TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICAS
Práctica 1: CARMEN

Métodos de determinación de microorganismos:

Recuentos:

- Recuento de viables: para bacterias, hongos, levaduras…recurrimos a las técnicas de

recuento en placas Petri (medios sólidos con agar 1.5%) para conseguir aislar sobre la
superficie células que, tras la incubación, se dividirán y darán lugar a las colonias o
unidades formadoras de colonia (u.f.c) las cuales observaremos y analizaremos.
Se distinguen 3 tipos de técnicas de recuento en placa:

 Siembra en superficie: la cual utilizaremos cuando estemos ante un

número elevado de microorganismos, por lo que tendremos que diluir la
muestra.

 Siembra por inclusión

 Filtración en membrana: la cual se aplica cuando el número de
microorganismos es bajo, por lo que deberemos concentrar la muestra.

- Recuento de totales: para el recuento de microorganismos de tamaño grande y en la

cual no se discrimina la viabilidad de las células, ya que se cuentan todos los
microorganimos. Se distinguen 3 tipos:

 Cámaras de recuento: sobre la que se deposita la dilución problema y

posteriormente se observa al microscopio.
  Contadores electrónicos: son los más utilizados.

 Citometría de flujo.

- Determinación del peso en seco: determinación directa en la cual podemos calcular el

total de la biomasa presente.
- Determinación de un componente celular: se trata de una determinación indirecta que
puede ser a su vez:
 Inespecífica: por ejemplo la cuantificación de proteínas
 Especifica: por ejemplo la cuantificación de pigmentos como la clorofila de
las microalgas.
- Determinación de la actividad microbiana: con una actividad enzimática, por ejemplo
la actividad esterasa.

*Microalgas:

Son microorganismos unicelulares que son capaces de llevar cabo la fotosíntesis

oxigénica. Presentan varios pigmentos característicos, sobre los que destaca la clorofila a.
Dentro de este grupo se engloban tanto las microalgas eucariotas como procariotas
(cianobacterias). Su importancia reside en que están presentes en todas las masas de agua
(tanto dulces como saladas) y que tienen un papel fundamental en las cadenas tróficas, ya que
se encargan de fijar CO2 y de sintetizar compuestos orgánicos complejos utilizando la energía
luminosa. Como fruto de este proceso, se produce la liberación de O2, que constituye más del
50% del total del planeta. A día de hoy son muy investigadas para sus aplicaciones en la
acuicultura (alimentación de las larvas de crustáceos y peces), para la industria farmacéutica
(producción de astaxantina) y la producción de biodiesel (para su uso en la obtención de
combustibles alternativos), así como su aplicación como indicadores de la calidad
medioambiental (pesticidas, contaminantes, fármacos…).
Las 4 microalgas que usaremos en esta primera práctica son procedentes del agua de
mar y muy usadas en la agricultura:
  Tetraselmis suecica (verde) + grande

 Dunaliella tertiolecta (verde)

 Isochrysis galbana (dorada)

 Phaeodactylum tricornutum (parda) + pequeña

1- Recuento de microorganismos totales: mediante las cámaras de recuento: cámara

Neubauer:

Se basa en conocer el volumen de muestra en el cual estamos llevando a cabo

el contaje. Cada cuadrante se divide en 16 cuadriculas, por las cuales nos ayudaremos
para el contaje. Se apunta en número de microorganismos por cuadrante, no por
cuadriculas, y las células que se encuentren en los bordes, tendremos que tomar la
decisión de contarlas o no, pero se contaran todas o ninguna.
Nº de células por cuadrante: 20-200 células
<200 no se considera cuantificable
>200 se considera un número demasiado elevado
Con las dimensiones de la placa sabemos el volumen medido: 1mm x1mm x
0.1mm.Sabiendo el volumen y el nº de células, sabremos el total de células del cultivo
puro.
Las microalgas se incuban en un medio inorgánico al que se le insufla aire para
que empleen el CO2 de la atmosfera para crecer.
Antes de proceder a su recuento necesitamos fijarlas, ya que algunas tienen
flagelos y capacidad de movimiento que nos dificultarían su contaje. Esta fijación se
lleva a cabo con lugol, solución de betadine sin alcohol, que impedirá el movimiento
de los flagelos anteriormente dicho. Se añaden así 30µl de lugol por cada mililitro de
cultivo.
Como el cultivo es muy denso, prepararemos una dilución antes de cargar la
cámara. Para ella se usará un tampón fosfato (PBS) de pH salino.
Una vez preparada, se cargará la cámara, para lo que antes mojaremos las
ranuras con H2O para fijar el porta y a continuación añadir con la ayuda de una pipeta
Pasteur el cultivo diluido con cuidado de que esta no sobresalga de su recuadro
correspondiente, y, seguidamente, procederemos al recuento en los microscopios
ópticos.

Cálculos: Phaeodactylum tricornutum

5ml de cultivo  150 µl

2ml de dilución + 60µl de lugol
0.1ml dilución + 2.9ml de solución tampón  3ml de volumen final  dilución 1/30
Recuento:
1-
1º cuadrante: 89 células
2º cuadrante: 59 células
3º cuadrante: 72 células
4º cuadrante: 75 células
2º
1º cuadrante: 54 células
2º cuadrante: 87 células
3º cuadrante: -- células
4º cuadrante: -- células BURBUJA

Hacemos la media con 6 valores aunque deberíamos de haber recargado de nuevo y

usar 8 valores.
Recuento total: 72.66 células
 72.66𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 1000 𝑚𝑙
0.1µ𝑙
𝑥 1𝑚𝑙
x 30= 21798000 células/ml de cultivo  22 millones de célula/ml

Densidad celular del cultivo: 22*10-6 células/ml en la disolución madre.

Hecho el recuento de totales, ya conocemos la densidad de nuestro cultivo.

