LABSTER MICROSCOPÍA BIOLOGÍA CELULAR:

 Microscopía.
o Microscopía óptica.
 Microscopio óptico.
 Preparación de la muestra.
 Tinción.
o Microscopía de fluorescencia.
 Tintes fluorescentes.
 Microscopio fluorescente.
o Microscopía electrónica.
 TEM.
 Intestino delgado.
o Epitelio intestinal.
o Inflamación del intestino.
o Enfermedad celíaca.
o Sí domaré de malabsorción en pollos.

Microscopía: los científicos utilizan microscopios (micro=pequeño; scope=mirar). Para

estudiar estructuras que son demasiado pequeñas para verlas a simple vista, como la
mayoría de las células. Un microscopio es un instrumento que amplia un objeto.

Existen varias técnicas de microscopía diferentes:

 La microscopía óptica es el método más común.

 La microscopía fluorescente se puede utilizar para estudiar estructuras celulares
específicas con alto contraste.
 La microscopía electrónica puede producir imágenes con una resolución muy
alta.

La microscopía óptica es la técnica de microscopía más utilizada. A menudo requiere la

tinción de la muestra para poder visualizar las estructuras de interés.

La microscopía óptica está limitada a una resolución mínima de aproximadamente 200

nanómetros (nm). La resolución mínima se define como la distancia entre dos puntos
que aún se pueden distinguir como dos entidades separadas. La resolución está
limitada por las propiedades físicas de la luz y la lente del microscopio. Por un lado, la
longitud de onda de la luz limita la resolución; cuanto más corta sea la longitud de
onda, mejor será la resolución. Por otro lado, el valor de apertura de la lente del
objetivo limita la resolución.

Para ajustar el valor de apertura a sus límites, puede colocar una gota de aceite de
inmersión entre el cubreobjetos del portaobjetos y la lente del objetivo. Sin el aceite de
inmersión, la luz se refracta cuando pasa del vidrio al aire y de regreso al vidrio de la

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lente del objetivo. Si utiliza aceite de inmersión con la misma densidad óptica que el
vidrio, este efecto se puede reducir y se puede lograrla resolución mínima.

Microscopio óptico: un microscopio óptico ilumina la muestra enfocando la luz a través

de una lente sobre el portaobjetos del microscopio. La luz pasada través de la muestra
y llega a las lentes del objetivo. Normalmente, un microscopio óptico contiene varias
lentes de objetivo para diferentes aumentos. Los objetivos están fijados en un revólver
giratorio que se encuentra sobre la muestra en la platina; este revólver puede girarse
para mover un objetivo diferente hacia la trayectoria de la luz. Cada objetivo está
marcado con un anillo de color que indica el aumento. El tamaño del objetivo también
es indicativo del aumento; el objetivo 5x es mucho más corto que el objetivo 100x. El
aumento total de la imagen resulta de multiplicar el aumento del objetivo por el
aumento del ocular, que normalmente es 10x. Por lo tanto, si observa un portaobjetos
utilizando el objetivo 5x, está ampliando la muestra 50 veces.

Para examinar una muestra, el revólver portaobjetos se gira al aumento más bajo antes
de colocar el portaobjetos en la platina del microscopio, ya que es mucho más fácil
enfocar la muestra con un aumento bajo. Los objetivos están diseñados para
serparfocalparfocal, lo que significa que permanecen enfocados al cambiar al siguiente
aumento. La platina del microscopio se puede mover horizontalmente para explorar
diferentes áreas del portaobjetos.

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Preparación de muestras para microscopía óptica: la larga historia de la microscopía
óptica y su amplia aplicación han dado lugar a innumerables técnicas de preparación
de muestras. Algunas muestras pueden mostrarse simplemente en un portaobjetos de
microscopio.

A menudo se requieren pasos adicionales para lograr resultados satisfactorios. La

mayoría de estos métodos matan las células, por lo que la microscopía óptica no es
ideal para visualizar procesos de células vivas. Los protocolos varían según la muestra y
el microscopio.

