CTV Biotecnologia FCAyF 2012

Qu es la Biotecnologa?
BIOLOGA + TECNOLOGA = BIOTECNOLOGA
BIOS quiere decir vida, y BIOLOGA es el
TECNOLOGA se refiere
estudio de los seres vivos.
a las herramientas o tcnicas que se usan para fabricar o producir algo.
Entonces, se puede definir BIOTECNOLOGA como: Conjunto de Herramientas o tcnicas que emplean seres vivos, o parte de ellos, para obtener productos, procesos o servicios.
Biotecnologa
Surgi como tal para el ao 1917 cuando el economista hngaro Karl Ereky idealiz el utilizar sistemas vivos (biolgicos) como materia prima para obtener productos en mayor escala a nivel industrial. Hasta aquel entonces, el trmino biotecnologa no estaba an conceptualizado y se le conoca como zimologa, o el estudio de los procesos de fermentacin. Cuando Ereky fue ministro de agricultura de su pas el trmino se difundi ampliamente.
EL CONCEPTO DE
Qu es la Biotecnologa?
Es la utilizacin de organismos, partes de organismos o procesos biolgicos naturales para producir bienes, productos y servicios.
No es una ciencia en si misma, es un rea intensiva de conocimiento

cientfico y por lo tanto, depende de la generacin y aplicacin de este conocimiento.
Tambin es multidisciplinaria abarca la fisiologa, bioqumica, biologa celular y molecular y la gentica, entre otras, as como la interrelacin entre ellas.
La Biotecnologa es multidisciplinaria, interdisciplinaria y transdisciplinaria.

Abarca: Gentica, bioqumica, biologa molecular y celular, microbiologa, inmunologa, qumica, farmacologa, ingeniera qumica e industrial, fisiologa, informtica y ecologa. Ha generado nuevas disciplinas como la bioinformtica, la bioprospeccin y la biodiplomacia entre otras.
LA BIOTECNOLOGA TIENE UNA LARGA HISTORIA

Comienzo de las domesticacin de plantas y animales. Las civilizaciones Sumeria y babilnicas ya conocan como elaborar cerveza. Los egipcios ya saban fabricar pan a partir de trigo Se conoca el vino en el Cercano Oriente y se poda fabricar queso, cultivar champignones, hacer alimentos y bebidas fermentadas: salsa de soja, yogurt, etc, Robert Hooke observ por primera vez las clulas. El cientfico francs, Luis Pasteur, desarrolla el proceso de la pasteurizacin. Un monje austraco, Gregor Mendel, enuncia la teora de la herencia. Nace la gentica. El mdico Alexander Fleming, en Londres, descubre las propiedades antibiticas de la penicilina James Watson (norteamericano) y Francis Crick (britnico) descubren la escritura del ADN. Perodo Neoltico 6000 AC 4000 AC Antes de la Biblia 1665 1864 1865 1928 1953 1961 1973 1983
Se descifra el cdigo gentico. Las bases del ADN definen la secuencia de aminocidos de las protenas.
Primer experimento de ingeniera gentica. S. Cohen y H. Boyer logran transferir el gen de la insulina humana a la bacteria Escherichia coli. Primera planta transformada mediante ingeniera gentica. Nacimiento del primer mamfero clonado, la oveja Dolly.
Obtencin del borrador de la secuencia del genoma humano en el ao 2001. El genoma completo fue presentado en abril del 2003.
Descubrimiento de la secuencia del genoma de la papa, tercer cultivo en importancia alimentaria mundial. Secuenciacin de Maz, el genoma vegetal ms grande y complejo secuenciado hasta la fecha.
1996
2001-2003 2009
Biotecnologa tradicional
Comenz hace miles de aos. Se refiere a la fabricacin del vino, el pan, el queso y el yogurt. Se basa en el empleo de microorganismos o de los productos que ellos fabrican para producir productos fermentados.
Esta biotecnologa era un arte, ms que una ciencia. Aunque en ese entonces los hombres no entendan cmo ocurran estos procesos, los aprovecharon para su beneficio.
Biotecnologa clsica
El hombre descubre que los responsables de ciertos procesos son microorganismos y comienza a perfeccionar su uso para elaborar productos. Se desarrollan por ejemplo la penicilina y otros antibiticos. El conocimiento de la totipotencia celular hace posible el cultivo de tejidos vegetales bajo condiciones de laboratorio.
Biotecnologa actual o moderna

La biotecnologa tal como la conocemos actualmente empez en los aos 50 con el descubrimiento por James Watson y Francis Crick de la estructura de la molcula de ADN. El hombre avanza en los conocimientos cientficos y hace que los organismos por l modificados brinden bienes y servicios. Por ejemplo: produccin de insulina humana en bacterias, cultivos transgnicos, clonacin de animales.
Nueva Biotecnologa
O BIOTECNOLOGA DE AVANZADA
INFORMTICA BIOINFORMTICA
BIOTECNOLOGA (ADN recombinante)
ADN
Cdigo Gentico
Protenas
Es la Biotecnologa que tiene un importante componente de tecnologa de ADN recombinante unido a la informtica.
La Biotecnologa puede aplicarse a todo tipo de Organismo Vivo

Es decir: virus, hongos, bacterias, Plantas, animales y humanos. Todos los organismos vivos estn conformados por clulas. La clula es la unidad bsica de la vida.
Caractersticas
Eucariota
Procariota
Hay organismos formados por una sola clula, los Organismos Unicelulares (como bacterias y ciertos hongos). Otros estn formados por millones de clulas organizadas en tejidos y rganos, y se los conoce como Organismos Multicelulares (tales como plantas y animales).
Clula Procariota
Unicelulares Generalmente ms pequeos (1-10 m) No definido Disperso No tiene
Clula Eucariota
Uni y pluricelulares Generalmente ms grandes (10-100 m) Definido En el ncleo Tiene varias
Organismos Tamao
Ncleo Ubicacin del ADN Organelas
Biotecnologa. Es Gentica
El ADN
El ADN es una larga molcula que contiene toda la informacin necesaria para la vida de un organismo.
Se encuentra alojada en el ncleo de las clulas, donde se enrolla y se asocia a unas protenas, las histonas, y forma estructuras que se denominan cromosomas. El cromosoma lleva los genes. El Gen es el portador de la informacin gentica que marca el ritmo de nuestra vida.
La informacin gentica de cada uno de nosotros es como una huella digital, ya que es nica y personificada. A la totalidad de genes que componen un organismo humano se lo conoce como Genoma Humano. El Genoma constituye la herencia gentica total de cada individuo.
Cada especie tiene su propio genoma caracterstico pero todos ellos tienen el mismo soporte fsico: el ADN.
Datos sobre el Genoma Humano

