UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC
QUÍMICA ÁREA BIOTECNOLOGÍA
PROCESOS DE LA SALUD
5QBT2
PROF.: Juan Ramón Padilla Mendoza
Ensayo de la Práctica de extracción de ADN
INTEGRANTES:
● Alva Cambrón Josué Fabián
● Cruz López Tania Marlene
● Delgado Mondragón Isaac
● Domínguez Jiménez Jonathan
● Ramírez Cerrillo Ramiro Gabriel
● Vargas Gómez Ahtziri Gabriela
INTRODUCCIÓN:
La electroforesis constituye una parte importante de procedimientos rutinarios en el análisis
y observación de la separación o fragmentación de ácidos nucleicos de ADN o ARN en
función de su tamaño o por diferencia de cargas, las proteínas varían en carga según los
aminoácidos incorporados.
El principio de la electroforesis consiste en la migración de moléculas a través de un gel (en
nuestro caso agarosa) u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, por acción de un campo
eléctrico, separándose de acuerdo a su tamaño o peso molecular. La electroforesis en gel
de agarosa forma una matriz de gel en 3D de moléculas helicoidales en paquetes
superenrollados sostenidos por enlaces de hidrógeno, con canales y poros a través de los
cuales las moléculas pueden pasar, el porcentaje de agarosa incluida en un gel afecta el
tamaño de los poros, cuanto mayor sea el porcentaje de agarosa menor será su tamaño,
por lo tanto, más pequeñas serán las moléculas capaces de pasar provocando que la
migración sea más lenta.
Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un
patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas, facilitando su visualización en
forma de bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.
En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la
electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de
estudio que se piensa ejecutar, ya que existen electroforesis de tipo vertical: en donde se
analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN, también tenemos la electroforesis en
campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN
genómico) y electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las proteínas.
Gracias a estas técnicas es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de patógenos,
detectar cambios o mutaciones a nivel genético y visualizar una nueva proteína, entre otros.
DESARROLLO:
Para realizar la extracción de ADN se utilizó la técnica de L. B (caldo de Lisogenia) en
Escherichia Coli. el L.B le da el ambiente favorable para su supervivencia, se colocó en un
tubo gruesos para posteriormente centrifugar a 3,500 RPM durante 5 minutos realizando
una decantación para extraer las proteínas, después se agregó un buffer de extracción para
facilitar la obtención del ADN y se resuspendió en un tubo eppendorf, se agregaron 300 μl
de fenol cloroformo con ayuda de una micropipeta, este se agrega para formar las fases
orgánica y acuosa, desnaturalizar proteínas e inactivar nucleasas, centrifugando los tubos
eppendorf a 120,000 RPM por 10 minutos a 4° C para separar por fases la muestra, se
conservó en frío para dar estabilidad al ADN, pasando este tiempo pudimos observar tres
fases.
imagen No. 1, 2 y 3: separación por fases
Nota: fuente propia
Las proteínas y el sobrenadante:
El sobrenadante se transfiere a un tubo eppendorf de 1.5 μl ya que aquí se localizan
nuestras cadenas de ADN, se agregan 2v de etanol para concentrar y desalinizar
preparaciones de ácidos nucleicos en soluciones acuosas y se deja reposar 20 minutos a
-20° C para después centrifugar a 12,000 RPM durante 10 minutos a 4° C.
Después de mantener la muestra en congelación pudimos observar la pastilla al fondo del
tubo Eppendorf adicionando agua esteril para resuspender la muestra y llevar a cabo la
electroforesis, esperamos unos minutos y procedimos con la preparación de nuestro gel
como base de agarosa al 1%.
Nuestro Tampón TAE contiene:
Tris: Es el grupo ácido-base que ejerce el taponamiento, este se encarga de mantener el Ph
EDTA: Es el agente quelante de cationes divalentes, evita la degradación del DNA durante
la preparación y la electroforesis.
Acetato de Sodio:Se utiliza como tampón en la disolución.
