Alteración Del Metabolismo Del Nitrógeno en Cepas de Biocontrol de Penicillium Rubens - ScienceDirect

2/5/24, 22:14 Alteración del metabolismo del nitrógeno en cepas de biocontrol de Penicillium rubens - ScienceDirect
Genética y biología de hongos

Volumen 132, noviembre 2019 , 103263
Metabolismo alterado del nitrógeno en cepas de biocontrol de

Penicillium rubens
EA Espeso ,M. Villarino b ,M. Carrerasb ,L. Alonso-Guirado a c ,JM Alonso ,P. Melgarejob ,I. Larena b.
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https://doi.org/10.1016/j.fgb.2019.103263
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Palabras clave
Penicillium rubens; Agente de biocontrol; Metabolismo de nitratos; nira; crna
Abreviaturas
licenciado en Letras, actividad de biocontrol; ACB, agente de biocontrol; P. rubens (crisogenum) Wisconsin 54-1255, PcWis 54-1255
1 . Introducción
En los ecosistemas naturales, las plantas dependen del crecimiento de microbios del suelo , como bacterias y hongos, para acceder a nutrientes
como N, P y S en formas inorgánicas (amonio, nitrato, fosfato y sulfato) ( Jacoby et al., 2017 ). En los sistemas agrícolas, los macronutrientes
también se aportan mediante la aplicación de fertilizantes minerales. En particular, el nitrógeno se puede encontrar en estado inorgánico y
orgánico. Los hongos aprovechan estas fuentes de nitrógeno del suelo, el agua y otros organismos vivos. Así, los hongos asimilan compuestos
nitrogenados orgánicos alternativos en ambientes limitantes como suelos naturales y seminaturales que suelen tener bajas concentraciones de
nitrato y amonio ( Watkinson, 2016 ). Sin embargo, en suelos agrícolas el nitrato es un compuesto abundante que se origina principalmente a
través de la nitrificación o la adición de fertilizantes. El manejo de la nutrición de los cultivos se realiza mediante la aplicación de fertilizantes
o modificación del suelo y se ha demostrado que estas técnicas agrícolas son componentes importantes en el control de diversas
enfermedades de las plantas ( Huber, 1989 ). Existen trabajos previos que demuestran la influencia de la forma nitrogenada en la severidad de
las enfermedades vasculares causadas por diferentes formas especiales de Fusarium oxysporum en plantas ornamentales y agrícolas ( Duffy y
DéFago, 1999 ). La reducción de la gravedad de la enfermedad y la promoción del crecimiento de las plantas se ha evidenciado mediante la
aplicación de nitrógeno en forma de nitratos en lugar del uso de nitrógeno amoniacal ( Woltz y Jones, 1973 , Engelhard, 1979 , Raju et al., 1984
). Así, la reducción de la gravedad de las enfermedades está influenciada por la nutrición del cultivo junto con otras medidas de manejo
integrado (químicas, biológicas y culturales) ( Huber, 1989 ). Actualmente se busca un manejo integrado de plagas que conduzca a una
reducción de riesgos y efectos sobre la salud humana y el medio ambiente. Debido a la reducción de sustancias activas disponibles y residuos
permitidos y la aparición de resistencias a fungicidas, se utilizan alternativas no químicas como los métodos biológicos. El control biológico de
las enfermedades de las plantas es el resultado de la compleja interacción entre el agente de biocontrol, el patógeno, la planta y el medio
ambiente. Los agentes biológicos (hongos, cromistas , nematodos, bacterias o virus) permiten reducir el inóculo del patógeno, proteger áreas
de infección y/o inducir resistencia en el huésped. Dado que el agente de biocontrol (ABC) es un elemento más dentro del sistema agrícola, es
necesario estudiar sus fenotipos y conocer sus rutas metabólicas más importantes que pueden interactuar o ser claves en su mecanismo de
acción.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1087184519301343?via=ihub 1/22
Entre los hongos, los géneros Trichoderma , Phlebia, Gliocladium , Epicoccum y Penicillium incluyen cepas que son antagonistas eficaces contra
enfermedades del suelo, aéreas o poscosecha. La cepa 212 de Penicillium rubens (PO212, ATCC201888), anteriormente Penicillium oxalicum (
Villarino et al., 2016 ) es un agente de biocontrol (BCA) probado contra diferentes enfermedades del suelo ( Larena et al., 2003 , De Cal et al.,
2008 , De Cal et al., 2009 , Martinez-Beringola et al., 2013 ) . Hasta el momento, PO212 es uno de los pocos aislados de Penicillium sp. para
exhibir BA in vivo , así como aislados de P. frecuentans ( P. glabrum ) ( Guijarro et al., 2006 ), P. citrinum ( Bhuiyan et al., 2003 ) y P. funiculosum (
Fang y Tsao, 1995 ). La aplicación de PO212 a plántulas de tomate siete días antes de su trasplante indujo resistencia y una reducción resultante
del 20 al 80% en la incidencia de la enfermedad de marchitez por Fusarium y Verticillium ( De Cal et al., 1997 , De Cal et al., 1999 , De Cal et al.,
2000 , Larena et al., 2003 ) tanto en condiciones de invernadero (inoculación artificial) como de campo (suelos naturalmente infestados).
PO212 es un BCA seguro para controlar patógenos transmitidos por el suelo debido a su dispersión vertical y horizontal muy limitada, y su baja
persistencia en el suelo ( Vázquez et al., 2013 ).
Otra particularidad de esta cepa es su capacidad para crecer en diversas condiciones, siendo de especial interés su resistencia a altas
concentraciones de anión clorato (>500 mM). La capacidad de tolerar el anión clorato está directamente correlacionada con la disminución en
la asimilación del nitrato como fuente de nitrógeno ( Marzluf, 1997 ). Para comprender el fenotipo BA presentado por PO212 iniciamos una
serie de estudios genéticos y moleculares ( Villarino et al., 2016 , Villarino et al., 2018 ). El aislamiento de mutantes PO212 resistentes al ácido
5-fluorótico (5-FOA) ha permitido la identificación de mutaciones en la ruta biosintética de las pirimidinas , específicamente en los genes pyrG
y pyrF ( Villarino et al., 2016 ). Aislamos el mutante PO212_18.2 que porta una mutación en el gen pyrG que causa un truncamiento de la
proteína PyrG en el aminoácido 104. Este aislado auxótrofo de pirimidina PO212 _ 18.2 se ha utilizado con éxito en la transformación ( Villarino
et al., 2016 ). Es importante destacar que la transformación no afectó las características morfológicas ni la eficacia del biocontrol de este hongo
( Villarino et al., 2018 ). Se utilizaron cepas derivadas de PO212 que expresan proteínas indicadoras fluorescentes verdes ( sGFP) o rojas (Ds-Red
Express) para estudiar la colonización de las raíces del tomate por PO212. Se demostró que la colonización por cepas fluorescentes PO212, al igual
que la cepa receptora, se restringe al sistema radicular (excluyendo el sistema vascular) sin extenderse a las partes aéreas de la planta (
Villarino et al., 2018 ). Así, el PO212 permanece en la interfase entre el suelo y la planta, sujeto a la influencia de ambos ambientes.
Con estas herramientas moleculares podremos analizar el fenotipo resistente al clorato que muestra PO212 y si su posible relación con el
metabolismo de los nitratos puede influir en su BA en los suelos agrícolas. En este trabajo, nuestro objetivo fue identificar la base genética de
PO212 para la tolerancia al clorato mediante la secuenciación de genes relacionados con la vía del catabolismo del nitrato. Esta caracterización
genética serviría también para determinar la proximidad genética de PO212 a cepas de Penicillium spp. cuyos genomas han sido secuenciados y
a otros aislados del laboratorio. Entre estos aislados encontramos la cepa CH8 con potencial BA que también presenta un fenotipo deficiente en
nitratos. La identificación de cambios de nucleótidos en genes implicados en el metabolismo del nitrógeno de las cepas estudiadas ha
permitido identificar los diferentes nitgenotipos y su relación con el mecanismo de biocontrol.
2 . Materiales y métodos
2.1 . Cepas y condiciones de cultivo.

Las cepas de Penicillium rubens utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla 1 . PO212 (ATCC201888) y su derivado, la cepa PO212_18.2
deficiente en pirimidina ( Villarino et al., 2016 ) eran de nuestra colección en el INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y
Alimentaria). La cepa 1AM2 (IPLA33001) fue un regalo del Dr. Mayo (Instituto de Productos Lácteos de Asturias-CSIC, España), siendo un
aislado de queso previamente identificado como P. chrysogenum (su secuencia DQ148949) ( Florez et al., 2007 ) y también verificado en
nuestro laboratorio. La cepa 1AM2 se utilizó como control porque mostró un crecimiento colonial y vegetativo saludable en la mayoría de las
condiciones probadas. La cepa CH8 se aisló de un brote de plantas perennes en un bosque cercano al INIA. P. rubens (chrysogenum) Wisconsin
54-1255 (abreviado como PcWis 54-1255) se obtuvo de la colección de cultivos de la ATCC, ATCC28089 ( van den Berg et al., 2008 ).
Tabla 1 . Cepas de Penicillium rubens utilizadas en este trabajo.
Cepa Genotipo relevante Referencia
PO212 nirA1 Este trabajo (1) y De Cal et al. (1995) (ATCC 201888)
PO212_18.2 pirG1 ; nirA1 Este trabajo (1) y Villarino et al. (2016)
PO212_ NirA 1AM2 (PO212_TF7) nira 1AM2 Este trabajo
PO212_NirA 1AM2 -GFP nirA 1AM2 ; GFP Este trabajo
CH8 crnA1 Este trabajo
CH8_7 crnA1 ; crnA PO212 Este trabajo
CH8_rev5 crnA + Este trabajo
Cepa Genotipo relevante Referencia
1AM2 prototrofo (WT) Florez et al. (2007) (IPLA 33001)
PcWis 54-1255 prototrofo (WT) van den Berg et al. (2008) (ATCC 28089/DSM 1075/NRRL 1951/Wisconsin 54-1255)
(1)
Alelo mutante nirA1 identificado en este trabajo.
Estas cepas y las cepas recién construidas basadas en PO212 y CH8 se mantuvieron en agar de papa dextrosa (PDA; Difco, Detroit, MI, EE. UU.) a
4 °C y se cultivaron en PDA en placas de Petri en la oscuridad a 20–25 °C. C durante 7 días para la producción de conidios. Se usó medio
mínimo (MM, medio mínimo de Aspergillus , ver ( Villarino et al., 2018 ) para los análisis fenotípicos de las cepas de Penicillium . Se usó D-
glucosa al 1% como fuente principal de carbono y se agregaron fuentes de nitrógeno de elección en las concentraciones indicadas en el texto se
agregaron uracilo y uridina cuando fue necesario para complementar los efectos de la mutación pyrG1 .
Para los ensayos de bicontrol, se produjeron y secaron conidias secas para el tratamiento con wtPO212 como lo describieron previamente
Larena et al. (2003) . El contenido de humedad del producto conidial final se midió usando un analizador de humedad (Boeckel, GmbH+Co,
Hamburgo, Alemania) y la germinabilidad de los conidios secos se determinó usando el bioensayo descrito por ( Larena et al., 2007 ).
El aislado 1A de F. oxysporum f. sp. lycopersici (Sacc) Snyder y Hansen (FOL1A) fue proporcionada por la Dra. Cristina Moyano (Laboratorio de
Evaluación de Variedades, Semillas y Plantas de Vivero, DTEVP, INIA), y se utilizó a 10 5 -10 6 microconidias/ml como cepa patógena de
Fusarium en ensayos de biocontrol.
2.2 . Construcción de casetes de transformación y otras técnicas de PCR.

