CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE
PROCESOS FERMENTATIVOS

PRÁCTICA # 3

RECUENTO DE COLIFORMES Y E. COLI

1. TEMA DE LA PRACTICA: RECUENTO DE COLIFORMES Y E. COLI

2. INTRODUCCION

Las bacterias del grupo coliforme son representadas por 5 géneros de la familia
Enterobacteriaceae: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia. Son bacilos
Gram negativos que se encuentran en la naturaleza y en el tracto intestinal de animales y
humanos. Tienen la capacidad de fermentar la lactosa con producción de gas (CO2) por la
presencia de la enzima β-galactosidasa, y pueden crecer en presencia de sales biliares
(McCormick & Company Inc., 2009). No forman esporas, fermentan glucosa y son aerobios
facultativos (Moss & Adams, 2008). Debido a la facilidad de su cultivo y diferenciación, son
usados como organismos indicadores para evaluar calidad microbiológica en muestras de
alimentos y agua (McCormick & Company Inc., 2009).

Escherichia coli es la especie coliforme de mayor preocupación porque su presencia en

alimentos indica contaminación fecal o prácticas no sanitarias durante o después de la
producción del alimento. En 1976, se describió la asociación (97% positiva) de Escherichia
coli con la enzima β-glucoronidasa (Rice E. W., 1990) y a partir de esa fecha se ha generado
un gran número de ensayos analíticos para determinar la presencia de E. coli en muestras
clínicas, alimentos, potable y fuentes ambientales a partir de diferentes sustratos usados por
esta enzima. Otra característica importante de E. coli es que, a diferencia de las otras bacterias
coliformes, puede crecer y fermentar lactosa a 45.5°C (McCormick & Company Inc., 2009).

Enterococcus faecalis es otra bacteria intestinal, coco Gram positivo, y junto con E. coli son
clasificados como buenos indicadores de contaminación fecal por las siguientes características:
• Altas concentraciones en heces de humanos y animales.
• Normalmente no están presentes en agua o suelo.
• Su identificación es relativamente fácil.
• Sobreviven en agua más tiempo que patógenos entéricos

La investigación de E. coli para establecer contaminación fecal es la más utilizada en el análisis

microbiológico.

El caldo Lactosa es un medio crucial para la deteccion de bacterias coliformes, este continee
extracto de carne y peptona como fuente de proteina y lactosa como fuente de carbono. Las
bacterias coliformes fermentan lactosa con la producción de gas que es observable a traves de
la campana Durham que se incorpora en el caldo. Este medio es clave y recomendado por
APHA para la identificacion de coliformes.

3. OBJETIVOS:
a. General

Realizar el recuento de coliformes y Escherichia coli en muestras de chochos.

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b. Específico

Preparar una muestra de chochos para el análisis bacteriológico.

Aprender y ensayar técnicas de diluciones, vertido en placa, extensión en placa y estriado
Calcular el número de bacterias mesófilas totales en un alimento
Utilizar el recuento de hongos como indicador de calidad microbiológica.
Calcular el número de unidades propagadoras de mohos y levaduras (upml) es una muestra
de mayonesa no pasteurizada
Conocer la importancia de las micotoxinas en un alimento.

4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MUESTRA
• 50 g de chocos desamargados de diferentes sitios (3 muestras, se trabaja en grupo G1-
G2, G3-G4, G5-G6-G7)
MATERIALES
• 3 Frascos con 225mL de agua invertida (9 tubos para cada grupo
peptonada G1-G2; G3-G4; G5-G6G7)
• 3 Tubos de ensayo con 9mL de agua • 7 Placas Microfast para Recuento de
peptonada al 0,1% (por grupo) Coliformes y E. coli.
• 6 cajas Petri estériles (Grupos de • Agua destilada
vertido: G2,G4,G6) • Agua Peptonada
• 450 mL de agar nutritivo en frasco • Asa de siembra
para técnica de vertido (para los 3 • Asa de Drigalski
grupos) • Mechero
• 24 Cajas Petri con Agar Nutritivo • Alcohol potable
para técnica de extensión (G1, • Alcohol 70%
G3, G5, G7) (Vt=600mL) • Puntas de micropipetas de 200uL
• 7 Cajas Petri con Agar Nutritivo • Papel toalla
(Estriado, una para cada grupo) • Jabón de manos
• 7 Cajas Petri con Agar MacConkey • Maskin
(Estriado, una para cada grupo) • Parafilm
• 7 Cajas Petri con Agar EMB • Papel film para envolver cajas
(Estriado, una para cada grupo) • Frasco con Alcohol potable 95%
• 29 tubos con caldo lactosa (9mL), • Guantes
colocar la campana Durham

