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    Práctica Bombeo de Protones en Levadura

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    PRÁCTICA No. 3
    BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS; EFECTO DE INHIBIDORES DEL TRANSPORTE
    ELECTRÓNICO, DESACOPLANTES E INHIBIDORES DEL BOMBEO DE PROTONES

    INTRODUCCIÓN

    Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación.
    En común con otras células eucariontes, las levaduras tienen un núcleo –en donde reside la
    información genética de la célula-, mitocondrias -en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP- y
    retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan del procesamiento de proteínas cuya
    localización final es la membrana plasmática o el exterior.

    A nivel de la membrana plasmática, las levaduras tienen una H+-ATPasa que acopla la hidrólisis del
    ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la célula. Desde un punto de vista estructural y
    funcional, esta proteína es semejante a la ATPasa de Na+/K+ de las células animales y, al igual que
    esta, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de
    la H+-ATPasa en la levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para
    impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de
    transporte del tipo simportadores o antiportadores. Para darse una idea de la importancia de esta
    enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la
    H+-ATPasa de la levadura consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula.

    Además de la H+-ATPasa de la membrana


    plasmática, las levaduras tienen una ATP
    sintasa convencional localizada en la
    membrana interna de la mitocondria,
    que se encarga de la síntesis del ATP. En
    contraste con la enzima de la membrana
    plasmática, el flujo de protones a través
    de la ATP sintasa induce la síntesis de
    ATP.

    Así, se puede visualizar uno de los


    muchos ciclos en los que interviene el
    ATP en la levadura (Fig. 1): por un lado,
    el ATP se sintetiza principalmente en la
    mitocondria por medio de la ATP sintasa,
    y a nivel de la membrana plasmática, la
    H+-ATPasa lo hidroliza para bombear
    protones al exterior de la célula. En
    ambos casos, el factor común es un flujo
    de protones a través de una membrana.

    Existen sustancias que impiden el


    transporte de electrones en la cadena
    respiratoria, con lo que no se genera el
    gradiente electroquímico y por lo tanto
    no ocurre fosforilación oxidativa (síntesis de ATP). También hay sustancias que pueden generar un
    “flujo de protones alternativo”, lo que disminuye el gradiente electroquímico y desacopla el
    transporte electrónico y la fosforilación oxidativa. Además, hay sustancias que pueden inhibir
    selectivamente la H+-ATPasa de la membrana plasmática; estas actúan de manera similar a como lo
    hacen los inhibidores de la bomba de protones de las células parietales de la mucosa gástrica.

    En esta práctica se pretende comprobar el descenso del pH del medio extracelular en una
    suspensión acuosa de levaduras, asociado al catabolismo de la glucosa para la producción de ATP y
    a su utilización por la H+-ATPasa de la membrana plasmática para el bombeo de protones. Este
    fenómeno genera un gradiente electroquímico a ambos lados de la membrana plasmática.

    OBJETIVOS

    Con esta actividad, el estudiante:


    1. Relacionará el consumo de glucosa y las variaciones en el pH inducidas en el ambiente
    extracelular de una suspensión acuosa de levaduras.
    2. Describirá detalladamente los procesos bioquímicos que vinculan el uso de glucosa como
    combustible metabólico con el mecanismo de las modificaciones en el pH del entorno
    extracelular de la levadura.
    3. Interpretará el efecto de los inhibidores del transporte de electrones, de los desacoplantes y de
    los inhibidores de la H+-ATPasa sobre el bombeo de protones.

    MATERIALES

    • Cinco vasos de precipitado de 100 mL.


    • Pipetas de 5 y 10 mL.
    • Potenciómetro.
    • Piseta para enjuagar el electrodo del potenciómetro.
    • Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/mL. La levadura se lava previamente con agua
    destilada, para eliminar restos de enzimas glucolíticos liberados por destrucción celular. La
    levadura seca comercial se suspende en 10 volúmenes de agua destilada, se centrifuga y se
    descarta el sobrenadante, con el precipitado se repite dos veces más este procedimiento.
    • Solución de glucosa (20%) para una concentración final de 2.22%.
    • Solución de azida de sodio 400 mmol/L. ¡Atención al pictograma de seguridad!
    • Solución de 2,4-dinitrofenol 100 mmol/L en etanol. ¡Atención al pictograma!
    • Solución de esomeprazol farmacéutico (40 mg en 5 ml de agua destilada) ¡Atención!
    • Agua destilada.

    PROCEDIMIENTO

    Experimento 1 (control negativo)


    1. Diluir 5 mL de la levadura con 35 mL de agua destilada.
    2. Determinar el pH de la solución* y repetir la lectura dos veces más con intervalos de 3 minutos
    para obtener la línea basal.
    3. Esperar 5 minutos.
    3. Adicionar 5 mL de agua destilada, agitar y medir el pH. Este es el tiempo 0 experimental.
    4. Determinar el pH de la solución 4 veces con intervalos de 5 minutos, y luego cada 10 minutos 2
    veces más.
    6. Registrar sus datos en la tabla de resultados.

    Experimento 2 (control)
    1. Diluir 5 mL de la levadura con 35 mL de agua destilada.
    2. Determinar el pH de la solución* y repetir la lectura dos veces más con intervalos de 3 minutos
    para obtener la línea basal.
    3. Esperar 5 minutos.
    3. Adicionar 5 mL de glucosa al 20 %, agitar y medir el pH. Este es el tiempo 0 experimental.
    4. Determinar el pH de la solución 4 veces con intervalos de 5 minutos, y luego cada 10 minutos 2
    veces más.
    6. Registrar sus datos en la tabla de resultados.

