Implementación de un Bioensayo in vitro con Células Disociadas

de Hepatopáncreas de Palaemon serratus y Procambarus bouvieri

para Detectar la Secreción de la α-Amilasa.

Isis Fernández (1), Laida Ramos (1), Alberto Huberman (2) y Alain Van
Wormhoudt (3)

1. Centro de Investigaciones Marinas # 2808, avenida 1ra entre 30 y 28, Miramar,

Playa, Ciudad de la Habana, Cuba.
2. Laboratorio de Bioquímica del Instituto Nacional de la Nutrición “Salvador Zubiran”,
Vasco de Quiroga # 15 Tlalpan, Distrito Federal. México.
3. Station de Biologie Marine du Muséum National d’Histoire Naturelle et du Collège
de France, 29 110 Conacarneau. France.

Introducción

En los crustáceos la digestión comienza en la cavidad cardíaca del estómago y se continúa

en los túbulos del hepatopáncreas (Vonk, 1960). Es a nivel de esta glándula que la digestión
se hace más activa (Van Wormhoudt, 1980), asegurada por enzimas secretadas por células
especializadas (Barker y Gibson, 1977). Cinco tipos celulares han sido descritos: las células E
(embryonic cells), las células R (resorptive cells), las células F (fibrilar cells), las células B
(blister-like cells) y las células M (midget cells) (Al-Mohanna et al., 1985a,b; Al-Mohanna y
Nott, 1987a,b; Vogt, 1994). El porcentage de cada tipo de células varia en función del estadio
de muda, las células F, responsables de la síntesis y de la secreción de las enzimas
digestivas se encuentran en mayor concentración en la intermuda (estadio C) (Toullec et al.,
1992).

La secreción de las enzimas y la síntesis de las proteínas están reguladas por diferentes
mecanismos, siendo el control hormonal de gran importancia (Fingerman et al., 1967). En los
pedúnculos se encuentran diferentes hormonas peptídicas que regulan las principales
funciones de los crustáceos (la muda, la reproducción y el metabolismo de los carbohidratos)
(Webster, 1986 en Carcinus maenas; Van Wormhoudt et al., 1984 en Palaemon serratus;
Huberman et al., 1993 en Procambarus bouvieri; Soyez et al., 1994 en Homarus americanus;
Sefiani et al., 1996 en Penaeus vannamei).

Diversos autores han estudiado la estimulación de la secreción de las enzimas digestivas in

vitro fundamentalmente de la amilasa bajo el efecto del calcio, de nucleótidos cíclicos, de
hormonas y otros efectores utilizando como modelo las células de vertebrados (Gardner,
1979; O’Doherty y Stark, 1982; Knight y Koh, 1984).

En los invertebrados se ha encontrado una estimulación de la secreción de la α-amilasa

hepatopancreática in vitro por la presencia del calcio y de la hormona hiperglucemiante en
Orconectes limosus (Sedlmeier, 1988). Giard et al., (1995) obtuvieron efectos semejantes con
células de la glándula digestiva en Pecten maximun.
Fernández I.; L., Ramos; A. Huberman y A. Van Wormhoudt. 2000. Implementación de un bioensayo in vitro con células 202
disociadas de hepatopáncreas de Palaemon serratus y Procambarus bouvieri para detectar la secreción de la α-Amilasa.
pp 202-219 En: Civera-Cerecedo, R., Pérez-Estrada, C.J., Ricque-Marie, D. y Cruz-Suárez, L.E. (Eds.) Avances en
Nutrición Acuícola IV. Memorias del IV Simposium Internacional de Nutrición Acuícola. Noviembre 15-18, 1998. La
Paz, B.C.S., México
Hasta este momento en los crustáceos se conocen trabajos in vitro sobre la estimulación de la
secreción de la α-amilasa por la influencia de diferentes efectores pero solamente a nivel del
órgano (hepatopáncreas) (Sedlmeier, 1988).

Objetivos de la investigación:

- Implementar un bioensayo in vitro utilizando células disociadas del hepatopáncreas en dos

tipos de crustáceos decápodos, Palaemon serratus y Procambarus bouvieri.

- Determinar la secreción de la α-amilasa por las células disociadas ante la presencia de

diferentes condiciones de incubación, entre ellas, la influencia del ionoforo de calcio A 23187,
del AMP cíclico, de extractos del pedúnculo ocular y de las neurohormonas de la familia de la
cHH.

Aplicación en la Acuacultura:

Contar con un bioensayo in vitro que pueda detectar la estimulación de las enzimas digestivas
como la α-amilasa bajo la influencia de diferentes efectores antes de realizar los bioensayos
in vivo.

Materiales y Métodos

Animales

Procambarus bouvieri es un crustáceo de agua dulce. Su peso medio es de 20 g y su talla de

20 cm. Palaemon serratus y Penaeus notialis son crustáceos marinos. Los organismos fueron
mantenidos en acuarios de 30 litros con filtros biológicos. Para los bioensayos los camarones
se seleccionaron en estadio C de intermuda.

Viabilidad celular

La identificación de las células se realizó siguiendo la metodología de Vogt, (1994). La

viabilidad de las células es controlada utilizando azul tripán 0.2%. Después de cada
experiencia, una alícuota de la suspensión celular es observada al microscopio óptico con el
objetivo de realizar el conteo de las células mediante una cámara de Malassez. La
estimación de la tasa de viabilidad celular es calculada a través de la fórmula siguiente:
Sobrevivencia celular = células vivas/(células vivas + células muertas).

Medios de separación y de incubación celular para Palaemon serratus.