La amplificación de los diferentes fragmentos de ADN , así como la construcción genética realizada, se llevó a cabo mediante técnicas de PCR
de laboratorio estandarizadas y utilizando los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 2 .
Tabla 2 . Oligonucleótidos utilizados en este trabajo.
Nombre del cebador secuencia 5′-3′ Utilización
niaD-1 TTCGAGTCAATTGTGGGTATTGGAC PCR/secuenciación de niaD
niaD-1.5 TCGTGTTGTGGGTACACAGC PCR/secuenciación de niaD
niaD-2 ACTTACCATTGAGCAAGTCACCACCCG PCR/secuenciación de niaD
niaD-3 CAACGTGAACTCGGTGGCTGTGTACC PCR/secuenciación de niaD
niaD-3.5 TTGCAGTCGATCTTTGAGCC PCR/secuenciación de niaD
niaD-4 CAGGATCTTAGGTGGGACGTTTTGCCACTC PCR/secuenciación de niaD
NirAPO-GSP1 CGGTCTACTCCGTATGTAACCCACCAAGGG Amplificación de la secuencia codificante de nirA.
NirAPO-GSP2 ACGCTGTTCATCACCAGGACTAGAGGCCG Amplificación de la secuencia codificante de nirA.
NirAPO-GSP3 TTGAATCCCCGATGATACCTAGGTACAACCGG Amplificación de 3́UTR nirA /secuenciación nirA
NirAPO-GSP4 ACCTTGATCGCGGCAACCATGAATCACGC Amplificación de 3́UTR nirA /secuenciación nirA /Fusion PCR
NirAPO-GFP1 CGGCCTTCTAGTCCTGGTGATGAACAGCGT PCR GFP-PyrG

(GGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCC)
NirAPO-GFP2 CCGGTTGTACCTAGGTATCATCGGGATTCAA(GTCTGAGAGGAGGCACTGATGCG) PCR GFP-PyrG
NirA-UP CAATGTTGAGACGTGGCTGGTGGAGCG Locus nirA de PCR
NirA-DW TCCACGATCTGGATGGAACTATTCCGCG Locus nirA de PCR
NirAqPCRUP ACAAGTGGTACGATGGCTCTGG qPCR, determinación del número de copias nirA
NirAqPCRDW AGACATGAGATTACTGTCCTG qPCR, determinación del número de copias nirA
niiA-1A ATCAGACCGAGTGGAATGAGGC PCR/secuenciación de niiA
niiA-2 TGCTAGCTTAGAAGCTGCG PCR/secuenciación de niiA
niiA-3 TAGTTCACGAGAGGAACCC PCR/secuenciación de niiA
Nombre del cebador secuencia 5′-3′ Utilización
niiA-4 CCGTCGAGACGGTAGAAGT PCR/secuenciación de niiA
niiA-5 GGTTGGCGTATGGGACAT PCR/secuenciación de niiA
niiA-6 ATAGGTTGGGACTGGGACTGC Promotor de PCR/secuenciación del promotor
crnA-1 TACCCTACTACCTCAACGCTCG PCR/secuenciación de crnA
crnA-2 CGCTTATACAAGAGTAGAGG PCR/secuenciación de crnA
crnA-3 CCATGTGTCATGGCAAGATG PCR/secuenciación de crnA
crnA-4 TGGCTGCTACTATGGAAGCG PCR/secuenciación de crnA
nre-1 CCACGGTCGCCTCTATTTG PCR/secuenciación de nre
nre-2 CGTCAGTCGAACCTGTCTG PCR/secuenciación de nre
nre-3 CTACCAGTCCTACTGTGTCG PCR/secuenciación de nre
nre-4 GCTAGCCACCACTATAATC PCR/secuenciación de nre
mat-1-1 fw TGCAGCTCAAGTTCTACG Locus mat-1.1 de PCR
mat-1-1 autocaravana GGTTGATGAGAGATGTACTCCT Locus mat-1.1 de PCR
mat-1-2 fw ATGGTGAAGTCTTCCTGCC Locus mat-1.2 de PCR
mat-1-2 rv GGTGTCGAGCCACTCTCT Locus mat-1.2 de PCR
PO212 actina 1 GAAATCGTCCGTGACATCAAGG control de actina qPCR
PO212 actina 2 CAATGTTGCCGTAGAGATCCTTACGG control de actina qPCR
PO212 benA 1 TCAGCTCAACTCCGATCTTCGC control de tubulina qPCR
PO212 benA 2 CTCAACCTCCTTCATGGAGACC control de tubulina qPCR
niaD qPCR 1 CAGTCGATCTTTGAGCCTAGG qPCR nitrato reductasa
niaD qPCR 2 AAGGATGTATCCTGGGATACG qPCR nitrato reductasa
niiA qPCR 1 GTGATCGTGGATGACAAACTCG qPCR nitrito reductasa
niiA qPCR 2 AGACACTCGACCACTTGTGACC qPCR nitrito reductasa
Para complementar las mutaciones nirA1 y crnA1, los fragmentos se amplificaron mediante PCR y polimerasa PrimeStar de alta fidelidad
(Takara) utilizando pares de cebadores específicos y ADN genómico de las cepas 1AM2 y PO212, respectivamente, como plantillas . Los detalles
de los fragmentos amplificados, cebadores y plantillas se describen en el texto. Para su uso en transformación, los fragmentos se purificaron a
partir de geles de agarosa TAE-0,8%.
Para marcar NirA con GFP construimos un casete de transformación mediante la técnica de PCR de fusión de 3 vías, descrita en ( Nayak et al.,
2006 ), que ha sido ampliamente utilizada por nosotros ( Markina-Iñarrairaegui et al., 2011 ). Básicamente, se genera un casete de ADN de
transformación mediante técnicas de PCR utilizando la polimerasa correctora Primer Star HR (Takara) y como plantilla una mezcla de
fragmentos que permiten la fusión en marco de epítopos, como el caso de GFP en el extremo C-terminal de NirA. proteína. Los fragmentos
plantilla se obtuvieron a partir de ADN genómico para recombinación homóloga y el fragmento que contiene el gen que codifica el epítopo GFP
y el marcador seleccionable ( gen pyrG de Aspergillus fumigatus ) se obtuvieron del plásmido p1439 ya descrito en ( Villarino et al., 2018 ).
Utilizando los oligonucleótidos hibridados en los extremos, el casete de transformación se amplificó usando las siguientes condiciones de PCR:
desnaturalización inicial 98 °C/2 min, 15 ciclos en períodos de desnaturalización 98 °C/10 s, hibridación 55 °C/5 s y extensión. 72 °C/1 min/kb,
25 ciclos en periodos de desnaturalización 98 °C/10 s, recocido 58 °C/5 s y extensión 72 °C/8 min + 20 s/ciclo y, finalmente, una extensión a 72
°C/9 min y almacenamiento a 4 °C. El casete de ADN amplificado se purificó a partir de gel de agarosa TAE al 0,8%, se cuantificó y se utilizó
directamente en la transformación de protoplastos .
2.3 . Transformación de cepas de P. rubens.

Se utilizaron fragmentos o casetes de ADN descritos anteriormente para la transformación de las cepas PO212, PO212_18.2 o CH8 siguiendo el
procedimiento descrito en ( Villarino et al., 2018 ). Para complementar la mutación nirA1 en la cepa PO212, se transformaron protoplastos con
un fragmento que contenía el gen nirA de la cepa 1AM2 y se seleccionaron transformantes positivos en medio de regeneración (MM + sacarosa 1
M como estabilizador osmótico) suplementado con nitrato (5 mM) como fuente principal de nitrógeno. . Para marcar NirA con el resto GFP, se
transformaron protoplastos de la cepa PO212_18.2 con el casete de PCR de 3 vías y se seleccionaron transformantes positivos en un medio de
regeneración que carecía de suplementos de uracilo y uridina, utilizado para complementar la mutación pyrG1 . La complementación de la
mutación crnA1 en la cepa CH8 se seleccionó utilizando un medio de regeneración que contenía nitrato (5 mM) como fuente de nitrógeno.
2.4 . Extracción de ARN y preparación de muestras para qPCR.

El ARN total se extrajo de micelios cultivados en las condiciones descritas en la sección de resultados. Los micelios se recogieron mediante
filtración usando Miracloth y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras se procesaron utilizando el reactivo TRI (Sigma-
Aldrich) y siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, los micelios recolectados se molieron usando un mortero y nitrógeno líquido. Se
suspendieron 200 mg de micelio pulverizado en 1 ml de reactivo TRI (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente.
Luego se agregaron 0,2 ml de cloroformo, se mezcló vigorosamente, se incubó durante 15 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 12.000
g/15 min/4 °C. Se recogió la fase acuosa superior y se precipitó el ARN con 0,5 ml de 2-propanol. El ARN se recogió mediante centrifugación a
12.000 g/10 min/4 °C. El precipitado de ARN se lavó con 1 ml de etanol al 75% seguido de centrifugación a 7500 g/5 min/4 °C. Cada precipitado
se secó al aire y se disolvió en 200 µl de agua milliQ sin ARN y se congeló a -80 °C hasta su uso.
Para la PCR cuantitativa, el ADNc se sintetizó utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript para RT-PCR (Invitrogen) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN total en las muestras se determinó utilizando un NanoDrop ND-1000.
Previo a la biosíntesis de ADNc , los rastros de ADN genómico (ADNg) se eliminaron utilizando Desoxirribonucleasa I , grado de amplificación
(Invitrogen). En un volumen de reacción de 10 µl, se trataron 2 µg de ARN total con 1 unidad de DNAseI (Invitrogen) durante 15 min a
temperatura ambiente. La digestión de ADNg se detuvo mediante la adición de 1 µl de EDTA y la incubación durante 10 minutos a 65 °C.
Se preparó la reacción de ADNc de la primera cadena que consta de 1 µg de ARN tratado con DNAseI, 1 µl de una mezcla de dNTP 10 mM, 1 µl
de oligonucleótido oligo(dT)12–18 y agua milliQ hasta un volumen final de 10 µl. Las muestras se incubaron a 65 °C/5 min y luego se
transfirieron inmediatamente a hielo durante 1 min. Después de la incubación en hielo, se añadió una mezcla compuesta por 2 µL de tampón
RT 10X, 4 µL de MgCl 2 25 mM, 2 µL de DTT 0,1 M y 1 µL de la enzima RNAseOUT™ 40 U/L. Las muestras se centrifugaron a velocidad máxima
durante 20 s y se incubaron a 42 °C/2 min. Después de esto, se añadió 1 µL de retrotranscriptasa SuperScript™ II RT a cada reacción y se incubó
a 42 °C durante 50 min y luego a 70 °C durante 15 min, dejándolo enfriar en hielo durante 2 a 3 min al final. del proceso. Finalmente, se añadió
1 µL de la enzima RNAsaH y la muestra se incubó con ella a 37 °C/20 min. La cantidad de ADNc obtenida se midió en un NanoDrop ND-1000.
Las muestras se almacenan a -20 °C hasta su uso.
2.5 . Análisis transcripcional y caracterización de transformantes. Técnica de PCR cuantitativa (qPCR)

Tras obtener el ADNc de las cepas de interés, se realizaron diluciones a las concentraciones finales de 100 ng/μL y 10 ng/μL en agua PCR Probe,
específicas para tal fin. Cada pocillo de reacción contenía 1 µL de la dilución correspondiente, 0,3 µL (300 nmoles) de cada uno de los
oligonucleótidos relevantes ( Tabla 2 ), 8,4 µL de agua de la sonda de PCR y 10 µL de la mezcla de reacción comercial 2x. SYBR® Green Master
Mix (Bio Rad) que incluye todos los componentes necesarios para realizar una PCR junto con SybrGreen como agente fluorescente para poder
medir los resultados. Las condiciones aplicadas fueron: preincubación a 95 °C/5 min y 40 ciclos de 95 °C/10 s + 65 °C/30 s. Para obtener la curva
de fusión se utilizó un ciclo en el que se bajó la temperatura de 95 °C a 65 °C a una velocidad de 4,4 °C cada 10 s. El equipo utilizado fue un
LightCycler96® (Roche).
Se utilizó qPCR para determinar el número de copias del gen nirA en transformantes de PO212. El ADN genómico de los transformados se utilizó
como plantilla en dos concentraciones, 10 ng/μL y 1 ng/μL. Utilizamos cebadores específicos para el gen nirA (NirAqPCRUP y NirAqPCRDW).
Ambos oligonucleótidos no tienen coincidencias entre las secuencias genómicas de PO212 y 1AM2 nirA . Las reacciones de PCR siguieron el
protocolo descrito anteriormente. Como control de un gen de copia única, amplificamos el gen de tubulina α, benA , utilizando los
oligonucleótidos PO212 benA1 y PO212 benA2 ( Tabla 2 ).
2.6 . Extracción de proteínas y análisis de inmunodetección.

La extracción de proteína total se realizó mediante el procedimiento de lisis alcalina descrito en ( Hernandez-Ortiz y Espeso, 2013 ).
Para la inmunodetección, las muestras de proteínas se sometieron a SDS-PAGE, cargando en cada carril la cantidad de muestra previamente
estimada en base a la tinción con azul de Coomassie. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot® Turbo™
Transfer Pack, Bio Rad) utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ (Bio Rad). Después de la incubación en una solución de
bloqueo (leche en polvo al 5% (p/v) en PBS), la membrana se lavó tres veces durante 5 a 10 minutos cada vez en PBS-Tween para eliminar la
solución de bloqueo. Luego se incubó con el anticuerpo primario disuelto en 5 ml de PBS-Tween con leche en polvo al 1% (p/v) durante 1 h a
temperatura ambiente con agitación. Pasado este tiempo, se lavó tres veces durante 10 min en PBS-Tween y se incubó con el anticuerpo
secundario en las mismas condiciones anteriores. Después del tiempo de incubación , la membrana se lavó 3 veces durante 10 minutos con
PBS-Tween y una vez con PBS, después de lo cual se reveló la membrana. Se utilizó un anti-GFP de ratón policlonal (1:5000; clones 7.1 y 13.1;
Sigma-Aldrich) para detectar la fusión NirA-GFP. Como anticuerpo secundario utilizamos una inmunoglobulina G anti-ratón de cabra
conjugada con peroxidasa (IgG; 1:4000; Jackson ImmunoResearch Laboratories). La actividad peroxidasa se detectó utilizando el sistema de
quimioluminiscencia ECL (GE Heathcare) como se detalla en el protocolo del fabricante y las imágenes se tomaron utilizando el sistema
ChemiDoc TM Imaging y el software Image Lab TM Touch, versión 2.2.0.08 (Bio Rad).
2.7 . Determinación in vitro de la actividad nitrato reductasa en extractos de proteína cruda.