El genoma humano es 10 veces ms pequeo que el genoma de la salamandra Bolitoglossa y 200 veces menor que el de la Ameba. Entre una persona y otra, el ADN slo difiere en 0.2%. De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de la mosca de la fruta (Drosophila).
Humanos
Chimpanc
Ratn 30.000 genes
Caenorhabditis elegans
19.000 genes
Drosophila melanogaster
13.000 genes
30.000 genes
30.000 genes
La molcula de ADN
El ADN tiene una estructura de doble hlice, que semeja una escalera en caracol.
Esta formado por muchas molculas simples denominadas nucletidos. Cada nucletido esta compuesto por: una molcula de azcar (desoxirribosa) un fosfato. una base nitrogenada Las bases nitrogenadas son cuatro: A (Adenina), T (Timina), C (Citosina) y G (Guanina). En los organismos vivos, el ADN se presenta como dos hebras unidas entre s por conexiones entre sus nucletidos: A = T G = C
El orden de las letras en el ADN constituye mensajes o instrucciones codificadas que determinan las caractersticas de los organismos, del mismo modo en que el orden de las letras del alfabeto forman palabras y frases.
Dos caractersticas Importantes del ADN

El ADN de las clulas lleva la informacin para la produccin de protenas. El ADN puede hacer copias exactas de s mismo, por un proceso denominado replicacin.
TRES letras en lenguaje DNA se traducen a UNA letra en lenguaje protena
MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRL AHPPFASWRNSEEARTREQWIMNCCPP TLTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEA VPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGY
LOS CAMPOS DE APLICACIN DE
La Biotecnologa
Abarca la industria, la ganadera, la agricultura, la salud y el ambiente. Por lo que se puede clasificar en:
Biotecnologa Vegetal Biotecnologa Humana Biotecnologa Industrial
Biotecnologa Animal
Biotecnologa Ambiental Biotecnologa Marina
Biotcnicas
Productos
Cultivo de tejidos Clones
Biologa Molecular Huellas digitales
Tecnologa de ADN recombinante Planta transgnicas

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Omicas. Genomas
Sandra Sharry
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BIOTECNOLOGA VEGETAL
Las nuevas tcnicas biotecnolgicas abren grandes posibilidades para mejorar la cantidad de alimentos disponibles y su calidad.
Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
Cultivo de tejidos vegetales
Dra. Sandra Sharry CEPROVE, FCAyF, UNLP [email protected] [email protected]
Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales Micropropagacin vegetal Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas
Sumario
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis Tipos de cultivo de tejidos vegetales Aplicaciones del CTV Alcances de la propagacin clonal masiva de plantas
Conservacin de recursos genticos e intercambio de germoplama.
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Referencias Sandra Sharry
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CULTIVO DE TEJIDOS
Conjunto de tcnicas que permiten el cultivo en condiciones aspticas de rganos, tejidos, clulas y protoplastos.
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Fundamentos del cultivo de clulas y tejidos vegetales
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Antecedentes.
S. XVIII: nutricin mineral, cultivos hidropnicos prolongados. Estudios de fisiologa y bioqumica celular. 1838: Teora de la totipotencia celular (Schwann y Schleiden) 1902, Haberlandt intent cultivar clulas aisladas de plantas, Resultado: no mueren pero no se dividen Gautheret (aos 30): Primeros cultivos in vitro reales con cambium y tejidos vasculares diferenciados. White, Nobecourt y Gautheret (1939): Crecimiento indefinido de tejidos vegetales tumorales (ausencia de citoquininas). Varios autores (aos 50 en adelante): xito en diferentes rganos y especies (presencia de citoquininas)-Murashige.Skoog.Miller. tejidos tumorales, pices meristemticos, embriones manipulados, zanahoria, tomate, tabaco, semillas de orqudeas, callos, cambios en ratios auxinas/citoquininas, diferenciacin y organognesis. 1950: Solucin mineral de Hoagland. Auxinas (Went, 1926, 1937) y Citoquininas (1957), fundamentalmente).
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DEFINICION
Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de clulas o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.
Cultivo asptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.
Caracterticas
Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas (explantos) en un medio de cultivo apropiado El cultivo crece en condiciones de temperatura, humedad, fotoperodo e irradiancia controlados. Se realiza en condiciones de asepsia. Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geogrficas, climticas y de tiempo de produccin. Ocupa pequea superficie Necesidad de reestablecer el equilibrio del explanto (requerimientos exigentes)
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Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro
Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciacin / Rediferenciacin
- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

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Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales
La teora de la totipotencialidad celular, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la redifereciacin de las clulas previamente desdiferenciadas. Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.
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Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales
Micropropagacin vegetal Regeneracin de plantas (embriognesis y organognesis) Cultivo de meristemas Cultivo de suspensiones de clulas vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de vulos y embriones
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Qu se puede hacer con una tecnologa que multiplica plantas a una velocidad alta y exponencial, que permite obtenerlas a partir incluso de una sola clula, y que permite manipular incluso dicha clula?
Cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos
micropropagacin mejoramiento de plantas produccin de compuestos de inters comercial
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produccin de metabolitos secundarios produccin de protenas produccin de polmeros biodegradables establecimiento de plantas transgnicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metablicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composicin de protenas, aceites, etc. fitorremediacin remocin de xenobiticos Sandra Sharry 31 remocin de metales pesados
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Consideraciones tcnicas del cultivo de tejidos vegetales
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Cultivo de tejidos Factores comunes

