UNIVERSIDAD NACIONAL DE JAÉN

INGENIERIA DE INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

INTEGRANTES: Núñez Manchay Yasmin

Ticliahuanca Guevara Nely
Santos chinguel Aracely
DOCENTE: MSc. Blga. Mblga. Deysy M. Vásquez Santiago

CARRERA: Ingeniería de industrias Alimentarias

CICLO: III

TEMA: practica de laboratorio

 PRÁCTICA N° 02
COLORANTES Y TINCIONES
I. INTRODUCCION
En general todas las bacterias vivas son prácticamente incoloras, no
presentan suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran
suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Pero si se
tiñen se produce un gran contraste con respecto al medio que las rodea.
Además, alguno de estos colorantes puede teñir estructuras internas de la
bacteria, lo que nos sirve para su identificación. En la actualidad disponemos
de una variedad de colorantes orgánicos, que presentan una afinidad
específica por ciertos componentes celulares. Por eso para distinguirlos del
medio es necesario hacer una coloración (tinciones simples), las cuales
también sirven para contrastar o resaltar distintas características
morfológicas o estructurales (tinciones diferenciales). La mayoría de los
colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica
por algún componente celular.

II. MARCO TEORICO

Los colorantes, son sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
La tinción, es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una
sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente
utilizado al preparar la solución colorante.
Los colorantes se comportan como compuestos ácidos o básicos y tiene la
tendencia de formar uniones electrostáticas con los radicales ionizables de
los tejidos.
Clasificación de los colorantes:
a) Colorantes Ácidos o Básico (Sales):
El término que no indica necesariamente el pH en solución, sino que una
parte significativa de la molécula sea aniónica o catiónica.
Los colorantes básicos consisten en un catión coloreado unido a un anión
incoloro.
Ejm: Clorhidrato (-) de azul de metileno (+).
Los colorantes ácidos tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.
Ejm: Eosinato (-) de sodio (+).
Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si
la célula no ha muerto, el proceso de tinción la mata.
La célula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente,
tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos, y ellos son los más
usados en citología bacteriana.
Las bacterias son ricas en ácidos nucleico que poseen cargas negativas en
forma de grupos fosfatos. Los colorantes básicos tiñen la célula bacteriana
uniformemente, a menos que antes sea destruido el ARN del citoplasma.
Los colorantes ácidos no tiñen la célula bacteriana y, por lo tanto, pueden
usarse para impartir al fondo un color de contraste (coloración negativa).
Desde el punto de vista práctico entonces, los colorantes básicos tiñen
estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células
eucariotas y procariotas; los colorantes ácidos reaccionan con sustancias
básicas, como las estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas.
b) Colorantes liposolubles
Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipídicos de la
célula, usándose a menudo para revelar la localización de los depósitos de
grasa. Ejm. Negro Sudán.
En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras
muy finas, con el propósito de hacerlas visibles al microscopio óptico; uno de
ellos es el ácido tánico que se emplea en la coloración de flagelos y
espiroquetas.
TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA
Una preparación coloreada exige la sucesión de tres pasos: preparación del
extendido, fijación y coloración.
1. Preparación del extendido
Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.
Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con asa y se extiende
hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos.
Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede así de la siguiente
manera:
• Con pipeta o asa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos.
• Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y
luego se extiende la suspensión bacteriana hasta formar una fina película
sobre el portaobjetos sin tocar los bordes.
• Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso
acercando el portaobjeto al aire caliente de la llama del mechero.
2. Fijación
Este segundo paso se efectúa para que los microorganismos queden
adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los
que hay que someterlos posteriormente.
La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento
no mueren todas las bacterias.
Existen dos tipos de fijación: con calor (o método de Koch) y fijación química.
Método Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado
por la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaución de llevar el
extendido hacia arriba. El inconveniente de este método es que los
microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta
excesivo. Después del procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente
pero no debe quemar cuando se coloca en ta parte posterior de la mano.
Fijación química
La coagulación del protoplasma microbiano con sustancias químicas es lo
ideal pues las células no resultan deformadas. Existen varios métodos:
- Se inunda el preparado con alcohol metílico, se deja actuar 3 minutos y
se lava con agua. Es el más usado.
- Idem con formalina al 5 % (v/v).
- Se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol
absoluto y éter sulfúrico) y se deja actuar hasta su evaporación completa.
3. Coloración
En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de
colorantes de acuerdo al método de tinción que se realice.
TIPOS DE TINCIONES
Para la observación microscópica existen diferentes tipos de coloraciones
según las características morfológicas o estructuras que quieran ponerse de
manifiesto. Se clasifican en simples y compuestas.
TINCIÓN SIMPLE
Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los
microorganismos aplicando sólo una solución colorante. Este tipo de
tinciones pueden ser positivas o negativas.
La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con
colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los
constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma
microbiano.