Tres medios salinos son utilizados: el primero es un medio fisiológico que contiene NaCl
(427mM), CaCl2 (30.0mM), KCl (15.7mM), MgCl2 (13.0mM), Na2SO4 (8.4mM), NaHCO3
(4.2mM). El segundo medio salino se encuentra desprovisto de iones divalentes y es utilizado
en la disociación, está compuesto de: NaCl (467mM), KCl (15.7mM), Na2SO4 (8.4mM),

203
NaHCO3 (4.2mM) a pH 7.4. El tercer medio de incubación es el medio Van Harreveld (1936).
Todos estos medios fueron ajustados a un pH de 7.4 y una osmolaridad calculada de
1100mOsmoles.

Medios de separación y de incubación celular para Procambarus bouvieri.

Dos medios son utilizados. El primero es el medio Van Harreveld (1936). El segundo es el
medio 199 que contiene sales de Earles y de la L-glutamina. La osmolaridad es ajustada a
450 mOsmol y pH 7.4. A estos dos medios se le añaden 1% de albúmina bovina. A todos los
medios se le adicionan dos antibióticos (estreptomicina, 100µg/ml; penicilina-G 100UI/ml), así
como un fungicida (anfotericina-B, 0.25µg/ml).

Condiciones optimas de incubación celular.

a) Temperatura.
Las células son incubadas a diferentes temperaturas: 5, 10, 20 y 30°C.

b) AMP cíclico y ionoforo de calcio A23187 ( C7522).

Una solución de adenosín monofosfato3-5’cíclico es preparada a concentraciones de 1, 5, 50
y 200µM y una solución de ionoforo de calcio a concentraciones de 10, 50 y 100µM en
solución salina.

Preparación de los extractos.

a) Extracto bruto de pedúnculo ocular de P. notialis.

Dos tipos de extracciones fueron realizados en los pedúnculos oculares de P. notialis. Una con
ácido acético al 0.1% y la otra con acetato de amonio 10 mM. Un gramo de pedúnculo ocular
en distintos estadios del ciclo de muda (postmuda B, intermuda C y premuda (Do, D1 y D2)
fueron macerados y centrifugados a 1800 g, posteriormente fueron liofilizados y
resuspendidos 2 ml de solución salina.

b) Extracto de las glándulas del seno de P. bouvieri y de las neurohormonas se realizaron

según la metodología de Huberman et al., (1993, 1995).

Determinación de proteínas.
Las proteínas solubles del extracto del pedúnculo ocular se cuantificaron según el método de
Lowry et al., (1951). La concentración de proteínas de las neurohormonas puras fueron
medidas por el método de Hazra et al ., (1984).

Determinación de la actividad de la enzyma α -amilasa.

La actividad de la α-amilasa fue medida por un método colorimétrico (No 577, Sigma). Este
método está basado en la liberación del nitrofenol detectado a 405 nm.
6
Los resultados fueron expresados de la siguiente manera: UA/min/10 células

204
La unidad de actividad (UA) se definió:

UA= Unidad/ml= (∆ Abs x VT x 1,25)/ (E x VE x 1)

∆ Abs = diferencia entre las absorbancias finales e iniciales.
VT= volumen total
VE= volumen de la muestra
E= coeficiente de absorción del p-nitrofenol
1= trayecto óptico.
El porcentaje de liberación total corresponde a la actividad al final de cada incubación dentro
del medio y en las células.

Pruebas estadísticas

Los resultados fueron comparados utilizando ANOVA de clasificación simple y la prueba de

Duncan con un 95% de confianza.

RESULTADOS

Implementación del bioensayo in vitro, utilizando células disociadas de

hepatopáncreas de P. serratus y P. bouvieri.

1. Condiciones optimas de difusión basal de la amilasa por las células disociadas del
hepatopáncreas de P. serratus y P. bouvieri.

Después de realizar la disociación de las células es indispensable lograr una alta

sobrevivencia en las mismas con el objetivo de disponer de un medio de incubación adecuado
para probar posteriormente diferentes factores que estimulen la respuesta biológica de las
células.

La calidad de los medios de incubación se definirán según dos criterios fundamentales: la

sobrevivencia celular y la secreción basal mínima de la amilasa por las células disociadas del
hepatopáncreas en el medio de incubación.

a) Utilización de diferentes medios de incubación.

Dos soluciones salinas fueron utilizadas en los bioensayos para P. serratus, el medio Van
Harreveld (VH) y el medio Tampón Disociación (TD). La secreción de la α-amilasa medida fue
la secreción basal. El aumento de esta secreción puedo ser debido a la destrucción de
algunas células o a la liberación pasiva de la enzima o a la influencia de algunos iones sobre
esta liberación.

La figura 1 indica el porcentaje de la amilasa dentro de estos dos medios después de 30 min
de incubación. El porcentaje observado para el medio VH es mas débil que el observado para
el TD con relación al porcentaje total. Como resultado se utilizara el medio VH para las
próximas experiencias (respuesta basal mínima).

205
 30

% de amilasa en el medio
25

20

15

10

0
VH TD
medios de incubación

Figura. 1. Porcentaje de liberación de -amilasa (basal) en los dos medios de incubación celular: Medio
Van Harreveld (VH) y medio Tampón Disociación (TD) en P. serratus. Tiempo de incubación 30 min. VH
difiere estadísticamente de TD después de haber utilizado la prueba ANOVA, para un 95% de confianza.

La figura 2 refleja la influencia de diferentes medios de incubación sobre la secreción basal de

la amilasa por las células disociadas del hepatopáncreas de P. bouvieri. De los medios
utilizados para la secreción basal, los valores mas débiles se encontró en el medio 199 + 1%
de albúmina.

30
% de amilasa en el medio

25

20

15

10

0
1 2 3 4
medios de incubación

Figura. 2. Porcentaje de liberación de la amilasa (basal) en diferentes medios (1. Medio 199, 2. Medio 199+
1% de albúmina, 3. Medio VH, 4. Medio VH + 1% de albúmina) en P. bouvieri. Tiempo de incubación 30
min. 1 difiere estadísticamente de 2,3 y 4 después de haber utilizado la prueba ANOVA, para un 95% de
confianza.