2- Estima indirecta con un componente celular:

Miraremos la cantidad de proteínas hidrosolubles presentes en las células de
las propias microalgas. Es una técnica inespecífica por que vamos a analizar una
molécula que no es especifica ni característica de un grupo determinado de
microorganismos, ya que están presentes en todos los demás.
El método Gradfor se basa en el uso de un colorante específico llamado
colorante de Coomasie, que se une específicamente a los aminoácidos,
fundamentalmente aromáticos como la arginina. Cuando se produce la unión, el
colorante sufre un cambio en su espectro de absorción, pasando de absorber a 465nm
de longitud de onda a valores entorno a 595nm. De esta manera, se podrán relacionar
dichos datos de la absorvancia por la cantidad de proteína presente en la muestra
problema.
Lo primero que haremos será retirar 8ml del cultivo, 1 tubo por pareja, y
concentraremos esa biomasa centrifugando a 3000rpm durante 8minutos. Pasado este
tiempo, desecharemos el sobrenadante del tubo con la ayuda de pipetas Pasteur
conectadas al grifo para conseguir así un sistema de vacío, quedándonos así con el
precipitado, que es donde se encuentra la biomasa que nos interesa.
Después de esto, haremos una suspensión celular en un medio libre de
proteínas (7ml de H2O destilada en este caso), asegurándonos que todas las células
queden resuspendidas agitando con cuidado o dándole pequeños toquecitos al tubo
de ensayo. Una vez hecho esto, someteremos a las células a un proceso de rotura para
liberar con ello el contenido citoplasmático donde se encuentran las proteínas que nos
interesan. Esto lo haremos mediante un método físico, el sonicador, pero también se
puede llevar a cabo con agitadores celulares, bolitas de vidrio, el vórtex… Sonicaremos
nuestra dilución durante 1 minuto y con la muestra siempre en agua con hielo para
evitar el sobrecalentamiento y la desnaturalización de las proteínas que con esto
conlleva. A continuación eliminaremos los restos celulares que no son de nuestro
interés, por lo que centrifugaremos de nuevo la muestra, otra vez a 3000rpm durante
8 minutos, pero, en este caso, nos quedaremos con el sobrenadante, que es donde se
encuentran las proteínas que vamos a cuantificar. A partir de cada muestra, haremos
diluciones de las cuales haremos 3 replicas, ya que necesitamos 3 datos para realizar
después nuestras medias. Para la cuantificación, usaremos un reactivo, un colorante,
que ha de añadirse siempre en la proporción 4:1 en cuanto a la muestra. Las replicas
han de tener siempre un mismo volumen final de 2ml para el espectrofotómetro.
Una vez miradas las absorvancias en este, necesitamos poder relacionar dichos
valores con el contenido de proteínas, por lo que haremos una recta patrón para la
que utilizaremos una solución estándar de proteína BSA (seroalbúmina bovina) y una
solución concentrada de 1mg/ml en H2O destilada. A partir de esta prepararemos 5
patrones con las siguientes concentraciones finales:
5 µg/ml 10 µg/ml 15 µg/ml 20 µg/ml 25µg/ml
De cada patrón se prepararán 8ml y a partir de cada uno se harán 3 tubos
siguiendo el patrón anterior (2ml finales y el colorante en una relación 4:1) para medir
la absorvancia. Una vez obtenidos los datos de la recta patrón, haremos en Excel una
gráfica para observar la relación.
Cálculos y gráfica

Ci x Vi = Cf x Vf
1000µg/ml x Vi = 5µg/ml x 8ml Vi = 0.04ml  46µl BSA 7.96ml H2O
1000µg/ml x Vi = 10µg/ml x 8ml Vi = 0.08ml  80µl BSA 7.92ml H2O

V15=0.12ml  120 µl BSA 7.88ml H2O

V20=0.16ml  160 µl BSA 7.84ml H2O
V25=0.20ml  200 µl BSA 7.80ml H2O

Cálculo de dilución 1/5

1.6ml
Vt= 8ml  1.6ml de la muestra 6.4 ml H2O

ABS 595nm tiene que ser siempre <1

Réplica/() 5µg/ml 10µg/ml 15µg/ml 20µg/ml 25µg/ml MUESTRA

1 0.201 0.538 0.767 0.956 1.154 0.903
2 0.338 0.516 0.739 0.975 1.126 0.968
3 0.313 0.533 0.712 0.964 1.085 0.945

[] y = 1,607x + 2,142
30

25

20

15
[]
10 Lineal ([])
5

0
0.533
0.767
0.201
0.338
0.313
0.538
0.516

0.739
0.712
0.956
0.975
0.964
1´154
1´126
1´085
 3,65𝑥 5 𝑥 7𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖 ó𝑛
8𝑚𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
= 15,97µ𝑔 ∗ 𝑚𝑙-1 cultivo

Proteínas por célula:

Peso seco  %= [(15,97picog/célula)/ 97pg/célula] x100= 16,46%

3- Filtración en membrana:
Para medir la calidad del aire. Se utilizara un medio selectivo, Saboraud, para el
recuento de hongos y levaduras presentes en el ambiente del laboratorio. Su
selectividad viene determinada por su composición, ya que cuenta con una alta
concentración de azúcares, un pH ácido con valores entorno a 5.2 y un antibiótico, el
cloranfenicol, que inhibirá el crecimiento de bacterias. Para llevar a cabo la filtración, a
parte del medio de cultivo, necesitaremos también un filtro para retener los
microorganismos. Estos vienen esterilizados y están compuestos de nitrato de celulosa
con un tamaño de poro de 0.45 µm. Forzaremos al aire a pasar por este mediante un
sistema de vacio (cafeteras conectadas al grifo), por lo que conoceremos el volumen
de aire que se filtrará y, por lo tanto, el nº de microorganismos por volumen de aire.
El filtro se manipulará siempre en condiciones de asepsia y se conectará la cafetera a
la bomba de vacio durante 10 minutos, provocando un flujo de aire constante de
500l/h. Una vez transcurrido ese tiempo, apagamos la bomba de vacío y colocamos el
filtro en la placa con el medio de cultivo. Dejamos incubar a temperatura ambiente y
boca abajo para evitar la condensación.
Las pruebas de medición de la calidad del aire se realizan ya que este puede
ser un foco de contaminación, tanto de alimentos, hospitales, oficinas… este no consta
de una microbiota propia, llegando los microorganismos mediante los animales, por
respiración, estornudos, tos…y manteniéndose en el por suspensión.
*Resultado: este dependerá del flujo de la bomba (500l/h) y del tiempo de
exposición (10min).