Para determinar la actividad de la nitrato reductasa en las cepas PO212, PO212_TF7 y 1AM2 seguimos el protocolo descrito por ( Kim y Seo,
2018 ). Estas cepas se cultivaron durante 24 horas en medio mínimo líquido que contenía 1% de glucosa como fuente de carbono y cloruro de
amonio 5 mM como fuente de nitrógeno en una incubadora orbital a 25 °C. Para cada cultivo, el micelio de un inóculo de 10 6 conidios/mL se
cosechó mediante filtración a través de miracloth y se dividió en tres porciones, una se mantuvo como control y las otras dos se suspendieron
por separado en un medio mínimo que contenía 1% de glucosa pero sin suplementación. de fuente de nitrógeno y se incubaron a 25 °C durante
1 h. A continuación, se añadió nitrato de sodio a una concentración de 5 mM a una muestra y cloruro de amonio a 5 mM a la otra. Luego,
ambos cultivos se incubaron adicionalmente a 25 °C durante una hora adicional. Luego, los micelios se cosecharon y procesaron como se indica
en ( Kim y Seo, 2018 ). Brevemente, para cada muestra, el micelio húmedo recolectado se trituró en nitrógeno líquido usando un mortero. Se
suspendieron 450 mg de micelio triturado y congelado en 750 µl de tampón de extracción enfriado (Tris-HCl 250 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM,
Na2MoO4 1 µM , dinucleótido de flavina adenina (FAD) 5 µM , ditiotreitol 3 mM. , BSA al 1%, 2-mercaptoetanol 12 mM, PMSF 250 μM) y se
centrifugó a 17.000 g durante 5 min para eliminar los restos celulares. Para la reacción enzimática, se mezclaron 150 µL de extracto de proteína
con 850 µL de tampón de reacción (NaNO3 40 mM , Na2HPO4 80 mM , NaH2PO4 20 mM (pH 7,5), NADH 0,2 mM) y se incubaron durante 2 h a 25 °C.
Para medir la producción de nitrito, este protocolo utiliza el reactivo de Griess, mezclando 200 l de sulfanilamida al 1% (preparada en HCl 3 M)
y clorhidrato de etilendiamina N-(1-naftil) al 0,05%. Se prepararon blancos mezclando inmediatamente la reacción enzimática y la mezcla de
reactivos de Griess. Después de una incubación durante 15 min a 25 °C, se tomó 1 ml de cada muestra y se determinó la absorbancia a 540 nm.
La actividad de la nitrato reductasa se calculó como la diferencia en el contenido de nitrito de la reacción entre las muestras incubadas y en
blanco. Se utilizó una curva estándar de nitrito para estimar la concentración de nitrito. En nuestros ensayos, la concentración más baja de
nitrito detectada fue de 5 μM.
2.8 . Microscopio fluorescente

Para la detección de la proteína de fusión NirA-GFP mediante microscopía de epifluorescencia, se cultivó la cepa NirA-GFP (transformante n.°
1II) durante 24 h a 25 °C en medio mínimo reloj (WMM, ( Penalva, 2005 )) suplementado con amonio 5 mM. tartrato como fuente de
nitrógeno. Las células fúngicas se cultivaron en portaobjetos de 8 pocillos (Ibidi) que contenían 300 µl de WMM. La inducción de la localización
nuclear de NirA-GFP se realizó reemplazando el medio de cultivo por WMM fresco que contenía nitrato de sodio 10 mM. Las muestras se
analizaron con un microscopio de fluorescencia invertido Leica DMI6000b equipado con un objetivo de inmersión 60X Plan APO 1.4 y filtros
adecuados para la observación de GFP (excitación a 470 nm y emisión a 525 nm). Las imágenes se adquirieron con una cámara ORCA ER
(Hamamatsu) y se procesaron utilizando el software ImageJ ( //imagej.nih.gov/ij ; NIH, EE. UU.).
2.9 . Experimentos de eficacia de biocontrol en plantas de tomate.

Para probar el efecto de la nitmutación sobre la eficacia de PO212 contra FOL1A , se llevaron a cabo experimentos en cámara de crecimiento en
plantas de tomate como se describe en ( Larena y Melgarejo, 2009 ). Se sembraron semillas de tomate (cv. San Pedro) en bandejas (1200 cm 2 )
que contenían una mezcla tratada en autoclave de vermiculita (Termita, Asfaltex, SA) y turba (Gebr. BRILL sustrato GmbH & Co. KG) (1:1, v: v), y
se mantuvo en una cámara de crecimiento a 22–28 °C con luz fluorescente (100 µE/m 2 s, fotoperíodo de 16 h) y 80–100% de humedad durante
3 semanas. Se realizaron dos ensayos: i) el primer ensayo (ensayo 1) agrupó las cepas PO212 y PO212_NirA 1AM2 , y ii) el segundo ensayo
(ensayo 2) agrupó las cepas PO212 y CH8. Las plántulas en almácigos fueron regadas 7 días antes del trasplante con dos tratamientos
diferentes: i) una suspensión de conidios de PO212 (10 6 conidios/g de sustrato); ii) una suspensión de conidios de PO212_NirA 1AM2 y CH8 (10
6 conidios/g de sustrato); iii) agua destilada estéril (SDW) como control. Siete días después de los tratamientos, se trasplantaron plántulas de
tomate de los semilleros a matraces que contenían una solución Hoagland estéril como se describe en ( De Cal et al., 1997 ). Se añadió FOL1A (
105-106 conidios /ml) a los matraces justo antes del trasplante. Hubo dos tipos de controles en los ensayos: (1) plantas no tratadas con BCA pero
inoculadas con el patógeno (FOL1A) (plantas no tratadas/inoculadas); (2) plantas no tratadas con BCA ni inoculadas con el patógeno (FOL1A)
(plantas no tratadas/no inoculadas). Para cada tratamiento se utilizaron cinco matraces repetidos, cada uno con cuatro plantas. Los matraces se
colocaron en una cámara de crecimiento durante 26 días en las condiciones descritas anteriormente. El desarrollo de la enfermedad causada
por FOL1A en plantas de tomate se evaluó cada semana hasta 26 días después del trasplante. Cada tipo de experimento se llevó a cabo dos
veces. La densidad de P. rubens en el sustrato del semillero y en la rizosfera de tres plantas por tratamiento se estimó justo antes del trasplante
como unidad formadora de colonias (UFC) por gramo de suelo seco y raíz fresca, respectivamente, como se describe en ( Larena et al. , 2003 ).
Cada 7 días después del trasplante se evaluaron los siguientes parámetros: consumo de solución nutritiva por planta, frasco y día; número de
hojas por planta; e índice de enfermedad en hojas según escala descrita en ( De Cal et al., 1995 ). La gravedad de la enfermedad y el área bajo la
curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) se calcularon utilizando el índice de enfermedad que se describe a continuación para cada
tratamiento ( Campbell y Madden, 1990).). Al finalizar el experimento se pesaron las raíces y partes aéreas por matraz.
2.10 . Análisis de los datos

El área bajo la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC) se calculó al final del experimento como lo describen Campbell y Madden (1990) ,
utilizando la fórmula:
donde t son los días después del trasplante (experimentos en cámara de crecimiento), d es la gravedad de la enfermedad (%) para cada planta y
n es el número de muestras. El ABCP para cada tratamiento se calculó utilizando el software Excel (Microsoft® Office Excel 2003).
Los datos fueron analizados mediante análisis factorial de varianza. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statgraphics Plus para
Windows v. 4.1 (StatPoint, Inc. Herndon, VA.). Cuando la prueba F fue significativa en P = 0,05, las medias se compararon mediante la prueba
de rango de Student-Newman-Keuls ( Snedecor y Cochran, 1980 ). Los datos de porcentaje de gravedad de la enfermedad, AUDPC y consumo
de solución se sometieron a transformación cuando fue necesario.
3 . Resultados
3.1 . Reducción de la utilización de nitratos por parte del BCA PO212

Al aislar mutaciones auxotróficas espontáneas en la cepa BCA PO212 para usar en procedimientos de transformación, se calificó la tolerancia a
varios compuestos tóxicos, incluido el 5-FOA ( Villarino et al., 2016 ) y el clorato de potasio (KClO 3 ). La Fig. 1 A muestra que la cepa PO212
toleró hasta 500 mM de KClO 3 en comparación con el productor industrial de penicilina y la cepa de referencia PcWis 54-1255 y con nuestra
cepa de control P. chrysogenum 1AM2. Por ejemplo, PO212 y 1AM2 crecieron mejor que PcWis 54-1255 en PDA. PO212 creció bien en PDA que
contenía KClO 3 500 mM en contraste con las otras dos cepas que presentaron una fuerte reducción en el crecimiento colonial ( Fig. 1 A). Dado
que el clorato se vuelve tóxico para las células cuando se convierte en clorito por la actividad de la nitrato reductasa (revisado en ( Scazzocchio
y Arst, 1989 )), la tolerancia de PO212 a concentraciones elevadas de clorato sugirió que los niveles de nitrato reductasa o su actividad se verían
fuertemente afectados. Probamos la capacidad de PO212 para crecer en PDA suplementado con nitrato, sin encontrar diferencias en el
crecimiento colonial entre cepas ( Fig. 1 A), probablemente debido a la complejidad de nutrientes del PDA. Por lo tanto, abordamos pruebas de
crecimiento utilizando MM sólido que restringe el acceso de las cepas de hongos a otras posibles fuentes de nitrógeno presentes en PDA ( Fig. 1
B). Se comparó el crecimiento de PcWis 54-1255, 1AM2 y PO212 cuando se inocularon en MM sólido que contenía 1% de D-glucosa como
fuente de carbono y en presencia de diferentes fuentes de nitrógeno ( Fig. 1 B). Las tres cepas crecieron bien en MM que contenía tartrato de
amonio 5 mM y cloruro de amonio 5 mM ( Fig. 1 B). PO212 mostró una fuerte reducción en el crecimiento cuando se agregaron nitrato de sodio
5 mM o nitrito de sodio 5 mM al MM como fuentes principales de nitrógeno ( Fig. 1 B). Las pruebas de crecimiento generales indicaron que la
resistencia de PO212 a altas concentraciones de clorato puede depender de las bajas actividades de las nitrato y nitrito reductasas.
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Figura 1 . Crecimiento colonial de P. rubens cepa 212 (PO212), P. rubens (chrysogenum) Wisconsin 54-1255 (PcWis 54-1255) y P. rubens
1AM2 . (A) Comparación del crecimiento colonial de las cepas PO212, PcWis 54-1255 y 1AM2 en medio PDA y cuando se complementa con
clorato de potasio 500 mM (KClO 3 ) con o sin adición adicional de nitrato. (B) Comparación del crecimiento colonial de las cepas PO212, PcWis
54-1255 y 1AM2 en medio mínimo (MM) suplementado con diferentes fuentes de nitrógeno mineral. Todas las cepas se cultivaron durante 5
días a 25 °C. Las concentraciones de nitrato, tartrato de amonio, cloruro de amonio, nitrito y clorato se indican a la derecha de cada fila.
3.2 . Identificación de cambios de nucleótidos en los genes de la vía de asimilación de nitrato PO212.
Con base en nuestro trabajo previo para la identificación de PO212 como miembro de la especie P. rubens ( chrysogenum ) ( Villarino et al., 2016
), utilizamos la base de datos genómica PcWis 54-1255 para diseñar cebadores específicos para la amplificación y secuenciación de genes que
pertenecen a la vía de asimilación de nitrato en el genoma PO212 (consulte la Tabla 2 para oligonucleótidos y la Tabla 3 para genes bajo
análisis). Luego amplificamos fragmentos genómicos para los genes niaD , niiA y crnA que codifican las enzimas reductasa y la nitrato permeasa
, y genes que codifican reguladores transcripcionales específicos, nirA , y generales, nre1 , de esta vía ( Fig. 2 A). Curiosamente, encontramos un
número bajo de cambios de nucleótidos (nt) entre las secuencias genómicas de PO212 y PcWis 54-1255 de referencia. En comparación con las
secuencias genómicas de PcWis 54-1255, se encontraron dos cambios de nt (SNP) en nre (PO212_nre1 ) y un único cambio de nt en las
secuencias nirA (PO212_nirA ) y niiA (PO212_niiA ) . El hallazgo de 4 SNP en más de 14 kb de genoma secuenciado ( Tabla 3 ) indicó claramente
la fuerte conservación entre las secuencias genómicas de PO212 y P. rubens Wisconsin 544-1255.
Tabla 3 . Genes relacionados con el metabolismo de nitratos en Penicillium spp.
Nombre del lugar ID del banco de germoplasma nombre del gen % Identidad PO212 a vs PcWis 54-1255 b (sobre secuencia
PO212 genómica)
nre XM_002566290.1 nre1 2948/2950 (99%)

regulador de nitrógeno, áreaA probablemente error de A/C y G/C
secuencia
Pc21g07150, regulador de nitrato nirA XM_002567710.1 nira 2716/2717 (99%)