Los valores de sobrevivencia celular determinados después de 30 min de incubación (Fig. 3)

indican que los medios mas favorables para la incubación de las células del hepatopáncreas
de P. bouvieri son el medio 199 y el medio 199 + 1% de albúmina.

206
Estos resultados indican que el medio 199 + 1% de albúmina es el aconsejado para las
incubaciones celulares de P. bouvieri debido a la alta sobrevivencia encontrada (mas del
95%) y la débil secreción basal de la α-amilasa en 30 minutos de incubación.

100

% de sobrevivencia
95
90
85
80
75
70
1 2 3 4
medios de incubación

Figura. 3. Sobrevivencia de las células del hepatopáncreas de P. bouvieri en diferentes medios (1. Medio
199, 2. Medio 199+ 1% de albúmina, 3. Medio VH, 4. Medio VH + 1% de albúmina). Tiempo de incubación
30 min, 16°C. 1 y 2 difieren estadísticamente de 3 y 4 después de la aplicación de la prueba ANOVA y
Duncan al 95% de confiabilidad.

La tabla 1 muestra el porcentaje de la amilasa en los diferentes medios de incubación (el

medio VH, el medio VH + 1% de albúmina, el medio 199 y el medio 199 + 1% de albúmina) y
dentro de las células. Los resultados indican que el porcentaje de amilasa medido en el medio
aumenta en el transcurso de 60 min de incubación, mientras el porcentaje de la amilasa
medido en las células disminuye.
En el transcurso de 30 min la respuesta de las células a la liberación de la amilasa es
detectada para ambas especies estudiadas.

Tabla 1. Porcentaje de liberación de la amilasa (basal) por las células disociadas del hepatopáncreas
de P. bouvieri en diferentes medios de incubación y a diferentes tiempos (0, 30 y 60 min).

% de amilasa determinada en los medios de incubación a

diferentes tiempos
MEDIOS 0 minutos 30 minutos 60 minutos
medio VH 3 20 24
medio VH + 1% de albúmina 8 10 14
medio 199 10 28 38
medio 199 + 1% de albúmina 3 9 26

b) Efecto de la temperatura.

Tan importante como la selección del medio de incubación resulta la temperatura apropiada
para obtener una buena respuesta de las células sobre la secreción de la amilasa (basal).
Diversas temperaturas fueron ensayadas (5, 10 y 20°C) sobre las células de P. serratus. El
efecto de la temperatura se relacionó con la sobrevivencia celular y la actividad basal de la

207
amilasa liberada por las células en el medio salino TD, para tiempos de incubación de 60 y
120 min (Fig. 4).
La sobrevivencia celular es del 97% para las diferentes temperaturas estudiadas en todas las
incubaciones. La actividad de la amilasa es detectada desde 5°C . Se observa un aumento a
20°C con relación a 10 y 5°C después de 120 min de incubación. Este resultado indica la
posibilidad de medir el efecto secretor de las células disociadas del hepatopáncreas a
temperaturas comprendidas entre 5 y 20°C .

a
0.02

0.02
UA/mn/10 células

b
0.01 d c
6

0.01 e e

0.00
1 2 3 1 2 3 1 2 3
5 oC 10 oC 20 oC

temperatura

Figura. 4. Actividad de la amilasa medida en el medio VH de incubación de las células disociadas del
hepatopáncreas de P. serratus a diferentes temperaturas de incubación durante 0(1), 30(2) y 60(3)
minutos. Las diferencias entre las medias se indican por letras diferentes(Prueba de Duncan).

En P. bouvieri la temperatura de la incubación optima de las células se encontró entre 15 y

20°C donde la sobrevivencia obtenida es alta.

2. Efecto del AMP cíclico y del ionoforo de calcio A 23187 sobre la secreción de la
amilasa por las células disociadas del hepatopáncreas de P. serratus.

En los crustáceos no existe ninguna referencia relacionada con la secreción de la amilasa a

nivel celular.

a) Efecto del AMP cíclico.

La influencia del AMP cíclico sobre la respuesta de las células con relación a la secreción de
la amilasa se observa en la figura 5. La actividad de la amilasa medida en el medio de
incubación VH a concentraciones de 5, 50 y 200 µM de AMP cíclico y en 60 min de
incubación estimulan la secreción de la amilasa de las células disociadas, observándose un
efecto dosis-respuesta significativo.

208
 a

UA/mn/10 células
0.012
b

0.008 c

6
d
0.004

0.000
0 5 10 50
AMP c (µM)

Figura. 5. Efecto del AMP cíclico a diferentes concentraciones (0, 5, 10 y 50 µM) sobre la secreción de la
amilasa in vitro por las células disociadas del hepatopáncreas de P. serratus . Tiempo de incubación 60 min.
Las diferencias entre las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

b) Utilización del ionoforo de calcio A 23187.

El ionoforo A 23187 (C 7522) ha sido probado en las células disociadas del hepatopáncreas
de P. serratus a concentraciones de 10 y 50 µM. La Fig. 6 muestra que el ionoforo de calcio C
7522 estimula la liberación de la amilasa dentro del medio. El efecto dosis-respuesta
encontrado es significativo.

a
0.035
b
UA/mn/10 células

0.030
0.025
c
0.020
6

0.015
0.010
0.005
0.000
0 10 50
Ionoforo A 23187 (µ M)

Figura. 6. Efecto de diferentes concentraciones de ionoforo A 23187 (C 7522) sobre la secreción de la

amilasa in vitro por las células disociadas de hepatopáncreas de P. serratus Tiempo de incubación 30 min.
Las diferencias entre las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

El porcentaje de secreción de la amilasa obtenido en el medio de incubación con ionoforo de

calcio es semejante al obtenido con el AMP cíclico, 20, 31 y 35 % para 0, 10 y 50 µM. Estos
resultados indican que el ionoforo de calcio y el AMP cíclico estimulan la secreción de la
amilasa de las células disociadas del hepatopáncreas de P. serratus y además se encuentra
en relación con la concentración utilizada.