500l/h  10min  83.33l

u.f.c x m-3 =0.083 m3
10 colonias  10colonias/0.083m3 = 120.5 u.f.c/m3 a las 72 horas en un medio
selectivo, Saboraud, a temperatura ambiente.
La muestra se considera representativa por que no se realizo ninguna dilución de la
misma previamente. En un caso real se realizaría la media de todas las placas del
laboratorio y se realizarían los cálculos con ese dato.
Práctica 2:

4- Determinacion a partir de una actividad microbiana: se hará a partir de una actividad

enzimática (esterasa), un método inespecífico.

Para llevarla a cabo, emplearemos el ensayo de la hidrólisis enzimática del diacetato de

fluoresceína. El FDA es un compuesto fluorogénico formado por un anillo central (un anillo de
fluoresceína) y dos radicales, que son dos acetatos. El FDA es un éster no polar, lipofílico, no
fluorescente (característica importante), que atraviesa las membranas lipídicas penetrando en
el interior celular. Cuando una célula es viable, se encuentra metabólicamente activa, por lo
que estas enzimas esterasas inespecíficas romperan los enlaces éster liberando los radicales
acetato, apareciendo de esta forma la fluoresceína libre en el interior celular. Al contrario que
el FDA, la fluoresceína es una molécula polar e hidrófila, por lo que quedará retenida en el
interior celular, absorbiendo luz entorno a los 400nm de longitud de onda y emitiendo
fluorescencia cuando se excita, presentando un espectro de emisión de luz a 525nm.

Monotorizando la aparición de fluoresceína en el interior celular, podremos cuantificar

la actividad esterasa presente en las células del cultivo, ya que los valores son directamente
proporcionales.
Lo primero que haremos será retirar del cultivo 20 millones de células, por lo que
necesitaremos saber la densidad celular del cultivo mediante las cámaras de recuento que
usamos en la práctica anterior. Si el volumen es pequeño (3-4ml), se centrifugará y se rellenará
con PBS hasta llegar a 7ml. El PBS no aportará ningún componente celular y lo eliminaremos
en el momento de desechar el sobrenadante.
Trabajaremos con 2 tubos por persona, diferenciándolos previamente en T0 y Tf, en los
que depositaremos los 20 millones de células que seleccionamos en el paso anterior. A
continuación centrifugamos a 3000rpm durante 8min y con pipetas Pasteur conectadas a la
bomba de vacío eliminaremos el sobrenadante, resuspendiendo después las células en 4ml de
PBS. A esta suspensión se le añadirá el FDA, en stock a 2mg/ml en acetona y con una
concentración final de 50µg/ml de fluoresceína.
En el tubo T0, en el momento de añadir el FDA, añadiremos también acetona 50% en
concentración final en el tubo partiendo de acetona 100%, con lo que pararemos la reacción
inmediatamente (será el tiempo inicial). Esta acetona va a permeabilizar las membranas
celulares, ya que daña sus lípidos de membrana, matando como consecuencia a las células y
eliminando por lo tanto la actividad metabólica. Además, también permitirá que el contenido
citoplasmático salga al exterior celular, saliendo con ello la fluoresceína y permitiéndonos
cuantificarla en el sobrenadante.
En el tubo Tf, , en cuanto añadamos el FDA, no pararemos la reacción, si no que lo
incubaremos a temperatura ambiente y protegido de la luz (papel de aluminio) durante hora y
media/ 2 horas. Transcurrido este tiempo, pararemos la reacción de la misma manera que en
el tubo anterior, con acetona 50%. Esperamos 10 minutos y centrifugaremos a 3000rpm
durante 8 minutos para eliminar los restos celulares.
Mediremos la absorvancia del sobrenadante de los dos tubos a 490nm. Para esto
vamos a necesitar 3 tubos de espectro por cada tubo de ensayo, es decir, 6 tubos, en los que
echaremos 2ml de nuestra dilución problema y que constituirán nuestras replicas.
 Igual que en la practica anterior, necesitamos una recta patrón que relacione la
absorvancia y la concentración de fluoresceína. Para hacerla tendremos concentraciones
conocidas de fluoresceína y un tubo que actúe como blanco, y con ellos y los valores obtenidos
realizaremos posteriormente una gráfica en Excel. La ecuación de la recta ya nos viene
proporcionada:
𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒í𝑛𝑎 = 4.79A490 + 0.08
Rango de trabajo de la ecuación: [0.5-5µg/ml]

Cálculos:
Densidad celular: 21798000cel/ml de dilución madre

21798000𝑐𝑒𝑙 20000000𝑐𝑒𝑙
𝑋𝑚𝑙 = =
1𝑚𝑙 𝑋𝑚𝑙
Xml=0.9175ml 917µl de dilución madre (cultivo de algas)
917µl + 6ml PBS= 7ml de volumen total
Ci x Vi = Cf x Vf
2000µg/ml x Vi = 50µg/ml x 4ml
ViFDA stock= 0.1ml  100µl FDA

100% x 4ml (volumen PBS)=50% x Vf (PBS + acetona)

Vf= 8ml  4ml PBS + 4ml de acetona

*Fluorescencia: excitación de una molécula o átomo y de sus electrones provocando en estos

un salto a un orbital de energía superior. Estos no se pueden mantener en ese orbital superior
y vuelven a su inicial emitiendo energía. Parte de esta energía se emite en forma de calor y
otra parte en forma de luz, la fluorescencia. La fluoresceína tiene un máximo de absorción a
490nm de longitud de onda, que corresponde al espectro de excitación. Esta longitud se
corresponde con el color azul. El espectro de luz visible se encuentra entre los valores de
400nm y 790nm.

La citrometría de flujo no se basa en nada de lo anterior, si no que se basa en el

espectro de emisión. La fluoresceína emite una longitud de onda superior a valores de 525nm,
correspondiente con el color verde en el espectro visible.