Composicin general de medios de cultivo: Fuente de Carbono (azcares) Macronutrientes (N, K, etc) Micronutrientes (Fe, Cl, etc) Vitaminas Agente gelificante (para medios slidos) Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales) Otros compuestos (ej: agentes quelantes)
asepsia
ambientacin
cultivo
El CTV requiere una infraestructura mnima especializada y condiciones controladas de cultivo
1. Laboratorio
Area de preparacin de medios Area de lavado y esterilizacin Cuarto estril Cmara de cultivo Area de rusticacin
2. Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas (preacondicionamiento) - Explantos (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc.)
3. Condiciones de cultivo
Asepsia Recipientes Temperatura Luz y fotoperodo
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1. Laboratorio de CTV
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Plantas madre
A campo
Invernadero
In vitro
Tipo de explante
Explanto: porcin de tejido u rgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo.
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Asepsia-Esterilidad-Axenia
Los cultivos in vitro de tejidos vegetales se realizan en condiciones de asepsia o de esterilidad. Para cultivar in vitro tejidos vegetales deben eliminarse todas las fuentes de contaminacin. Asepsia indica que se han eliminado la mayora de los organismos vivos, Esterilidad indica ausencia total de todo organismo vivo. El trmino esterilidad en este caso indicar que se han eliminado todas las formas de vida excepto el material vegetal.
En algunos casos concretos tambin interesa que otros organismos convivan con el explanto (por ejemplo bacterias portadoras de determinados plsmidos durante un proceso de transformacin gentica). El material vegetal es esterilizado en superficie. Cualquier organismo que se encuentre en su interior, tales como las bacterias endgenas, permanecer y podr producir problemas de contaminacin posterior. 25/04/2013 Sandra Sharry 40 En general sin embargo se admite la utilizacin del trmino esterilizacin del material vegetal.
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NECESIDAD DE LA ESTERILIZACIN
Qu hay que esterilizar? Por qu hay que esterilizar?, y hay que esterilizar siempre?. Las causas por las que se puede contaminar un cultivo in vitro son: El recipiente con medio de cultivo El intrumental utilizado El material vegetal utilizado La inadecuacin del agente esterilizante La falta de contacto entre el agente esterilizante y el material vegetal El incorrecto funcionamiento de la cabina de flujo Las condiciones de las salas de incubacin La incorrecta manipulacin y control posterior
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Esquema de una cmara de flujo laminar horizontal
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Medio de cultivo
El cultivo de tejidos se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de diferentes componentes purificados o de soluciones orgnicas complejas
Es una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos.
Medios de cultivo: composicin general
Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina
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Reguladores del crecimiento Auxinas Citoquininas Giberelinas

Soporte inerte (medios semislidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite pH 5,6 5,8
Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 min en autoclave
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Propiedades fsicas de los medios de cultivo
Semislido Consistencia del medio Lquido El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad del gar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)
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El cultivo en medio lquido se utiliza cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las siguientes vas:
- Induccin de embriognesis - Cultivo de protoplastos Sandra Sharry - Cultivo de suspensiones celulares
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Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto White Ca(NO3)2 KNO3 NaNO3 NH4NO3 NH4H2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O KCl KH2PO4 NaH2PO4.H2O MnSO4.H2O MnSO4.4H2O KI H3BO3 ZnSO4.7H20 CuSO4 CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O 142 81 74 65 12 Schenk y Hildebrandt (SH) 2.500 300 400 200 10 1 5 1 0,2 0,1 Gamborg (B5 300 134 500 150 150 10 0,75 3 2 0,025 0,25 Heller 600 250 75 750 125 0,1 0,01 1 1 0,03 Murashige y Skoog 1.900 1.650 370 440 170 22,3 0,83 6,2 8,6 0,025 0,25
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Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Concentracin en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto
White CoCl2.6H2O AlCl3 NiCl2.6H2O FeCl3.6H2O FeSO4.7H2O Fe(SO4)3 Sequestrene 330 Fe Na2EDTA Mio-inositol Tiamina-HCl Acido nicotnico Piridoxina-HCl Extracto de Levadura Sacarosa 2,46 100 20.000 Schenk y Hildebrandt (SH) 0,1 15 20 1.000 5 5 0,5 30.000 Gamborg B5 0,025 28 100 10 1 1 20.000 5,5 Heller 0,03 0,03 1 Murashige y Skoog (MS) 0,025 27,86 37,26 100 0,4 30.000 5,8
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pH
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Reguladores del crecimiento comnmente usados en medios de cultivos vegetales

Clase Auxina Nombre Acido clorofenoxiactico Acido 2,4diclorofenoxiactico Acido indol 3-actico Acido 3-indolbutrico Acido 1-naftalenoactico Acido -naftoxiactico Citoquininas 6-bencilaminopurina N-isopentenilaminopurina 6-furfurilaminopurina (kinetina) Zeatina Abreviatura pCPA 2,4-D AIA IBA NAA NOA BAP 2iP K Zea Peso Molecular 186,6 221,0 175,2 203,2 186,2 202,2 225,2 203,3 215,2 219,2 Rango de concentracin (M) 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 10-7-10-5 Es termolbil, no debe ser autoclavada. Es comnmente necesario para la iniciacin o el mantenimiento de callos y cultivos en suspensin. Algunas veces necesario para la regeneracin de plntulas. Las citoquininas son normalmente disueltas en NaOH diludas o en etanol acuoso La zeatina es termolbil y no debera ser autoclavada Las auxinas son usualmente tituladas en solucin con NaOH El AIA puede ser oxidado por clulas vegetales. Es frecuentemente usado como nica fuente de auxinas en el medio de cultivo Preparacin de solucin stock Comentarios
Giberelina
Acido giberelico
GA3
364,4
10-7-5x10-6
Soluble en agua
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Reguladores del crecimiento
Grupos bsicos de reguladores del crecimiento: Auxinas Citoquininas Giberelinas Acido abscsico Etileno
Generalidades:
- Actan a bajas concentraciones

- Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta. Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de la planta y en cada uno de los rganos de sta.
- Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.
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Las auxinas se emplean como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis
O Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)
OH N
Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleoptile de gramneas. - Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventcias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
Su transporte es polar
Auxinas sintticas: - Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
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Las citoquininas determinan diferentes respuestas morfogenticas en combinacin con las auxinas
Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas: - Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citoquininas endgenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP)
Citoquininas sintticas:
- Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP) Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg. Su transporte es no polar.
Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes
O Acido giberlico (GA3) HO H CH3 C O H H COOH CH3 OH
Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberelinas diferentes. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormicin - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla
Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin.