209
3. Secreción de la amilasa por las células incubadas en presencia de fracciones
purificadas del pedúnculo ocular.

Este trabajo tiene como objetivo verificar el comportamiento de las células disociadas de
hepatopáncreas (en P. serratus y en P. bouvieri) incubadas con extractos de pedúnculos
oculares, glándulas sinusales y hormonas purificadas de la familia de la cHH.

a) Influencia de diferentes extractos del pedúnculo ocular de P. notialis sobre la

secreción de la amilasa de las células disociadas de P. serratus.
La actividad de la amilasa es medida en el medio VH de incubación, el cual contenía
diferentes equivalentes de extractos de pedúnculos oculares (0.4; 0.6 y 0.8 equivalentes) (1
equivalente = extracto correspondiente a 1 pedúnculo ocular). La figura 7 muestra la curva
dosis-respuesta de la secreción de la enzima con relación al control.

0.040 a
UA/mn/10 células

b
0.030

c
6

0.020
d
0.010

0.000
0 0.4 0.6 0.8

equivalentes del pedúnculo ocular

Figura. 7. Actividad de la amilasa en el medio de incubación celular (en células de P. serratus) en presencia
de diferentes equivalentes del pedúnculo ocular ( 0; 0,4; 0,6 y 0,8 equivalentes de P. notialis) . Extracto con
ácido acético. Tiempo de incubación 60 min. Las diferencias entre las medias se indican por letras
diferentes (Prueba de Duncan).

Los porcentajes de secreción en el medio son de 18%, 34%, 45% y 60% para las
concentraciones de 0, 0.4, 0.6, y 0.8 equivalentes del pedúnculo ocular. respectivamente.

Diferentes cantidades de extractos del pedúnculo ocular fueron obtenidos con acetato de
amonio 10 mM (0, 1 y 2 equivalente) fueron utilizados para las incubaciones celulares. La
figura 8 muestra la respuesta de la actividad de la enzima en el medio a 60 min de
incubación. La actividad secretora es proporcional a la cantidad de equivalentes del
pedúnculo ocular en el medio donde las células son incubadas.

210
 0.25 a

UA/mn/10 células
0.20
b
6 0.15

0.10 c
0.05

0.00
0 1 2
equivalentes del pedúnculo ocular

Figura. 8. Actividad de la amilasa en el medio de incubación celular (en células de P. serratus) en presencia
de diferentes equivalentes del pedúnculo ocular (0, 1 y 2 equivalentes de P. notialis). Extracto con acetato
de amonio 10 mM. Tiempo de incubación 60 min. Las diferencias entre las medias se indican por letras
diferentes (Prueba de Duncan).

El porcentaje de secreción liberada por la células del hepatopáncreas de P. serratus es de 16

%, 35% y 51% para 0, 1 y 2 equivalentes del pedúnculo ocular respectivamente.

0.08 a a a
UA/mn/10 células

b
0.06 bc
c
6

0.04

0.02

0
T B C D0 D1 D2

e s t a d io d e m u d a

Figura. 9. Actividad de la amilasa en el medio de incubación celular (P. serratus) con 0.8 equivalentes de
extracto de pedúnculo ocular provenientes de camarones (P. notialis) en diferentes estadios del ciclo de
muda (B, C, D0, D1 y D2 con relación al testigo (T).

Extracto con acetato de amonio 10 mM. Tiempo de incubación 60 min. Las diferencias entre
las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

La figura 9 indica la variación de la actividad de la amilasa por las células (P. serratus)
incubadas con 0.8 equivalentes de extracto de pedúnculo ocular proveniente de camarones
(P. notialis) en diferentes estadios del ciclo de muda. La incubación celular con los extractos
en C, Do y D2 muestran una actividad de la enzima mayoritaria. Estos resultados ponen en
evidencia la reacción cruzada entre las especies P. serratus y P. notialis.

211
El porcentaje de secreción encontrado es de 33% para el estadio B, 41% para el estadio C,
40% para el estadio Do, 30 % para el estadio D1, 39% para el estadio D2 con relación al
testigo (26%).

b) Primeros estudios del efecto de extractos de la glándula sinusal y de hormonas

purificadas sobre la secreción de la amilasa por las células disociadas del
hepatopáncreas de Procambarus bouvieri.

Las incubaciones de las células disociadas del hepatopáncreas de P. bouvieri en presencia de

diferentes concentraciones de la glándula sinusal se presentan en la figura 10. Un efecto
dosis respuesta es obtenido a partir de 0.5 equivalente hasta 6 equivalente de la glándula,
utilizando el medio 199 + 1% de albúmina.

0.025
a
0.020 ab a ab
UA/min/10 células

b
0.015 b b
b
6

0.010

0.005

0.000
T 0.5 1 2 3 4 5 6

equivalentes de la glándula sinusal

Figura. 10. Actividad de la amilasa medida en el medio 199 + 1% de albúmina secretada por las células
disociadas del hepatopáncreas de P. bouvieri e incubadas a diferentes equivalentes de la glándula sinusal
(P. bouvieri) (0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6). Tiempo de incubación de 30 min. Las diferencias entre las medias se
indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

El porcentaje de liberación de la amilasa al medio de incubación por las células disociadas

del hepatopáncreas de P. bouvieri es significativo a partir de 3 equivalentes de glándula
sinusal, con un valor máximo de secreción del 18% con relación al testigo (10%).