 Dunaliella tertiolecta
490nm

Tubo 1 (T0) 0.127 0.136 0.127

Tubo 1 (Tf) 0.445 0.514 0.532
Tubo 2 (T0) 0.110 0.104 0.235
Tubo 2 (Tf) 0.353 0.426 0.460

T0= 𝑋= 0.65 µg/ml Tf - T0= 1´1561 µg/ml

1´1561 µg /ml 𝑥8 𝑚𝑙
Tf=𝑋= 2´211 µg/ml = 0.3122 µg/106*horas
20 𝑚𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑥 2 𝑕𝑜𝑟𝑎𝑠
5- Determinación del peso en seco:

Estima directa de la biomasa por ml de cultivo. Consiste en concentrar la muestra

mediante filtración.
Cada pareja trabajará con 4 filtros de microfibra de vidrio de 25mm de diámetro. Lo
primero que haremos será pesar estos filtros para conocer el peso inicial cuando se
encuentran totalmente secos y, una vez filtrada la biomasa microalgal, pesarlos de nuevo y
comparar ambos datos. Los filtros los depositaremos en una placa Petri dividida en 4
cuadrantes, manipulándolos siempre con las pinzas para evitar su contaminación. Para
pesarlos usaremos una balanza de precisión o granatarios capaces de pesar hasta un cuarto
decimal. Filtraremos un volumen conocido de cultivo con la ayuda de los mltifilters, que
pueden filtrar hasta 12 muestras a la vez, y lo conectaremos a la bomba de vacio para agilizar
el proceso. Se filtrará ml a ml para evitar la saturación del filtro. Cuando esta filtración no se
produzca de una manera ágil, a partir de 3-4ml aproximadamente, dejaremos de añadir la
muestra.
Una vez finalizada la filtración, colocaremos cada filtro en su cuadrante
correspondiente y lo dejaremos en la estufa a 70ºC durante 24 horas para eliminar toda la
humedad. Transcurrido dicho tiempo, pesaremos de nuevo y compararemos como ya se ha
dicho antes el peso inicial con el peso final.

Cálculos:
1 2 3 4
Peso inicial 0.0264 0.0266 0.0259 0.0267
Peso final 0.0370 0.0373 0.0366 0.0374
*Volumen de la solución madre  5ml en cada filtro*
Para calcular el peso en seco hallaremos la diferencia entre el peso inicial y el peso
final, correspondiendo este resultado con el valor de la biomasa presente.

F1  0.0370 - 0.0264 = 0.0106

F2  0.0370 - 0.0266 = 0.0109 Hacemos la media  Biomasa total
F3  0.0366 - 0.0259 = 0.0107 𝑋 = 0.0107g/5ml  2´145 mg/ml de muestra
F4  0.0374 - 0.0267 = 0.0107
Mili= -3
Micro= -6
Nano=-9
Pico= -12
Fento= -15

P.S célula= 2´145 mg*ml-1/ 22*106 ml = 0.097*10-6 mg/célula  0.097 ng/célula  97 pg/cél
6- Determinación de un componente celular:

Haremos una estima indirecta especifica de la biomasa a través de un compuesto

bioquímico especifico de microalgas y cianobacterias, el pigmento clorofila a. Es indirecta por
que estimamos la biomasa por un componente especifico de la célula.
Para llevar a cabo este ensayo, trabajaremos con un tubo por persona, retiramos 5ml
de cultivo, centrifugaremos a 3000rpm durante 8min y nos quedaremos con el precipitado,
sobre el cual añadiremos un solvente polar (ya que las clorofilas son polares) y 8ml de acetona
90%, resuspendiendo bien el precipitado. La acetona permeabilizara la membranas
plasmáticas y dejara que salga al exterior la clorofila, por lo que será un solvente del pigmento.
Sellaremos los tubos con parafilm y dejaremos reposar a 4ºC durante 24 horas y en
oscuridad. Pasado este tiempo, centrifugaremos de nuevo a 3000rpm durante 8 minutos y
mediremos los coeficientes de extinción molar en el sobrenadante.
Si la extracción de los pigmentos ha sido eficaz al 100%, el pellet estará incoloro, ya
que la clorofila se habrá disuelto.
Determinar las absorvancias a diferentes longitudes de onda del sobrenadante. Diluir
previamente la solución madre con acetona 90% y hacer 3 mediciones (3 replicas) de 2ml del
estrato diluido. Aplicaremos la ley de Lambert Beer y los coeficientes de extinción molar para
cuantificar la cantidad de clorofila. En este caso no hacemos recta patrón por que no es fácil
obtener clorofila a natural aislada, por lo que aplicaremos una ecuación en base a os
coeficientes de extinción molar. Esta ley permite relacionar la absorvancia con el coeficiente
de extinción molar por la concentración de la disolución y por l (longitud de onda), cuyo valor
suele ser constante y de 1cm:
E = coeficiente de extinción molar
𝐴𝑏𝑠 = 𝐸 𝑥 𝑐 𝑥 𝑙 c = concentración
L = 1cm
En el caso de las clorofilas, conocemos los coeficientes de absorción, con lo que
podemos conocer la concentración de clorofila mediante la siguiente ecuación:

𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎 𝑎 = 11.85 𝑥 𝐴664 − 1.54 𝑥 𝐴647 − 0.08𝑥 𝐴630

En nuestra preparación también tenemos clorofila b y c, por lo que tenemos que

sustraerla aplicando los máximos de abs y los coeficientes de extinción molar. Así
obtendremos los mg/ml de clorofila a por ml del extracto. Cada vez que se cambia de longitud
de onda para las mediciones, tendremos que configurar el blanco.