T/C no coincide con el codón CAA con TAA
Pc13g11410, nitrato reductasa niaD XM_002559513.1 niaD 100% sobre 2944/2944 nt
Pc13g11420, niiA XM_002559514.1 niia 99 % sobre 3699/3700 nt

nitrito reductasa desajuste C/T
Pc13g11470, transportador de nitrato XM_002559518.1 crnA 100% 1779/1779 nt

crnA
a
PO212, cepa 212 de Penicillium rubens .
b
PcWis 54-1255, cepa 54-1255 de P. rubens (chrysogenum).
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Figura 2 . Vía reguladora de NirA y mutación nirA1 en la cepa PO212. ( A) Representación esquemática de la vía de asimilación de nitrato en
PO212. Los genes niaD , niiA y crnA codifican enzimas reductasa y nitrato permeasa , y genes que codifican reguladores transcripcionales
específicos, nirA , y generales, nre1 . (B) Representación gráfica de la mutación nirA1 encontrada en PO212. Se indican el dominio de unión al
ADN que consiste en un grupo binuclear de zinc (Zn(II)2Cys6) y la región de homología media reguladora del factor de transcripción fúngica
(TF MHR). nirA1 , trunca NirA en la posición 261.
En PO212_niiA , el SNP identificado se ubica en el quinto intrón, lo que, como era de esperar, no afecta la secuencia de proteínas de la nitrito
reductasa. En PO212_nre1 , los dos SNP identificados tienen efectos diferentes; la transversión G/C tiene un efecto silencioso sobre el codón de
Thr208 en la secuencia KZN90283.1 de PcWis 54-1255 Nre (ref PMID: 25059858). Sin embargo, la transversión A/C da como resultado el
cambio del residuo glutámico 73 a una alanina en PO212_Nre1.
Pero en PO212_nirA , la transversión de C a T encontrada cambia el codón CAA para la glutamina 262 en un codón de parada TAA . Este SNP
provoca el truncamiento de la proteína NirA en PO212 en el aminoácido 261 que carece de 2/3 de la proteína hipotética en comparación con la
proteína NirA Pc21g07150 en PcWis 54-1255 ( Fig. 2 B). NirA es un factor de transcripción de grupo binuclear de zinc (Zn(II)2Cys6), y la
mutación encontrada en el gen PO212_ nirA , denominada nirA1 , trunca NirA en la región de homología media reguladora del factor de
transcripción fúngica predicha (TF MHR) sin afectar el dominio de unión al ADN. (ver figura 2 B).
El codón de parada encontrado en la secuencia genómica PO212_nirA podría ser responsable del fenotipo observado deficiente en nitrato, nit- ,
de PO212, ya que es un regulador específico de la vía que media en la regulación transcripcional de los genes codificantes de las nitrato y
nitrito reductasas ( Birkett y Rowlands, 1981 ), Modelo en la Fig. 2 A). Sin embargo, la presencia de un cambio de aminoácido en el regulador
general de nitrógeno Nre podría ser aditivo a la presencia de la mutación nirA1 . Luego buscamos en las bases de datos genómicas disponibles
de cepas de P. rubens/chrysogenum la presencia de un cambio de aminoácido similar en Nre. Pc3 (IB08/921), un aislado austriaco ( Böhm et al.,
2015 ), porta los mismos dos SNP que encontramos en Nre de PO212 sin ningún cambio adicional a lo largo de la secuencia codificante.
También verificamos que la secuencia de nirA en el genoma de Pc3 tenía un 100% de identidad con nirA en PcWis 54-1255.
La Fig. 1 muestra el crecimiento de P. chrysogenum 1AM2 en PDA y MM, y la sensibilidad al clorato que se correlaciona con su capacidad para
utilizar nitrato como fuente principal de nitrógeno ( Fig. 1 A-B). Además, el crecimiento de 1AM2 en MM suplementado con nitrato debe estar
respaldado por un sistema regulador funcional para el metabolismo de los nitratos. La secuenciación de nirA en 1AM2 mostró la presencia de
29 SNP en comparación con la secuencia nirA de PcWis 54-1255 . La mayoría de estos cambios afectaron a la tercera base de los codones, pero
encontramos cambios de 6 aminoácidos entre las secuencias de la proteína NirA de P. chrysogenum 1AM2 y PcWis 54-1255 ( Fig. 1
complementaria ). Este resultado contrastó con la fuerte conservación de las secuencias de nirA y otros genes relacionados con el nitrógeno en
los genomas PO212, Pc3 y PcWis 54-1255.
3.3 . Complementación de la mutación nirA1 en PO212.

No hay evidencia de que la cepa Pc3 exhibiera un fenotipo nit asociado a aquellas variaciones alélicas presentes en su locus Nre ( Böhm et al.,
2015 ) que también se encontraron en PO212. Por lo tanto, nos centramos en el posible efecto de la mutación nirA1 encontrada en PO212.
Transformamos PO212, siguiendo el protocolo mediado por protoplastos y calcio/PEG ( Villarino et al., 2018 ), con un fragmento de ADN
genómico de 4,8 kb que comprende el CDS y las UTR 5' y 3' del locus nirA de P. chrysogenum 1AM2 ( Fig. 3). A). Este fragmento de ADN se
obtuvo mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores NirAPO-GSP1 y NirAPO-GSP4 ( Tabla 2 ) como se indica en la Fig. 3 A. El
medio de regeneración selectiva para transformantes positivos contenía nitrato de sodio 5 mM como fuente única de nitrógeno. Después de la
purificación hasta homocariosis, seleccionamos varios transformantes para un estudio más detallado. Los transformantes TF2, TF7, TF9 y TF13
crecieron bien en MM suplementado con nitrato al igual que la cepa 1AM2; sin embargo, el crecimiento en MM que contenía nitrito de sodio 5
mM fue deficiente para todas las cepas que analizamos ( Fig. 3 B). Para todos los transformantes analizados, encontramos que el gen endógeno
PO212 nirA estaba presente ( Figura complementaria 2 ). Un análisis de PCR adicional utilizando los pares de oligonucleótidos externos NirA-
UP y NirA-DW ( Tabla 2 ) mostró la integración ectópica del casete 1AM2 nirA en todos los transformantes seleccionados, que portaban una
sola copia de TF2, TF7 y TF9, y dos copias de TF13 ( Figura complementaria. 2 ).

Fig. 3 . Complementación de la mutación nirA1 . ( A) Representación esquemática de la estrategia de reemplazo de genes para complementar
la mutación nirA1 . Se utilizó un fragmento de ADN que comprende el CDS y las UTR 5' y 3' del locus nirA de la cepa 1AM2 de P.
chyrsogenum/rubens para la transformación de la cepa 212 (PO212) de P. rubens . (B) Pruebas de crecimiento que muestran la capacidad de
varios transformantes que expresan NirA 1AM2 para crecer en MM suplementado con nitrato 5 mM o amonio 5 mM como control. Todas las
cepas analizadas crecieron mal en MM que contenía nitrito 5 mM. (C) Evaluación de los niveles de expresión de los genes niaD y niiA en PO212,
transformante PO212_TF7 (PO212_NirA 1AM2 ) y 1AM2 en presencia de nitrato y amonio. Se muestran barras de desviación estándar. (D)
Cuantificación de la actividad de la nitrato reductasa medida como producción de nmoles de NO 2 - por gramo de micelio de peso fresco (FW) y
por hora de reacción. Se muestran barras de desviación estándar.
Para confirmar el efecto negativo de la mutación nirA1 en la expresión de genes de asimilación de nitrato, analizamos los niveles de expresión
de los genes codificantes de nitrato reductasa ( niaD ) y nitrito reductasa ( niiA ) en PO212 y los comparamos con los encontrados en 1AM2 y en
uno de los transformantes. llevando una copia de 1AM2 nirA (PO212_TF7). Como se muestra en la Fig. 3 C, la expresión de los genes niaD y niiA
fue detectable en PO212; sin embargo, sus niveles de expresión no aumentaron cuando había nitrato presente en el medio. Por el contrario, P.
chrysogenum 1AM2 mostró la regulación esperada para los genes niaD y niiA , expresándose en niveles muy bajos en presencia de amonio pero
regulada positivamente cuando se reemplaza por nitrato. De acuerdo con la capacidad de la cepa TF7 (PO212_NirA 1AM2 ) para crecer en MM
que contiene nitrato, este transformante recuperó la regulación dependiente de nitrato de los genes niaD y niiA ( Fig. 3 C). La medición in vitro
de la actividad de la nitrato reductasa en PO212, TF7 transformante y 1AM2 confirmó la ausencia de actividad NiaD en PO212, pero una
actividad NiaD inducida por nitrato en TF7 y 1AM2 ( Fig. 3 D). Estos resultados demuestran que el fenotipo deficiente en nitrato causado por la
mutación nirA1 puede interpretarse como una regulación negativa de los genes que codifican las nitrato y nitrito reductasas y una fuerte
reducción en la actividad de la nitrato reductasa.
3.4 . Regulación de NirA en PO212, evidencia de una importación nuclear de NirA en Penicillium dependiente de
nitrato
Para promover el reemplazo de genes en el locus nirA1 mutante , seguimos la técnica de etiquetado de locus utilizada en A. nidulans ( Nayak et
al., 2006 ). Se construyó un fragmento de ADN lineal mediante procedimientos de PCR de fusión uniendo la región 5'UTR + CDS de 1AM2 nirA a
la secuencia codificante de GFP y al gen pyrG de A. fumigatus , terminando con un fragmento 3'UTR de 1,5 pb del locus endógeno PO212 nirA. (
Figura 4A ). Seleccionamos transformantes de la cepa receptora pyrG1 PO212_18.2 complementando la auxotrofia de pirimidina causada por la
mutación pyrG1 . Los transformantes capaces de crecer en un medio selectivo que carecía de uracilo y uridina ( pyrG +) se calificaron
posteriormente por su capacidad de crecer en MM suplementado con nitrato ( Fig. 4 B). La mayoría de los transformantes analizados pudieron
crecer en estas condiciones selectivas, así como en un medio que contenía amonio ( Fig. 4 B), lo que indica la complementación de las
mutaciones nirA1 y pyrG1 por el casete de ADN. Los transformantes #1II, #2II, #3II y #4II fueron seleccionados debido a su capacidad de crecer
en medio suplementado con nitrato, pero también analizamos los transformantes #9II y #12II debido a la complementación parcial del
fenotipo nit ( Fig. 4 B). ). La secuenciación de fragmentos genómicos amplificados por PCR de transformantes con oligonucleótidos NirAPO-
GSP1 y NirAPO-GSP2 mostró la integración del casete de ADN en el locus nirA para los transformantes #1II, #3II y #4II, pero integraciones
ectópicas para los transformantes #2II, #9II y #12II. La presencia de la etiqueta GFP en estas cepas permitiría la visualización de la proteína de
fusión nirA en transferencias Western y mediante microscopía de epifluorescencia. Los análisis de inmunodetección detectaron la fusión NirA-
GFP en extractos de proteínas totales de los transformantes #1II, #2II, #3II y #4II. Aunque con diferentes intensidades, se visualizó una banda
con una movilidad cercana a 150 kDa que encajaba bien con el peso molecular previsto de 117 kDa para la fusión NirA-GFP ( Fig. 4 C). Cabe
mencionar que los transformantes ectópicos #9II y #12II no mostraron la banda esperada para la fusión NirA-GFP. Sospechamos que la
complementación parcial del fenotipo nit en estos transformantes es una consecuencia de sus integraciones y/o reorganizaciones ectópicas
después de la recombinación para incorporar el gen pyrG de A. fumigatus ya que este fue la base de la selección después de la transformación (
Figura 4 B-C)