Preparación:

 Fijación: los fijadores químicos preservan el tejido al evitar su degradación y

ayudan a mantener la estructura de la célula y de los componentes
subcelulares. El fijador más común para la microscopía es la formalina
tamponada neutra al 10%.
 Deshidratación: se elimina el agua de la muestra ya que no se mezcla con el
medio de inclusión.
 Incrustaciones: la muestra se incrusta en una matriz externa sólida para facilitar
el corte.
 Corte: la muestra se corta en secciones delgadas. El grosor de las secciones
depende de la muestra y del tema de investigación. Para la histología de rutina,
estos cortes son 2-5, de dos a cinco micrómetros de espesor.
 Montaje: fijación de muestras al portaobjetos del microscopio.
 Tinción: la muestra se tiñe para agregar contraste y etiquetar las estructuras de
interés.

Tinción: la mayoría de las células son casi transparentes y es muy difícil distinguir las
estructuras. Para visualizar mejor las células y sus componentes específicos, se pueden
utilizar productos químicos que tiñen ciertas estructuras. Antes de aplicar el tinte a la
muestra, es necesario prepararla. Generalmente, se requieren uno o varios de estos
procedimientos adicionales para teñir las células:

 Deshidratación: reemplazo del agua dentro de la muestra con alguna otra

sustancia química.
 Permeabilización: disolución de las membranas celulares para permitir que
moléculas de tinte más grande penetran en el interior de las células.
 Fijación: implica varias técnicas, como la creación de enlaces químicos entre
proteínas para aumentar su rigidez.
 Aplicación de mordiente: sustancia que forma un complejo fuerte con el tinte y
el tejido.

Existen muchas tinciones diferentes:

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 Método de tinción de Mallory: el método de
tinción de Mallory utiliza tres colorantes
diferentes. Este método tiene la ventaja de
visualizar un mayor número de estructuras
tisulares. La tinción de Mallory combina azul de
anilina, que tiñe el tejido conectivo, la matriz
extracelular, las glicoproteínas y el moco,
naranja G, que tiñe las proteínas, y fucsina roja
oscura, que tiñe el ARN y el ADN.

Tinción de H&E: es la tinción más utilizada en el diagnóstico médico. El hemalum, un

complejo formado por iones de aluminio y hemateína, tiñe de azul las estructuras
ácidas (con carga negativa), como los núcleos y otros componentes celulares. Después
de la tinción nuclear, se aplica una segunda tinción, la E en H&E. La espina es un
colorante ácido que se adhiere a las estructuras básica y tiñe de rosa el citoplasma y las
proteínas extracelulares.

Microscopio de fluorescencia: aprovechan la diferencia en las longitudes de onda de

emisión y transmisión de los fluoróforos para producir imágenes de alto contraste.
Existen varios colorantes fluorescentes que pueden difundirse libremente en una célula
viva. Otros fluoróforos incluyen etiquetas de proteínas fluorescentes como la proteína
fluorescente verde (GFP) o las etiquetas SNAP que se pueden expresar de forma
transgénica y anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a las moléculas de
interés de la célula. Por lo tanto, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para
visualizar procesos microscópicos que son imposibles de visualizar con otras técnicas
de microscopía.

Tintes fluorescentes: los colorantes fluorescentes son fluoróforos que se unen a

estructuras celulares específicas. Los siguientes fluoróforos se utilizan frecuentemente
como colorantes fluorescentes:

 DAPI
 CY3 y CY5
 Rodamina
 Isotiocianato de fluoresceína (FITC)

En muchos casos, no existe una molécula fluorescente que se una específicamente a la

estructura celular para marcarla. Por lo tanto, las moléculas fluorescentes se unen a
otra molécula que se une específicamente al componente celular para visualizarlo. Por
ejemplo, la faloidina, una molécula altamente tóxica producida por un hongo, que se
une a los citoesqueletos de actina, evita su despolarización y, por lo tanto, mata la
célula. La alta especificidad para los filamentos de actina se puede utilizar para teñir el
citoesqueleto mediante la reticulación química de la faloidina con un fluoróforo como
la rodamina.