Cálculos:

Dilución ¼  2ml de extracto + 6ml acetona 90%  8ml

Tubo/ABS A664 A647 A630

Tubo 1 0.153 0.052 0.036
Tubo 2 0.153 0.052 0.037
Tubo 3 0.165 0.053 0.038
Tubo 4 0.260 0.090 0.063
Tubo 5 0.222 0.074 0.050
Tubo 6 0.263 0.088 0.063

Tubo 1: []=11.85 x 0.153 – 1.54 x 0.052 – 0.08 x 0.036= 1.72 µg/ml de clorofila
Tubo 2: []=11.85 x 0.153 – 1.54 x 0.052 – 0.08 x 0.037= 1.73 µg/ml de clorofila
Tubo 3: []=11.85 x 0.165 – 1.54 x 0.053 – 0.08 x 0.038= 1.72 µg/ml de clorofila
Tubo 4: []=11.85 x 0.260 – 1.54 x 0.090 – 0.08 x 0.063= 2.937 µg/ml de clorofila
Tubo 5: []=11.85 x 0.222 – 1.54 x 0.074 – 0.08 x 0.050= 2.512 µg/ml de clorofila
Tubo 6: []=11.85 x 0.263 – 1.54 x 0.088 – 0.08 x 0.063= 2.975 µg/ml de clorofila
𝑋 = (1.72 + 1.73 + 1.87 + 2.937 + 2.512 + 2.975)/6 = 2.29µg/ml  2.29*10-3 mg/ml

2.29*10-3mg clorofila/ml estrato diluido = 2.29µl/ml

2.29 µ𝑔/𝑚𝑙𝑥 4 𝑥 8𝑚𝑙 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑜𝑛𝑎

= 14´6496 µ𝑔/𝑚𝑙
5𝑚𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

14´649µ𝑔/𝑚𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜
= 0.67206 𝑝𝑔/𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎
21798000𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝑙

14´6496µ𝑔/𝑚𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜
= 6.8296 µ𝑔 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑓𝑖𝑙𝑎/𝑚𝑔 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜
2´145𝑚𝑔/𝑚𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜

0.67296 𝑝𝑔 /𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎
µg/ps= %= 98.4 𝑝𝑔 /𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎
x 100 = 0.68%
Práctica 3: KIKE

Análisis microbiológico de las aguas

Una de las técnicas que más repercusión tiene sobre la vida cotidiana y la sociedad al
decidir si un agua es apta para el consumo humano o no es su análisis microbiológico o análisis
de potabilidad.
Se dice que un agua es potable cuando cumple con los requisitos físico-químicos y
microbiológicos que la hacen apta para el consumo humano y de animales.
Criterios microbiológicos: ausencia de microorganismos patógenos, como por ejemplo
E.coli, Salmonella, Legionella, Bacillus, protozoos, virus, hongos, estreptococos… los cuales
presentan una gran diversidad y dificultad a la hora de detectarlos y cultivarlos.
Para su detección se usan principalmente los microorganismos bioindicadores,
aquellos que se encuentran en un determinado ambiente siempre y cuando se dan unas
características físico-químicas concretas, de tal manera que si yo detecto ese microorganismo,
puedo decir que en ese ambiente se dan dichas características sin necesidad de medirlas. Estos
criterios aparecen plasmados en la teoría de la asignatura previamente dada.
Lo primero que deberemos hacer será averiguar como llegan los microorganismos al
agua, considerando un tipo de contaminación, por materiales fecales como ejemplo. Esta
contaminación no es visible, por lo que es muy fácil de pasar por alto y es un riesgo muy
importante para la salud mundial. La principal tarea consiste en demostrar que en ese agua no
existe ningún aporte ni presencia de materia fecal, fácil de indicar gracias a los bioindicadores
de antes. Hay un grupo que determina las condiciones de la contaminación fecal, el grupo de
los coliformes, bacterias que viven en el tubo digestivo de los animales de sangre caliente, que
serán expulsados al medio juntos con las heces. Este grupo es además muy fácil de cultivar y
de detectar. En un agua no buscamos patógenos, si no indicios de contaminación fecal a
través de los bioindicadores. El que haya coliformes no quiere decir que haya patógenos, pero
es una señal de alarma.
Lo que haremos antes de nada será recurrir a la legislación para saber los criterios y el
análisis adecuado que debemos realizar. En este caso realizaremos un análisis casi completo.

Análisis microbiológico de un agua:

1- Filtración de membrana: es una técnica habitual que se emplea para aguas no turbias y
que consiste en filtrar un volumen determinado de un agua problema a través de
membranas estériles de 0.45µm de tamaño de poro. Filtrada el agua, los
microorganismos quedaran retenidos en el filtro y este se colocara encima de un
cultivo determinado (cultivos selectivos), en función de lo que estemos buscando.
Estos nos permiten saber si el microorganismo en cuestión esta presente en la
muestra de una manera rápida.

1.1- Recuento de bacterias aerobias mesófilas heterótrofas:

Incubaremos los filtros a dos temperaturas, a 20-22ºC (Tª ambiente) y a 37ºC
(Tª corporal) para hacer una comparación entre las dos y saber a que Tª crecen mas
microorganismos y determinar de esta forma si ha habido contaminación o no. Esto lo
sabremos ya que si crecen microorganismos a 37ºC, no son propias del ambiente, por
lo que si que habría contaminación.
Para esto filtraremos en condiciones asépticas 1ml del agua problema y se
colocara el filtro en un medio de cultivo general. La de Tª ambiente se incubara
durante 3 días (72 horas), mientras que la de 37ºC la dejaremos 24 horas. Antes de
añadir el ml del agua problema, debemos echar un poco de solución salina en el filtro
como mecanismo de dispersión para nuestra agua. La cantidad de este suero no será
relevante.
*Resultados 20-22ºC: después de 24 horas no vemos formación de
colonias, por lo que incubaremos 24 horas más.
37ºC: después de 24 horas, observamos un gran
número de unidades formadoras de colonias (u.f.c), por lo que haremos un
recuento en el contador de colonias total: 82 u.f.c/ml agua

