Fsico-Qumica de Biomolculas Lic.

en Biotecnologa
1
Prctica 1
CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE BARRIDO


1. Objetivo

Simular un diagrama de calorimetra diferencial de barrido (DSC) del
plegamiento/desplegamiento de una proteina y, por otra parte, extraer de un diagrama
experimental la entalpa del proceso de desplegamiento.
La prctica consta de varios pasos:

- Utilizacin de un modelo muy simplificado que da lugar a un diagrama de DSC
- Perfeccionamiento del modelo inicial que da lugar a un diagrama de DSC ms realista.
- Independientemente de cualquier consideracin de modelo, obtener H y T
1/2
de la
transicin del estado nativo de la proteina al estado desnaturalizado.
- Como alternativa al paso 3, se ajustan los parmetros del modelo 2 al espectro
experimental, obteniendose los valores de H y T
1/2.


La utilizacin de modelos permite entender a qu se deben los diferentes rasgos
(features) que se observan en el diagrama.

Figura 1: Principio de la DSC. Una muestra (S) y
una referencia (R) se calientan de manera
controlada por los sensores de temperatura.


Figura 2: Ejemplo de termograma DSC. Muestra del
pptido ubiquitina 5 g/l en bfer de glicina-HCl a pH 2.45.
Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
2

2. Fundamento

La calorimetra diferencial de barrido (DSC) consiste en calentar una muestra (S en la
Figura 1) as como un compuesto de referencia (R) de tal manera que la temperatura es en
todo momento igual en R y en S. Esto se consigue midiendo las temperaturas con sensores y
ajustando las potencias de calentamiento. Se aplican velocidades de calentamiento (en
grados/s) uniformes a la muestra y a la referencia para realizar el barrido de temperaturas. La
representacin de la potencia de calentamiento frente a la temperatura es lo que se denomina
diagrama DSC o, dado que se realiza frente a la temperatura, termograma. Un ejemplo de
termograma se encuentra en la Figura 2. La DSC detecta transiciones que implican
intercambio de energa, sea almacenamiento de calor (procesos endotrmicos) o liberacin de
calor (procesos exotrmicos). Ejemplos de estos procesos son las transiciones de fase (slido-
slido o slido-lquido por ejemplo), procesos de cristalizacin, oxidaciones irreversibles,
deshidrataciones, etc Esta tcnica tambin resulta muy adecuada para comprobar la pureza
de un material, examinando la forma y la anchura del pico obtenido.

Para muestras biolgicas, esta tcnica est considerada hoy en da como la ms
adecuada para estudiar la energtica de las transiciones plegamiento-desplegamiento de las
proteinas. Permite la caracterizacin termodinmica de los cambios conformacionales
inducidos por cambios de temperatura en proteinas, cidos nuclicos y biomembranas.
Un aspecto fundamental para la modelizacin que efectuaremos en esta prctica es que
supondremos que el sistema se encuentra en todo momento en equilibrio termodinmico, lo
que correspondera a una velocidad de barrido infinitamente lenta. Consideremos una protena
que puede estar en uno de dos estados: Nativo (N) y Desnaturalizado (U). Estos estados estn
en equilibrio. Sea la fraccin molar de proteina desnaturalizada.
N U
(1-)C C

La constante de equilibrio de esta reaccin es:
[ ]
[ ] N
U
K = (1)

=
1 ) 1 ( C
C
K (2)
La Ecuacin (2) puede escribirse para expresar en funcin de K:
K
K
+
=
1
(3)

Dado que medimos el calor que se le proporciona a la muestra comparandolo con una
muestra de referencia que no contiene la protena, el primer principio de la termodinmica
dicta que:
} } }
+ + = = dT C CV dT C CV H CV dT C CV H Q
p pU pN R 0
) 1 ( (4)
En esta ecuacin, Q es la cantidad de calor que se le proporciona a la muestra, H
R
es
la variacin de entalpa del sistema, C la concentracin de la protena, V el volumen de la
muestra, H la entalpa molar para pasar de la protena nativa a la desnaturalizada a una
temperatura de referencia T
m
(luego veremos qu valor de T
m
es oportuno elegir), C
pN
, C
pU
y
C
p0
seran la capacidad calorfica de la protena nativa, desnaturalizada, y de una cantidad de
agua que ocupe el mismo volumen que la proteina. Las integrales se realizan entre T
m
y T.

Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
3
Puesto que el nmero de moles de protenas es
CV n = , (5)
la Ec. 4 puede escribirse como:
( ) ( )
} }
+ + = dT C C dT C C H n Q
p pN pN pU
) ( ) (
0
, (6)
donde ( )
}
+ dT C C H
pN pU
) ( es una entalpa molar corregida por la temperatura, que se
conoce como relacin de Kirchoff:
}
+ =
T
Tm
p m
dT T C T H T H ' ) ' ( ) ( ) ( (7)
donde C
p
(T)= C
pU
(T)- C
pN
(T).

Se supone que C
pN
y C
p0
no varan mucho con la temperatura por lo que se pueden
sacar de la integral.

( )n T C C T H Q
p pN
+ = ) ( ) (
0
(8)
T es la diferencia (T-T
m
).
Ahora derivamos la ec. (4) con respecto al tiempo:

n
dt
dT
C C
dt
H d
dt
dQ
p pN
|
.
|

\
|
+

= ) (
) (
0

(9)
Sabiendo que

dt
dT
dT
H d
dt
H d ) ( ) (
=

,
Podemos sacar factor comn de dT/dt en la ec. (9).
Para entender la ec. 9, recordemos que dT/dt= es la velocidad constante a la que se efecta el
calentamiento en K/s y dQ/dt=P(T) es la potencia que suministra el calormetro.
En consecuencia, la ec. (9) se transforma en:
0
) ( ) (
p pN
C C
dT
H d
n
T P
+

(10)

El diagrama consta de un cero al que se llamara base (y de unas desviaciones del
cero (picos).
0
) (
p pN
base
C C
n
T P
=

(11)
dT
H d
n
T P
xs
) ( ) (
=

(12)
Los trminos a la derecha de la igualdad en la ec. 12 son formalmente capacidades
calorficas. El trmino de la izquierda corresponde entonces a una capacidad calorfica
aparente de exceso C
p,xs

dT
H d
T C
xs p
) (
) (
,

=

(13)
La Ec. 12 expresa que la parte que resulta de inters en el diagrama, las desviaciones
de la base, es proporcional a la capacidad calorfica de exceso de la protena. Nuestro
cometido es, por tanto, obtener una representacin de C
p,xs
(T).

Para conocer K, que se necesita en la ec. (3), se utiliza la relacin de vant Hoff:
Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
4
2
) (ln
RT
H
dT
K d
= (14)

A continuacin vamos a suponer que C
pU
=C
pN
de modo que H(T) es independiente
de la temperatura= H.
Ec. (14) puede integrarse:
} }

=
2
1
2
2
1
) (ln dT
RT
H
K d
|
|
.
|

\
|

=
2 1 1
2
1 1
) (
) (
ln
T T R
H
T K
T K

|
|
.
|

\
|

=
2 1
1 1
1 2
) ( ) (
T T R
H
e T K T K (15)
Por definicin, la temperatura T
1/2
es aquella para la que =0.5 (es decir K(T
1/2
)=1, ec.
(2)). Usaremos esta temperatura como referencia en la ec. (14) y T
2
=T. Nota, T
1/2
es
normalmente identico a T
m
, el mximo de la capacidad calorfica de exceso en el diagrama de
DSC. Ec (14) se simplifica:
|
|
.
|

\
|

=
T T R
H
m
e T K
1 1
) ( (16)

Volvamos a la ec. (12). En el caso de este primer modelo, se reduce a:
dT
d
H
dT
H d
T C
xs p
) (
) (
) (
,

=
(17)
Las derivadas se obtienen de forma numrica:
T
T T T T
T T T T
T T T T
dT
d

2
) ( ) (
) ( ) (
) ( ) (
+
=
+
+
=
(18)
Sustitucin de (17) en (16):

H
T
T T T T
T C
xs p

(

+
=

2
) ( ) (
) (
,
(19)

3. Procedimiento prctico

Primero se crea una carpeta de trabajo en el Escritorio en la que se guardarn todos los
ficheros.

1)
En una hoja de clculo de Excel, se dedican unas celdas a los datos de entrada. Introducir los
datos en las unidades indicadas:
H /kJmol
-1
, T
1/2
/K, T /K, y a la constante R=0.008314 kJ/mol.
Para todos los casos se usar
T=10
-6
K

Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
5
En la hoja de clculo, por debajo de las celdas de datos, se usarn las columnas A-H para los
datos siguientes:

A B C D E F G H
Temperaturas
T /K
T+T T-T K(T+T) K(T-T) (T+T) (T-T) C
p,xs

273
274

373

La columna de las temperaturas es una columna de datos que hay que generar: se quieren
calcular las temperaturas de 273 a 373 K cada Kelvin. Las columnas D y E se obtienen con la
ec. (16); las columnas F y G a partir de la ec. (3); la columna H finalmente a partir de la ec.
(19).

a) Caso 1: T
1/2
=300 K, H=200 kJ/mol
Obtener los valores de C
p,xs
, copiarlos en una columna distinta. Sugerencia: se puede usar
copiar y pegado especial convirtiendo las frmulas a Valores. De esta manera, los datos no
se actualizarn si se modifica el contenido de la celda que contiene H.
b) Caso 2: T
1/2
=300 K, H=100 kJ/mol

Representar los datos en una grfica XY de dispersin en una Hoja aparte. Elegir una escala
adecuada (250-400 K). Comparar los diagramas entre s. Compararlos tambin con el
diagrama DSC de la ubiquitina (Figura 2).