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DAPI: es un colorante fluorescente a las regiones ricas en AT del ADN. Se vuelve
altamente fluorescente cuando se une al surco menor de la hélice del ADN. El DAPI
tiene un máximo de absorción a 358 nm (ultravioleta) y su máximo de emisión a 461
nm (azul). Por lo tanto, el ADN se puede visualizar con un microscopio fluorescente al
proyectar luz ultravioleta sobre la muestra teñida con DAPI y filtrar la luz azul.

CY3 y CY5: se unen al ADN. Son sensibles a la luz y deben almacenarse y utilizarse en la
oscuridad tanto como sea posible. Por lo tanto, los pasos de etiquetado se realizan
utilizando tubos oscuros para evitar la pérdida de señal debido al fotoblanqueo del
colorante.

Las moléculas CY3 y CY5 interactúan con el ADN mediante un sistema de enlace
universal (ULS), que utiliza un compuesto especial de platino. El compuesto platino
tiene dos sitios de unión libres. El primer sitio de unión se une a un grupo marcador,
que es el compuesto de cianina (CY3 y CY5) formando un complejo Cy-ULS. El segundo
sitio de unión une el complejo a la purina de un ADN o ARN monocatenario,
bicatenario, lineal o superenrollado.

Fluoróforo: cuando una sustancia absorbe la luz, se produce la excitación de un

electrón a un estado superior. Cuando el electrón vuelve al estado electrónico inferior,
emite energía en forma de ondas electromagnéticas. Las sustancias fluorescentes
emiten ondas electromagnéticas dentro del espectro de luz visible, es decir, entre 390 y
700 nm.

Los fluoróforos se utilizan en muchas técnicas, como la microscopía fluorescente, la

qPCR, la citometría de flujo y la FACS. Existen diferentes formas de etiquetar una
molécula de forma fluorescente, entre ellas: colorantes fluorescentes,
inmunofluorescencia, etiquetas fluorescentes.

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Microscopio de fluorescencia: un microscopio de fluorescencia es similar a un
microscopio óptico. En lugar de hacer brillar todo el espectro de luz visible a través de
la muestra, el microscopio de fluorescencia solo hace brillar una longitud de onde
específica sobre la muestra. Esto se puede lograr mediante un filtro de excitación que
solopermite que la luz de una longitud de onda específica llegue a la muestra, o
mediante el uso de láseres que solo emiten una longitud de onda específica. La
longitud de onde coincide con el espectro de absorción del fluoróforo, que luego emite
una longitud de onda más larga que se utiliza para producir una imagen. La
observación se realiza mejor en la oscuridad para una detección más clara de las
señales fluorescentes y para evitar blanquear el portaobjetos, ya que los tintes
fluorescentes son sensibles a la luz.

Microscopía electrónica: los electrones tienen propiedades ondulatorias. Debido a su

alta energía, los electrones tienen una longitud de onde muy corta. Esto se traduce en
resoluciones mucho más altas que las que serían posibles con los microscopios ópticos.
Tipos de microscopios electrónicos:

 Los microscopios electrónicos de transmisión (MET): utilizan un haz de

electrones de alto voltaje para producir una imagen y se detectan los electrones
que pasan a través de la muestra.

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  Los microscopios electrónicos de barrido (SEM): producen una imagen al
sondear la superficie de una muestra.
 Los microscopios electrónicos de reflexión (REM): utilizan un haz de electrones
que apunta a una muestra delgada para detectar los electrones dispersos que
se reflejan en ella.

Microscopía electrónica de transmisión (MET): los

microscopios electrónicos de transmisión (MET)
funcionan de manera similar a los microscopios
ópticos, pero utilizan electrones en lugar de luz. Los
electrones pasan a través de la muestra como la luz
a través de una pantalla de sombras artificiales. Las
estructuras densas absorben una gran cantidad de
electrones y crean una mancha oscura en la imagen
resultante, al igual que la sombre de una marioneta
que bloquea la luz. Una imagen de MET siempre es
en blanco y negro; las técnicas de tinción solo
permiten aumentar la densidad de ciertas estructuras y, por lo tanto, hacer que
parezcan más oscuras. Para agrupar los electrones, el MET contiene imanes potentes
que son análogos a las lentes del microscopio óptico. Para iluminar eficazmente la
muestra con un haz de electrones, la porción de muestra debe ser muy delgada y el
cuerpo del MET debe estar vacío.