1.2- Recuento de coliformes totales: determinaremos todos los géneros de

coliformes.
-COLIFORMES: bacilos gram-, anaerobias facultativas, no formadoras de
endosporas y capaces de fermentar lactosa con producción de ácido y gas a 37ºC en 24
horas.
Esta se realiza filtrando 100ml del agua problema, colocando el filtro después
en un medio selectivo y diferencial para coliformes, el medio ENDO, que lleva un
compuesto con sales biliares, que emulsiona las grasas y actúa como un inhibidor del
crecimiento de bacterias por que desorganizan sus lípidos de membrana. Las
coliformes estas acostumbradas a estas sales, por lo que constituye un medio selectivo
para ellas. Este medio también lleva lactosa como fuente de carbono y un colorante, la
fucsina, que le dará un color rojo fuerte propio a las colonias de coliformes. Cuanto
mayor sea la actividad fermentativa de estas, mas fuerte se teñirán de color rojo.
Incubaremos a 37ºC durante 24 horas.
*Recuento: Número de unidades formadoras de colonias Incontable
No se considera un dato fiable en este caso.
>300 u.f.c/100ml agua

1.3-Recuento de coliformes fecales:

- COLIFORME FECAL: grupo dentro los coliformes totales importante por que
se encuentra siempre en el tubo digestivo de los animales de sangre caliente. Si se
encuentra en el agua significa que se produjo contaminación fecal, mientras que si son
otro tipo de coliformes no tuvo por que ser contaminada ya que pueden ser bacterias
presentes en el ambiente, siempre y cuando su número no sea muy elevado o
desproporcionado. Los coliformes fecales tienen la misma definición que los
coliformes pero son capaces de fermentan la lactosa con producción de acido y gas no
solo a 37ºC, si no que también a 44ºC.
El medio de cultivo usado en este caso es el mFC, que lleva todo lo necesario
para ser selectivo para coliformes, pero además esta selectividad viene determinada
también por la Tª (44ºC).
 Filtraremos, como en el caso anterior, 100ml del agua problema e
incubaremos a 44ºC durante 24 horas.
*Recuento: Número de unidades formadoras de colonias de color
azul2 u.f.c/100ml agua

1.4- Análisis de enterococos y estreptococos fecales:

Estos son buenos indicadores de contaminación fecal por que su ambiente es
el tubo digestivo de animales de sangre caliente pueden ser mejores indicadores que
los coliformes por que pueden resistir mejor las condiciones externas, indicándonos
una contaminación lejana en el tiempo e incluso en el espacio. El medio de cultivo para
esa determinación se denomina KF-estreptococos, cuyo agente selectivo es la azida
sódica, un conservante e inhibidor de la cadena de transporte electrónico. Los
estreptococs no la tienen ya que son organismos fermentativos. Además, lleva
también un colorante, el TTC, muy típico de los medios de cultivo.
Se filtran de nuevo 100ml del agua problema y se incuban a 37ºC de 24 a 48
horas, ya que presentan un crecimiento muy lento.
*Recuento: las colonias adquieren una coloración rojiza. En nuestro
caso, el medio de cultivo estaba en mal estado  u.f.c incontables
>300 u.f.c/100ml agua

1.5- Análisis de Estafilococos aureus:

Bacterias comunes en la piel, mucosas, tracto respiratorio… que cuando se
encuentra heridas puede causar infecciones. Son productoras de toxinas
termorresistentes, por lo que su presencia en comidas y aguas es indeseable.
Como medio selectivo se usa el agar de sal y manitol, cuyo agente selectivo
principal es el cloruro sódico (sal común). La salinidad del H2O de mar esta entorno a
3.5-3.7%, mientras que nuestro medio alcanzará valores tales como un 7.5%. Aún con
esto, estos microorganismos son capaces de crecer en estas condiciones por que
presentan una gran resistencia a los medios hiperosmóticos e hipersalinos, a diferencia
de otros muchos.
Filtraremos así 100ml de nuestra agua problema e incubaremos a 37ºC
durante 24 horas.
*Resultados: producen colonias de color amarillo. En nuestro caso, el medio de
cultivo presentó un leve colo amarillo, pero no hay presencia de colonias, por lo que
serán principalmente bacilos y no estafilococos. Este dato se corroborará mirando al
microscopio, y si hay cocos, se coagularía.
< 0.5 u.f.c/100ml de agua

1.6- Análisis de Vibrio:

Son un género de microorganismos patógenos cuya presencia en el agua es
motivo de gran preocupación y alarma. Un ejemplo es el Vibrio cólera, microorganismo
principalmente marino y productor de la toxina colérica, así como el Vibrio
parahemoliticus, presente en aguas costeras, generalmente en verano, y que suele
contaminar a mariscos de tal manera que a la hora de consumirlos mal o poco
cocinados, producen daños en el tracto digestivo.
 Para determinarlos se utiliza un medio de cultivo denominado TCDS
(tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa). Estos también están relacionados con el
medio digestivo, por lo que el pH será alcalino, entorno a un 8.6, y bastante salino.
Como en los casos anteriores, filtramos 100ml del agua problema e incubaremos a
37ºC durante 24 horas.
*Resultados: cuando estas crecen, pueden fermentar o no la sacarosa. En el
caso de que la fermentase, se generaría ácido y la colonia adquirirá un color amarillo.
En el caso contrario, no se generaría ácido y las colonias presentarán un color verde. El
Vibrio cólera es una bacteria que sí fermenta la sacarosa, por lo que se verá de color
amarillo, mientras que el Vibrio paraemoliticus, a diferencia, no fermenta sacarosa, por
lo que las colonias serán de color verde.
En nuestro caso sólo hay colonias verdes muy pequeñas, pero para confirmar
esto hay que hacer una prueba bioquímica.
<0.5 u.f.c/100ml agua

1.7- Análisis de Pseudomonas:

Dentro de este género, hay una en concreto que causa gran preocupación y su
detección es de gran interés e importancia. Se trata de la Pseudomona aeruginosa,
patógeno presente en las aguas y que provoca infecciones en heridas, ojos, oídos… se
caracteriza por ser un patógeno oportunista y por crecer casi en cualquier ambiente.
El medio utilizado en este caso es el agar de cetrimida. La cetrimida es un
amonio cuaternario que altera las membranas plasmáticas de las células provocando la
lisis de los microorganismos excepto el de las pseudomonas debido a sus
características de membrana.
Filtraremos 100ml del agua problema e incubaremos a 37ºC durante 24 horas.
*Resultado: la Pseudomona aeruginosa al crecer en un medio selectivo forma
colonias que, con luz UV, muestran un color azul claro fluorescente muy llamativo.
>300 u.f.c/100ml agua (incontables)

2- Colimetría por el test del NMP (número más probable): test realizado para agua
turbias que no se pueden filtrar. Se divide en 3 etapas:
2.1- Test presuntivo: este se basa en suponer que en el agua problema existe la
presencia de colifomes, por lo que queremos detectarlos y cuantificarlos. Se realiza
siguiendo la técnica del número más probable (NMP) o técnica de los tubos múltiples.
Consiste en sembrar diferentes volúmenes de nuestra agua en unos tubos que
contienen 10ml de un medio de cultivo denominado caldo MacConkey. Estos
volúmenes se sembraran por triplicado de la siguiente manera:
En los 3 primeros: 10ml
En los 3 segundos: 1ml
En los 3 ultimos: 0.1ml
Si tenemos un volumen del caldo igual al del agua problema, el caldo ira a
doble concentración.
El caldo MacConkey es un medio de cultivo lactosado, así que tendrá lactosa
como única fuente de carbono y un indicador de pH, el purpura de bromocresol.
Además de esto, en el interior de los tubos irá la llamada campana de Durhan, que
consiste en un tubo de ensayo de pequeño tamaño colocado de manera invertida. Una
vez sembrados dichos tubos, se incubaran durante 24horas a 37ºC. Si dan un resultado
negativo, se incubaran 24 horas más.
*Recuento: lo primero que se tiene que tener en cuenta para esto es la
definición de coliforme anterior. Para saber si cumple dicha definición, deberemos
fijarnos en su crecimiento en el tubo, ya que así fermentara la lactosa, que constituye
el único aparte de carbono en el caldo. Tiene que haber turbidez y precipitado para
considerarlo crecimiento. En nuestro caso seria un lactosa positivo (lactosa+). En lo
siguiente que nos fijaremos será en la producción de ácido, que producirá un cambio
de color en el indicador de pH inicialmente púrpura, tornando como consecuencia de
ese ácido a un color amarillo. En nuestro caso seria un ácido positivo (ácido+). Si se
produce gas, este quedara atrapado dentro de la campana en forma de burbuja. Se
tienen que dar las siguientes características para considerar la prueba positiva para la
colimetría: turbidez, precipitado, cambio de color del indicador de pH y gas dentro de
la campana de Duhnan.

10ml  3 positivos - 0 negativos Ante la duda dejar incubar

1ml 1 positivo - 2 negativos 24 horas mas
0.1ml  1 positivo - 2 negativos

2.2- Test confirmativo:

Consiste en confirmar el resultado positivo que se ha detectado
anteriormente, ya que hay bacterias en las aguas que no siendo coliformes dan el
mismo resultado que estas. Para descartar falsos positivos, se siembra en una placa un
medio de cultivo, el EMB (eosina azul de metileno) o medio Levine. Este lleva en su
composición lactosa como única fuente de carbono y un compuesto de colorantes que
inhibirá el crecimiento de bacterias Gam+, dejando crecer sólo las Gam- y las lactosa+.
Este compuesto lo forman la eosina y el azul de metileno. De esta manera, todos los
tubos considerados positivos en el test anterior debemos confirmarlos sembrando en
la placa de este medio.
Además, se sembrara realizando un aislamiento en una placa con cuadrantes,
extendiendo un volumen concreto (1ml) y flameando el asa de siembra a medida que
se cambia de cuadrante. Las colonias deberán tener un color rojo característico que, al
ponerlos a contra luz, emiten un ligero brillo verdoso. Si esto sucede, se considerará el
tubo positivo.
Vistos los resultados, iremos a la tabla del NMP, en la cual aparecen el nº de
positivos obtenidos, el índice del nº más probable (nº más probable de coliformes
totales que hay en 100ml del agua problema) y por ultimo una serie de columnas con
el intervalo de Poisson, un test estadístico y probabilístico, semicuantitativo, en
comparación con la filtración de membrana (cuantitativa).
*Resultados: en nuestra colimetría, en un volumen de 100ml de nuestro agua
problema, obtuvimos un índice de NMP de 75, con lo que asumimos, con un límite de
confianza del 95%, que hay entre 14 y 230 u.f.c de organismos coliformes.
 En el caso de que los tres tubos fuesen negativos, sería un índice de NMP
menos de 3 y con un intervalo de colonias menos de 0.5 en 100ml de nuestra agua
problema.

2.3- Test final: se trata de la confirmación de la confirmación. Para esta

cogeríamos una colonia aislada de la siembra anterior y haríamos un cultivo
puro para identificar la especie concreta ante la que nos encontramos.

BACTERIÓFAGOS: se trata de virus que infectan a bacterias, por lo que su presencia en el

agua indica que las hay o hubo en un pasado no muy lejano, y, por lo tanto, contaminación
fecal, usándose para determinar la potabilidad de un agua. No se trata de una analítica común
ni rutinaria.
Lo primero que hay que hacer para su cultivo es un preenriquecimiento del medio para
aumentar así su población total. Para esto no hay ningún medio de cultivo selectivo como tal,
pero los alimentaremos añadiendo E.coli, aportando con ello un medio de cultivo en el que
pueda crecer su hospedador y por lo tanto favoreciendo su crecimiento. El procedimiento
consiste en inocular en el medio el hospedador de interés, que ya dijimos que seria E.coli, y el
agua problema donde queremos averiguar si hay bacteriófagos. Estos infectaran a las bacterias
y producirán más bacteriófagos.
Cogeremos por lo tanto 20ml de nuestra agua problema y la echaremos en 20ml de TSB a
doble concentración, inoculando después 1ml de un cultivo de E.coli. Incubaremos durante 24
horas a 37ºC.
El segundo paso consiste en detectar la población de los fagos y si esta ha aumentado tal y
como pretendíamos. A partir de la muestra de enriquecimiento, cogeremos 5ml y los
centrifugaremos a 2500rpm durante 10min. Una vez hecho esto, seleccionaremos el
sobrenadante ya que será ahí donde se encontraran los virus después de la lisis celular. De ese
sobrenadante, filtraremos 2ml y nos quedaremos con el filtrado, donde deberían haber
quedado retenidos los posibles virus. Para determinarlos, en un tuvo de ensayo con un caldo
nutritivo general sólido fundido, añadiremos 1ml del E.coli y 200µl del filtrado. Como esta
fundido, lo verteremos en una placa con un medio de cultivo cualquiera que servirá de
soporte. Se incuba durante 24 horas a 37ºC. Obtendremos un césped bacteriano de E.coli y, si
en el filtrado hay bacteriófagos, entre este césped aparecerán calvas, como resultado de la
infección de estos a la E.coli.
Esta técnica requiere la realización de un control de E.coli para comprobar que el cultivo de
este sin filtrado no esta contaminado y que no hubo un aporte de bacteriófagos previo.
*Resultados: podemos observar el césped de E.coli que sembramos, pero no hay
ninguna calva, que se correspondería con la presencia de los bacteriófagos que
buscamos, por lo que estos no están presentes en nuestro cultivo.
0 virus/200 µl de filtrado enriquecido.
Práctica 4:

Análisis de esporas de Clostridium sulfito reductoras:

El Clostridium es un género de bacterias que también se encuentran en las aguas,

principalmente en los sedimentos, de metabolismo aerobio y capaz de formar estructuras de
resistencia (esporas), por lo que su presencia en el agua puede indicarnos una contaminación
lejana en el tiempo. Una especie destaca sobre el resto, el Clostridium perfrigens, también
patógeno y causando daños en el tracto digestivo.
Estas se detectan por sus características de aerobiosis y formación de esporas, en tubos de
ensayo llenos de agar. Como también vamos a buscar sus esporas, y la principal característica
de ellas es su resistencia a altas temperaturas, eliminaremos las formas vegetativas calentando
20ml de la muestra a 80ºC durante 5 minutos. Pasado ese tiempo, inocularemos la muestra en
un medio selectivo, el SPS, en cuya composición destaca el tiosulfato sódico y una sal de
hierro. Este medio esta preparado a doble concentración y el proceso debe hacerse rápido,
añadiendo los ml de agua encima del medio y agitando, ya que se solidifica con gran rapidez.
Se incubará después durante 24 horas a 37ºC.
*Resultados: lo que podremos observar en el agar ennegrecido serán las esporas, ya que las
formas vegetativas las hemos destruido elevando la Tª del medio a 80ºC. Cuando crecen son
capaces de reducir el tiosulfato a sulfuro, que reaccionará con el hierro para dar sulfuro de
hierro, de color negro y responsable por lo tanto de ese tono de las colonias de esporas. En
nuestro caso, el agar esta prácticamente todo negro y roto debido al gas que desprenden.
20 u.f.c/20ml agua.  100 u.f.c. en 100ml de nuestro agua problema.

FISH: HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE

Se usa para detectar rápidamente microorganismos en base a técnicas nucleares. Esta se

basa en la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, en el emparejamiento de dos hebras
complementerias de DNA. Estas dos hebras se emparejaran mejor cuanta más homología de
secuencias haya. En el caso de la identificación de microorganismos, se usa una secuencia
corta de DNA que hibridara con una región en particular del Dan del microorganismo
problema, secuencia que sólo estará en ese grupo. A estas cortas secuencias de nucleótidos se
les denomina SONDA, cuya particularidad va a estar marcada con radiactividad o con un
compuesto fluorescente. Si la hibridación se realiza con un compuesto fluorescente y además
directamente en los microorganismos intactos, tendremos el FISH.
El primer paso consiste en fijar los microorganismos, para lo que cogeremos 10ml de
nuestro agua problema y le añadiremos formol de forma que la concentración final de este sea
2%, partiendo de que su concentración inicial es del 35%.

Ci x Vi = Cf x Vf
X x 35 = 10 x 2 0.57ml formol 35% + 9.43ml agua problema
X = 0.57ml formol
Otra opción de cálculo:
Ci x Vi = Cf x Vf
Vi x 35= (10+ Vi) x 2
 35 Vi -2 Vi =20
Vi= 20/33
Vi= 0.60ml formol 35% + 10ml agua problema

Realizaremos una detección de bacterias en el agua usando una sonda que se unirá a una
región de RNAr, la EUB338 (eubacteria). Esta se une complementariamente a una secuencia
conservada concreta del ARNr: 5´ GCT GCC TCC CGT AGG AGT 3´, siendo una sonda de DNA
debido a la presencia de timina en vez de uracilo. La secuencia complementaria es la secuencia
conservada en el RNAr.
Además, en el extremo 5´, lleva un colorante fluorescente, el 5´-SYTO-13, que, una vez
iluminada con luz azul (UV), emitirá fluorescencia amarillo-verdoso, por lo que si hay bacterias,
se verán de ese color. Usaremos un tampón de lavado para eliminar las sondas que no se han
unido a las regiones complementarias.
 PROTOCOLO DE LA HIBRIDACIÓN:
- Fijación con formol 2% entre 1 y 2 horas
- Filtración de las células con filtros de 0.22µm
- Deshidratación:
 Lavar con 5ml de agua (2 veces)
 Lavar con 3ml de etanol 50% (2min)
 Lavar con 3ml de etanol 80% (5min)
 Lavar con 3ml de etanol 100% (5min)
 Secar al aire
- Hibridación: con un tampón de hibridación que consta de: cloruro sódico 900mM,
tampón trisclorhídrico pH8 20mM, formamida 35% y SDS 0.01%. A este tampón la
añadiremos la sonda (15µl), cortaremos los filtros e incubaremos 2 horas a 45ºC.
- Lavado: con un tampón de lavado que consta de: cloruro sódico 8mM, EDTA 5mM,
SDS 0.01% y tampón trisclorhídrico pH8 20mM. Incubaremos durante 15min a
44ºC
- Etanol 80%
- Secar
- Observar
La hibridación se llevará a cabo sumergiendo los filtros en un ependorf, por lo que habrá
que cortar un triangulito no muy grande para que quepa dentro de el. Una vez cortado, le
haremos una muesca en una esquina para identificar la parte de arriba y después lo
sumergiremos y lo incubaremos.