2) Obtencin de H y T
m
de un registro de DSC experimental
T
m
es la temperatura a la que la capacidad calorfica de exceso es mxima. H se obtiene por
integracin por trapecios del pico asumiendo que la lnea base es una recta.

Abrir una nueva hoja que llamaremos Hoja 3.
Conectarse a la pgina web de la asignatura
(http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/quimbiotec_FQbiomol.html).
Junto a la prctica de la DSC, se encuentra un fichero de datos DSCexp.dat. Descargar este
fichero y guardarlo en la carpeta de trabajo. Abrir este fichero con Excel. Copiar los datos a
columnas seleccionadas de la Hoja 3. Representar los datos en una grfica XY de dispersin
en una Hoja nueva que llamaremos Grfico 3. Seleccionar a ojo dos puntos de la curva por los
que pasar tambin la lnea base (un punto de principio (X0,Y0) y uno de fin del pico
(X1,Y1)). En una columna obtener para cada temperatura la ordenada de la lnea base.
Integrar el pico entre X0 e X1 segn el mtodo de los trapecios para obtener H.


Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
6
3) Obtencin de H y T
m
de un registro de DSC experimental ajustandolo al Modelo 1
En este caso vamos a determinar los parmetros de tal manera que el Modelo 1 se ajuste lo
mejor posible a los datos experimentales. Estos datos comportan dos columnas, las
temperaturas en K y las capacidades calorficas de exceso en kJ/mol.
Copiar la Hoja 1 a una nueva Hoja de clculo que llamaremos Hoja 4. Ahora, H y T
m
no se
considerarn datos sino estimaciones iniciales y dejaremos que Excel los modifique durante el
ajuste. Del fichero de datos copiado de la pgina web y que se trata de ajustar, copiar la
columna de temperaturas a la columna A (de manera que el Modelo proporcione los datos de
C
p,xs
a los intervalos en los que se dispone tambin de datos experimentales). En otra
columna, copiamos los C
p,xs
experimentales. Construiriamos entonces la funcin de la suma
de los cuadrados de la diferencia entre C
p,xs
experimental y calculado:

=
2
, exp ,
) (
xscalc p xs p
C C R
No obstante, el Modelo 1 presenta ciertas deficiencias, as que optamos por dotarlo de una
linea base ajustable de forma que la nueva funcin calculada queda como:

+ + = ) arctan( 1
, ,
d
T T
c C C
m
xscalc p o xscalcnuev p

Con la herramienta solver de Excel (comprobar que su versin de Excel haya sido instalada
con este mdulo), se minimiza esta funcin utilizando las casillas H, T
m
, c y d. Es
importante que las estimaciones iniciales se encuentren razonablemente cerca de la solucin.
De no ser as, el programa puede converger hacia una solucin que no es la correcta. Este es
un problema muy general en la minimizacin de funciones de varias variables. Es muy fcil
encontrar un mnimo local pero de forma general, no existe ningn mtodo para encontrar
con fiabilidad el mnimo absoluto de la funcin. Opcionalmente se puede representar la
funcin ajustada frente al diagrama experimental. Probar por ejemplo el conjunto de valores
iniciales: H=150 kJ/mol , T
m
= 290 K, c=1 y d=1, cuya minimizacin debera dar un R
"pequeo" y una muy buena adecuacin a la curva. Cambiar ahora el valor de la temperatura
inicial a 280 K y observar la nueva solucin.

Fsico-Qumica de Biomolculas Lic. en Biotecnologa
7

Figura 3: Problemtica de encontrar el mnimo global de una funcin de varias
variables

Nota: Los valores reales de la curva DSC son H=200 kJ/mol y Tm=300 K.


7. Bibliografa

Michael E. Brown, Introduction to Thermal Analysis, 2
nd
ed., Techniques and Applications,
Secaucus, NJ USA: Kluwer Acad., 2001; libro electrnico
Babur Chowdhry y Stephen Leharne, Simulation and Analysis of Differential Scanning
Calorimetry Output: Protein Unfolding Studies 1, J. Chem. Edu., 74, 236 (1997)