La secreción de la amilasa por las células incubadas con hormonas purificadas a partir de la
glándula sinusal de P. bouvieri fue determinada. La figura 11 muestra que la incubación de las
células con las dos isoformas de la hormona hiperglucemiante (cHH-I y cHH-II) estimulan la
secreción de la amilasa con relación al testigo, siendo la estimulación producida por la cHH-II
superior a la de la cHH-I.

212
 0.07
a a
0.06

UA/min/10 células
0.05
b
0.04 b

6
0.03
c c
0.02

0.01

0.00
testigo cHH-I cHH-II testigo cHH-I cHH-II
50 74
Concentración de la cHH (nM)

Figura. 11. Actividad de la amilasa medida en el medio 199 + 1% de albúmina, secretada por las células del
hepatopáncreas de P. bouvieri e incubadas en concentraciones diferentes de las dos isoformas de la
hormona hiperglucemiante de P. bouvieri (cHH-I y cHH-II). Tiempo de incubación de 30 min. Las diferencias
entre las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

Los resultados muestran que las concentraciones de 50 nM (que se corresponden con

208ng/500 µl y 4 glándulas sinusales) y 74 nM (que se corresponden con 312 ng/500 µl de
medio y 6 glándulas sinusales) tienen un efecto similar con relación al porcentaje de
liberación de la amilasa. La isoforma cHH-II estimula un 43% la secreción de la amilasa con
relación a la isoforma cHH-I (30% a 50 nM y un 24% a 74 nM). Ambas isoformas estimulan la
secreción de la enzima con relación al testigo (15%).

La actividad de la amilasa en presencia de la hormona inhibidora de la muda (Fig. 12) y de la

hormona inhibidora de las gónadas (Fig. 13) es medida en el medio de incubación de las
células del hepatopáncreas de P. bouvieri. Los resultados muestran que la secreción de la
amilasa no es estimulada ni por la hormona inhibidora de la muda (MIH) ni por la hormona
inhibidora de las gónadas(GIH). Las concentraciones de proteínas son equivalentes a 2, 4, 6
y 8 glándulas sinusales (en 500 µl de medio de incubación).

0.012 a
a a a
UA/mn/10 células

0.010
a
0.008
6

0.006

0.004

0.002

0.000
testigo 3 6 9 12 nM

Figura. 12. Actividad de la amilasa medida en el medio 199 + 1% de albúmina, secretada por las células del
hepatopáncreas de P. bouvieri e incubadas en concentraciones diferentes de la hormona inhibidora de la
muda (MIH) de P. bouvieri (3 nM=12.4 ng/500 µl= 2 glándulas; 6 nM= 24.8 ng/500 µl= 4 glándulas; 9 nM=
37.2 ng/500 µl= 6 glándulas; 12 nM= 49.6 ng/500 µl= 8 glándulas) Tiempo de incubación de 30 min. Las
diferencias entre las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

213
 0.014
0.012 a

UA/mn/106 células
a a
0.010 a a
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
testigo 3 6 9 12 nM

Figura. 13. Actividad de la amilasa medida en el medio 199 + 1% de albúmina, secretada por las células del
hepatopáncreas de P. bouvieri e incubadas en concentraciones diferentes de la hormona inhibidora de las
gónadas (GIH) de P. bouvieri (3 nM= 25.4 ng/500 µl= 2 glándulas; 6 nM= 50.8 ng/500 µl= 4 glándulas; 9
nM= 76.2 ng/500 µl= 6 glándulas; 12 nM= 101.6 ng/500 µl= 8 glándulas) Tiempo de incubación de 30 min.
Las diferencias entre las medias se indican por letras diferentes (Prueba de Duncan).

Este resultado indica de una parte, la existencia de una respuesta estimulatriz de la cHH en la
secreción de la amilasa por las células disociadas del hepatopáncreas y de otra parte que la
estimulación que produce la isoforma cHH-II es superior a la estimulación que produce la
isoforma cHH-I. Sin embargo, las hormonas inhibidoras de la muda (MIH) y de las gónadas
(GIH) no estimulan la secreción de la amilasa.

DISCUSIÓN

Implementación del bioensayo in vitro con células disociadas del hepatopáncreas.

La utilización de células disociadas de hepatopáncreas de P. serratus o de P. bouvieri a

permitido determinar la secreción de la amilasa en el medio. Hasta la fecha, en crustáceos
solamente se conoce el trabajo de Sedlmeier (1988), donde utiliza el hepatopáncreas para los
bioensayos in vitro. La implementación de un bioensayo con células disociadas del
hepatopáncreas tiene como ventajas: que los tejidos (muscular, nervioso y hemolinfático)
presentes alrededor de las células son eliminados (Gibson y Baker, 1979), particularmente el
hemolinfático donde se han detectado enzimas digestivas (Amiard et al., 1982; Kono et al.,
1995). También se eliminan los efectos que produce la acción de ciertos péptidos (los
neuromediadores influyen sobre la contracción muscular de los túbulos hepatopáncreaticos y
estimulan la liberación de las enzimas dentro del lumen) sobre el sistema neuromuscular.

El establecimiento de un medio de cultivo que permita una tasa basal de actividad (mínima)
de la amilasa en el medio y una tasa de sobrevivencia celular alta constituyó la primera etapa
de esta investigación.

Dos especies de crustáceos fueron utilizadas P. serratus y P. bouvieri. La sobrevivencia de la

células de P. serratus disociadas del hepatopáncreas e incubadas por 86 horas en diferentes
medios fue determinada por Cancre (1997) con una sobrevivencia de 98%. En este trabajo se
obtuvo una sobrevivencia de 98.5% para el medio TD y de 97.5 para el medio VH, lo que

214
confirma los resultados obtenidos por Cancre (1997). Con relación a P. bouvieri, la
sobrevivencia mas alta se obtuvo para el medio 199 + 1% de albúmina.