Figura 4 . Análisis funcional, de expresión y localización de NirA-GFP en PO212. (A) Esquema del procedimiento de reemplazo de genes para
la construcción de PO212_NirA-GFP mediante la sustitución del locus mutante nirA1 por el gen 1AM2-nirA fusionado a la secuencia
codificante de GFP . Como marcador de selección se utilizó el gen pyrG de A. fumigatus . Se utilizaron 5'UTR y 3'UTR para promover la
recombinación homóloga . (B) Pruebas de crecimiento de transformantes seleccionados que supuestamente expresan NirA 1AM2 -GFP en
medios mínimos suplementados con amonio o nitrato. Se indican los transformantes #1II, #2II, #3II y #4II que fueron seleccionados debido a
su capacidad para crecer en medio suplementado con nitrato. También se analizaron los transformantes #9II y #12II porque exhibieron una
complementación parcial del fenotipo nit . (C) Análisis de inmunodetección de la fusión NirA-GFP en extractos de proteínas totales de los
transformantes #12II, #9II, #1II, #2II, #3II y #4II. Se indica la banda correspondiente a una versión completa de la fusión NirA-GFP y su Mw
deducido. La punta de flecha indica una versión fragmentada de esta quimera. (D) Análisis de los niveles de NirA-GFP en el transformante #1II
cuando se cultiva en MM suplementado con amonio o nitrato y luego se transfiere a medios nuevos que contienen nitrato o amonio,
respectivamente. Enzima hexoquinasa citoplasmática utilizada como control de carga. Se cuantificó la intensidad de quimioluminiscencia de
cada banda y se muestra una relación GFP/HXK. (E) Visualización de NirA-GFP en el transformante #1II. Distribución uniforme de la
fluorescencia a lo largo de las hifas en presencia de amonio y acumulación nuclear cuando el medio fue reemplazado por MM suplementado
con nitrato. Barras de escala de 5 μm.
Dado que NirA es un factor de transcripción de grupo binuclear de zinc sujeto a activación postraduccional por nitrato ( Burger et al., 1991 ),
observamos que los niveles de NirA-GFP no cambiaron cuando se cambió la fuente de nitrógeno en el medio de las condiciones represoras.
(amonio) a condiciones inductoras (nitrato) y viceversa (ver relaciones GFP/HXK en la Fig. 4 D). Sin embargo, estas proporciones fueron
menores en los micelios inicialmente cultivados en nitrato. Microscópicamente, NirA-GFP mostró una localización citoplasmática difusa en
presencia de amonio que cambió de una ubicación citoplasmática a nuclear cuando el nitrato estaba presente en el medio ( Fig. 4 E).
3.5 . Caracterización de una cepa de P. rubens portadora de una mutación en el gen que codifica la nitrato
permeasa CrnA
El aislado CH8 mostró incapacidad para crecer en MM suplementado con nitrato ( Fig. 5 A). Se secuenciaron genes relacionados con la vía de
asimilación de nitratos en CH8 y se compararon con los de PO212. No se encontraron cambios en las secuencias genómicas de niaD , niiA y nre1.
CH8 contiene un gen nirA de tipo salvaje , pero el gen que codifica la nitrato permeasa CrnA presentó una inserción de una G en la posición 1640
del codón de iniciación. Esta mutación se denominó crnA1 y provoca un cambio de marco dentro del CDS del quinto exón. En PO212, como en
PcWis 54-1255, crnA codifica un polipéptido 533 organizado de manera predecible en 12 dominios transmembrana (TM) que se ubicarán en la
membrana plasmática. La proteína CrnA1 mutante lleva una cola fuera de marco de 28 aminoácidos después de Gly466. Se muestran
topologías hipotéticas de proteínas CrnA mutantes y de tipo salvaje, predichas utilizando Protter Omasits et al. (2014) , en la figura
complementaria 3 . Como era de esperar, el transportador mutante CrnA1 carece de las dos últimas TM.

Figura 5 . Análisis comparativo del fenotipo nit de cepas de Penicillium y transformantes, CH8, CH8_7, CH8_rev5, PO212, PO212_TF7 y
1AM2. (A) Pruebas de crecimiento que muestran la capacidad de utilizar nitrato como fuente de nitrógeno mediante cepas complementadas o
revertidas. La sensibilidad de la cepa CH8 al clorato sugiere la presencia de un sistema de transporte alternativo para el clorato. La resistencia
del PO212 al clorato se debe a la ausencia de un regulador NirA funcional. (B) Pruebas que muestran la ausencia de crecimiento colonial en un
medio que contiene nitrito como fuente principal de nitrógeno en comparación con otras fuentes alternativas de nitrógeno como la prolina
(Pro) o la urea. La combinación de estas fuentes alternativas de nitrógeno con nitrito permitió el crecimiento de todas las cepas con excepción
de PO212. En el texto se da una interpretación de este fenotipo. Todas las cepas se cultivaron durante 5 días a 25 °C usando MM (medio
mínimo) y se complementaron con las concentraciones de fuentes de nitrógeno y clorato que se muestran en la parte superior de cada
columna.
Para demostrar que la mutación crnA1 es responsable del fenotipo nit de CH8, generamos una cepa crnA + complementada. Se amplificó un
fragmento de ADN de 1,9 kb que comprende la región codificante de CrnA a partir de ADN genómico de PO212 utilizando los cebadores crnA-1
y crnA-2 ( Tabla 2 ). La cepa CH8 se transformó con este fragmento y como control realizamos un segundo experimento de transformación
utilizando el mismo fragmento pero obtenido a partir de ADN genómico de CH8. En medio mínimo selectivo que contenía nitrato 5 mM,
observamos abundantes transformantes putativos en ambos experimentos de transformación. Seleccionamos varios de estos transformantes y,
después de la purificación hasta homocariosis, se caracterizaron mediante PCR y secuenciación adicional (ver estrategia de caracterización en
la Fig. 4 complementaria , oligonucleótidos en la Tabla 2 ). Entre los transformantes putativos que utilizan el fragmento crnA +, encontramos el
transformante CH8_7 que portaba una copia de la construcción insertada en el locus crnA1 de CH8 pero que no reemplazaba el gen mutante
endógeno ( Fig. 4 complementaria ). En otros transformantes putativos, detectamos un fenómeno de reversión de la mutación crnA1 . Entre
estas cepas encontramos la eliminación de una guanina en la región rica en guanina donde se localiza la mutación crnA1 , lo que restableció el
marco de lectura abierto de los mutantes a una secuencia de tipo salvaje. Entre estos revertidos seleccionamos la cepa CH8_rev5 para una
mayor caracterización.
La cepa CH8_7 complementada, que expresa CrnA de PO212, pudo crecer en nitrato de manera similar a la cepa PO212_TF7 complementada
que expresa NirA 1AM2 y 1AM2 ( Fig. 5 A). En comparación con PO212, CH8 es muy sensible al clorato y la restauración de la actividad de CrnA
en CH8_7 solo acentuó este fenotipo ( Fig. 5 A). Estos resultados respaldan el papel de CrnA en el metabolismo del nitrato, actuando como
transportador de este anión en la membrana plasmática y la presencia de una vía alternativa para la entrada de clorato en la célula.
3.6 . Metabolismo de nitritos en cepas PO212, CH8 y 1AM2.

La acumulación de nitrito en las células causa trastornos metabólicos nocivos, como la generación de especies reactivas de NO y el agotamiento
de las reservas de ATP ( Cabrera et al., 2014 ). El pobre crecimiento de todas las cepas utilizadas en este estudio en medio sólido suplementado
con nitrito 5 mM sugiere una deficiencia en la regulación del contenido de nitrito en estas cepas ( Fig. 5 B). Luego decidimos investigar si el
pobre crecimiento de nitrito podría deberse a un sistema de transporte ineficiente o a la toxicidad intracelular del nitrito. Para ello,
combinamos nitrito con una fuente alternativa de nitrógeno, como prolina 5 mM o urea 5 mM, que no reprimen las fuentes de nitrógeno. El
aislado de CH8 y las cepas derivadas, CH8_7 y CH8_rev5 crecieron bien en un medio que contenía cualquiera de estos dos compuestos como
fuente principal de nitrógeno y también lo hicieron cuando se mezclaron con nitrito 5 mM ( Fig. 5 B), lo que indica que el transportador CrnA
no tiene ningún papel en esta sensibilidad a nitrito. Por el contrario, el crecimiento deficiente de PO212 en comparación con la cepa
complementada PO212_TF7 en medio suplementado con nitrito y fuentes alternativas de nitrógeno indica la necesidad de un gen nirA
funcional para prevenir la toxicidad de los nitritos. Se plantea la hipótesis de que un sistema de desintoxicación de nitritos dependiente de
NirA remediará la acumulación inadecuada de este anión en la célula.
3.7 . La eficacia del biocontrol de las cepas PO212_NirA 1AM2 y CH8.

Para evaluar el papel de nirA1 en BA de PO212, realizamos una serie de experimentos de eficacia de biocontrol en plantas de tomate en
cámaras de crecimiento. Determinamos si el PO212_NirA 1AM2 (transformante TF7) retenía la capacidad de PO212 para reducir la enfermedad
causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate.
Como se describe en materiales y métodos, se inocularon cepas de Penicillium en el semillero 7 días antes del trasplante de plantas de tomate
en matraces que contenían solución de Hogland. La viabilidad de los conidios de ambas cepas fue comparable al momento de la aplicación y
superior al 90%. Para garantizar la colonización por cepas de PO212, se estimaron las poblaciones de PO212 justo antes del trasplante a
matraces. La carga fúngica de PO212 y PO212_NirA 1AM2 fue similar en las raíces y en el sustrato del semillero, 10 5 –10 6 UFC g −1 de peso de
raíz fresca (g de peso de sustrato seco). Además verificamos la ausencia de PO212 y PO212_NirA 1AM2 ya sea en la rizosfera o en el sustrato de
las plántulas de las plantas no tratadas en cualquiera de los ensayos.
Como control, en todos los ensayos no se observaron síntomas de la enfermedad en plantas no inoculadas con el patógeno o cuando solo se
utilizaron las cepas PO212 o PO212_NirA 1AM2 . Las plantas inoculadas con el patógeno FOL1A pero no tratadas con Penicillium mostraron una
gravedad de la enfermedad del 51,87 % ( Tabla 4 ). En comparación con las plantas de control no tratadas, los tratamientos con PO212 y
PO212_NirA 1AM2 redujeron significativamente ( P ≥ 0,05) la gravedad de la enfermedad causada por FOL1A con una reducción de un 40% y un
26,5%, respectivamente. El AUDPC también mostró una reducción del 67% y 18,5%, respectivamente) ( Tabla 4 ). Sin embargo los porcentajes de
severidad de la enfermedad y ABCP fueron significativamente diferentes ( P ≥ 0.05) entre los tratamientos con PO212 y PO212_NirA 1AM2 ,
siendo PO212 la cepa que reduce la enfermedad de manera más efectiva ( Tabla 4 ). Las dos cepas de Penicillium no afectaron el consumo de
solución, hojas número y peso del tallo y la raíz de plantas de control infectadas o no tratadas ( Tabla 4 ). PO212_NirA 1AM2 mantuvo la
capacidad de biocontrol de la cepa wt (PO212) aunque disminuyó sus niveles de eficacia. Este resultado indica que la mutación nirA1 no es
totalmente responsable de la BA de PO212, pero sugiere un papel importante del metabolismo del nitrógeno en el proceso de biocontrol.
Tabla 4 . Efecto de los tratamientos con Penicillium rubens 212 cepa (PO212) y PO212_NirA 1AM2 sobre el desarrollo de la enfermedad causada
por Fusarium oxysporum f. sp lycopersici (FOL1A) en plantas de tomate cv San Pedro cultivadas en cámara de crecimiento a los 26 días después
del trasplante.
Designación del ensayo y cepas utilizadas. % Gravedad de la AUDPC (3) Consumo de solución N Peso del Peso de raíz
enfermedad (2) (ml/planta día) hojas/planta tallo (g) (g)
ACB Patógeno
(1) FOL1A
PO212 + + 30,7 (1,6)c 247,12(0,4)c 6.2b 7.1b 14.8b 11.8a
PO212_NirA 1AM2 + + 38,1 (1,7)b 610,9 (0,4)b 6.1b 7.5b 17.8b 13.7a
Control no tratado – + 51,9 (1,8)a 749,7 (0,3)a 5.7b 6.8b 17.8b 13.0a
Control no tratado y no – – 0 (0) re 0 (1,0) d 10.4a 8.8 un 31,6 un 13.7a

