La resolucin puede ser alta. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz. La resolucin puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La velocidad puede ser alta

APLICACIN
El fraccionamiento es mejor en las ltimas etapas de la purificacin. En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y podr existir una limitacin respecto al volumen de muestra Es ms efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volmenes.

Tamao

Carga

Intercambio inico

Cromatoenfoque

Es mejor usarla en una purificacin posterior, ya que las matrices son caras. Puede ser utilizada en cualquier fase, pero es mejor aplicarla cuando la fuerza inica es alta tras la precipitacin con sales o despus de un intercambio inico Puede emplearse en cualquier etapa, aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases

Polaridad

Interaccin hidrofbica

Resolucin buena Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra. Velocidad alta La resolucin puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja, dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad alta.

Afinidad biolgica

Afinidad

CROMATOGRAFIA DE INTERACCIONES HIDROFBICAS (HIC)

La fase estacionaria son generalmente compuestos alifticos de distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc) Elucin por gradiente (usando mezclas de agua y solventes orgnicos) Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades fisicoquimicas)

FUNDAMENTO
Las protenas se unen reversiblemente a ligandos hidrofbicos que se encuentran inmovilizados en el soporte cromatogrfico, debido a la presencia de una elevada concentracin de sal. La elucin se logra disminuyendo la fuerza inica en la fase mvil, formando un gradiente decreciente (Fausnaugh y Regnier, 1986).

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

La fase mvil es lquida Particin o reparto

Adsorcin
Intercambio inico

Exclusin molecular

CARACTERSTICAS Y VENTAJAS
Trabaja con partculas muy pequeas (< 10 mm).

Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch

= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7).

Rpida.
Picos angostos (alta eficiencia). Separa compuestos no-voltiles o trmicamente inestables.

ESQUEMA DEL EQUIPO DE HPLC

INYECTOR PRE-COLUMNA

BOMBA
CMARA DE MEZCLA COLUMNA

DETECTOR

SEPARACIN EN DOS FASES LQUIDAS

VENTAJAS La fcil separacin de protenas por un lado y paredes celulares y residuos semisolubles por otro. La posibilidad de funcionar en continuo. FUNDAMENTO El principio de esta tcnica se fundamenta en la observacin de que al poner en contacto una solucin de protenas con una mezcla de dos polmeros inmiscibles, los dos polmeros se separan en fases distintas y las protenas quedan selectivamente repartidas entre una fase y la otra.

 La razn de esta separacin de los polmeros en fases y de la adsorcin selectiva de las protenas, est en las caractersticas fsicas de las molculas implicadas; las molculas idnticas o similares tienen mayor tendencia a agregarse entre s, que a hacerlo con molculas diferentes. Un sistema de dos fases tpico podra estar constituido por una mezcla de polietilenglicol (PEG) y dextrano, o quizs, polietilenglicol y sulfato amnico. La fase en la que se localice una determinada protena depender de su propio peso molecular, del peso molecular y concentracin de los polmeros, as como de la temperatura, el pH y la fuerza inica. Una vez mezclados los ingredientes, la separacin en fases se realiza por decantacin o centrifugacin (posiblemente en continuo).

SEPARACIN EN DOS FASES LQUIDAS