La difusión de la amilasa en el medio de incubación mas débil (como respuesta de las células
disociadas) se encontró en P. serratus en el medio VH y en P. bouvieri en el medio 199 + 1%
de albúmina.

Diversas temperaturas fueron estudiadas con el objetivo de lograr un mínimo de difusión de la

enzima por las células en el medio de incubación. Los mejores resultados fueron obtenidos
entre 20 y 10º C para P. serratus. En este rango de temperatura se obtuvieron igualmente
buenos resultados para la incubación de las células de P. bouvieri.

Devillez y Fyler (1985) incubaron células disociadas de Orconectes rusticus en 22º C. Toullec
et al., (1992) y Cancre (1997) indican una temperatura de incubación para las células
disociadas del hepatopáncreas de P. serratus de 15º C, mientras que Frerichs (1996) reporta
28º C para Macrobrachium rosenbergii. Estas deferencias de temperaturas para las
incubaciones se corresponden con las temperaturas habituales de cada especie en su medio.

La validación del bioensayo fue obtenida al estudiar el efecto de diferentes factores sobre la
secreción de la amilasa. El AMP cíclico en diferentes concentraciones mostró un papel
estimulador sobre la secreción de la enzima por las células disociadas del hepatopáncreas de
P. serratus coincidiendo con lo planteado por Cancre (1997) pero con respecto a la síntesis
de proteínas.

En los crustáceos, solamente Sdlmeier (1988) demostró la estimulación de la secreción de la

amilasa en hepatopáncreas de Orconectes incubado en 100 µM de AMP cíclico.

En los bivalvos, una respuesta similar con relación a la secreción de la amilasa fue detectada
por las células disociadas del complejo estomago-glándula digestiva de Pecten maximus,
donde el AMP cíclico estimula la secreción de la α-amilasa de forma semejante a lo
observado en vertebrados (Giard et al., 1995).

El calcio está igualmente implicado en los mecanismos que controlan la liberación de la

amilasa por las células disociadas del hepatopáncreas de P. serratus. Concentraciones de 10
y 50 µM de ionoforo A 23187 muestran una respuesta estimulatriz en la secreción de la
amilasa por las células disociadas. La influencia del ionoforo A 23187 fue estudiada por
Sedlmeier (1988). La amilasa del hepatopáncreas (in vitro) es igualmente estimulada en
2+
Orconectes limosus por el calcio. El Ca extracelular parece ser necesario para la secreción
de amilasa por el hepatopáncreas.

Estos resultados evidencian que puede ser utilizado como prueba biológico en futuras
experiencias la secreción de la amilasa por las células disociadas.

Secreción de la amilasa por las células de hepatopáncreas incubadas en presencia de

diferentes extractos de pedúnculo ocular y de hormonas purificadas.

La utilización del bioensayo a permitido de poner en evidencia la influencia de diferentes

extractos del pedúnculo ocular (extracto ácido y extracto con acetato de amonio), así como
extractos de la glándula sinusal sobre la secreción de la amilasa por las células aisladas del
hepatopáncreas de P. serratus y P. bouvieri.

215
Esta respuestas difieren según el estadio de muda. Es en los estadios C, Do y D2 que las
células incubadas presentan una secreción máxima de la amilasa. Este resultado indica la
presencia de un factor estimulante de la secreción de la enzima, presente mayoritariamente
en intermuda y en premuda temprana (Van Wormhoudt et al., 1972). La baja de la actividad
enzimática en D1 es atribuida a la ausencia de ese factor estimulante en ese estadio. El
aumento de la actividad en D2 pudiera provenir de una nueva estimulación de las células de
hepatopáncreas por otros mecanismos, ya sea por la acción de metabolitos que intervienen
en el crecimiento o mas directamente por la acción de la ecdisona sobre la RNA polimerasa o
de la acción de una hormona o de pequeñas moléculas activas secretada por los pedúnculos.

La disminución de la secreción de la amilasa en D1 coincide con la disminución de la

actividad específica in vivo (Van Wormhoudt et al., 1972) y con una disminución del número
de células inmunoreactivas por la cHH en D1 (Van Herp et al., 1984). En efecto, estos autores
localizaron utilizando métodos inmunocitoquímicos la localización de los sitios de síntesis, de
transporte, de almacenamiento y de liberación de la cHH dentro del pedúnculo ocular de P.
serratus. Durante el ciclo de la muda, el número de células inmunopositivas aumenta del
estadio C al estadio Do, el mínimo de células inmunoreactivas se encuentra en el estadio D1.
Posteriormente un ligero aumento es observado en D2.

Este trabajo muestra la capacidad biológica de las células aisladas del hepatopáncreas (en
dos crustáceos) de responder a efectores de la secreción de la amilasa. En P. bouvieri, se
probaron diferentes concentraciones de la cHH (50 y 74 nM) correspondiente a
concentraciones fisiológicas determinadas de la glándula sinusal. Sin embargo, las
concentraciones probadas de la hormona inhibidora de la muda y de la hormona inhibidora de
las gónadas no ejercen ningún efecto sobre la secreción de la amilasa, no obstante estas
hormonas pudieran influir en otras funciones metabólicas del hepatopáncreas.

La presencia de receptores dentro de las células del hepatopáncreas ha sido demostrada

únicamente para la cHH. Kummer y Keller (1993) evidenciaron la existencia de receptores en
la membrana del hepatopáncreas para la cHH de Carcinus maenas y de Orconectes limosus.
Estos autores sugieren que la especificidad de la actividad biológica de la cHH esta ligada a
la fijación de la hormona sobre su receptor.