Intestino delgado: es el órgano donde se completa la digestión de proteínas, grasas e

hidratos de carbono. Es el principal responsable de mezclar los alimentos con los jugos
digestivo y ponerlos en contacto con el revestimiento intestinal para su absorción. El
intestino delgado absorbe el 90% de los nutrientes y el agua. También hace avanzar los
alimentos por el tracto gastrointestinal.

El intestino delgado es un órgano largo con forma de tubo. Su interior está cubierto por
el epitelio intestinal que aumenta la superficie del intestino y aumenta la eficiencia de
absorción de los nutrientes. El intestino delgado está rodeado por dos capas de
músculos lisos que se contraen en un patrón ondulatorio. Este movimiento peristáltico
mezcla el contenido del intestino delgado y lo mueve lentamnete hacia el intestino
grueso. Los nutrientes absorbidos en la sangre son transportados a la vena porta
hepática, que conduce al hígado.

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El intestino delgado humano mide más de 6 metros de largo y está dividido en tres
partes: el duodeno, el yeyuno y el íleon.

Epitelio intestinal: el epitelio cilíndrico único del intestino delgado está formado por
diferentes células epiteliales. Las células epiteliales en forma de empalizada están
estrechamente conectadas mediante uniones celulares. El epitelio intestinal está
plegado en proyecciones en forma de dedos llamados vellosidades. Cada vellosidad
contiene vasos sanguíneos y linfáticos que distribuyen de manera eficiente los
nutrientes que fueron absorbidos por lsa células del revestimiento intestinal. Estos son
objetos calve para los patógenos, por lo tanto, el revestimiento intestinal es una
barrera importante que está bien protegida por el sistema inmunológico.

Tipos de células del epitelio intestinal: el epitelio intestinal está formado por distintos
tipos de células. Las más abundantes son los enterocitos, también conocidos como
células de absorción intestinal, debido a que su membrana apical y su glicocálix están
repletos de enzimas digestivas y transportadores. Los enterocitos no solo son
responsables de la absorción de nutrientes, sino que también desempeñan un papel
importante en el procesamiento de antígenos y su presentación a las células T.

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Las células en cepillo son otro tipo de células epiteliales con microvellosidades en el
lado apical. Aunque las células en cepillo tienen microvellosidades más largas, tienen
un glicocálix más delgado que los enterocitos. La función de las células en cepillo
todavía está bajo investigación, pero se ha planteado la hipótesis de que tienen un
papel receptor.

Las células caliciformes se distinguen fácilmente de los otros tipos de células, ya que
producen y secretan moco en el lumen del intestino delgado. El moco está compuesto
principalmente de glicoproteínas de mucina, que forman una capa gelatinosa que
cubre las células epiteliales. Esto ayuda a proteger las células del daño físico al actuar
como lubricante y la red gelatinosa de macromoléculas también forma una barrera
contra las células bacterianas.

Uniones celulares: son estructuras moleculares entre células que estabilizan el tejido,
forman barreras y permiten el transporte de moléculas entre dos células.

Las uniones celulares más grandes se denominan desmosomas. Son complejos

proteicos que conectan las fibras de queratina de dos células como un cierre de velcro.
Los desmosomas ayudan al tejido a resistir fuerzas de corte.

Los tejidos que forman una barrera, como el epitelio intestinal, requieren que las
células individuales estén estrechamente conectadas para evitar que se escape
cualquier líquido. Esta función de sellado la realiza una red de uniones estrechas. Estas
cadenas de complejos proteicos conectan la membrana plasmática de dos células
vecinas formando una barrera prácticamente impermeable al líquido.

Las uniones estrechas están sostenidas por las uniones adherentes. Las uniones
adherentes son complejos proteicos con forma de ancla similares a los desmosomas,
pero están unidos al citoesqueleto de actina.

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Duodeno: la parte fija del intestino delgado, que tiene forma de “C”, se llama duodeno.
El duodeno está separado del estómago por el esfínter pilórico, que se abre para
permitir que el quimo pase del estómago al duodeno. En el duodeno, el quimo se
mezcla con los jugos pancreáticos en una solución alcalina rica en bicarbonato que
neutraliza la acidez del quimo y actúa como amortiguador.