Su transporte no es polar. Sandra Sharry 57
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Medio nutritivo
Auxinas Citocininas
Auxinas
Citocininas
Parte area
Enraizamiento
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Sandra Sharry
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algunos de los posibles cambios a los que se encuentran expuestos los explantes
Las plantas que se encuentran en el medio natural estn expuestas a los cambios fisiolgicos del ambiente, y en algunos casos tarda su desarrollo, Las plantas in vitro contienen un medio controlado en cuanto, a los cambios fisiolgicos en que se encuentran
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Cmo se hace?
1.
Eleccin y acondicionamiento del explante 2. Formulacin del medio de cultivo 3. Ajuste de condiciones ambientales 4. Observaciones
Eleccin del explanto inicial
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Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
Protocolo tipo de esterilizacin superficial de material vegetal:

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg. - Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diludas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante H2O estril (4 5 veces). - En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difcil de eliminar.
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Diseo del medio de cultivo

Los medios nutritivos para el cultivo de clulas y tejidos vegetales son, en general, menos complejos que los de cultivos microbianos y son formulados en forma ms o menos emprica. Si bien se desarrollan peridicamente nuevas frmulas comerciales, no existe hasta el presente un diseo racional que tenga en cuenta la composicin centesimal de la clula vegetal y el conjunto de condiciones que controlan el crecimiento y la diferenciacin. No obstante, normalmente se puede utilizar un medio sencillo y complementarlo con diferentes componentes y reguladores de crecimiento para llegar empricamente a la frmula que le brinde al tejido las mejores condiciones para su crecimiento y produccin (Krikorian, 1991).
Ajuste de las candiciones de cultivo

Las condiciones para el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales debe ser fundamentalmente estrictas, para que la planta pueda desarrollarse y crecer exitosamente, aprovechando la gama de nutrientes que se encuentran en el medio donde esta se estableci
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1 . ASEPSIA: QUE LOS MATERIALES CON QUE SE LLEVARA A CABO EL PROCEDIMIENTO ESTN EN PERFECTAS CONDICIONES ES DECIR ESTERILIZADOS Y LOS EXPLANTES SE ENCUENTREN TOTALMENTE DESINFESTADOS. 2. GENOTIPO: CADA ESPECIE RESPONDE DIFERENTE AL CULTIVO VEGETAL (HERBCEAS RESPONDEN MS Y MEJOR Y LEOSAS DIFCIL DE PROPAGAR). 3. EFECTO DE COMPOSICIN Y COMPETENCIA: COMO SE PONDR CADA PLANTA PARA EVITAR LA COMPETENCIA CON LAS DEMS Y PUEDA DESARROLLARSE DE UNA MANERA VIABLE, AL IGUAL QUE EL EFECTO DE LA MISMA. 4. EXPLANTE: VER EL TAMAO (YA SEA MEDIANO, GRANDE, PEQUEO) LA FUENTE (DE DONDE SE OBTENDR ES DECIR DE LA YEMAS, DEL TALLO RACES, FLORES, PTALOS, VULOS ETC.) Y POR SUPUESTO LA EDAD FISIOLGICA (REPRESENTA LA EDAD DE LA PLANTACIN ES DECIR LAS CLULAS RESPONDEN MEJOR QUE LAS CLULAS VIEJAS). PARA ESTO LAS PLANTAS LEOSAS SOLO SE DEBER TOMAR 1/3 DE LA SUPERFICIE, Y PARA SEMILLAS GRANDES SOLO SE DEBER CORTAR EL PURO EMBRIN. 5. MEDIO DE CULTIVO: CADA ESPECIE NECESITA UN MEDIO DE CULTIVO ESPECFICO PERO LA MAYORA CRECE BIEN EN EL M.S. 6. LUZ: CERCA DE 8,000 LUX (LMPARAS FLUORESCENTES 2,000 2,500 LUX) C.T.V 7. TEMPERATURA: 18 25 C NORMAL EN UN CULTIVO DE TEJIDO 8. POLARIDAD: SE PUEDE CONTROLAR, SE DEBE CONSERVAR LA POLARIDAD DE LA PLANTA MADRE. TEJIDOS ORGANIZADOS. 9. FASE GASEOSA: CUANDO SE CIERRA EL FRASCO SE INYECTA CO2PARA QUE HAYA MS FOTOSNTESIS, PERO ESTO ES MUY COMPLICADO. EN EL AIRE HAY 0.03% CO2. NO FLAMEAR LOS FRASCOS DEBIDO AL ETILENO YA QUE ESTO OCASIONARA QUE LA PLANTA ENVEJEZCA MS RPIDO. 10. HUMEDAD: HUMEDAD RELATIVA 100% EL AGUA EVAPORADA DEL FRASCO OBVIAMENTE SE QUEDARA EN EL FRASCO Y QUEDA CONDENSADA CERCA DEL 100%. 11. SUBCULTIVO: CON EL PASO DEL TIEMPO LOS EXPLANTES EN SUBCULTIVO PIERDEN EL PODER VEGETATIVO ES DECIR LA MULTIPLICACIN. EL MERISTEMO SOPORTA MS MULTIPLICACIONES 2 AOS MXIMO YA DESPUS DE ESTE TAMPOCO PODR AUMENTAR LA VARIACIN SOMACLONAL. 12. ESTACIN: VER LA ESTACIN EN QUE SE ENCUENTRAN LAS PLANTAS, LAS ESTACIONES DEL AO (INVIERNO) O ESTN EL LETARGO ES DECIR QUE NO CRECE PORQUE HAY DORMICIN DE SEMILLA, NORMALMENTE NO SE RECOMIENDA SEMBRAR PLANTAS EN ESTACIONES COMO EL INVIERNO. 25/04/2013 Sandra Sharry 66
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
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Contaminacin Oxidacin Vitrificacin Habituacin Necrosis Plantas fuera de tipo Falta de respuesta
Problemas
Obtencin de plantas completas

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis Directa e indirecta
TIPOS BSICOS DE CULTIVOS IN VITRO

Se pueden clasificar en grupos segn su mayor o menor organizacin semejante a la de los vegetales enteros cultivados habitualmente: 1 Cultivos organizados: cultivo de rganos o fragmentos Sera el cultivo de semillas, fragmentos de rganos o tejidos. Son ejemplos de uso habitual el cultivo de pices meristemticos (principalmente el pice de tallo), los cultivos nodales, los embriones cigticos, as como fragmentos radicales con o sin pice. 2 Cultivos desorganizados Pueden ser cultivos de una o varias clulas relacionadas, o incluso de diferentes orgnulos celulares. Son ejemplos de cultivos de este tipo desorganizado el cultivo de clulas indiferenciadas agregadas (conocido como callo), agregados celulares (clusters), clulas aisladas, microsporas, protoplastos, orgnulos celulares
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Tipos de Morfognesis in vitro

La regeneracin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tipos de morfognesis citadas. De Klerk et al. en 1997 denominaron a estas 3 diferentes fases como: 1. Fase de adquisicin de la competencia: En esta fase las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. 2. Fase de induccin: En esta fase las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar.