Las células incubadas con las dos isoformas de la hormona hiperglucemiante responden con
la secreción de la amilasa. Se distingue que la respuesta de las células de hepatopáncreas
incubadas con la isoforma cHH-II es dos veces superior a la respuesta de las células
incubadas con la cHH-I (Fig. 14), al ser medida esta respuesta en el medio de incubación con
relación al testigo (0%).

216
 nM

74

50 Se

0 50 100 150 200

% de secreción de la amilasa

Figura. 14. Porcentaje de secreción de la amilasa de las células incubadas a concentraciones diferentes de
las dos isoformas de la hormona hiperglucemiante (cHH-I y cHH-II), medido en el medio de incubación con
relación al testigo (0%).

Estas dos moléculas tienen el mismo peso molecular (8388 Da), la única diferencia entre
ellas es que la cHH-II posee un tercer residuo de aminoácido diferente, la D-fenil alanina,
mientras que la cHH-I tiene la L-fenil alanina.
La inyección de cada isoforma de la cHH de P. bouvieri provocó la misma respuesta
hiperglucemiante. En C. maenas y C. pagurus (Chung y Webster, 1996), las dos isoformas de
la cHH producen igualmente respuestas hiperglicémicas semejantes. Soyez et al., (1994)
mostraron que las isoformas de la cHH de Homarus americanus, (la “cHHA [D-Phe3]”
(minoritaria) y la “cHHA [L-Phe3]” mayoritaria) producen respuestas hiperglicémicas entre 3 y
4 horas respectivamente después de la inyección en Orconectes limosus.

Diversos bioensayos han sido realizados con el objetivo de demostrar la presencia dentro de
los extractos del pedúnculo ocular, de la cHH y de sus isoformas. Sin embargo, los criterios y
los bioensayos utilizados muestran divergencia con relación a la identificación biológica de
esta hormona y de sus isoformas (Santos y Stefanello, 1991; Soyez et al., 1994; Yasuda et
al., 1994; Aguilar et al., 1995; Chung y Webster, 1996; Sefiani et al., 1996).

Conclusión

1. Implementación de un bioensayo in vitro teniendo en cuenta el medio y la temperatura

adecuada para realizar las incubaciones de las células de P. serratus y P. bouvieri de tal
forma que se logre una secreción basal de la amilasa y un alto porcentaje de sobrevivencia
en las células.

2. La relación dosis respuesta encontrada en la secreción de la α-amilasa por las células

incubadas a diferentes concentraciones de extractos del pedúnculo ocular y de la glándula
sinusal indica la presencia dentro de esos extractos de factores estimuladores para la
secreción de la enzima por las células disociadas y que dependerá del estadio de muda en
que se encontraba el animal cuando se disecó el pedúnculo ocular. La incubación celular con
hormonas purificadas evidenció una respuesta estimulatriz de la secreción de la amilasa
cuando la incubación se realizó con la cHH-I y la cHH-II, siendo la respuesta de las células
superior cuando era incubada con la cHH-II, sin embargo no se detectó respuesta cuando las
células eran incubadas con la MIH y la GIH.

217
Referencias:

Aguilar, M. B., Soyez, D., Falcheto, R., Arnott, D., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. & Huberman, A. (1995).
Amino acid sequence of the minor isomorph of the crustacean hyperglycemic hormone (cHH-II) of
the mexican crayfish Procambarus bouvieri (Ortmann): Presence of D-amino acid. Peptides, 16(8):
1375-1383.
Al-Mohanna, S. Y., Nott, J. A. & Lane, D. J. W. (1985 a). M. < Midget> cells in the hepatopancreas of the
shrimp Penaeus semisulcatus de Hann. Crustaceana, 48: 260-268.
Al-Mohanna, S. Y., Nott, J. A. & Lane, D. J. W. (1985 b). Mitotic E- and F-cells in the hepatopancreas of the
shrimp Penaeus semisulcatus (Crustacea: Decapoda). J. Mar. Biol. Ass. UK, 65: 901-910.
Al-Mohanna, S. Y. & Nott, J. A. (1987 a). M. < Midget> cells and moult cycle in Penaeus semisulcatus
(Crustacea: Decapoda). J. Mar. Biol. Ass. U. K., 67: 803-813.
Al-Mohanna, S. Y. & Nott, J. A. (1987 b). R-cells and the digestive cycle in Penaeus semisulcatus
(Crustacea: Decapoda). Marine Biology, 95: 129-137.
Barker, P. & Gibson, R. (1977). Observations on the structure of mouthparts, histology of the alimentary tract,
and digestive physiology of the mud crab Scylla serrata (Decapoda: Portunidae). J. Exp. Mar. Biol.
Ecol., 32: 177-196.
Cancre, I. (1997). Recherche de Facteurs de croissance chez les invertebrés marins: Approche biologique in
vivo et in vitro, immunologique, biochimique et moléculaire. Thèse d’Université de Bretagne
Occidentale. Mention: Chimie Marine. 191p.
Chung, J. S. & Webster, S. G. (1996) Does the N-terminal pyroglutamate residue have any physiological
significacance for crab hyperglycemic neuropeptides? Eur. J. Biochem, 240 (2): 358-364.
De Villez, E.& Fyler, D. J. (1985). Isolation of hepatopancreatic cell types and enzymatic activities in B cells of
the crayfish Orconectes rusticus. Can. J. Zool., 64: 81-83.
Fingerman, M., Dominiczak, T. Oguro, C. & Yamamoto, Y. (1967). Neuroendocrine control of the
hepatopancreas in the crayfish Procambarus clarkii. Physiol. Zool., 40: 23-30.
Gardner, J. D. (1979). Regulation of pancreatic exocrine function in vitro: initial steps in the actions of
secretagogues. Ann. Rev. Physiol., 41: 55-66.
Giard, W., Favrel, P. & Boucaud-Comou, E. (1995). In vitro investigation of alfa-amylase release from the
digestive cells of the bivalve mollusc Pecten maximus: Effect of second messengers and biogenic
amines. J. Comp. Physiol., 164(7): 518-523.
Gibson, R. & Baker. P. L. (1979). The decapod hepatopancreas. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev., 17: 285-346.
Hazra, A. K. , Chock, S. P. & Albers, R. W. (1984). Protein determination with trinitrobenzene sulfonate: A
method relatively indepent of amino acid composition. Anal. Biochem., 137: 437-443.
Huberman, A., Aguilar, M. B., Brew, K., Shabanowitz, J. & Hunt, D. F. (1993). Primary structure of the
major isomorph of the crustacean hyperglycaemic hormone (cHH-I) from the sinus gland of Mexican
crayfish Procambarus bouvieri (Ortmann): Interspecies comparaison. Peptides, 14: 7-16.
Huberman, A., Aguilar, M. B. & Quakenbush, L. S. (1995). A neuropeptide family from the sinus gland of the
Mexican crayfish, Procambarus bouvieri (Ortmann). Aquaculture, 135: 149-160.
2+
Knight, D. E. & Koh, E. (1984). Ca and cyclic nucleotide dependence of amylase release from isolated rat
pancreatic acinar cells rendered permeable by intense electric fields. Cell Calcium, 5: 401-418.
Kono, M., Wilder, M. N., Matsui, T., Furukawa, K., Koga, D. & Aida, K. (1995). Chitinolytic enzyme activities
in the hepatopancreas, tail fan and hemolymph of kuruma prawn Penaeus japonicus during the molt
cycle. Fish. Sci., 61(4): 727-728.
Kummer, G. & Keller, R. (1993). High-affinity binding of crustacean hyperglycemic hormone ( cHH) to
hepatopancreatic plasma membranes of the crab Carcinus maenas and the crayfish Orconectes
limosus. Peptides, 14: 103-108.
Lowry, O. M., Rosbrougt, M. J., Farr, A. L. & Andrandall, R. J. (1951). Protein measurement with Folin
Phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 267-275.
O’doherty, J. & Stark, R. J. (1982). Stimulation of pancreatic acinar secretion: increases in cytosolic calcium
and sodium. Am. J. Physiol., 242: G513-521.

