Manejo de enfermedades en camarones

WSSV Y CICLO DE MUDA EN EL CAMARÓN

BLANCO LITOPENAEUS VANNAMEI
Fabrizio Echeverría, Victor Otero, Fitis Cornejo y Jenny Rodríguez
Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas - CENAIM

INTRODUCCIÓN animales, tanto en el campo como en el laboratorio.

Información obtenida de los primeros monitoreos en
El camarón como todos los crustáceos, necesita remover y camaroneras, reporta mortalidades masivas en periodos de
reemplazar periódicamente su exoesqueleto rígido para seguir cuadraturas, conocidos también como quiebras, generalmente
creciendo. Este proceso es una fuente intrínseca de variaciones los animales se sincronizan para mudar en esos periodos.
etológicas, fisiológicas e inmunitarias. Dichas variaciones, Ensayos de desafío describen la presencia de exuvios, previo
sumadas a la pérdida de la cutícula, (primera barrera defensiva a las mortalidades, como un indicador de que la infección se
en los crustáceos), son algunos de los factores que desarrolló. Las observaciones descritas anteriormente nos
probablemente influyen en la resistencia y/o susceptibilidad plantean las siguientes interrogantes:
de los crustáceos a los patógenos. Así, Le Moullac et al.
(1997), encontraron que Penaeus stylirostris es más sensible ¿El WSSV modifica el ciclo de muda?,
al vibrio patógeno AM23 durante la premuda que durante la ¿Ciertos estadios de muda representarían puertas de infección
intermuda. Adicionalmente, Hasson et al. (1999) reportaron y propagación del virus?,
que TSV ocasiona la mortalidad de Litopenaeus vannamei
¿Debe considerarse al ciclo de muda en el diseño de estrategias
en D4 (tardía premuda) o en E (exuvia). Por otra parte
de manejo?
información anecdótica señala que los animales que mueren
por WSSV son blandos al tacto. El ciclo de muda fue dividido En este trabajo analizamos datos obtenidos de muestreos en
en cinco estadios por Drach (1939) y son: postmuda (A,B) camaronera durante los picos de infección y de ensayos de
Intermuda (C), Premuda (D0, D1, D2, D3) y exuvia (E). desafío con WSSV. Con los datos de camaronera se comparó
la prevalencia del WSSV con los estadios de muda, la
Los cambios bioquímicos, biológicos así como las
respuesta inmune y la susceptibilidad al WSSV. En
modificaciones morfológicas en la epidermis de los crustáceos
laboratorio, se analizó la mortalidad en función del estadio
influyen también en el sistema inmune. Algunos estudios
de muda y la influencia del virus sobre el ciclo de muda.
señalan cambios del hemograma durante el ciclo de muda.
Tsing et al. (1989), con Penaeus japonicus y Le Moullac et
al. (1997), con Penaeus stylirostris, encontraron el mayor MATERIALES Y MÉTODOS
número de hemocitos durante la postmuda y el menor número
durante la intermuda. Similares variaciones fueron Control de muda
observadas, en Sicyonia ingentis en el cual la mayor liberación El estadio de muda se determinó observando los urópodos al
de hemocitos del tejido hematopoyético ocurrió en postmuda microscopio siguiendo el protocolo descrito por Robertson
(Hose et al. 1992). En cuanto a la fórmula hemocitaria, el et al. (1987). Gráfico:
mayor número de hemocitos granulares, ha sido observado
en intermuda en P. stylirostris
y S. Ingentis (Le Moullac et al.
1997; Hose et al. 1992). En
tanto que se ha reportado que
el pico de las células hialinas
ocurre durante el período de
exuvia en S. ingentis y en P.
japonicus (Hose et al. 1992;
Sequeira et al. 1995).
Considerando que la respuesta
inmune del hospedero es vital
para enfrentar la agresión viral
y que está sujeta a modifi-
caciones según el estadio de
muda, desde que se iniciaron
los trabajos para estudiar y/o
manejar el Virus de la Mancha
Blanca (WSSV), se ha seguido
el estadio de muda de los