3. Fase de realizacin: En esta fase, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado.
Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro
Cultivo de callos
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.
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Existen dos posibles vas morfogenticas para la diferenciacin de novo de brotes o plantas completas
Posibles vas morfogenticas: - Organognesis - Embriognesis Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de clulas del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas. - La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explanto se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.
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A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa sin la formacin de callo. Si la formacin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares La diferenciacin de rganos a partir de callos o morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. La denominacin de morfognesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en 1980.
Fotomicrografas de las dos vas morfogenticas

Organognesis
d pf pf
Embriognesis
av
cv
ar
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Sistemas de propagacin vegetativa in vitro
Propagacin vegetativa in vitro . Puede ser por regeneracin directa e indirecta
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Se pueden desarrollar plantines completos a partir de diferentes explantos mediante morfognesis directa
Morfognesis directa
Micropropagacin masiva
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La morfognesis indirecta permite regenerar plantas a partir de callos formados por clulas desdiferenciadas
Morfognesis indirecta
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Propagacin vegetativa por embriognesis somtica
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Procedimiento para la regeneracin va embriognesis somtica

1. Iniciacin: callos embriognicos 2. Proliferacin: callos embriognicos, masas proembriognicas (PEM) 3. Desarrollo y maduracin de embriones : embriones 4. Germinacin de embriones (Regeneracin)
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Estadios de desarrollo en dicotiledneas: Masas proembriognicas Estadio globular Corazn Torpedo 84 Cotiledonar
El callo embriognico suele distinguirse visualmente del callo en crecimiento
Callo embriognico de caa de azcar en regeneracin
Inicio de la regeneracin
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Embriognesis somtica a partir de callo de Daucus carota
Clulas de callo proembriognicas
4 clulas proembriognicas a estadio globular temprano
Estadio globular y de corazn
Embriognesis somtica en cebada

a b c
a) callo embriognico b) divisin periclinal c) origen del sitio de formacin d, e, f) embrin somtico g) plntula h) radcula i) embrin somtico con dos hojuelas
Embriognesis repetitiva
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Fases de la Embriognesis somtica
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Pinus sylvestris
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La embriognesis indirecta puede utilizarse para generar plantas transgnicas
Callos en crecimiento de caa de azcar en medio selectivo
Agrobiotecnologa
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Organognesis directa e indirecta
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Los TMB mantuvieron la capacidad para formar brotes por largos perodos de tiempo (4 aos) slo subcultivndolos a un medio fresco MY (BAP y Adenina) cada 30-45 das
Indirecta
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Organogpenesis DIRECTA
Proliferacin de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleracin in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas. - La tasa de multiplicacin (tm) se calcula en base al nmero de brotes o vstagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestin, entre otras variables. - Por ejemplo, con una tm de 5/mes podran obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao a partir de una nica yema inicial.
- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta tcnica.

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La propagacin puede iniciarse a partir de la extraccin de yemas de la planta madre
Propagacin a partir de yemas apicales y/o axilares ( I )
Adaptado de: Edwin George. Plant Propagation by Tissue Culture,1996.
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Directa a partir de hojas
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Etapas del cultivo in vitro de yemas apicales y laterales
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Vas de regeneracin de plantas por CTV
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CALLOS MIXTOS
Los cuatro factores principales que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos en condiciones in vitro son:
1. 2. 3. 4. El genotipo Las condiciones qumicas seleccionadas para realizar el cultivo Las condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo El explante
Factores que afectan los procesos morfognicos
El Genotipo
El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro as como tambin para la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologas o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser especficos para cada situacin en particular. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones zigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar Pinot Noir.
Condiciones Qumicas
Varios son los compuestos qumicos que influyen en los patrones morfognicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar:
1. La composicin Salina del medio de cultivo: 2. Reguladores del crecimiento 3. Antibiticos 4. Carbn activado 5. Agar 6. Atmsfera gaseosa
Condiciones Fsicas
Entre las condiciones fsicas podemos mencionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz.
1. La Temperatura: Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta esperada. 2. La Humedad Relativa: depender del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. 3. La Luz: La respuesta morfognica de un explante puede variar segn se le proporcione luz o no. Para estimular la formacin de callo es comn que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos.
CULTIVO DE CLULAS
Cultivos celulares
Propagacin de clulas fuera del organismo de origen Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro de stas, pueden provenir de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las clulas de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto que se produzcan mutaciones durante el proceso
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Para qu cultivar clulas in vitro ?

Investigacin
Comprender la fisiologa celular Toxicologa, virologa, etc.
Ingeniera de tejidos
Piel, hgado Hueso y cartlago
Produccin de biolgicos

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Anticuerpos monoclonales Hormonas (FSH) Enzimas Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)
Ventajas
Un solo tipo bien definido de clulas en cada cultivo Fcil de manipular, condiciones controladas Establecimiento de lneas internacionales de fcil acceso Alternativa al uso de animales
Sistema para estudiar principios fisiolgicos Chequeo posterior en un nmero reducido de animales
Pueden obtenerse grandes cantidades de clulas Permite trabajar en pequea, media y gran escala Las clulas pueden mantenerse congeladas por largos perodos de tiempo con mnima prdida de viabilidad
Sin embargo...
Cuidado que no son animales enteros
Las clulas no estn organizados en verdaderos tejidos No hay interrelacin con otros tejidos El comportamiento es distinto a la organizacin tridimensional
El entorno es distinto Las condiciones de crecimiento son distintas Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas
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Tipos de cultivo
Cultivo primario: clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un animal. Cultivo de rganos, explantes: mantenimiento de rganos o parte de rganos in vitro. Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de clulas: mantenimiento de clulas dispersas. Lneas celulares: clulas mantenidas por subcultivos sucesivos comenzando por un cultivo primario. Cultivos continuos: clulas que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida infinita.
Lneas celulares continuas: algunos ejemplos