inoculado
MSdentro (0,00741) (0,00021) 1.02103 1.81382 11.1965 2.75825
Los datos son la media de cinco réplicas con cuatro plantas por réplica. Las medias seguidas de la misma letra en cada columna no son significativamente
diferentes ( P ≥ 0,05) según la prueba de rango de Student-Newman-Keuĺ. ABCP es el área bajo la curva de progreso de la enfermedad estimada como se describe
en Campbell y Madden (1990) . (1) BCA, agente de biocontrol (PO212 o PO212_NirA 1AM2 ). (2) El porcentaje de datos de gravedad de la enfermedad entre
paréntesis se sometió a una transformación log 10 (x + 10). (3) Los datos AUDPC entre paréntesis se sometieron a una transformación 1/log 10 (x + 10). MS dentro es el
error cuadrático medio.
Como otro aislado de liendre , evaluamos la capacidad de biocontrol del CH8 y lo comparamos con el PO212. CH8 redujo significativamente el
porcentaje de gravedad de la enfermedad causada por FOL1A, superando la reducción del 50 % ( Tabla 5 ). La gravedad de la enfermedad en las
plantas no tratadas y en las inoculadas con FOL1A mostró un 69,73% ( Tabla 5 ). Además, PO212 y CH8 aumentaron significativamente ( P ≥
0,05) el número de hojas y el peso del tallo y la raíz en las plantas infectadas en comparación con las plantas de control inoculadas con FOL1A
no tratadas, excepto el consumo de solución ( Tabla 5 ). Estos resultados demuestran que CH8 es otra cepa de P. rubens eficaz para reducir la
enfermedad causada por FOL1A.
Tabla 5 . Efecto de los tratamientos con Penicillium rubens 212 (PO212) y CH8 sobre el desarrollo de la enfermedad causada por Fusarium
oxysporum f. sp lycopersici (FOL1A) en plantas de tomate cv San Pedro cultivadas en cámara de crecimiento a los 20 días después del trasplante.
Designación del ensayo y cepas utilizadas. % Gravedad de la AUDPC Consumo de solución N Peso del Peso de
enfermedad (2) (ml/planta día) (3) hojas/planta tallo (g) raíz (g)
ACB Patógeno
(1) FOL1A
PO212 + + 32.5b 587.5b 2,9 (11,2)b 7,1 a.C. 11.6b 9.5b
CH8 + + 26.2b 389.4c 2,6 (9,9) segundo 7.5b 14.0b 11.1b
Control no tratado – + 69,7 un 968,7 un 0,7 (2,8)b 6.3c 2.9c 4.4c
Control no tratado y no – – 0c 0 días 13,2 (62,3)a 11.3a 49.2a 26,9a

inoculado
EM dentro 256,73 30200.6 (33.81) 1,94 21.32 13.58
Los datos son la media de cinco réplicas con cuatro plantas por réplica. Las medias seguidas de la misma letra en cada columna no son significativamente
diferentes ( P ≥ 0,05) según la prueba de rango de Student-Newman-Keuĺ. (1) BCA, agente de biocontrol (PO212 o CH8). (2) ABCPC es el área bajo la curva de
progreso de la enfermedad estimada como se describe en Campbell y Madden (1990) . (3) Los datos de consumo de solución entre paréntesis se sometieron a una
transformación asin (x/15). MS dentro es el error cuadrático medio.
4 . Discusión
Las cepas PO212 y CH8 de Penicillium chrysogenum/rubens comparten una característica común de su incapacidad para asimilar nitrato como
fuente de nitrógeno. De hecho, las diferencias son visibles entre las cepas que muestran un crecimiento limitado pero apreciable de PO212 en
MM que contiene nitrato o nitrito y CH8 que casi no muestra crecimiento alguno. La secuenciación de genes que codifican enzimas y
transportadores de nitrato y sus reguladores transcripcionales ha revelado la presencia de mutaciones interesantes. PO212 porta una mutación
en el gen que codifica el factor transcripcional específico de ruta NirA. La mutación nirA1 elimina dos tercios de la proteína manteniendo el
dominio de unión al ADN. nirA1 es una mutación con pérdida de función ya que la complementación es posible con una copia ectópica
funcional obtenida de la cepa 1AM2, una cepa capaz de crecer en nitrato. Fenotípicamente, la cepa PO212 refleja el defecto en la función NirA,
la incapacidad de crecer en un medio con nitrato o nitrito como fuente principal de nitrógeno. Este defecto se correlaciona con la incapacidad
de expresar enzimas que metabolizan la reducción del nitrato a nitrito y éste a amonio. Esta es la primera vez que se describe una mutación en
el gen codificante NirA en P. rubens . Se han aislado mutaciones en nirA en P. chrysogenum ( Birkett y Rowlands, 1981 ) y Penicillium
brevicompactum ( Varavallo et al., 2005 ) , basándose en la tolerancia al clorato. Además, se aislaron mutantes nirA que no lograron crecer en
nitrato y nitrito de Penicillium griseoroseum y se transformaron con el gen nirA de Aspergillus nidulans ( Pereira et al., 2004 ). Sin embargo,
todas estas mutaciones nirA no se han descrito completamente. Nuestro estudio muestra que el sistema de regulación de la expresión de los
genes niaD que codifican la nitrato reductasa y los genes niiA que codifican la nitrito reductasa es similar al descrito en otros hongos
filamentosos como A. nidulans (ver revisión, ( Scazzocchio y Arst, 1989 )) o F fujikuroi ( Pfannmüller et al., 2017 ). La presencia de nitrato induce
la localización nuclear de NirA en P. rubens y en consecuencia la inducción de la expresión de estos genes estructurales. La misma ubicación se
describió en A. nidulans donde el nitrato intracelular media el tráfico nucleocitoplasmático de NirA ( Schinko et al., 2010 ), ( Berger et al.,
2006).), ( Bernreiter et al., 2007 )). En Fusarium fujikuroi, se estudió la regulación de la localización nuclear de NirA-GFP en diversos orígenes
mutantes. En este hongo, la ausencia de NRTA, un homólogo transportador de nitrato de CrnA, y las funciones AREA no afectaron la
localización de NirA regulada por nitrato, en un fondo Δ NIAD, NirA permaneció citoplásmico, lo que sugiere que el hongo es capaz de detectar
nitrato de una manera independiente de AreA y NrtA, pero dependientes de la nitrato reductasa ( Pfannmüller et al., 2017 ).
Por tanto, la entrada de nitrato en la célula debería ser un paso regulador esencial. El estudio de la cepa CH8 revela el transportador implicado
en la captación de nitrato de P. rubens . Al igual que la cepa PO212, CH8 no utiliza nitrato como única fuente de nitrógeno. La secuenciación de
los genes implicados en su metabolismo revela la presencia de una mutación en el gen que codifica el transportador de la familia CrnA. El
deterioro del CH8 para utilizar nitrato o nitrito puede explicarse por el hecho de que la mutación crnA1 debe abolir el principal mecanismo de
transporte de estas fuentes de nitrógeno. Se han aislado mutaciones en crnA en P. brevicompactum , pero no se analizaron ( Varavallo et al.,
2005 ). La mutación crnA1 provoca la pérdida de los dos últimos dominios transmembrana de los 12 que están previstos en ese transportador.
La ausencia de crecimiento de CH8 en el nitrato está de acuerdo con un papel importante de CrnA en el transporte de nitrato. Hasta ahora, sólo
P. digitatum había sido identificada dentro del género Penicillium como la única especie que no podía utilizar nitrato porque carece del
homólogo para el transporte de nitrato CrnA y de los tres ORF entre niiA y crnA que interrumpen el grupo de asimilación de nitratos. ,
indicando que si bien las especies de este género comparten la misma organización genómica básica en esta región, han sufrido importantes
reordenamientos ( Marcet-Houben et al., 2012 ). Por lo tanto, nuestros resultados muestran que CrnA es el principal medio de transporte
intracelular de nitrato y que otros sistemas no son funcionales o no existen en P. rubens .
Sin embargo, la cepa CH8 sigue siendo sensible al anión clorato, por lo que el sistema de entrada de clorato de P. rubens sigue una ruta diferente
a la del nitrato.
Uno de los aspectos más interesantes de esta investigación es que ninguna de las cepas utilizadas, incluidas las complementadas con los genes
de tipo salvaje nirA y crnA, muestran la capacidad de crecer en un medio con nitrito como principal fuente de nitrógeno. Los experimentos que
mezclan fuentes de nitrógeno no represivas como prolina o urea y nitrito sugieren que estas cepas de P. rubens no son capaces de utilizar
nitrito. Dado que el nitrito extracelular no provoca un defecto en el crecimiento de estas cepas en presencia de fuentes alternativas de
nitrógeno es factible pensar que no tienen un defecto en la reducción de nitrito, sino más bien un posible defecto en la entrada celular de este
anión. Es posible que CrnA sólo pueda transportar nitrato en P. rubens . Es interesante observar que los niveles de expresión de niiA que hemos
medido en la cepa complementada PO212_NirA 1AM2 (transformante TF7) y en 1AM2 son más altos que los de niaD , lo que podría sugerir que
la nitrito reductasa se encuentra en niveles más altos en la célula, tal vez para evitar Acumulación intracelular de nitritos y sus efectos
perniciosos. Por lo tanto, la incapacidad de crecer en un medio que contiene nitrito puede deberse a la incapacidad de transportar dicho anión.
Los BCA son un tema de creciente interés para controlar las enfermedades de las plantas como insumos alternativos a los productos químicos
sintéticos. El control biológico es la manifestación de la interacción entre la planta (hospedador), el patógeno, el BCA (antagonista), la
comunidad microbiana en y alrededor de la planta y el ambiente físico utilizando microorganismos que reducen o suprimen las enfermedades
de las plantas ( Whipps y McQuilken, 2009 ). ).
En particular, la cepa 212 de P. rubens (PO212) es uno de los pocos casos de hongos Eurotiomycetes que tiene un efecto de biocontrol como
organismo vivo en el que se ha identificado como mecanismo de acción la inducción de resistencia y/o competencia ( De Cal et al., 1995 ). En
este trabajo describimos un nuevo aislado, CH8, identificado como P. rubens basado en la secuenciación de secuencias genómicas para varios
loci, incluidos aquellos relacionados con el metabolismo del nitrógeno/nitrato y el tipo de apareamiento (identificado como mat1-1 , no
mostrado). . Aquí descubrimos que el aislado CH8 es también un potencial agente de biocontrol contra F. oxysporum f.sp. lycopersici en plantas
de tomate. Las características de biocontrol del CH8 son similares a las descritas previamente para el PO212, reduciendo la gravedad de la
enfermedad en más de un 50% y aumentando el número de hojas y el peso de tallos y raíces de las plantas infectadas. La identificación del CH8
sugiere que la capacidad de biocontrol es un atributo adicional de Penicillia y estudios futuros mostrarán el rango de acción del CH8 como BCA
en otros cultivos hortícolas. El descubrimiento de esta cepa abre la posibilidad de caracterizar nuevos aislados que podrían mostrar
características adicionales que permitan el control de otras enfermedades fúngicas y plantas hospedantes alternativas.
El análisis genético de PO212 y CH8 muestra que la conservación en la secuencia de nucleótidos de estas cepas con otras cepas de P. rubens
previamente secuenciadas y caracterizadas es muy alta. Hasta donde sabemos, no se han descrito fenómenos de biocontrol para las cepas
secuenciadas. En este estudio nos centramos en PO212 y estudiamos cómo la corrección de la deficiencia en la asimilación de nitratos podría
afectar su capacidad de biocontrol. La complementación de la mutación nirA1 permitió evaluar un posible papel del metabolismo del
nitrógeno en la eficacia de PO212 contra FOL1A en plantas de tomate. Aunque no se encontraron diferencias morfológicas como en el caso de
los transformantes nirA+ de P. griseoroseum ( Pereira et al., 2004 ), la cepa PO212_NirA 1AM2 mostró una BA atenuada. La misma tendencia se
observó en el consumo de solución nutritiva, número de hojas y peso de tallo y raíz. La cepa transformada redujo significativamente la
gravedad de la enfermedad, pero sus niveles de eficacia disminuyeron en comparación con PO212.
Los mecanismos de acción de los BCA son múltiples y no mutuamente excluyentes. Dado que los suelos y los cultivos son entornos con
nutrientes limitados desde el punto de vista microbiano, se ha informado que la competencia entre patógenos y no patógenos por los sitios de
infección y/o los recursos de nutrientes es un mecanismo de acción utilizado por los BCA y, por lo tanto, puede influir en la incidencia y
gravedad. de la enfermedad ( De Cal et al., 1995 , Whipps y McQuilken, 2009 ). PO212 puede actuar por competencia o inducción de resistencia
del huésped porque los tratamientos con PO212 contra FOL en tomate no redujeron las clamidosporas del suelo ni las poblaciones de
patógenos en la rizosfera ( De Cal et al., 1995 ). Nuestros resultados sugieren que el fenómeno de biocontrol puede estar asociado, en parte, con
la búsqueda de nutrientes por parte de PO212. También abre la posibilidad de que las señales de origen peptídico emitidas por la planta o
patógeno sean consideradas por PO212 como fuentes alternativas de nitrógeno. Esto provocaría la ruptura de las vías de señalización , de la
respuesta inmune o de una disminución de las enzimas extracelulares del patógeno debido a su degradación. En el futuro será importante
determinar el patrón de enzimas extracelulares capaces de producir PO212 y la variedad de fuentes de nitrógeno que es capaz de asimilar. Por
otro lado, ampliar estos estudios al CH8 permitirá una comprensión más completa del proceso de biocontrol ya que tiene un trasfondo
genético diferente al del aislado PO212. La exploración de los genomas de PO212 y CH8 junto con otras cepas de P. rubens que carecen de BA
proporcionará genes o mutaciones específicas que podrían señalar las vías implicadas en este proceso. La fuerte conservación de secuencias
genómicas encontradas entre estos dos aislados naturales y otros productores de penicilina ya secuenciados sería de gran ayuda en esta
identificación.
Agradecimientos
El trabajo en el laboratorio CIB/CSIC contó con el apoyo del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) de España a través de las
subvenciones BFU212-33142 y BFU2015-66806-R, parcialmente apoyadas por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER, UE), a EAE. y en
el INIA fue financiado con RTA2010-00093-00-00 , RTA2013-00060-C05-01 , RTA2017-00060-C03-01 (Plan Nacional de I+D, MCINNU, España).
M. Villarino realizó contratos postdoctorales asociados a las becas RTA2010-00093-00-00 y BFU2012-33142 del MINECO, España . M. Carreras
recibió una beca del INIA, España. Los autores desean agradecer a Y. Herranz, R. Castillo, B. Larena por su apoyo y colaboración en el INIA y a
Tamar San-Hipólito-Marín del departamento de Proteómica y Genómica del CIB por su ayuda con las PCR cuantitativas.
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Referencias
Berger y otros, 2006 H. Berger , R. Pachlinger , I. Morozov , S. Goller , F. Narendja , M. Caddick , J. Strauss
El factor GATA AreA regula la localización y la ocupación del sitio de unión in vivo del activador de nitrato NirA.
Mol. Microbiol. , 59 ( 2006 ) , págs . 433-446 ,10.1111/j.1365-2958.2005.04957.x
View at publisher Ver en Scopus Google Académico
Bernreiter y otros, 2007 A. Bernreiter , A. Ramon , J. Fernández-Martínez , H. Berger , L. Araújo-Bazan , EA Espeso , R. Pachlinger , A. Gallmetzer , I. Anderl , C.
Scazzocchio , J. Strauss
La exportación nuclear del factor de transcripción NirA es un punto de control regulatorio para la inducción de nitratos
en Aspergillus nidulans
Mol. Biol celular. , 27 ( 2007 ) , págs . 791-802 ,10.1128/MCB.00761-06
Bhuiyan y otros, 2003 SA Bhuiyan , MJ Ryley , VJ Galea , D. Tay