Técnica: La coloración consiste en cubrir el frotis, después de fijado, con la

solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua
y se deja secar.
• Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de
Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.
• Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja
actuar 30 a 60 segundos.
• Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul
de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.
El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se
usa más concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la
solución de azul de metileno de uso se le agrega un álcali (KOH) como
intensificante, que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de
coloración. Generalmente como intensificante se usa un álcali para un
colorante básico y un ácido para un colorante ácido. Debido a que el
protoplasma bacteriano tiene una débil carga negativa que aumenta al
aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos las coloraciones de
bacterias se hagan más intensas.
En la coloración negativa los microorganismos quedan sin teñir y se colorea
el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células.
La sustancia usada para la tinción negativa es un colorante opaco que no
tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las
células, tal como:
• Tinta china (suspensión de partículas de Carbono coloidal demasiado
grandes como para penetrar en la bacteria).
• Colorantes ácidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares).
El más utilizado es la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por
ser negro.
La coloración negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste
de los microorganismos en microscopía óptica, pero su máxima utilidad
está en revelar estructuras como cápsulas tanto bacterianas como de
levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y
espiroquetas que, por su pequeño diámetro transversal, resulta difícil
ponerlas en evidencia.
Técnica: Método de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un
extremo del portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la
suspensión microbiana y se mezclan bien con el asa. Luego, con otro
portaobjeto se apoya sobre la mezcla y se hace un extendido a lo largo del
portaobjeto. Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo a
medida que se extiende, con lo cual se conseguirá una zona donde el
contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de
inmersión.
TINCION COMPUESTA (O DIFERENCIAL)
Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referimos a los dos
métodos de coloración compuesta más comúnmente empleados en la
práctica corriente del laboratorio de microbiología: la tinción de Gram y la de
Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten diferenciar las bacterias incluso
cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una "tinción
diferencial".
Tinción de Gram
Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la más empleada en
bacteriología.
Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la Grampositividad depende
de la naturaleza y composición química de la pared o parte de ella. Se han
propuesto varias teorías para su explicación, pero la más aceptada es la que
sostiene que las bacterias gramnegativas son más permeables al alcohol
debido a su alto contenido en lípidos.
III. OBJETIVOS
 Adiestrar al estudiante en el desarrollo de la Tinción diferencial o simple
 Interpretar el fundamento de las tinciones diferencial o simple.
 Interpretar la base química de la tinción de Gram.
 Interpretar el procedimiento para diferenciar entre dos grupos
principales de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
IV. MATERIAL

1. BIOLOGICO:
 Muestra de alimento (Por ejem. Yogurt, Levadura)

2. REACTIVO:
 Kit coloración Gram (Cristal violeta, Lugol Gram, Alcohol acetona o
alcohol 96°, Safranina).

3. DE LABORATORIO
 Agua destilada o solución salina fisiológica estéril (SSFE)
 Mechero
 Laminas porta objetos
 Asa bacteriológica
 Papel lente
 Aceite de inmersión

4. EQUIPOS:
 Microscopio

V. PROCEDIMIENTO
1. Obtenga 1 portaobjeto limpio.
2. Prepare un frotis de cada una de las muestras:
a. Con el asa bacteriológica colocar una pequeña gota de agua destilada
o SSFE en el centro de un portaobjetos limpio.
b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones
asépticas, una pequeña cantidad de muestra y transferirlo a la gota de
agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su
secado.
Nota: Si la muestra se toma de una muestra líquida, no es necesario
realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una
gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra,
directamente sobre el portaobjetos.
 c. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación
acercando el portaobjetos a la llama del mechero.
3. Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe
durante 1 minuto.
4. Lave suavemente con agua.
5. Agregar Lugol Gram, deje actuar durante 1 minuto.
6. Lave suavemente con agua.
7. Decolore con alcohol acido o 96°. Nota: no sobre decolore, agregue el
alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.
8. Lave suavemente con agua.
9. Agregue la safranina para la tinción de contraste, deje actuar durante 1
minuto.
10. Lave suavemente con agua.
11. Secar.
12. Observar al microscopio, con el objetivo de inmersión

VI. ESQUEMA DE TRABAJO

Primero nos aseguramos que nuestra Tomamos un portaobjeto, verificamos si

área de trabajo esté limpia, procedemos está limpio, procedemos a limpiar con
a limpiar con alcohol. alcohol y secamos.
 Para la preparación de nuestra muestra Tomamos una gota de agua lo esparcimos
tomamos el asa bacteriológica con el asa bacteriológica y luego
prendemos nuestro mechero y la procedemos a tomar la muestra de
esterilizamos. yogurt, removemos y secamos

Añadimos cristal violeta para teñir Le agregamos Lugol Gram y lo dejamos

nuestra muestra, se agrega lo suficiente actuar por un minuto, pasado el tiempo
y dejamos actuar por un minuto, luego procedemos a lavar suavemente con
se procede a lavar. agua.

Decoloramos con alcohol acido por un Agregamos la safranina a nuestra

tiempo de 30 segundos, procedemos a muestra, dejamos actuar por un minuto
lavar suavemente. y procedemos a lavar.
 Encendemos nuestro mechero y Por ultimo colocamos nuestra muestra en
secamos bien nuestra muestra. el microscopio y observamos.
VII. COMENTARIO

La práctica realizada en laboratorio fue de la tinción del yogur es un proceso

comúnmente utilizado en microbiología para observar y analizar los microorganismos
presentes en este producto lácteo fermentado, principalmente las bacterias lácticas
como Lactobacillus y Streptococcus.

El objetivo principal de la tinción es facilitar la observación de las bacterias presentes en

el yogur bajo el microscopio. Esto permite estudiar la morfología de las bacterias, su
distribución y su viabilidad. Para esto, se suelen utilizar diferentes tipos de tinciones,
como la tinción de Gram, que distingue a las bacterias Gram-positivas (como las
presentes en el yogur) de las Gram-negativas, basándose en la composición de la pared
celular.fue muy interesante realizar esta práctica la cual nos ayuda mucho en nuestra
formación profesional.

VIII. RESULTADO

Los resultados principales que se lograron obtener fueron:

Bacterias Gram-positivas:

 En el yogur gloria, las bacterias más comunes son Lactobacillus y Streptococcus.

 Estas bacterias tienen una pared celular gruesa con una alta concentración de
peptidoglicano, lo que les permite retener el cristal violeta y aparecer de color
púrpura o azul-violeta bajo el microscopio.
 En la observación, Lactobacillus se presenta típicamente como bacilos
(bastones alargados), mientras que Streptococcus se observa como cocos
(esferas) dispuestos en cadena

 Un yogur de buena calidad que haya sido elaborado de manera adecuada

debería mostrar una abundante presencia de bacterias Gram-positivas
(púrpura), especialmente de los géneros Lactobacillus y Streptococcus.
  Si se observan muchas bacterias Gram-negativas (rosadas), podría ser indicativo
de una contaminación o mala conservación del yogur, lo cual podría afectar su
seguridad y calidad.

Estos resultados ayudan a evaluar la viabilidad de los cultivos bacterianos y la calidad

microbiológica del yogur, asegurando la presencia de las bacterias beneficiosas que
contribuyen a su proceso de fermentación y propiedades probióticas

IX. CUESTIONARIO
1. Describir las estructuras químicas de 2 colorantes ácidos y 2 básicos.

Colorantes Ácidos

1. Eosina Y:
 Fórmula molecular: C₂₀H₈Br₄O₅.
 Estructura química: Eosina Y es un derivado de la fluoresceína, en la
que los grupos hidroxilo están sustituidos por átomos de bromo.
Contiene un anillo xanteno central con dos grupos bromo en cada anillo
lateral.
 Grupo ácido: El grupo ácido principal es el grupo carboxilo (-COOH), que
se ioniza para darle una carga negativa. Esto permite que se una a
proteínas citoplasmáticas cargadas positivamente.
 Usos: Es utilizado en la tinción de células y tejidos (como parte de la
tinción H&E) para teñir el citoplasma y otros componentes
extracelulares.
2. Ácido pícrico:
 Fórmula molecular: C₆H₂(NO₂)₃OH.
 Estructura química: Es un compuesto aromático con un anillo de
benceno sustituido con tres grupos nitro (-NO₂) y un grupo hidroxilo (-
OH).
 Grupo ácido: El grupo ácido en este compuesto es el grupo hidroxilo (-
OH), que puede liberar un protón y adquirir una carga negativa en
soluciones acuosas.
 Usos: Se utiliza en tinciones histológicas para teñir proteínas en tejidos,
aunque también puede tener aplicaciones como agente fijador.

Colorantes Básicos

1. Azul de metileno:
 Fórmula molecular: C₁₆H₁₈ClN₃S.
  Estructura química: Contiene un anillo de tiazina y un grupo metilo, y se
presenta como una sal clorhidrato. Tiene un grupo amonio cuaternario.
 Grupo básico: Su estructura incluye un grupo amino que puede
protonarse para adquirir una carga positiva, lo que permite que se una a
componentes celulares negativos como el ADN.
 Usos: Se utiliza para la tinción de células y bacterias en microbiología,
siendo particularmente útil para teñir el núcleo celular y la membrana.
2. Cristal violeta:
 Fórmula molecular: C₂₅H₃₀ClN₃.
 Estructura química: Es un derivado de la trifenilmetano, con tres anillos
de benceno unidos a un grupo de nitrógeno central (amina terciaria).
 Grupo básico: El nitrógeno central y los grupos amina pueden
protonarse, lo que le confiere una carga positiva. Esto facilita su unión a
la pared celular de bacterias Gram-positivas.
 Usos: Es el colorante principal en la tinción de Gram, ya que tiñe de
púrpura las bacterias Gram-positivas

2. ¿Cuál es el fundamento de la tinción diferencial de Gram?

El fundamento de la tinción diferencial de Gram se basa en las diferencias
estructurales y químicas de las paredes celulares de las bacterias, que determinan
su capacidad para retener el colorante cristal violeta cuando se someten a un
proceso de tinción y decoloración. Esta tinción, desarrollada por Christian Gram en
1884, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram-positivas y
Gram-negativas.

3. Explique qué reacción de Gram darán las levaduras. ¿Estos tendrán la misma
importancia que para las bacterias?

Las levaduras, al someterse a la tinción de Gram, generalmente reaccionan como Gram-

positivas. Esto se debe a que, aunque no son bacterias sino hongos unicelulares, sus
paredes celulares están compuestas por polisacáridos complejos, como la quitina,
glucanos y mananos, que son capaces de retener el cristal violeta de manera similar a
las bacterias Gram-positivas. Por tanto, al observarlas bajo el microscopio después de
una tinción de Gram, las levaduras aparecerán teñidas de púrpura.

4. Investigue otra técnica de Tinción selectiva que permita observar otras

estructuras bacterianas.

Una técnica de tinción selectiva que se utiliza para observar estructuras bacterianas
específicas es la tinción de esporas. Esta técnica permite visualizar endosporas (esporas
internas) producidas por ciertas bacterias, como las de los géneros Bacillus y Clostridium.
Las endosporas son estructuras resistentes que las bacterias forman como respuesta a
condiciones adversas, permitiéndoles sobrevivir a entornos extremos de calor,
desecación, radiación, y productos químicos.

5. Escribir el nombre científico (género y especie) de 5 bacterias Gram positivas y

Gram negativas.

Bacterias Gram-positivas:

1. Staphylococcus aureus
2. Bacillus subtilis
3. Streptococcus pneumoniae
4. Lactobacillus acidophilus
5. Clostridium botulinum

Bacterias Gram-negativas:

1. Escherichia coli
2. Salmonella enterica
3. Pseudomonas aeruginosa
4. Neisseria gonorrhoeae
5. Klebsiella pneumoniae

6. ¿Para qué se utiliza el aceite de inmersión?

El aceite de inmersión se utiliza en microscopía óptica para mejorar la resolución y
la calidad de la imagen cuando se observan muestras con objetivos de alta
magnificación (usualmente de 100x). Este aceite tiene un índice de refracción similar
al del vidrio (alrededor de 1.5), lo que permite una mejor transmisión de la luz entre
la muestra y el objetivo del microscopio.
7. Describa función que cumple cada componente para una coloración Gram.

Cristal Violeta: Tiñe todas las células de púrpura.

Lugol (Mordiente): Fija el cristal violeta, formando un complejo más difícil de eliminar.
Alcohol o Acetona (Decolorante): Diferencia entre bacterias Gram-positivas (retienen
el complejo) y Gram-negativas (pierden el colorante).
Safranina: Tiñe las bacterias que se decoloraron, permitiendo la identificación de
bacterias Gram-negativas como rosadas y dejando las Gram-positivas en púrpura.

8. Explicar: ¿Por qué se debe usar alcohol de 70° para desinfectar superficies y no
alcohol de 96°?
 Alcohol al 70%: Más eficaz porque la presencia de agua permite una
desnaturalización más eficiente de proteínas, facilita la penetración en las
células, y prolonga el tiempo de acción del alcohol.

Alcohol al 96%: Menos eficaz como desinfectante porque se evapora más rápido
y desnaturaliza proteínas de forma superficial, lo que puede proteger a algunos
microorganismos.

Por estas razones, el alcohol al 70% es la opción preferida para desinfectar superficies y
piel, garantizando una mejor eliminación de microorganismos.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Harrigan, W.F. y M.E. Mc Cance. 1979. Métodos de laboratorio en
Microbiología de Alimentos y productos lácteos. Edit. Academia León.
España.
2. Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores. 2e edición. Ed.
Masson, Barcelona, 1999.
3. Salazar Wilson, Guras de práctica de Laboratorio de Microbiología, Depart.
de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito — Ecuador,
2007.