BHK: Fibroblastos de rin de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de rin de gato domstico MDCK: Epitelio de rin canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de rin de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de rin de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazn fetal bovino Etc., etc., etc.
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Soporte
Lquido: Clulas en suspensin
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Soporte
Slido: Clulas adheridas a vidrio o distintos tipos de materiales sintticos. POLICUBETAS
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Soporte
Titulacin de virus en policubetas con coloracin final
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FRASCOS ESTTICOS
BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)
Soporte
Superficies cubiertas con sustancias que favorecen el crecimiento celular
CLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DAS SOBRE SOPORTE PLSTICO DESNUDO
CLULAS FBHE CRECIDAS DURANTE 5 DAS SOBRE SOPORTE PLSTICO CON COBERTURA DE COLGENO I
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MICROCARRIERS
El uso de cultivos celulares para producir metabolitos podra atenuar la presin sobre los bosques naturales
Cultivos de clulas en suspensin

Agregado celular de Erythrina
- Crioalmacenamiento de germoplasma - Sistemas de aislamiento de lneas mutantes - Seleccin de fenotipos resistentes a estrs - Transformacin gentica - Produccin a gran escala de embriones somticos
Obtencin de metabolitos secundarios Se ha logrado un xito considerable en la produccin de taxol in vitro (extrado de Taxus brevifolia).
Taxus brevifolia
- Existen muchas otras sustancias de inters.
Aplicaciones del CTV
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Micropropagacin vegetal
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La micropropagacin constituye la principal aplicacin comercial del cultivo de tejidos vegetales
La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperodo.
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Etapas de la micropropagacin vegetal
Iniciacin
- Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre - Eleccin del explanto inicial y de la formulacin del medio de cultivo - Desinfeccin superficial de los explantos - Establecimiento del cultivo in vitro
Multiplicacin
- Multiplicacin del material stock
Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro
Rusticacin
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo
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El proceso de micropropagacin de especies vegetales consta de varias etapas
Etapa 0
Eleccin de una planta madre selecta Explantos
ETAPA 1
Desinfeccin superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicacin

ETAPA 2
Formacin de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernculo 137
ETAPA 3
ETAPA 4
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Ventajas de la micropropagacin vegetal
Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin
Mayor control sobre la sanidad del material propagado

Introduccin rpida de nuevos cultivares
Conservacin de germoplasma
Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

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La multiplicacin de microinjertos y microestacas representa una miniaturizacin de las tcnicas convencionales
Microinjertos: consiste en el injerto de pices caulinares en pies (plntulas) bajo condiciones in vitro. Se utiliza para regenerar especies recalcitrantes.
Subdivisin de microestacas
Microestacas: son pequeos esquejes que se multiplican in vitro. Aumentan las posibilidades de enraizamiento y reducen el tiempo de Sandra obtencin de plntulas por juvenilizacin. 25/04/2013 Sharry 139
La propagacin a gran escala puede efectuarse en biorreactores
Propagacin de plantines de Ananas comosus temporaria en biorreactores
mediante inmersin
Gentilezade: Centro de Bioplantas. Ciego de Avila, Cuba
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La inmersin temporaria sirve como alternativa durante la Etapa II para incrementar la calidad y bajar los costos
Biorreactores RITA de inmersin temporaria
Plantines de caa de azcar creciendo en biorreactores 25/04/2013 Sandra Sharry 141
Existen diversos modelos de biorreactores para la propagacin masiva

Propagacin de eucaliptus en sistemas de inmersin temporaria
Multiplicacin de plntulas de arroz en biorreactores RITA

Ariel D. Arencibia, Aydiloide Bernal, Leidy Cortegaza, Rolando Garcia, Odalis Nodarse and Ignacio Santana, 2011. Regulating Gene Expression in High-scale Plants Micropropagation. Journal of Plant Sciences, 6: 213-224.
25/04/2013
Sandra Sharry
Signaling mechanisms have been elicitated towards the priming and biopriming stages during micropropagation in Temporary Immersion Bioreactors (TIBs) in sugarcane as model plant. CO2-rich TIBs induces a photomixotrophic condition adequate for the production of natural phenolic metabolites, altogether increasing multiplication rates and functional plants rooting. When combined withGluconacetobacter diazotrophicus inoculations during transplanting, originate a significant improvement of the percentage of plant adaptability to natural conditions. A more efficient micropropagation process has been optimized on the basis of an accurate exploitation of the natural 143 plant physiology.
Embriognesis: obtencin de semillas artificiales

Semillas sintticas de orqudea obtenidas por encapsulacin en alginato
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Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemas
Agrobiotecnologa
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Sandra Sharry
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Los meristemas son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos
Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies

vegetales.
Agrobiotecnologa
Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.
Sandra Sharry 146
25/04/2013
Las plantas poseen diferentes tipos de meristemas
Meristemas apicales
- Estn localizados en la porcin terminal o distal del vstago y de la raz. - Sus divisiones dan lugar a las clulas de los tejidos pimarios del tallo y la raz. - Son organognicos. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races.
Meristemas secundarios
- Determinan el crecimiento radial de los rganos vegetales. - Dan lugar a los tejidos de conduccin.
Meristemas florales
- Derivan de la transformacin de meristemas apicales. - Se limitan a la produccin de rganos florales.
Agrobiotecnologa
Meristemas intercalares
- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemas apicales intercalados en los tejidos maduros. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races Sandra Sharry 147
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El cultivo de meristemas facilita la eliminacin de patgenos
- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin).
- El nmero de partculas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos.
- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.
Agrobiotecnologa
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
25/04/2013
Sandra Sharry
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El empleo de meristemas como explantos es una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas
Cultivo de meristemas
Meristema apical
Meristema axilar
Agrobiotecnologa
Domo meristemtico
25/04/2013
Sandra Sharry
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Consideraciones prcticas sobre el cultivo de meristemas
La eficiencia del cultivo de meristemas como procedimiento para la obtencin de plantas sanas depender del tamao del explanto. Existe una situacin de compromiso entre el tamao mnimo posible del meristema y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. Ejemplos prcticos:
- Pisum sativum / Pea mosaic virus (PMV) Explantos de 0,3-0,4 mm; 80% de plantas sanas. - Solanum tuberosum / Potato virus X: Explantos de 0,1 mm (o menores); 10% de plantas sanas. Si el explanto incluye 2 pares de primordios el porcentaje de plantas sanas es menor. - Solanum tuberosum / Potato virus Y: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantos de no ms de 2 pares de primordios foliares.
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Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de protoplastos
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
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Los protoplastos son clulas vegetales desprovistas de pared
Adecuados para manipulaciones genticas que no son posibles con clulas intactas ni plantas. Constituyen herramientas experimentales nicas para investigaciones fisiolgicas, biofsicas y bioqumicas. Antecedentes:
- Primer aislamiento mecnico: protoplastos de cebolla (Klercker, 1892). - Primer aislamiento enzimtico: clulas de levadura, utilizando jugo gstrico de caracol (Giaja, 1919). - Uso de compuestos degradativos de pared celular para el aislamiento de protoplastos de plantas superiores (Cocking, 1960). Preparacin de celulasa cruda del hongo Myrothecium varrucaria para el aislamiento de protoplastos de races de tomate.
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Procedimiento para el aislamiento y cultivo de protoplastos
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
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Cultivo in vitro de clulas haploides y embriones
Agrobiotecnologa
Aplicaciones del cultivo de tejidos
25/04/2013
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Aplicaciones del cultivo in vitro de clulas haploides
Mejoramiento vegetal.
Estudios de gentica cuantitativa. Estudios de diferenciacin celular y alternancia de generaciones.
Agrobiotecnologa
Ttradas de microsporas Sacos polnicos (con granos de polen)
25/04/2013
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Cultivo in vitro de anteras
Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en medios sintticos que promueven la divisin celular y la formacin de embriones o callos. Los embriones, transferidos a un medio de regeneracin, darn lugar a plantas haploides.
anteras
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
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El cultivo de anteras ofrece numerosas ventajas para el mejoramiento de plantas de inters comercial
- Permite la expresin e identificacin de alelos recesivos

- Constituye una fuente til para el mejoramiento intravarietal - Permite la rpida introduccin de caracteres citoplasmticos en un fondo gentico homocigtico - Crea y acrecienta las reservas citogenticas y citoplasmticas de los cultivos - La obtencin de haploides duplicados resulta til para el desarrollo de nuevas variedades con el fin de distribuirlas en ambientes ecolgicos muy diversos y para ensayarlas en ellos. - Las microsporas o clulas haploides pueden usarse para la induccin de mutantes y para la seleccin de caracteres esporofticos.
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Agrobiotecnologa
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Cultivo de polen
Consiste en un cultivo aislado de las microsporas, previa diseccin de las anteras y descarte de los tejidos somticos y estriles del estambre.
Agrobiotecnologa
Granos de polen observados al microscopio electrnico de barrido
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Sandra Sharry
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Rescate de embriones
Embriones de Picea sp
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una herramienta til para superar las dificultades en la obtencin de hbridos (v.g., aborto del embrin y produccin escasa de semillas), cuando se incorporan especies silvestres a los programas de mejoramiento gentico. Muy usado para obtencin de las vitroplantas, acelerando de sta Sandra Sharry 159 forma su crecimiento.
Tomado de: www.nrcan.gc.ca;
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El cultivo de embriones inmaduros permite realizar diferentes aplicaciones
Estudio de requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo. Rescate de embriones hbridos derivados de cruzamientos interespecficos e intergenricos. Producin de monoploides. Superacin de la latencia de las semillas.
Embrin cigtico
Agrobiotecnologa
Corte longitudinal de una semilla de Brassica
25/04/2013
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Aplicaciones del cultivo de vulos
Rescate de embriones (mediante polinizacin y fertilizacin in vitro)

Induccin de la embriognesis somtica a partir de nucelos de diferentes especies vegetales.
es
Agrobiotecnologa
Embriones somticos (es) obtenidos a partir del cultivo de vulos de Arabidopsis. 25/04/2013 Sandra Sharry 161
El uso de seleccin in vitro y variacin somaclonal
Seleccin in vitro resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas y tolerancia a estreses ambientales. Los resultados del mejoramiento mediante Variacin somaclonal son difciles de preveer. Se han obtenido rboles tolerantes a metales pesados y a bajas temperaturas.
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El uso de cultivos celulares para producir metabolitos podra atenuar la presin sobre los bosques naturales
Cultivos de clulas en suspensin

Agregado celular de Erythrina
- Crioalmacenamiento de germoplasma - Sistemas de aislamiento de lneas mutantes - Seleccin de fenotipos resistentes a estrs - Transformacin gentica - Produccin a gran escala de embriones somticos
Obtencin de metabolitos secundarios Se ha logrado un xito considerable en la produccin de taxol in vitro (extrado de Taxus brevifolia).
Taxus brevifolia
- Existen muchas otras sustancias de inters.

Variacin somaclonal
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
164
La variacin somaclonal puede explicar la variacin fenotpica de las plantas regeneradas in vitro
Entre otras causas: Modificaciones genticas heredables por las progenies de las plantas obtenidas mediante cultivo in vitro Prevalencia del cariotipo especfico de plantas y tejidos quimricos y de mosaicos Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientos de cultivo (composicin del medio, etc.)
Agrobiotecnologa
Aneuploides no separables en el cultivo
25/04/2013
Sandra Sharry
165
Otra posibles causas de la variabilidad de las plntulas regeneradas
Cese mittico que lleva a lneas poliploides Mutaciones del cariotipo Amplificacin o disminucin de genes Reordenamiento de mutaciones en genomas de organelas Transposones Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosmicos
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
166
Caractersticas de la variacin somaclonal

Indeseable en la micropropagacin de plantas de inters comercial (diversidad genotpica)
Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material gentico (variabilidad)
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
167
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
168
25/04/2013
Sandra Sharry
169
Las tcnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales costituyen parte esencial de una estrategia general para la conservacin e intercambio de recursos fitogenticos.
Agrobiotecnologa
Gentillieza W. Roca
25/04/2013
Sandra Sharry
170
Existen diferentes mtodos para la conservacin de germoplasma
Colecciones in vitro Bancos de semillas Crioconservacin
Agrobiotecnologa
www.cgiar.org
25/04/2013
Sandra Sharry
171
Bancos de germoplasma in vitro
La conservacin de germoplasma mediante el cultivo de tejidos se basa en la limitacin del crecimiento del material vegetal. Implementacin:
- Medios de cultivo de composicin subptima
- Baja intensidad lumnica (<500 lux) - Temperaturas inferiores a las adecuadas para el activo metabolismo de las clulas y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 C)
Agrobiotecnologa
- Alta concentracin de compuestos osmticamente activos (sacarosa, manitol)