Evaluación de potenciales agentes de biocontrol contra Claviceps africana in vitro e in vivo.
Patol de plantas. , 52 ( 2003 ) , págs . 60-67 ,10.1046/j.1365-3059.2003.00799.x
Birkett y Rowlands, 1981 JA Birkett , RT Rowlands

Resistencia a cloratos y asimilación de nitratos en cepas industriales de Penicillium chrysogenum.
Microbiología , 123 ( 1981 ) , págs . 281-285 ,10.1099/00221287-123-2-281
Böhm et al., 2015 J. Böhm , TA Dahlmann , H. Gümüser , U. Kück

Una cepa MAT1-2 de tipo salvaje de Penicillium chrysogenum : caracterización del locus de tipo de apareamiento
funcional, secuenciación del genoma y apareamiento con una cepa industrial productora de penicilina
Mol. Microbiol. , 95 ( 2015 ) , págs . 859-874 ,10,1111/mmi.12909
Hamburguesa y otros, 1991 G. Burger , J. Strauss , C. Scazzocchio , BF Lang

nirA, el gen regulador específico de la vía de asimilación de nitratos en Aspergillus nidulans , codifica una supuesta
proteína de dedos de zinc tipo GAL4 y contiene cuatro intrones en regiones altamente conservadas
Mol. Biol celular. , 11 ( 1991 ) , págs. 5746 - 5755
Ver en Scopus Google Académico
Cabrera et al., 2014 E. Cabrera , R. González-Montelongo , T. Giraldez , DLR Álvarez , JM Siverio

Componentes moleculares del eflujo de nitrato y nitrito en levadura.
Célula eucariota , 13 ( 2014 ) , págs . 267-278
https://doi.org/EC.00268-13 [pii];10.1128/EC.00268-13 [doi]
Campbell y Madden, 1990 CL Campbell , LV Madden

Introducción a la epidemiología de las enfermedades de las plantas.
John Wiley & Sons , Nueva York, NY, EE. UU. ( 1990 )
Google Académico
De Cal et al., 2000 A. De Cal , R. García-Lepe , P. Melgarejo

Resistencia inducida por Penicillium oxalicum contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici : estudios histológicos de tallos
de tomate infectados e inducidos
Fitopatología , 90 ( 2000 ) , págs . 260-268 ,10.1094/PHYTO.2000.90.3.260
De Cal et al., 1999 A. De Cal , R. García-Lepe , S. Pascual , P. Melgarejo

Efectos del momento y método de aplicación de Penicillium oxalicum sobre la eficacia y duración del control del
marchitamiento por Fusarium del tomate
Patol de plantas. , 48 ( 1999 ) , págs. 260 - 266 ,10.1046/j.1365-3059.1999.00324.x
De Cal et al., 1995 A. De Cal , S. Pascual , I. Larena , P. Melgarejo

Control biológico de Fusarium oxysporum f. sp. licopersici
Patol de plantas. , 44 ( 1995 ) , págs. 909 - 917
View at publisher Referencia cruzada Ver en Scopus Google Académico
De Cal et al., 1997 A. De Cal , S. Pascual , P. Melgarejo
Implicación de la inducción de resistencia por Penicillum oxalicum en el biocontrol de la marchitez del tomate
Patol de plantas. , 46 ( 1997 ) , págs. 72 - 79
De Cal et al., 2008 A. De Cal , C. Redondo , A. Sztejnberg , P. Melgarejo

Biocontrol del oídio por Penicillium oxalicum en viveros de fresas a campo abierto
Biol. Control , 47 ( 2008 ) , págs . 103-107
Ver PDF Ver artículo Ver en Scopus Google Académico
De Cal et al., 2009 A. De Cal , A. Sztejnberg , P. Sabuquillo , P. Melgarejo

Manejo Marchitez por Fusarium en melón y sandía por Penicillium oxalicum
Biológico. Control , 51 ( 2009 ) , págs . 480-486 ,10.1016/j.biocontrol.2009.08.011
Duffy y DéFago, 1999 BK Duffy , G. DéFago

Los fertilizantes con macro y microelementos influyen en la gravedad de la pudrición de la corona y la raíz por fusarium
del tomate en un sistema de producción sin suelo.
HortScience HortSci , 34 ( 1999 ) , págs . 287-291 ,10.21273/HORTSCI.34.2.287
Engelhard, 1979 AW Engelhard

Control de la marchitez por Fusarium del clavel con un programa integrado de control de nitrógeno nitrato y fungicidas
sistémicos
Fitopatología , 69 ( 1979 ) , p. 1027
Google Académico
Fang y Tsao, 1995 JG Fang , PH Tsao

Eficacia de Penicillium funiculosum como agente de control biológico contra la pudrición de la raíz por Phytophthora en
azaleas y cítricos.
Fitopatología , 85 ( 1995 ) , págs . 871-878 ,10.1094/Fito-85-871
Florez et al., 2007 AB Florez , P. Álvarez-Martín , TM López-Díaz , B. Mayo

Identificación morfotípica y molecular de hongos filamentosos del queso Cabrales de veta azul español y tipificación de
aislados de Penicillium roqueforti y Geotrichum candidum.
En t. Dairy J. , 17 ( 2007 ) , págs . 350-357 ,10.1016/j.idairyj.2006.04.002
View at publisher Google Académico
Guijarro et al., 2006 B. Guijarro , I. Larena , P. Melgarejo , A. De Cal

Efecto del secado sobre la viabilidad de las conidias de Penicillium frecuentans , un agente de control biológico contra la
pudrición parda del durazno causada por Monilinia spp.
Ciencia del biocontrol. Tecnología. , 16 ( 2006 ) , págs . 257-269 ,10.1080/09583150500335897
Hernández-Ortiz y Espeso, 2013 P. Hernández-Ortiz , EA Espeso

Fosforregulación y tráfico nucleocitoplasmático de CrzA en respuesta al estrés por calcio y pH alcalino en Aspergillus
nidulans
Mol. Microbiol. , 89 ( 2013 ) , págs . 532-551 ,10,1111/mmi.12294
Huber, 1989 Huber, DM, 1989. Introducción, en: Engelhard, AW (Ed.), Patógenos vegetales transmitidos por el suelo: Manejo de enfermedades
con macro y microelementos Amer. Fitopatol. Soc., St. Paul, Minesota, págs. 1–8.
Google Académico
Jacoby y otros, 2017 R. Jacoby , M. Peukert , A. Succurro , A. Koprivova , S. Kopriva
El papel de los microorganismos del suelo en la nutrición mineral de las plantas: conocimientos actuales y direcciones
futuras.
Ciencia vegetal frontal. , 8 ( 2017 ) , pág. 1617 ,10.3389/fpls.2017.01617 [doi]
Kim y Seo, 2018 Kim, JY, Seo, HS, 2018. Ensayo de actividad de nitrato reductasa in vitro a partir de extractos crudos de Arabidopsis.
Bioprotocolo 8, e2785. https://doi.org/10.21769/BioProtoc.2785 .
Google Académico
Larena et al., 2007 I. Larena , A. De Cal , P. Melgarejo

Efectos de los estabilizantes sobre la vida útil de formulaciones de Epicoccum nigrum y su relación con el biocontrol de la
pudrición parda poscosecha por Monilinia del durazno
J. Aplica. Microbiol. , 102 ( 2007 ) , págs. 570 - 582
https://doi.org/JAM3075[pii];10.1111/j.1365-2672.2006.03075.x
Larena y Melgarejo, 2009 I. Larena , P. Melgarejo

Desarrollo de un método para la detección del agente de biocontrol Penicillium oxalicum Strain 212 mediante la
combinación de PCR y un medio selectivo
Desinfección de plantas. , 93 ( 2009 ) , págs . 919-928 ,10.1094/PDIS-93-9-0919
Larena et al., 2003 I. Larena , P. Sabuquillo , P. Melgarejo , A. De Cal

Biocontrol de la marchitez por fusarium y verticillium del tomate por Penicillium oxalicum en condiciones de invernadero
y de campo.
J. Fitopatol. , 151 ( 2003 ) , págs . 507-512 ,10.1046/j.1439-0434.2003.00762.x
Marcet-Houben et al., 2012 M. Marcet-Houben , AR Ballester , B. de la Fuente , E. Harries , JF Marcos , L. González-Candelas , T. Gabaldón
Secuencia del genoma del hongo necrotrófico Penicillium digitatum , principal patógeno poscosecha de los cítricos
BMC Genomics , 13 ( 2012 ) , pág. 646 ,10.1186/1471-2164-13-646
Markina-Iñarrairaegui et al., 2011 A. Markina-Iñarrairaegui , O. Etxebeste , E. Herrero-García , L. Araujo-Bazán , J. Fernández-Martínez , JA Flores , SA

Osmani , EA Espeso
Transportadores nucleares en un organismo multinucleado: análisis funcionales y de localización en Aspergillus nidulans
Mol. Biol. Celda , 22 ( 2011 ) , págs . 3874-3886 ,10.1091/mbc.E11-03-0262
Martínez-Beringola et al., 2013 ML Martínez-Beringola , T. Salto , G. Vázquez , I. Larena , P. Melgarejo , A. De Cal

Penicillium oxalicum reduce el número de quistes y juveniles de nematodos del quiste de la patata
J. Aplica. Microbiol. , 115 ( 2013 ) , págs . 199-206 ,10.1111/mermelada.12213
Marzluf, 1997 GA Marzluf

Regulación genética del metabolismo del nitrógeno en los hongos.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. , 61 ( 1997 ) , págs . 17-32
Nayak y otros, 2006 T. Nayak , E. Szewczyk , CE Oakley , A. Osmani , L. Ukil , SL Murray , MJ Hynes , SA Osmani , BR Oakley
Un sistema de selección de genes versátil y eficiente para Aspergillus nidulans
Genética , 172 ( 2006 ) , pág. 1557 ,10.1534/genética.105.052563
Omasits et al., 2014 U. Omasits , CH Ahrens , S. Muller , B. Wollscheid