    Experimento 3 (azida)
    1. Diluir 5 mL de la levadura con 35 mL de agua destilada.
    2. Añadir usando un gotero 0.5 mL de la solución de azida de sodio 400 mmol/L (la concentración
    final en la mezcla del experimento será 4.44 mmol/L). Agitar con cuidado.
    3. Determinar el pH de la solución* y repetir la lectura dos veces más con intervalos de 3 minutos
    para obtener la línea basal.
    4. Esperar 5 minutos.
    5. Adicionar 5 mL de glucosa al 20%, agitar y medir el pH. Este es el tiempo 0 experimental.
    6. Determinar el pH de la solución 4 veces con intervalos de 5 minutos, y luego cada 10 minutos 2
    veces más.
    7. Registrar sus datos en la tabla de resultados.

    Experimento 4 (dinitrofenol)
    1. Diluir 5 mL de la levadura con 35 mL de agua destilada.
    2. Añadir usando un gotero 0.5 mL de la solución de dinitrofenol 100 mmol/L (la concentración
    final en la mezcla del experimento será 1.11 mmol/L). Agitar con cuidado.
    3. Determinar el pH de la solución* y repetir la lectura dos veces más con intervalos de 3 minutos
    para obtener la línea basal.
    4. Esperar 5 minutos.
    5. Adicionar 5 mL de glucosa al 20 %, agitar y medir el pH. Este es el tiempo 0 experimental.
    6. Determinar el pH de la solución 4 veces con intervalos de 5 minutos, y luego cada 10 minutos 2
    veces más.
    7. Registrar sus datos en la tabla de resultados.

    Experimento 5 (esomeprazol)
    1. Diluir 5 mL de la levadura con 35 mL de agua destilada.
    2. Añadir con un gotero 0.5 mL de la solución de esomeprazol 8 mg/ml (la concentración final en
    la mezcla del experimento será de 88.8 μg/mL). Agitar con cuidado.
    3. Determinar el pH de la solución* y repetir la lectura dos veces más con intervalos de 3 minutos
    para obtener la línea basal.
    4. Esperar 5 minutos.
    5. Adicionar 5 mL de glucosa al 20 %, agitar y medir el pH. Este es el tiempo 0 experimental.
    6. Determinar el pH de la solución 4 veces con intervalos de 5 minutos, y luego cada 10 minutos 2
    veces más.
    7. Registrar sus datos en la tabla de resultados.

    ---------------------------------
    * Esperar a que la lectura del pH se estabilice o bien utilizar la función de “congelado” del potenciómetro
    (si está disponible), con esta función se “congela” la lectura cuando se alcanza alguna estabilidad. Si se
    mantiene la fluctuación, usar la lectura intermedia del rango que se muestre.

    DIAGRAMA DE FLUJO
    DIAGRAMA DE FLUJO
    RESULTADOS

    Tiempo
    pH extracelular (pH del medio)
    (minutos)
    Control Azida de
    Procedimiento Para graficar Control 2,4-DNF Esomeprazol
    negativo sodio
    0 (basal) 0
    3 (basal) 3
    6 (basal) 6
    Adición de glucosa (5 ml)
    0 11
    5 16
    10 21
    15 26
    20 31
    30 41
    40 51

    ANÁLISIS DE RESULTADOS

    1. Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos, utilizando los valores de las lecturas de pH
    en función del tiempo.
    2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control negativo (1), control (2),
    con azida de sodio (3), con 2,4-dinitrofenol (4) y con esomeprazol (5).
    3. Relacionar los cambios del pH en función del tiempo, con el efecto bioquímico de los
    compuestos usados en los experimentos del 3 al 5; tomar en cuenta que las levaduras poseen
    una ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna que se encarga de la fosforilación
    oxidativa, usando el gradiente de protones a ambos lados de la membrana mitocondrial
    interna, y que tienen una H+-ATPasa en la membrana plasmática cuya función es similar a la
    bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos.

    REFERENCIAS

    Área Académica de Medicina, Instituto de Ciencias de la Salud UAEH. (2017). Manual de prácticas
    de Bioquímica 2017. México: UAEH.
    Departamento de Bioquímica UNAM. (2019). Manual de prácticas de Laboratorio 2019-2020.
    México: UNAM.
    Pardo, J. P. (1990). La ATPasa de H+ de la membrana plasmática de los hongos. Mensaje
    Bioquímico, 13, 119-172.
    Peña, A. (1975). Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Archives of Biochemistry and
    Biophysics, 167, 397-409.
    CUESTIONARIO

    Responda a las siguientes preguntas:


    1. ¿En este experimento, cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura, y por cuáles vías
    metabólicas las cataboliza?

    2. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa?

    3. Realice un esquema de la cadena respiratoria y describa cómo ocurre el transporte electrónico


    y cómo se acopla con la fosforilación oxidativa?

    4. ¿Cuáles son los inhibidores de los complejos multienzimáticos I, III y IV de la cadena


    respiratoria? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. ¿Dónde actúa la
    azida de sodio?

    5. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los “protonóforos” desacoplan la fosforilación
    oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP.
    6. ¿Cuál es la característica estructural de los compuestos que inhiben las H+-ATPasas?

    7. ¿Cuáles son las similitudes y diferencias estructurales entre omeprazol, lansoprazol,


    pantoprazol y rabeprazol?

    8. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los compuestos mencionados en el inciso 10
    inhiben las bombas de protones (H+-ATPasa tipo P)? ¿Tienen todos la misma efectividad para
    esta inhibición?

    REFERENCIAS (formato APA 7ma edición).

    Departamento de Bioquímica, septiembre 2024.


    Elaboración: Rubén Velásquez, 2020.
    Edición 2024 RV.

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