Fundación Cenaim - Espol julio 2001 - enero 2002 43

 Manejo de enfermedades en camarones

Muestreo en camaronera Segundo ensayo de desafío

En una piscina de camaronera localizada en Engunga-Guayas. En este ensayo, 128 animales fueron distribuidos en 32 frascos
Se realizaron muestreos sistemáticos a partir de la tercera de vidrio a razón de 4 animales por frasco; 16 frascos
semana hasta la sexta semana posterior a la siembra (2 recibieron un inóculo de WSSV a razón de 750 ul de solución
muestreos por semana), Se colectaron 20 camarones por viral/1.5 litros de agua de mar, en tanto que los 16 frascos
muestreo cuyo peso osciló entre 0,9 y 3,0 g. Los animales restantes sirvieron de control. Se retiraron periódicamente los
fueron analizados individualmente para WSSV por PCR (IQ exuvios, varias veces al día, durante 13 días.
2000), hemograma (conteos totales y diferenciales de
hemocitos), color de la hemolinfa y estadio de muda de los RESULTADOS
animales. Un estudio paralelo en inmunología de L.
vannamei, señaló el color de hemolinfa (rosado/azul), como WSSV y estadíos de muda
un indicador de enfermedad de WSS, por lo que para efecto
de análisis de datos, los animales fueron divididos en dos Los animales de hemolinfa azul, presentaron los picos de
poblaciones de acuerdo al color de la hemolinfa infección en los muestreos del 15 y 22 de enero (Figura 1),
encontrándose que en el primer muestreo alrededor del 45%
Otros análisis inmunitarios fueron, actividad antibacteriana de los animales en intermuda y el 55% en temprana premuda
(AA), según el protocolo de Tapia (1997); actividad (Figura 2). Se observó que en los momentos de baja
fenoloxidasa (PO), siguiendo el protocolo estandarizado por prevalencia, a partir del 29 de enero, los animales se
Echeverría (1997); detección del anión superóxido (O -2) encontraron en temprana y tardía premuda.
mediante la técnica de Muñoz et al. (2000) y cuantificación
de proteínas en el plasma (Lowry et al. 1951). Para estos
análisis se utilizaron mezclas de hemolinfa provenientes de
los veinte animales de cada muestreo. Las mezclas se
prepararon separando las muestras azules de las rosadas.
Mediante análisis de correlación Pearson r a un nivel de
significancia p£0.05, se analizaron las variables continuas.
Los datos porcentuales fueron normalizados mediante
transformación con arcoseno.

Ensayos de desafío en laboratorio

Con el objetivo de verificar los estadio de muda de animales
infectados, se realizaron pruebas de desafío con WSSV.
Figura 1. Prevalencia WSSV, animales de Hemolinfa Azul
Preparación del inóculo viral
El inóculo viral se preparó siguiendo el protocolo de Chou et
al. (1998). Para esto, se tomó branquias de animales
infectados, las cuales fueron homogenizadas con tampón TN
(0.4M de ClNa, 20 mM de Tris HCl pH 7.2). La mezcla fue
centrifugada a 1000g y filtrada con filtro de 0.45 mm. Luego
fue almacenada a –80˚C.

Primer ensayo de desafío

En este ensayo se realizó una prueba de infección con el
WSSV en camarones. En 5 acuarios se inoculó el virus activo
y en otros 5 acuarios se inoculó virus inactivo (sometido a
autoclave por 15 minutos a 121ºC y a15 libras de presión).
Figura 2. Distribución de Estadíos de muda, Animales de Hemolinfa Azul
Los acuarios que recibieron el inóculo activo fueron
mantenidos en una sala de infección experimental. Mientras
que, los que recibieron el inóculo inactivado estuvieron en En los animales de hemolinfa rosada, el mayor pico de
una sala diferente, a fin de evitar la contaminación. La infección ocurrió el 22 de enero (Figura 3). El 20% de los
inoculación del virus se realizó durante dos días a una animales se encontraron en intermuda, el 40% en temprana
concentración de 37500 viriones/µl de solución viral (1.5 ml premuda y el 40% en tardia premuda (Figura 4). El segundo
de solución viral/8 litros de agua). Antes de cada inoculación pico de infección fue el 26 de enero donde los animales en
se descendió el volumen de agua a 8 litros, manteniéndose intermuda alcanzaron el 45%, mientras que el resto de la
este nivel durante 8 horas. Se determinó el estadio de muda población se encontró en temprana y tardía premuda. Estos
de los camarones muertos. fueron muy similares al los que se presentaron el 15 de enero
los animales de Hemolinfa azul. A partir del 29 de enero,
cuando la infección comienza a decaer, el 70% de los animales

44 VOL 8, No. 1 EL MUNDO ACUICOLA

 Manejo de enfermedades en camarones

de hemolinfa rosada parecen entrar en temprana premuda, el

específicamente en cuanto a la concentración de hemocitos
20% en tardía premuda y un 10% aparecieron en postmuda, hialinos en los estadios de muda, donde se apreció que estas
los mismos que el 1de febrero estuvieron en intermuda 10%. poblaciones hemocitarias se incrementan en temprana
premuda (Tabla 2).

Tabla 2. Tabla de contingencia que permite relacionar estadísticamente

rangos de concentración (de baja o muy alta) de hemocitos con el
número de animales en cada estadío de muda. Nótese que, alta
concentraciones de hemocitos se encuentran en animales en temprana
premuda (D-0)

ESTADIO DE MUDA

Rango de
concentración B C D-0 D-1 D-2 D-3 E Total
Baja HH 5 15 7 12 10 2 0 51
Media HH 4 7 10 14 7 2 0 44
Figura 3. Prevalencia WSSV, animales de Hemolinfa Rosada
Alta HH 0 4 9 5 8 2 1 29
Muy Alta HH 0 0 1 9 5 1 0 16
Total 9 26 27 40 30 7 1 140
Mayores concentraciones en temprana premuda (D-0, D-1)

Mortalidad en postmuda
Al verificar el estadio de muda de los animales muertos por
WSSV en el primer ensayo de desafío, se observó que éstos
se encontraron en mayor porcentaje en postmuda (estadio A
y B), (Figura 5), lo que explicaría la textura blanda de los
animales que mueren por WSSV.
Figura 4. Porcentaje de Estadíos de muda, Animales de Hemolinfa Rosada

Tanto en los animales de hemolinfa azul como en los de Figura 5. Estadíos

hemolinfa rosada se observó una relación directa entre de muda de los
positivos paraWSSV e intermuda. Paralelamente, en los animales muertos
animales de hemolinfa azul, la correlación entre WSSV y por WSSV. La
mayoría se encuen-
premuda (temprana y tardía) fue inversa, en tanto que en los
tran en postmuda.
animales de hemolinfa rosada la correlación entre WSSV y
tardía premuda fue directa.
Los animales infectados en el estadio C y en D-0, estuvieron
Aceleración de la muda
en su mayoría en nivel muy leve de infección. Aunque el Información no publicada señalan que en ensayos de desafío
número y porcentaje de animales infectados se mantuvo bajo con WSSV se presenta una gran cantidad de exuvios justo
en D-1, se incrementó el nivel de infección en los animales. antes de iniciarse las mortalidades. Por otra parte, en las
(Tabla 1).
piscinas se han observado mortalidades precedidas de una
En cuanto a los parámetros inmunitarios, se encontraron muda generalizada. Con la finalidad de determinar si el vi-
diferencias significativas (p= 0.05) en los hemogramas, rus tiene alguna influencia sobre el ciclo de muda, se realizó
un ensayo de desafío, en el que se cuantificaron los exuvios
Tabla 1.Tabla de contingencia que permite relacionar de los animales infectados y no infectados. Como se puede
estadísticamente el nivel de infección y el número de animales en observar en la Figura 6 el porcentaje de exuvios fue
cada estadio de muda. Nótese que la mayoría de los animales PCR- significativamente mayor en los animales infectados, el
están en temprana premuda (D-0, D-1) y los PCR+ están en
segundo día de postinfección, justo antes del inicio de las
intermuda (C) y tardía premuda (D-2) aunque con un nivel leve.
mortalidades (Figura 7).
ESTADIO DE MUDA
WSSV B C D-0 D-1 D-2 D-3 E Total
PCR – 4 9 13 24 13 6 1 70 Figura 6. Rela-
PCR + 3 19 8 11 14 1 0 50 ción entre muda
Total 7 22 21 35 27 7 1 120 y mortalidad.
Nivel de infección Porcentaje de
muda en anima-
muy leve 3 12 7 5 11 1 0 39
les infectados y
leve 0 0 0 1 3 0 0 4 no infectados
medio 0 0 0 1 0 0 0 1 con WSSV.
severo 0 1 1 4 0 0 0 6

Fundación Cenaim - Espol julio 2001 - enero 2002 45

 Manejo de enfermedades en camarones

que en los no infectados, a pesar de la caída de la población

experimentada por los primeros. Por otra parte, los urópodos
de animales con infección aguda mostraron, a más de graves
daños cuticulares, varios estadios a la vez (D0, D1, D2,
D3)(datos no mostrados). Desconocemos el mecanismo que
utilizaría el WSSV para perturbar el ciclo de muda en el
camarón, siendo necesario realizar más estudios sobre el tema.
En insectos existe la hipótesis de que el baculovirus perturba
los eventos hormonales que conducen a la muda, deteniendo el
ciclo (Beckage 1996). Sin embargo provocar la mortalidad en
postmuda favorecería la propagación del virus, muchas partículas
virales serían liberadas con los exuvios, en tanto que los animales
blandos y debilitados serían presa fácil de los animales sanos.
Figura 7. Relación entre muda y mortalidad. Porcentaje de muda y mortalidad
El control microscópico de la muda realizado a la par de otras
en los animales infectados.
técnicas de detección y diagnóstico del WSSV, tales como PCR
y/o histología, ayudarían al productor camaronero a tomar
medidas preventivas (suministro de buen alimento, utilización
DISCUSIÓN de atractantes o inmunopotenciadores) durante los periodos de
mayor riesgo de infección (intermuda) y a evitar las situaciones
Los resultados de hemograma en los animales de hemolinfa
de estrés, durante el periodo de exuvia, momento en que se
azul concuerdan con los reportados por la literatura, en cuanto
incrementan los riesgos de mortalidades masivas.
a conteos diferenciales, los resultados sugieren que los
hemocitos hialinos serían más abundantes en premuda,
coincidiendo con lo reportado por Sequeira et al. (1995) para BIBLIOGRAFÍA
P. japonicus, quienes señalaron la presencia de un elevado Beckage, N. E. 1996. Interactions of viruses with invertebrate cells. In: Söderhäll
número de células hialinas en el período ecdycial (cuando la K., Sadaaki, I., Vasta, G. (Eds.), New Directions in Invertebrate Immunol-
ogy. SOS Publications, Fair Haven. pp. 109-129.
cutícula está débil). El incremento de hemocitos hialinos en Chou, H. Y., Huang, C., Lo, C. C., y Kou, G. H. 1998. Studies of transmission of
este período estaría relacionado a la coagulación y a la white spot syndrome associated baculovirus (WSB) in Penaeus monodon
formación de la cutícula (Hose et al. 1992). Por otra parte los and Penaeus japonicus via water-borne contact and oral ingestion. Aquacul-
ture. 164: 263-276.
hemocitos hialinos serían responsables de la producción de Drach, P. 1939. Mue et cycle d´intemue chez les crustacés décapodes. Ann Inst.
los difenoles necesarios para el teñido de la cutícula (Vacca y Oceanogr. 19: 103-391.
Fingerman 1983). Echeverria, L. F. 1997 Desarrollo de un ensayo de cuantificación de la actividad
fenoloxidasa (PO) como una herramienta de inmunoevaluación del camarón
El hemograma de los animales rosados mostró modifica- Penaeus vannamei. Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Mari-
ciones. Sin embargo, es necesario considerar que estos nas. 1-17.
Hasson, K. W., Lightner, D. V., Mohney, L., Redman, R. M. y White, B.
animales fueron los más infectados por WSSV, factor que M. 1999. Role of lymphoid organ spheroids in chronic Taura syn-
probablemente provocó las modificaciones. drome virus (TSV) infections in Penaeus vannamei.
Hose, J. E., Martin, G.G., Tiu, S., y McKrell, N., 1992. Patterns of hemocyte
El alto porcentaje de animales infectados en el estadio C, production and release throughout the molt cycle in the penaeid shrimp
podría estar relacionado con el apetito de los animales y sus Sicyona ingentis. Bioll. Bull. 183: 185-199.
Le Moullac, G. M., Le Groumellec, M., Ansquer, D., Froissard, S., Levy, P., y
hábitos caníbales. En intermuda los animales ingieren mucho Aquacop. 1997. Haematological and phenoloxidase activity changes in the
alimento (Molina y Cadena 2001). Los resultados sugieren shrimp Pennaeus stylirostris in relation with the moult cycle: protection
que en temprana premuda, particularmente en D0, los against vibriosis. Fish and Shellfish Immunology, 7: 227-234.
animales son más resistentes al WSSV. Los parámetros Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., y Randall, R.J. 1951. Protein Mea-
surement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.
inmunitarios correlacionados con la temprana premuda fueron Molina, C., y Cadena, E. 2001. Alimentación de camarones en relación a la
hemocitos hialinos y generación del O2-. Estos dos parámetros actividad enzimática como una respuesta natural al ciclo de muda. El mundo
mostraron también correlación inversa significativa con Acuicola. 7(1): 54-57.
Montesdeoca, M.; Amano, J.; Echeverria, F.; Romero, X.; Sotomayor, M.;
prevalencia del WSSV (Montesdeoca et al. 2001) sugiriendo Betancourt, I.; Panchana, F. y Rodríguez, J. 2001. Modificaciones en los
que serían elementos claves en la estrategia antiviral del camarón. parámetros inmunitarios de camarones Penaeus vannamei infectados con
WSSV en piscinas. VI Congreso Ecuatoriano de Acuicultura, 24-27 Octubre,
Los resultados encontrados en este estudio en las camaronera Guayaquil, Ecuador.
y en infecciones experimentales, indican que los camarones Muñoz, M., Cedeño, R., Rodríguez, J., Van der Knap, W. P. W., Mialhe, E. y
que no logran controlar la infección viral en temprana premuda, Bachere, E. 2000., Measurement of reactive intermediate production in
haemocytes of the penaeid shrimp, Penaeus vannamei. Aquaculture. 191:
pasarían con una fuerte infección a tardía premuda, la cual 89-107.
posiblemente se beneficia de las modificaciones fisiológicas Robertson, L., Bray, W., Leung-Trujillo, J. y Lawrence, A. 1987. Practical molt
asociadas a la muda, como son disminución de la tasa de staging of Penaeus setiferus and Penaeus stylirostris. J. of World Aquacul-
ture Society. 18 (3): 180-185.
ingestión del alimento (el animal comienza a utilizar sus Sequeira, T., Vilanova, M., Lobo-Da-Cunha, A., Baldaia, L. y Arala-Chavez, M.
reservas energéticas) (Molina y Cadena 2001) y el incre- 1995. Flow cytometric analysis of molt-related changes in hemocyte type
mento de la actividad de las células epiteliales (uno de los in male and female Pennaeus japonicus. Biol. Bull., 189: 376-380.
Tapia., L. 1997. Optimización de ensayos antibacterianos y estudios sobre la
tejidos preferidos del WSSV), actividad que favorece la
inducción de la actividad antibacteriana en el hemolinfa del camarón Penaeus
replicación del virus, provocando mortalidades en postmuda. vannamei. Tesis de Acuicultura. Facultad de Ingeniería Marina y Ciencias del
Mar. Escuela Superior Politécnica del Litoral-Ecuador. Guayaquil, Ecuador.
Nuestras observaciones sugieren además que el virus acelera Tsing, A., Arcier, J. M. y Brehelin, M. 1989. Hemocytes of penaeid and palaemonid
la muda. No sólo una muda generalizada precedió el inicio shrimps: Morphology, Cytochemistry, and haemograms. J. Invert. Pathol.,
de la mortalidad, sino que además en todo el bioensayo se 53: 64-77.
Vacca, L. L., y Fingerman, M. 1983. The roles of hemocytes in tanning during the
recolectó mayor número de exuvios en los animales infectados molting cycle: A histochemical study of fiddler crab, Uca pugilator. Bioll.
Bull. 165: 758-777.

46 VOL 8, No. 1 EL MUNDO ACUICOLA