Protter: visualización interactiva de características de proteínas e integración con datos proteómicos experimentales
Bioinformática , 30 ( 2014 ) , págs . 884-886
https://doi.org/btt607 [pii];10.1093/bioinformatics/btt607 [doi]
Peñalva, 2005 MA Penalva
Seguimiento de la vía endocítica de Aspergillus nidulans con FM4-64
Hongos. Genet Biol. , 42 ( 2005 ) , págs. 963 - 975
https://doi.org/S1087-1845(05)00138-6[pii];10.1016/j.fgb.2005.09.004
Pereira et al., 2004 JF Pereira , MVD Queiroz , FJF Lopes , RB Rocha , MJ Daboussi , EFD Araujo
Caracterización, regulación y análisis filogenéticos del gen de la nitrato reductasa de Penicillium griseoroseum y su uso
como marcador de selección para transformación homóloga.
Poder. J. Microbiol. , 50 ( 2004 ) , págs. 891 - 900 ,10.1139/w04-081
Pfannmüller et al., 2017 A. Pfannmüller , JM Boysen , B. Tudzynski

La asimilación de nitratos en Fusarium fujikuroi está controlada por múltiples niveles de regulación
Frente. Microbiol. , 8 ( 2017 ) , pág. 381 ,10.3389/fmicb.2017.00381
Raju y otros, 1984 Raju, BC, Semer IV, CR, Tepper, BL, 1984. Marchitez de las mamás por Fusarium. Acta Horticulturae 152, 65–76. Sociedad
Internacional de Ciencias Hortícolas (ISHS), Lovaina, Bélgica.
Google Académico
Scazzocchio y Arst, 1989 C. Scazzocchio , HNJ Arst

Regulación de la asimilación de nitratos en Aspergillus nidulans
L. Wra , R. Kinghorn (Eds.) , Aspectos moleculares y genéticos de la asimilación de nitratos , Oxford University Press , Oxford ( 1989 ) , págs. 299-313
Google Académico
Schinko y otros, 2010 T. Schinko , H. Berger , W. Lee , A. Gallmetzer , K. Pirker , R. Pachlinger , I. Buchner , T. Reichenauer , U. Güldener , J. Strauss
El análisis del transcriptoma de la asimilación de nitrato en Aspergillus nidulans revela conexiones con el metabolismo del
óxido nítrico
Mol. Microbiol. , 78 ( 2010 ) , págs . 720-738 ,10.1111/j.1365-2958.2010.07363.x
Snedecor y Cochran, 1980 G. Snedecor , W. Cochran

Métodos de estadística
Prensa de la Universidad Estatal de Iowa , Ames ( 1980 )
Google Académico
van den Berg y otros, 2008 MA van den Berg , R. Albang , K. Albermann , JH Badger , JM Daran , AJ Driessen , C. García-Estrada , ND Fedorova , DM Harris ,
WH Heijne , V. Joardar , JA Kiel , A. Kovalchuk , JF Martin , WC Nierman , JG Nijland , JT Pronk , JA Roubos , IJ van der Klei , NN van Peij , M. Veenhuis ,
H. von Dohren , C. Wagner , J. Wortman , RA Bovenberg
Secuenciación del genoma y análisis del hongo filamentoso Penicillium chrysogenum.
Nat. Biotecnología. , 26 ( 2008 ) , págs. 1161 - 1168
https://doi.org/nbt.1498[pii];10.1038/nbt.1498
Varavallo et al., 2005 MA Varavallo , MVD Queiroz , JF Pereira , RA Ribeiro , MA Soares , João Batista , EFD Araújo
Desarrollo de un sistema de transformación de Penicillium brevicompactum basado en el gen de la nitrato reductasa de
Fusarium oxysporum
Braz. J. Microbiol. , 36 ( 2005 ) , págs . 184-189 ,10.1590/S1517-83822005000200015
Ver en el editor Ver en Scopus Google Académico
Vázquez et al., 2013 G. Vázquez , P. Melgarejo , A. De Cal , I. Larena

Persistencia, supervivencia, dispersión vertical y distribución horizontal del agente de biocontrol, Penicillium oxalicum
cepa 212, en diferentes tipos de suelo.
Aplica. Ecología del suelo. , 67 ( 2013 ) , págs . 27-36 ,10.1016/j.apsil.2013.02.005
Villarino et al., 2016 M. Villarino , A. De Cal , P. Melgarejo , I. Larena , EA Espeso
El desarrollo de marcadores genéticos y moleculares para el registro y comercialización de Penicillium rubens (antes
Penicillium oxalicum ) cepa 212 como agente de biocontrol
Microbio. Biotecnología. , 9 ( 2016 ) , págs . 89-99 ,10.1111/1751-7915.12325
Villarino et al., 2018 M. Villarino , EA Espeso , P. Melgarejo , I. Larena

Transformación de Penicillium rubens 212 y expresión de genes codificantes de GFP y DsRED para la visualización de la
interacción planta-agente de biocontrol
Frente. Microbiol. , 9 ( 2018 ) , pág. 1653 ,10.3389/fmicb.2018.01653
Watkinson, 2016 SC Watkinson

Fisiología y adaptación
The Fungi Academic Press , Boston ( 2016 ) , págs . 141-187
Whipps y McQuilken, 2009 JM Whipps , diputado McQuilken

Agentes de control biológico en el control de enfermedades de las plantas.
D. Walters (Ed.) , Control de enfermedades en cultivos : enfoques biológicos y respetuosos con el medio ambiente , Blackwell Publishing Ltd , Oxford (
2009 ) , págs. 27-61
Referencia cruzada Ver en Scopus Google Académico
Woltz y Jones, 1973 SS Woltz , JP Jones

Interacciones en fuente de fertilizante nitrogenado y procedimiento de encalado en el control de la marchitez por
Fusarium del tomate.
HortScience HortSci , 8 ( 1973 ) , págs. 137-138
Referencia cruzada Google Académico
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Penicillium chrysogenum: Beyond the penicillin

2024, Advances in Applied Microbiology
Show abstract
A role for Penicillium rubens strain 212 xylanolytic system in biocontrol of Fusarium wilt disease in tomato plants
2023, European Journal of Plant Pathology
Monilinia fructicola Response to White Light

2023, Journal of Fungi
CRISPR/Cas9-Mediated Disruption of the pcz1 Gene and Its Impact on Growth, Development, and Penicillin Production in
Penicillium rubens
2023, Journal of Fungi
Comparative analysis of Penicillium genomes reveals the absence of a specific genetic basis for biocontrol in Penicillium
rubens strain 212
2023, Frontiers in Microbiology
Pcz1 regulates growth, conidiation, conidial germination, and production of penicillin in the filamentous fungus Penicillium
rubens (formerly Penicillium chrysogenum)
2023, Research Square
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Alteración Del Metabolismo Del Nitrógeno en Cepas de Biocontrol de Penicillium Rubens - ScienceDirect

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2/5/24, 22:14 Alteración del metabolismo del nitrógeno en cepas de biocontrol de Penicillium rubens - ScienceDirect

Genética y biología de hongos

Metabolismo alterado del nitrógeno en cepas de biocontrol de

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2.1 . Cepas y condiciones de cultivo.

Tabla 1 . Cepas de Penicillium rubens utilizadas en este trabajo.

Cepa Genotipo relevante Referencia

PO212_18.2 pirG1 ; nirA1 Este trabajo (1) y Villarino et al. (2016)

PO212_ NirA 1AM2 (PO212_TF7) nira 1AM2 Este trabajo

PO212_NirA 1AM2 -GFP nirA 1AM2 ; GFP Este trabajo

CH8 crnA1 Este trabajo

CH8_7 crnA1 ; crnA PO212 Este trabajo

CH8_rev5 crnA + Este trabajo

Cepa Genotipo relevante Referencia

1AM2 prototrofo (WT) Florez et al. (2007) (IPLA 33001)

2.2 . Construcción de casetes de transformación y otras técnicas de PCR.

Tabla 2 . Oligonucleótidos utilizados en este trabajo.

Nombre del cebador secuencia 5′-3′ Utilización

niaD-1 TTCGAGTCAATTGTGGGTATTGGAC PCR/secuenciación de niaD

niaD-1.5 TCGTGTTGTGGGTACACAGC PCR/secuenciación de niaD

niaD-2 ACTTACCATTGAGCAAGTCACCACCCG PCR/secuenciación de niaD

niaD-3 CAACGTGAACTCGGTGGCTGTGTACC PCR/secuenciación de niaD

niaD-3.5 TTGCAGTCGATCTTTGAGCC PCR/secuenciación de niaD

niaD-4 CAGGATCTTAGGTGGGACGTTTTGCCACTC PCR/secuenciación de niaD

NirAPO-GSP1 CGGTCTACTCCGTATGTAACCCACCAAGGG Amplificación de la secuencia codificante de nirA.

NirAPO-GSP2 ACGCTGTTCATCACCAGGACTAGAGGCCG Amplificación de la secuencia codificante de nirA.

NirAPO-GSP3 TTGAATCCCCGATGATACCTAGGTACAACCGG Amplificación de 3́UTR nirA /secuenciación nirA

NirAPO-GSP4 ACCTTGATCGCGGCAACCATGAATCACGC Amplificación de 3́UTR nirA /secuenciación nirA /Fusion PCR

NirAPO-GFP1 CGGCCTTCTAGTCCTGGTGATGAACAGCGT PCR GFP-PyrG

NirAPO-GFP2 CCGGTTGTACCTAGGTATCATCGGGATTCAA(GTCTGAGAGGAGGCACTGATGCG) PCR GFP-PyrG

NirA-UP CAATGTTGAGACGTGGCTGGTGGAGCG Locus nirA de PCR

NirA-DW TCCACGATCTGGATGGAACTATTCCGCG Locus nirA de PCR

NirAqPCRUP ACAAGTGGTACGATGGCTCTGG qPCR, determinación del número de copias nirA

NirAqPCRDW AGACATGAGATTACTGTCCTG qPCR, determinación del número de copias nirA

niiA-1A ATCAGACCGAGTGGAATGAGGC PCR/secuenciación de niiA

niiA-2 TGCTAGCTTAGAAGCTGCG PCR/secuenciación de niiA

niiA-3 TAGTTCACGAGAGGAACCC PCR/secuenciación de niiA

Nombre del cebador secuencia 5′-3′ Utilización

niiA-4 CCGTCGAGACGGTAGAAGT PCR/secuenciación de niiA

niiA-5 GGTTGGCGTATGGGACAT PCR/secuenciación de niiA

niiA-6 ATAGGTTGGGACTGGGACTGC Promotor de PCR/secuenciación del promotor

crnA-1 TACCCTACTACCTCAACGCTCG PCR/secuenciación de crnA

crnA-2 CGCTTATACAAGAGTAGAGG PCR/secuenciación de crnA

crnA-3 CCATGTGTCATGGCAAGATG PCR/secuenciación de crnA

crnA-4 TGGCTGCTACTATGGAAGCG PCR/secuenciación de crnA

nre-1 CCACGGTCGCCTCTATTTG PCR/secuenciación de nre

nre-2 CGTCAGTCGAACCTGTCTG PCR/secuenciación de nre

nre-3 CTACCAGTCCTACTGTGTCG PCR/secuenciación de nre

nre-4 GCTAGCCACCACTATAATC PCR/secuenciación de nre

mat-1-1 fw TGCAGCTCAAGTTCTACG Locus mat-1.1 de PCR

mat-1-1 autocaravana GGTTGATGAGAGATGTACTCCT Locus mat-1.1 de PCR

mat-1-2 fw ATGGTGAAGTCTTCCTGCC Locus mat-1.2 de PCR

mat-1-2 rv GGTGTCGAGCCACTCTCT Locus mat-1.2 de PCR

PO212 actina 1 GAAATCGTCCGTGACATCAAGG control de actina qPCR

PO212 actina 2 CAATGTTGCCGTAGAGATCCTTACGG control de actina qPCR

PO212 benA 1 TCAGCTCAACTCCGATCTTCGC control de tubulina qPCR

PO212 benA 2 CTCAACCTCCTTCATGGAGACC control de tubulina qPCR

niaD qPCR 1 CAGTCGATCTTTGAGCCTAGG qPCR nitrato reductasa

niaD qPCR 2 AAGGATGTATCCTGGGATACG qPCR nitrato reductasa

niiA qPCR 1 GTGATCGTGGATGACAAACTCG qPCR nitrito reductasa

Pc13g11420, niiA XM_002559514.1 niia 99 % sobre 3699/3700 nt