EQUIPOS
• Autoclave
• Balanza
• Incubadora
• Micropipeta de 100uL y 200uL

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5. PROCEDIMIENTO
Preparación de diluciones
1. De manera aséptica con instrumentos estériles y junto al mechero, medir 25 g de la
muestra en un frasco o funda estéril y adicionar 225 ml de agua peptonada. De esta
manera se ha preparado la primera dilución 1 en 10 o 10-1. La dilución 10-2 resulta de
transferir 1 ml de la dilución anterior a 9 ml de agua peptonada y así sucesivamente
hasta la dilución 10-4.
2. El número de diluciones se establece de acuerdo al grado de contaminación de la
muestra o de acuerdo a lo que recomienda la Norma INEN del producto a analizar. En
este caso suponemos que la muestra puede tener un elevado número de bacterias por lo
tanto el número de diluciones recomendada es de 10-1 a 10-4.
3. Utilizar los dos métodos de siembra: vertido en placa y extensión en placa.

Método de Vertido en placa

1. Rotular la base de cajas Petri estériles vacías (fecha, dilución, grupo, método de
siembra) tomando en cuenta que no se deben abrir las cajas.
2. Homogeneizar y tomar 1 ml de la dilución 10 -2 con una micropipeta y colocar en el
interior de una caja Petri previamente esterilizada, realizar este paso por duplicado.
3. Repetir el paso 2, con las diluciones 10-3 y 10-4 (se tendría un total de 6 cajas Petri
inoculadas con la muestra).
4. Verificar que el agar nutritivo se encuentre a una temperatura de 45-50ºC,
homogeneizar y verificar que esté completamente líquido.
5. Verter el medio de cultivo lentamente sobre las cajas Petri inoculadas hasta que el medio
cubra la mitad de su volumen (aproximadamente 25 ml).
6. Suavemente homogeneizar la mezcla con movimientos pequeños y delicados (arriba-3
veces, abajo-3 veces, derecha-3 veces e izquierda-3 veces) sobre el mesón sin levantar
la caja y evitando que el medio se derrame fuera de la caja o entre en contacto con la
tapa.
7. Realizar un control de contaminación del medio (control de esterilidad), colocando
solamente medio de cultivo en una caja Petri estéril rotulada.
8. Dejar reposar y no mover las cajas hasta que el medio solidifique completamente.
9. Colocar las placas invertidas, es decir con el medio de cultivo hacia arriba en la
incubadora y dejar por 24 horas a 35°C.

Método de Extensión en placa

1. Rotular la base de las cajas Petri que contienen agar nutritivo sólido (fecha, dilución,
grupo, técnica de siembra).
2. Homogeneizar y colocar con ayuda de una micropipeta tomar 0.1 ml (100 μl) de la
dilución 10-2 sobre la superficie del agar, realizar este paso por duplicado.
3. Sacar el asa de vidrio Asa de Drigalski, que se encuentra sumergida en alcohol al 96%,
eliminar el excedente de alcohol y acercar a la llama del mechero, luego retirar y esperar
que la llama se consuma completamente.

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4. Enfriar el asa en una esquina del medio donde NO se encuentre la dilución de la muestra
y extender el inóculo uniformemente sobre toda la superficie del medio.
5. Colocar el asa de vidrio directamente en el recipiente de alcohol que debe estar ubicado
a 30 centímetros del mechero. ¡NO CALENTAR EL ASA DE VIDRIO!
6. Repetir desde el paso 2 al 5 con las diluciones 10-3 y 10-4 (se tendría un total de 6 cajas
Petri inoculadas con la muestra)
7. Dejar reposar las placas por 5 minutos.
8. Colocar las placas en la incubadora e incubar por 24h horas a 35°C de igual manera que
en el método anterior.

Método de Recuento en placas Microfast

1. Colocar una placa Microfast para el Recuento de coliformes y E. coli en una superficie
plana y nivelada. Levantar la película superior y agregar 1mL de la muestra en dilución
10-1 y 10-2 de forma perpendicular al centro de la lámina inferior.
2. Bajar lentamente la lámina superior sobre la muestra, con el objetivo de difundir el
inóculo por toda el área de crecimiento, evitar la generación de burbujas de aire. No
deslizar y presionar con los dedos a través de la lámina.
3. Dejar reposar la placa Microfast por un minuto.
4. Incubar a temperatura ambiente por 3-5 días.