Sandra Sharry 172
25/04/2013
Los bancos de semilla permiten la conservacin de especies vegetales que se propagan sexualmente
Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo perodo de almacenamiento.
El material debe mantenerse bajo condiciones controladas en una cmara de mantenimiento:

- Bajas temperaturas - Bajo contenido de humedad
Este mtodo no puede aplicarse a la conservacin de plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especies de propagacin vegetativa obligada
Agrobiotecnologa
25/04/2013
Sandra Sharry
173
Crioconservacin de germoplasma
Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 C), por inmersin en nitrgeno lquido
Diferentes explantos (pices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) as como callos y suspensiones celulares pueden ser crioconservados a -196 C.
Agrobiotecnologa
www.science.siu.edu
25/04/2013
Sandra Sharry
174
Etapas del proceso de crioconservacin de material vegetal
Crioproteccin
Congelamiento Almacenamiento Descongelamiento Pruebas de viabilidad
Agrobiotecnologa
Recultivo
Sandra Sharry 175
25/04/2013
Aspectos prcticos de la crioconservacin
Crioproteccin:
Consiste en la preparacin del material a preservar utilizando compuestos crioprotectores tales como glicerol (5%-20%) y DMSO (5%-15%).
Congelamiento:
- Congelamiento rpido
- Congelamiento lento
Agrobiotecnologa
- Congelamiento escalonado
25/04/2013
Sandra Sharry
176
La crioconservacin permite almacenar tejidos u rganos vegetales a largo plazo
Almacenamiento
- Mantenimiento del material vegetal a -196 C, minimizando toda actividad metablica y preservando la estabilidad genotpica de las muestras
Descongelamiento Pruebas de viabilidad

- Regeneracin de plantas a partir de meristemas o yemas criopreservadas - Coloracin con diacetato de fluorescena (FDA) - Viabilidad de clulas y protoplastos. Mtodo del cloruro de 2,3,5-trifeni tetrazolio (TTC) - Viabilidad de suspensiones celulares o de protoplastos.
Agrobiotecnologa
Recultivo
- Cultivo bajo condiciones controladas del material descongelado.
Sandra Sharry 177
25/04/2013
El congelamiento de las muestras constituye el paso crtico de esta tcnica de conservacin
Congelamiento rpido: - El material vegetal se coloca directamente en el nitr geno lquido. - La v elocidad de disminucin de la temperatura es de hasta 1000 C/min. - Es im prescindible usar sustancias crioprotectoras . - Se emplean p equeos volmenes de material vegetal con reducido contenido de agua. Congelamiento lento: - El congelamiento es gradual . - La disminucin de la temperatura es de 0,1 a 3 C. - Una vez alcanzados los -40 C (punto en el que la mayor parte del agua de la muestra ha sido congelada extracelularmente ), se dispone el material directamente en el nitrgeno l quido. Congelamiento escalonado:
Agrobiotecnologa
- El material vegetal se somete sucesivamente a varias temperaturas por debajo de 0 oC y se mantiene por determinado tiempo en cada una de las mismas . - Finalmente , se sumerge en nitrgeno lquido.
Sandra Sharry 178
25/04/2013
Crioconservacin y cultivo de meristemas de soja
25/04/2013
Sandra Sharry
179
25/04/2013
Sandra Sharry
180

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Qu es la Biotecnologa?

BIOLOGA + TECNOLOGA = BIOTECNOLOGA

BIOS quiere decir vida, y BIOLOGA es el

estudio de los seres vivos.

a las herramientas o tcnicas que se usan para fabricar o producir algo.

No es una ciencia en si misma, es un rea intensiva de conocimiento

La Biotecnologa es multidisciplinaria, interdisciplinaria y transdisciplinaria.

LA BIOTECNOLOGA TIENE UNA LARGA HISTORIA

Biotecnologa actual o moderna

BIOTECNOLOGA (ADN recombinante)

La Biotecnologa puede aplicarse a todo tipo de Organismo Vivo

Ncleo Ubicacin del ADN Organelas

Datos sobre el Genoma Humano

Ratn 30.000 genes

Dos caractersticas Importantes del ADN

TRES letras en lenguaje DNA se traducen a UNA letra en lenguaje protena

MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRL AHPPFASWRNSEEARTREQWIMNCCPP TLTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEA VPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGY

LOS CAMPOS DE APLICACIN DE

Biotecnologa Vegetal Biotecnologa Humana Biotecnologa Industrial

Cultivo de tejidos Clones

Biologa Molecular Huellas digitales

Tecnologa de ADN recombinante Planta transgnicas

Cultivo de tejidos vegetales

Dra. Sandra Sharry CEPROVE, FCAyF, UNLP [email protected] [email protected]

Referencias Sandra Sharry

Fundamentos del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Cultivo de tejidos vegetales

Cultivo asptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.

Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro

- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales

Cultivo de tejidos vegetales

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Cultivo de tejidos vegetales

Consideraciones tcnicas del cultivo de tejidos vegetales

Cultivo de tejidos vegetales

Cultivo de tejidos Factores comunes

El CTV requiere una infraestructura mnima especializada y condiciones controladas de cultivo

Cultivo de tejidos vegetales

Esquema de una cmara de flujo laminar horizontal

Medios de cultivo: composicin general

Reguladores del crecimiento Auxinas Citoquininas Giberelinas

Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 min en autoclave

Propiedades fsicas de los medios de cultivo

Cultivo de tejidos vegetales 25/04/2013

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Reguladores del crecimiento comnmente usados en medios de cultivos vegetales

Reguladores del crecimiento

- Actan a bajas concentraciones

Cultivo de tejidos vegetales

Las auxinas se emplean como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis

O Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)

Cultivo de tejidos vegetales

Las giberelinas favorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes

O Acido giberlico (GA3) HO H CH3 C O H H COOH CH3 OH

Cultivo de tejidos vegetales

Se sintetizan en hojas jvenes, en yemas y en el embrin.

Eleccin del explanto inicial

Protocolo tipo de esterilizacin superficial de material vegetal: