MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE ENFERMERIA
“GUIA DE PRÁCTICA N° 6”
Autores:
Custodio Neciosup Mayra
Rosales Castillo Maity
Villanueva Huertas Karen
Paísig Fernández Norma Dhayana
Tirado Espino Solange
Gonzales Cueva Sandra
Vásquez Sánchez Zeleny
Blanca Campos Chavez
Docente:
M. Sc. Sánchez Mendoza Henry William

Pimentel–Perú
2024

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 MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

PRÁCTICA N° 6
MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA
Aislamiento e Identificación de Staphylococcus y Streptococcus
Competencias:
- Identifica el uso de los medios de cultivo en Microbiología
- Aísla microorganismos mediante los medios cultivos
Materiales:
- Agar Müller-Hinton
- Agar Manitol Salado
- Agar SS
- Agar Mc Conckey
- Agar Sangre
- Caldo Peptonado
- Placas petri
- Asas Bacteriológicas
- Matraces
- Balones
- Mechero Bunsen
- Autoclave
- Horno
- Estufa

Medios de Cultivo:
Agar Sangre
Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos
microorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para el aislamiento y cultivo
de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran
variedad de muestras, como para la observación de reacciones de hemólisis.
También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio
agar chocolate.
Fórmula (en gramos por litro)
Infusión de músculo de corazón 375.0
Peptona 10.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH: 7.3

Fundamento
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que
permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos
nutricionalmente exigentes.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10%, aporta nutrientes
para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis.

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Microorganismos Crecimiento Hemólisis

E. coli ATCC 25922 Abundante --
S. aureus ATCC 25923 Abundante Beta
S. pyogenes ATCC 19615 Abundante Beta
S. pneumoniae ATCC 6305 Abundante Alfa
S. pneumoniae ATCC 49619 Abundante Alfa

Agar Mc Conckey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en
muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua
Pluripeptona 3.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
Lactosa 10.0 uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a
2 minutos hasta disolver. Esterilizar en
Mezcla de Sales biliares 1.5
autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Cloruro de Sodio 5.0
Agar 13.5
Rojo Neutro 0.03
Cristal Violeta 0.001
pH: 7.1

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el
cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora
Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las
colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Microorganismos Colonias
Escherichia coli Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas
Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes
Shigella flexneri Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas

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Agar Manitol Salado

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras
clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.
También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de Vibrio, sino se
dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies
pueden no desarrollar.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Extracto de Carne 1.0 Suspender 111 g de polvo por litro de agua
Pluripeptona 10.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
d-manitol 10.0 calentando a ebullición durante 1 o 2
minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave
Cloruro de Sodio 75.0
a 118-121°C durante 15 minutos.
Agar 15.0
Rojo Fenol 0.025
pH: 7.4

Fundamento:
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias
aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o
púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio
para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de
carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el
cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el
desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol,
producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color
rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias
amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de
una zona del mismo color o púrpura.

Microorganismos Crecimien Colonias

to
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarillas
Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Bueno Rojas
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

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Agar SS

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. Y de algunas especies de

Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su
presencia.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de agua
Extracto de carne 5.0 destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta
Lactosa 10.0 homogeneizar. Calentar a ebullición durante
2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN
Mezcla de Sales Biliares 8.5
AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir
Citrato de Sodio 8.5 unos 20 ml por placa. Secar la superficie del
Tiosulfato de sodio 8.5 medio unos minutos en la estufa.
Citrato férrico 1.0
Agar 13.5
Verde Brillante 0.00033
Rojo Neutro 0.025
pH: 7.0

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, está dada por la sales biliares y
el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los
coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a
partir del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el
medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre
un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el
medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se
evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

Microorganismos Colonias
Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro
Shigella flexneri Incoloras
Shigella sonnei Incoloras
Proteus mirabilis Transparentes, centro negro
Escherichia coli Rosadas a rojas
Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas
Enterococcus faecalis Incoloras, de muy escaso
crecimiento

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Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a

los antimicrobianos. Además, es útil con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes.

Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS), recomendó su uso en forma rutinaria para la realización del
antibiograma en medio sólido, debido a una serie de factores que se detallan a continuación:
presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en
inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los patógenos
crece satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han sido evaluados y avalados usando
este medio de cultivo.

Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las pruebas de
sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de
Peptona ácida de caseína 17.5 agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos.
Almidón 1.5 Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1
minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 45°-50°C y distribuir a cajas de Petri (o
Agar 15.0 agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel
de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en
placas de 9 cm de diámetro).
pH final: 7.3 ± 0.1

Siembra
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología
apropiada.
Incubación
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología
apropiada.
Resultados
Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la metodología
apropiada.

Notas:
1- Los lotes de agar Mueller Hinton Britania cumplen con las normas descriptas en el
documento M6 - P del NCCLS: ¨Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar¨.
Esto es muy importante pues algunos lotes pueden variar significativamente y si las bacterias
no crecen adecuadamente, las zonas de inhibición en las pruebas de difusión son
generalmente más grandes, quedan fuera de los límites de control de calidad y pueden dar
resultados erróneos.

2- Los medios que contienen cantidades excesivas de timidina o timina pueden revertir el
efecto inhibitorio de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo así zonas de inhibición

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más pequeñas y por lo tanto informes de falsa resistencia. Para evaluar el contenido de
timidina del lote de agar Mueller Hinton, se prueba la cepa de control de calidad:
Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a discos de TMS. En un medio satisfactorio, se
produce una zona clara de inhibición de 20 mm o más.

3- Otro aspecto de cuidado en el control de calidad en el agar Mueller Hinton es que las
variaciones en cationes divalentes principalmente calcio y magnesio pueden afectar los
resultados con tetraciclina, polimixina y aminoglucósidos cuando se ensayan cepas de
Pseudomonas spp. Por tal motivo, se deben cumplir los límites de control de calidad
publicados por el NCCLS.

4- Los resultados deben ser cuidadosamente observados con todos los organismos de control
para evitar datos aberrantes debido al medio de cultivo. Para aquellas cepas que fallan de
crecer satisfactoriamente sobre Agar Mueller Hinton no suplementado, se agrega sangre
desfibrinada de carnero al agar fundido y enfriado, a una concentración final al 5% (v/v).

Para el control de precisión y exactitud del agar de Mueller Hinton se usan las siguientes cepas
control:

S. aureus ATCC 25923

E. coli ATCC 25922
P. aeruginosa ATCC 27853
E. faecalis ATCC 29212
Para evaluar el desempeño de inhibidores de beta lactamasa, se utiliza la cepa control:

E. coli ATCC 35218

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

Lowenstein-Jensen Medio Base.

Es esta una base para la preparación de varios medios destinados al aislamiento, cultivo y
diferenciación de micobacterias.

Fundamento
Los nutrientes de este medio basal, más los aportados por el agregado de la mezcla de huevos,
constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. El
verde de malaquita inhibe a gran parte de la flora acompañante. Con el agregado de glicerina
se estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis, aunque gran parte de M. bovis es
inhibido. Agregando un 5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal,
como es el caso de M. smegmatis.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Fosfato monopotásico 2.5 Suspender 37,3 g del polvo en 600 ml de agua destilada y
Sulfato de magnesio 0.24 agregar 12 ml de glicerina. Calentar agitando
Citrato de magnesio 0.6 continuamente y hervir un minuto. Esterilizar en
Asparragina 3.6 autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C
Harina de papa 30.0 aproximadamente. Mezclar asépticamente un litro de

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huevo íntegro, evitando la formación de burbujas de aire

y agregar al medio base. Mezclar el huevo y la base hasta
Verde de malaquita 0.4 uniformar. Distribuir en recipientes estériles adecuados
y tapar herméticamente. Colocar los mismos en posición
inclinada y coagular a 85-90°C durante 45 minutos.
pH final:4.8 ± 0.1
Siembra
Se recomienda, en procedimientos de rutina, inocular la muestra previamente descontaminada
,sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubación
A 35-37°C. A los 7 días de incubación, se observa por primera vez si hubo crecimiento. Luego,
observar cada semana, hasta un total de 8 semanas.
Resultados
Observar las características morfológicas y la presencia o ausencia de pigmento en las
colonias.
Microorganismos Crecimien Características de las colonias
to
Mycobacterium tuberculosis Excelente Grandes, secas, amarillentas, granulares
Mycobacterium avium Excelente Lisas, sin pigmentos
Mycobacterium gordonae Excelente Lisas
Mycobacterium bovis --- ---

Características del medio

Medio preparado: verde pálido, opaco.

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la
fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 20.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua
Extracto de carne 3.0 destilada. Mezclar bien y calentar con
Lactosa 10.0 agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos
hasta disolución total. Llenar hasta la tercera
Cloruro de Sodio 5.0
parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a
Sacarosa 10.0 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de
Glucosa 1.0 flauta profundo.
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Agar 13.0
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo fenol 0.025
pH: 7.3

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano.

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La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el
sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp.
basado en la descarboxilación/desaminación de la lisina y en la producción de ácido
sulfhídrico.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado en
Extracto de levadura 3.0 un litro de agua destilada. Dejar embeber
Lisina 10.0 unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente,
agitando con frecuencia y hervir durante un
Citrato de hierro y amonio 0.5
minuto hasta la disolución completa.
Glucosa 1.0 Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15
Sulfato de hierro y amonio 0.2 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un
Agar 15.0 fondo vertical apto para la punción.
Tiosulfato de sodio 0.04
pH: 6.7
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano.
La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para
detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y de aminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de
ácido sulfhídrico.
El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o
menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y
esto produce el viraje del indicador al color violeta.
La descarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de
la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24hs
de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el
fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido
a la formación de sulfuro de hierro.

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Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la
lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados
1- Decarboxilación de la lisina:
- Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
- Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2- Desaminación de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna
cepas de Morganellas pp.
3- Produccióndeácidosulfhídrico:
- Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico
y fondo)

Agar Citrato de Simons

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato como única fuente de carbono y energía.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por
Cloruro de sodio 5.0 litro de agua destilada. Dejar reposar 5
Fosfato dipotásico 1.0 minutos y mezclar calentando a ebullición
durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y
Fosfato monoamónico 1.0
esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
Sulfato de magnesio 0.2 minutos. Enfriar en posición inclinada.
Azul de bromotimol 0.08
Agar 15.0
pH: 6.9
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de
sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano.
Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de
pH, que vira al color azul en medio alcalino.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno,
con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a

través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente,
oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato
permeasa.

Resultados

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-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no
hay cambio de color.

Microorganismos Citrato Color del medio

permeasa
Klebsiella pneumoniae Positivo Azul
S. typhimurium Positivo Azul
E. coli Negativo Verde
S. flexneri Negativo Verde

MIO Medio
Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de
ornitina descarboxilasa y producción de indol.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Dextrosa 1.0 Suspender 31 g del polvo en un litro de agua
Extracto de levadura 3.0 destilada. Calentar a ebullición hasta
Peptona 10.0 completa disolución. Distribuir en tubos y
esterilizar 15 minutos a 121°C.
Tripteína 10.0
Clorhidrato de L-ornitina 5.0
Agar 2.0
Púrpura de bromocresol 0.02
pH: 6.5

Fundamento:
Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de
levadura, peptona y tripteína.
Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima
triptofanasa, para la realización de la prueba de lindol.
La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección
de la enzima ornitina descarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en
medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.
Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia
de ornitina descarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde
mas allá de la línea de inoculación.
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la
fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que
el indicador de pH púrpura de bromocresol vire a ladrillo.
La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina
descarboxilasa, la cual descarboxila la ornitina presente.
Por descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el
color púrpura.

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El indol, es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de
Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados
1-Movilidad:
- Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.-
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
2- Ornitina decarboxilasa:
- Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede
desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.
3- Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad
y la prueba de ornitina.
- Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
- Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Medio SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de
hidrógeno en un mismo tubo.
Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la
tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso
interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con
el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las
cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por
la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que
el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de
Peptona 6.1 agua destilada. Mezclar hasta disolver;
Sulfato de hierro y amonio 0.2 calentar agitando y hervir durante un
Tiosulfato de sodio 0.2 minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos
de hemólisis y esterilizar en autoclave a
Agar 3.5 121°C durante 15 minutos. Solidificar
en posición vertical.
pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con
aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la
punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en línea recta.

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Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Resultados
Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de la línea de siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de
Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Microorganismo Movilid Indol Producción

ad de ácido
sulfhídrico
E. coli ATCC 25922 + + -
K. pneumoniae ATCC - - -
700603
P. mirabilis ATCC 43071 + - +
S. typhimurium ATCC + - +
14028
S. enteritidis ATCC 13076 + - +
S. flexneri ATCC 12022 - - -

Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser
difícil de observar.

-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color

parduzco,que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido
sulfhídrico.

Características del medio

Medio preparado: ámbar.

TÉCNICAS DE SIEMBRA

Se siembra en medios de cultivo para hacer que las bacterias se reproduzcan con el objetivo
de aumentar el número de individuos de una población.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del
microorganismo a estudiar.

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 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el
mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para
microorganismos aerobios.

 Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez
solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la
capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
 Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido,
se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula
de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo.
Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

 Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se
deja solidificar.

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 Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio

de cultivo fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar.
En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce
mediante punción en el medio contenido en la parte inferior del tubo.

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En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el
mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

Cuestionario:
¿Cuáles son los usos de los medios de cultivo en microbiología?
Los medios de cultivo son herramientas esenciales en la microbiología, ya que proporcionan los
nutrientes y condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos.
Estos medios permiten:
 Aislamiento e identificación de microorganismos: Al proporcionar un ambiente adecuado
para el crecimiento de microorganismos específicos, los medios de cultivo facilitan su
aislamiento y posterior identificación.
 Estudio del metabolismo microbiano: Los medios de cultivo pueden diseñarse para
observar las reacciones metabólicas de los microorganismos, como la fermentación
de azúcares o la producción de enzimas.
 Ensayos de sensibilidad a antibióticos: Los medios de cultivo se utilizan para determinar
la sensibilidad de los microorganismos a diferentes antibióticos, lo que ayuda a elegir el
tratamiento adecuado para las infecciones.
 Investigación microbiológica: Los medios de cultivo son esenciales para la investigación en
áreas como la genética microbiana, la biotecnología y la ecología microbiana.

¿Cómo se clasifican los cultivos según su estado físico, uso y finalidad?

Los cultivos se pueden clasificar según su estado físico, uso y finalidad:
Estado físico:
 Líquidos: Los caldos son medios líquidos que proporcionan un ambiente
homogéneo para el crecimiento de microorganismos.
 Sólidos: Los agares son medios sólidos que contienen agar-agar, un polisacárido que
proporciona una superficie sólida para el crecimiento de microorganismos.
 Semisólidos: Estos medios tienen una consistencia intermedia entre los líquidos y
los sólidos, y se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias.

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Uso:
 Medios generales: Estos medios son adecuados para el crecimiento de una amplia
gama de microorganismos.
 Medios selectivos: Estos medios contienen sustancias que inhiben el crecimiento
de ciertos microorganismos, permitiendo el aislamiento de otros específicos.
 Medios de enriquecimiento: Estos medios contienen nutrientes adicionales
que favorecen el crecimiento de microorganismos específicos.
Finalidad:
 Medios de mantenimiento: Estos medios se utilizan para mantener la viabilidad de los
microorganismos durante largos períodos.
 Medios de transporte: Estos medios se utilizan para transportar muestras de
microorganismos sin alterar su composición.
 Medios de identificación: Estos medios se utilizan para identificar microorganismos
específicos mediante pruebas bioquímicas.

¿Explicar, a que se debe el cambio de color de los medios de cultivo por

determinadasbacterias?
El cambio de color en los medios de cultivo se debe a la producción de productos
metabólicos por parte de las bacterias. Estos productos pueden ser ácidos, bases o enzimas
que interactúan con los indicadores de pH o los sustratos presentes en el medio.
 Agar MacConkey: Este medio contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias que
fermentan la lactosa producen ácidos, lo que cambia el color del indicador de pH de
amarillo a rojo.
 Agar sangre: Este medio contiene glóbulos rojos. Las bacterias que
producen hemolisinas pueden romper los glóbulos rojos, lo que genera halos claros
alrededor de las colonias.

¿A qué se le denomina medio de transporte y para qué sirve?

Un medio de transporte es un medio de cultivo diseñado para mantener la viabilidad de los
microorganismos durante el transporte de muestras. Estos medios no promueven el crecimiento
de los microorganismos, sino que simplemente mantienen su viabilidad hasta que se puedan
cultivar en un medio adecuado. Los medios de transporte son esenciales para garantizar la
precisión de los resultados de los análisis microbiológicos.

¿Cómo puede incubarse microorganismos anaerobios estrictos?

Los microorganismos anaerobios estrictos son aquellos que no pueden sobrevivir en presencia de
oxígeno. Para cultivar estos microorganismos, se necesitan métodos especiales para eliminar el
oxígeno del ambiente de cultivo. Algunos métodos para incubar microorganismos anaerobios
estrictos incluyen:

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 Jarra de anaerobios: Este sistema utiliza un catalizador químico para eliminar

el oxígeno de una jarra sellada.
 Cajas de anaerobiosis: Estas cajas utilizan un sistema de vacío para eliminar el
oxígeno y crear un ambiente anaeróbico.
 Incubación en atmósfera modificada: Este método utiliza una mezcla de gases que no
contiene oxígeno para crear un ambiente anaeróbico (1,2).

REFERENCIAS:
1. Corrales LC, Antolinez Romero DM, Bohórquez Macías JA, Corredor Vargas AM.
Bacterias anaerobias: procesos que realizan y contribuyen a la sostenibilidad de la
vida en el planeta. Nova [Internet]. 2015 [citado el 20 de octubre de 2024];13(24):55–
81. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S1794- 24702015000200007
2. Cultivo de microorganismos anaerobios [Internet]. Microbiologiaitt.es.tl. [citado el 20
de octubre de 2024]. Disponible en: https://microbiologiaitt.es.tl/10-.--Cultivo-de-
microorganismos-anaerobios.htm

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus y Streptococcus

Competencia:
Realiza el aislamiento e identificación de las principales especies de cocos Gram positivos que
afectan al hombre.
Establece diferencia entre géneros de cocos Gram positivos.

Materiales:
- Asa curva
- Mechero
- Muestras biológicas
- Agar Manitol salado
- Agar Sangre

Procedimiento:
 Colocar la cabeza del paciente en hiperextensión y se iluminan las fauces en forma
conveniente.
 Con el hisopo estéril se frotan ambas amígdalas (o ambos papilares en pacientes
amigdalectomizados), si existiera un exudado visible se debería tratar de tocarlo con
la punta del hisopo y en cualquier caso se debe evitar el contacto del hisopo con el
paladar o la lengua, es por ello que resulta imprescindible ayudarse con un
bajalenguas.
 Una alternativa recomendada ante una emergencia se debe colocar el hisopo en un
tubo estéril con unas gotas de solución fisiológica estéril o el medio de transporte.
 Los medios de cultivo por utilizar deben estar a temperatura ambiente.
 La siembra se realiza rotando el hisopo con muestra en una superficie de 3 x 2 cm
cerca al borde de la placa de agar sangre, manitol salado; en ese orden y con el asa se
estría por dispersión agotamiento de los cuatro cuadrantes de la placa, con el
propósito de obtener colonias aisladas e incubar los medios por 24 horas.
 Los cultivos se incubaron a 37 °C en atmósfera de CO2 al 5% durante 24 -48 hs para el
género de Streptococcus.
 Con el hisopo con muestra se rota en la lámina para la identificación de
microorganismos y diferenciación celular microscópicamente para luego colocarlo en
caldo tioglicolato.
 Revisar el cultivo observando el crecimiento tanto en los medios primarios como en
los diferenciales, así como el tipo de hemólisis en el agar sangre.
 Realizar la identificación bioquímica y microscópica así como a la vez el antibiograma
respectivo.

Sthaphylococcus. Diagnóstico de Laboratorio

Las colonias de estafilococo son fáciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a
3 mm o más, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de
superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la

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identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como

sólido y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos
del género estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan
diferentes pruebas dentro de las cuales están las siguientes.

Streptococcus y Enterococcus. Diagnóstico de Laboratorio

Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de la especie; Para
iniciar la identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido
como sólido y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite
diferenciarlos del género estafilococo, el cual produce esta enzima.

Resultados:

 STAPHYLOCOCCUS

 STREPTOCOCCUS

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Cuestionario
- Defina los diferentes tipos de hemólisis.
La hemólisis es la descomposición o ruptura de los glóbulos rojos (eritrocitos) que libera
hemoglobina en el plasma sanguíneo. Este proceso puede ocurrir tanto dentro como fuera del
cuerpo (in vivo e in vitro).
Existen diferentes tipos de hemólisis, clasificados principalmente por su apariencia en un cultivo
de agar sangre:
 Hemólisis alfa: Se caracteriza por una hemólisis parcial, donde la zona de crecimiento
del microorganismo se rodea de un halo de color verdoso. Esto se debe a que la bacteria
produce una enzima que oxida la hemoglobina, dando lugar a la coloración verdosa.
 Hemólisis beta: Es una hemólisis completa, donde se observa un halo claro alrededor de
la colonia bacteriana. Esto indica que la bacteria produce una enzima llamada
hemolisina que destruye completamente los glóbulos rojos (1,2).

- Escriba 5 enfermedades infecciosas producidos por Streptococcus y

Staphylococcus
 Faringitis estreptocócica (faringitis estreptocócica): Causada por Streptococcus
pyogenes, también conocido como estreptococo beta-hemolítico del grupo A. Se caracteriza
por dolor de garganta, fiebre, dolor de cabeza y ganglios linfáticos inflamados.
 Escarlatina: Causada por Streptococcus pyogenes, es una infección que sigue a la faringitis
estreptocócica y se caracteriza por una erupción roja en la piel, fiebre y lengua de fresa.
 Impétigo: Causada por Streptococcus pyogenes o Staphylococcus aureus, es una infección
de la piel que se caracteriza por ampollas y costras.
 Neumonía: Puede ser causada por Streptococcus pneumoniae o Staphylococcus aureus. Se
caracteriza por tos, fiebre, dificultad para respirar y dolor en el pecho.
 Síndrome de shock tóxico: Causada por Staphylococcus aureus, es una infección grave
que se caracteriza por fiebre alta, erupción cutánea, hipotensión y fallo multiorgánico.

- A que se debe el pigmento amarillento generado por Staphylococcus aureus.

El pigmento amarillento generado por Staphylococcus aureus se debe a un pigmento
llamado estafilococoxantina. Este pigmento es un carotenoides que se produce en respuesta a las
condiciones de crecimiento, como la presencia de oxígeno y la luz. La estafilococoxantina tiene
propiedades antioxidantes y puede proteger a la bacteria de los daños causados por los radicales
libres. La producción de estafilococoxantina es una característica importante para la identificación
de Staphylococcus aureus en los cultivos bacterianos. Las colonias de Staphylococcus aureus en
medios de cultivo como el agar salado manitol, se caracterizan por su color amarillo debido a la
fermentación del manitol y la producción de estafilococoxantina (3,4).

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REFERENCIAS:

1. Hemólisis [Internet]. Medlineplus.gov. [citado el 20 de octubre de 2024]. Disponible en:

https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/002372.htm
2. Polilla Studio. Edulab Blog detalle [Internet]. Com.mx. [citado el 20 de octubre de 2024].
Disponible en: https://edulabc.com.mx/wintercms/blog/post/tipos-de-hemolisis
3. Bush LM. Staphylococcus aureus Infections [Internet]. Merck Manual Consumer Version.
[citado el 20 de octubre de 2024]. Disponible en:
https://www.merckmanuals.com/home/infections/bacterial-infections-gram-positive-
bacteria/staphylococcus-aureus-infections
4. Pasachova Garzón J, Ramírez Martínez S, Muñoz Molina L. Staphylococcus aureus:
generalidades, mecanismos de patogenicidad y colonización celular. Nova [Internet]. 2019
[citado el 20 de octubre de 2024];17(32):25–38. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1794-24702019000200025

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