Recuento de Colonias

1. Efectuar los contajes de aerobios mesófilos a las 24 horas.

2. Elegir las placas cuyos contajes se encuentren entre 25 y 250 UFC y seguir la guía para
recuento microbiano.
3. Expresar los resultados como UFC/g ó ml de muestra.
4. El recuento de mohos se reporta como upml (unidades propagadoras de mohos y
levaduras) por gramo de alimento.
5. Los recuentos deben ser reproducibles, es decir, no debe existir un error mayor al 5%
entre duplicados.
6. El resultado se calculará tomando la media de los resultados de cada dilución y no debe
existir un error mayor al 10% entre diluciones.

Ejemplo de recuento total de colonias:

DILUCIÓN PLACA 1 PLACA 2 PROMEDIO UFC/mL INTERPRETACIÓN
10-1 Incontables Incontables Incontables --- No se puede divisar
colonias aisladas y no
se puede hacer recuento
debido a que existen >
250 UFC por placa
10-2 150 120 135 1,35 x 104
10-3 15 10 12,5 1,25 x 104
10-4 1 0 0,5 5 x 103
Ejemplo de Cálculo

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𝑈𝐹𝐶 𝑈𝐹𝐶 135 ∗ 102 𝑈𝐹𝐶

𝑜 = 1,35 𝑥 104
𝑚𝑙 𝑔 1𝑚𝐿 𝑔

Técnica de estriado

1. A partir de la dilución 10-1, ensayar la técnica de estriado en el Agar Nutritivo y en el

medio EMB.
2. Tomar con el asa de siembra estéril una muestra de dilución 10 -1 y realizar el inóculo
primario, luego realizar el inóculo secundario, terciario y cuaternario.

Método del número más probable

1. Rotular los tubos de caldo lactosa con diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, por triplicado,
verificar que todos los tubos tengan la campana o tubo Durham invertido.
2. Transferir 1 ml de la dilución 10 -1 a cada uno de 3 tubos que contienen 9 ml de Caldo
Lactosa para la detección de coliformes (triplicado).
3. Repetir el paso 2 con las diluciones 10-2 y 10-3 (se tendrá un total de 9 tubos)
4. Incubar a 37ºC por 24 horas.
5. La presencia de coliformes se manifiesta con la formación de gas en el interior de los
tubos de Durham y turbidez del medio.
6. Indicar el número de tubos positivos de cada dilución para la formación de gas
(coliformes).
7. Calcular el NMP/ml para coliformes acuerdo a la siguiente tabla:
Tabla de referencia para NMP

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VALORES DE REFERENCIA
Requisitos microbiológicos de chocho desamargado (Norma INEN 2389, 2005)

6. RESULTADOS
Técnica de vertido en Placa
DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2 PROMEDIO UFC/g OBSERVACIONES
10-2
10-3
10-4

Resultado de recuento total: ___________

Técnica de extensión en placa

DILUCIÓN CAJA 1 CAJA 2 PROMEDIO UFC/g OBSERVACIONES
10-2
10-3
10-4

Resultado de recuento total: ___________

Técnica de Placas Microfast

DILUCIÓN CAJA 1 UPML/g OBSERVACIONES
10-1
10-2

Técnica de estriado en placa

MEDIO DE TIPO DE MEDIO RESULTADO OBSERVACIONES
CULTIVO (Composición)
Agar Nutritivo
Agar EMB
Agar MKL

Técnica del Número más probable (NMP)

10-1 10-2 10-3 Código NMP/g
reportado
Coliformes

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7. DISCUSIÓN
a) Compare los resultados obtenidos para el recuento total entre los 2 métodos de siembra
(vertido en placa y extensión en placa), ¿debería ser valores comparables? Si hay
diferencias discuta las posibles razones
b) ¿Cuáles son los componentes selectivos de los medios para el crecimiento de coliformes
y Escherichia coli?
c) Discuta sobre el método del número más probable para identificación de coliformes
d) ¿En qué situaciones es mejor utilizar E. faecalis en lugar de E. Coli como indicador de
contaminación fecal?

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