Los jugos pancreáticos también contienen varias enzimas digestivas, que se mezclan
con la bilis del hígado y la vesícula biliar, así como los jugos digestivos de las células
glandulares de la propia pared intestinal. Estos jugos digestivos descomponen las
partículas de alimentos del quimo en glucosa, triglicéridos y aminoácidos. En el
duodeno se produce una parte de la digestión química de los alimentos, así como la
absorción de ácidos grasos.

Yeyuno: la segunda parte del intestino delgado, después del duodeno, se llama yeyuno.
Aquí continúa la hidrólisis de los nutrientes mientras la mayoría de los carbohidratos y
aminoácidos se absorben a través del revestimiento intestinal. La mayor parte de la
digestión química y la absorción de nutrientes se produce en el yeyuno.

Íleon: es la última parte del intestino delgado. Aquí se absorben las sales biliares y las
vitaminas en el torrente sanguíneo. Los alimentos no digeridos se envían al colon
desde el íleon mediante movimientos peristálticos del músculo. El íleon termina y el
intestino grueso comienza en la válvula ileocecal.

Inflamación del intestino delgado: el epitelio del intestino delgado está

constantemente expuesto a una variedad de microorganismos y sustancias extrañas.
Proporciona una barrera física e inmunológica contra estos desafíos externos. Las
células del epitelio escanean constantemente el entorno en busco de antígenos para
poder reaccionar rápidamente ante los patógenos. Debido a esta exposición constante,
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los linfocitos siempre están presentes en el intestino en una proporción de
aproximadamente 6 a 40 linfocitos por cada 100 células epiteliales.

Si un linfocito detecta un antígeno,

la célula inmunitaria envía
inmunoestimuladores y se inicia
una cascada de señalización. Se
reclutan más linfocitos y migran al
tejido inflamado. Los cambios
radicales de la arquitectura epitelial
conducen a una disminución de la
longitud de las vellosidades, a la apoptosis de las células epiteliales y al agrandamiento
de las criptas. Estos cambios reducen la superficie del intestino delgado, lo que a su vez
conduce a una disminución de la absorción de nutrientes.

Enfermedad celíaca: es una enfermedad autoinmune desencadenada por el gluten.

El gluten es una proteína que se encuentra en cereales como el trigo, la cebada y el

centeno. El gluten reticula las fibras de almidón y le da a la masa su elasticidad y
masticabilidad. En individuos genéticamente predispuestos, el gluten es reconocido
como un antígeno y desencadena una respuesta inmunitaria. Los linfocitos migran al
epitelio del intestino delgado e inician una reacción inflamatoria. Si la persona continúa
consumiendo gluten, el intestino permanece crónicamente inflamado. Esto conduce a
la contracción de las vellosidades y a una disminución de la superficie del intestino
delgado.

Los pacientes sufren estreñimiento crónico, diarrea, anemia, fatiga y retraso en el

crecimiento de los niños. El daño inducido en la mucosa intestinal persiste durante
mucho tiempo y el único tratamiento eficaz es una dieta sin gluten. La intolerancia al
gluten no se diagnostica en la mayoría de los pacientes, por lo que se desconoce
cuántas personas lo padecen. Estudios recientes estiman que alrededor del 1% de la
población de los países occidentales padece enfermedad celíaca.

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Síndrome de malabsorción en pollos: también conocido como enfermedad del
enanismo, se presenta en pollos jóvenes y presenta un retraso en el crecimiento de los
individuos afectados y una reducción general de la productividad de la granja avícola.
La enfermedad está asociada a varias cepas de virus diferentes, pero no se ha
identificado un agente único. Los pollos sanos pueden infectarse con un inóculo del
contenido intestinal de un individuo enfermo.

Los pollos infectados desarrollan lesiones entéricas, inflamación intestinal y dilatación

de las criptas. Estos cambios provocan una reducción de la superficie de absorción, lo
que a su vez provoca una menor absorción de nutrientes y un menor crecimiento.

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