Para que se pueda ver nuestra electroforesis se añaden indicadores como: Azul de
bromofenol; Es un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso
de la electroforesis.En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que la
mayoría de moléculas de DNA.
Xileno-cianol: Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el
progreso de la electroforesis. En la electroforesis se mueve aproximadamente como las
moléculas de DNA de 9000 PB.(Herráez,2014). Este tampón se agrega para disolver
agarosa, se aumenta la temperatura sin llevar a ebullición y se deja enfriar. Después se
ponen nuestros peines para que se puedan hacer nuestros pozos para poder poner nuestra
muestra ahí, se mete en el congelador para acelerar su gelificación y seguir con la práctica.
Se quitan los peines de un solo movimiento evitando la ruptura del gel, se agrega el Buffer
EDNA hasta la marca de la cámara de electroforesis, teniendo nuestro gel en la cámara.
Se extraen 5 microlitros de la muestra, con una micropipeta calibrada mezclando con Azul
de Bromofenol, Una vez cargada la micropipeta se procede a llenar con mucho cuidado
nuestro pozo, acercando la pipeta de manera que no dañemos el gel y se pueda depositar
la muestra.Una vez depositada la muestra se retira cuidadosamente la micropipeta.
Imagen 4 y 5: pozos de electroforesis
Nota: Fuente propia
Ya que todos los pozos se encuentren llenos se procede a conectar la fuente de poder de la
cámara, se cierra con los polos cambiados para que las cargas queden positivo con
negativo y se pueda llegar a la electroforesis. Se dejan de 30 a 40 min con un voltaje de
70V. Pasados los 30 min se abre la cámara y procedemos a retirar el gel evitando que el gel
se rompa, esto se hace con un solo movimiento y se pone en el soporte de colado el cual
tiene luz ultravioleta para poder visualizar los plásmidos.
Estos se pueden observar en las siguientes imágenes:
imagen 6 y 7: Celdas de muestra en luz ultravioleta.
Nota: Fuente propia
Podemos observar que tenemos un efecto cometa indicando que hubo degradación de la
muestra, esto se debe a que el proceso no se realizó en condiciones óptimas, sin embargo
también pudieron observarse plásmidos siendo atraídos por la carga que les atrae.
CONCLUSIÓN
En base a los resultados obtenidos tras la extracción y electroforesis con ADN bacteriano
(E. coli), Podemos decir que en esta práctica, realizamos la estandarización de esta técnica
en bacterias, con el fin de aprender y poder mejorar el resultado para futuros análisis en el
curso.
Cabe mencionar que si hubiésemos dejado la muestra por más tiempo se hubiese podido
observar ADNs de cadenas más pesadas. Lo que pudimos visualizar en la electroforesis
fueron ADN y ARN mezclados, como pudiese haber sido el ARN ribosomales (28s, 18s,
5.8s y 5s) que conforman al ribosoma. Podemos mejorar esta técnica utilizando enzimas
ARNasas, para sólo mantener ADN en la electroforesis, dejándonos con resultados de 1
banda y produciendo datos más precisos.
Dentro de las observaciones que tuvimos para evitar “el efecto cometa”, (causado por la
degradación de la muestra), fueron: mejorar las condiciones de extracción, tomar solamente
la parte acuosa de la muestra, ocupar tubos, puntas y reactivos estériles, no precipitar por
más de 2 hrs el ADN y usar agua de ampolleta.
BIBLIOGRAFÍA
● Abyntek. (2017). PRECIPITACIÓN DE DNA CON ETANOL O
ISOPROPANOL. Abyntek Recuperado de abyntek.com
● Herrnandez, A. (n.d.). Reactivos. biomodel.uah.es
● Sandoval A. (2020). Extracción de ácidos nucleicos. AccessMedicina
Recuperado de accessmedicina.mhmedical.com.
● Yábar C.A. (2003). Manual de procedimientos de electroforesis para
proteínas y ADN.División de Biología Molecular. Centro Nacional de Salud
Pública Instituto Nacional de Salud. Lima-Perú.…bvs.ins.gob.pe