218
Santos, E. A. & Stefanello, T. M. (1991). The hemolymph of Chasmagnathus granulata Dana, 1851
(Decapoda-Grapsidae) as a target tissue of crustacean hyperglycemic hormone. Braz. J. Med. Biol.
Res., 24(3): 267-270.
Sedlmeier, D. (1988). The crustacean hyperglycemic hormone (CHH) releases amylase from the crayfish
midgut gland. Regulatory Peptides, 20: 91-98.
Sefiani, M., Le Caer, J. P. & Soyez, D. (1996). Characterization of hyperglycemic and molt-inhibiting activity
from sinus glands of the penaeid shrimp Penaeus vannamei.. Gen. Comp. Endocrinol., 103(1): 41-
53.
Soyez, D., Van Herp, F., Rossier, J., Le Caer, J-P., Tensen, C. P. & Lafont, R. (1994). Evidence for a
conformational polymorphism of invertebrate neurohormones. J. Biol. Chem., 269: 18295-18298.
Toullec, J. Y., Chikhi, M. & Van Wormhoudt, A. (1992). In vitro protein synthesis and amylase activity in F
cells from hepatopancreas of Palaemon serratus (Crustacea; Decapoda). Experientia, 48: 272-277.
Van Harreveld, A. (1936). A physiological solution for fresh water crustaceans. Soc. Exp. Biol. Med. Proc., 34:
428-432.
Van Herp, F.; Van Wormhoudt, A.; Van Venroy, W. A. J. & Bellon-Humbert, C. (1984).
Immunocytochemical study of crustacean hyperglycemic hormone in the eyestalks of prawn
Palaemon serratus (Pennant) and some other palaemonidae, in relation to variation in the blood
glucose level. J. Morphol., 182: 85-94.
Van Wormhoudt, A., Ceccaldi, H. J. & Le Gal, Y. (1972). Activité des proteases et amylases chez Penaeus
kerathurus : existence d'un rythme circadien. C. R. Acad. Sc. Paris, 274: 1208-1211.
Van Wormhoudt, A. (1980). Regulation d’activité de l’α-amylase à diiférentes températures d’adaptation et en
fonction de l’ablation des pédoncules oculaires et du stade de mue chez Palaemon serratus.
Biochem. Syst. Ecol., 8: 193-203.
Van Wormhoudt, A., Van Herp, F., Bellon, C., Ceccaldi, H. J. & Keller, R. (1984): Changes and Crustacean
hyperglycemic hormone in Palaemon serratus (Crustacea, Decapoda, Natantia) during the different
steps of purification. Comp. Biochem. Physiol., 79B(31): 353-360.
Vogt, G. (1994). Life-cycle and functional cytology of the hepatopancreatic cells of Astacus astacus
(Crustacea, Decapoda). Zoomorphology, 114: 83-101.
Vonk, H. J. (1960). Digestion and metabolism. In: Physiology of Crustacea. Vol. I. Metabolism and growth
(Edited by Waterman T. H.) Academic Press. N. Y.,: 291-316.
Webster, S. G. (1986). Neurohormonal control of ecdysteroid biosynthesis by Carcinus maenas Y-organs in
vitro, and preliminary characterisation of the putative molt-inhibiting hormone (MIH). Gen. Comp.
Endocrinol., 61(2): 237-247.
Yasuda, A.; Yasuda, Y.; Fujita, T. & Naya, Y. (1994). Characterisation of crustacean hyperglycemic hormone
from the crayfish (Procambarus clarkii): Multiplicity of molecular forms by stereoinversion and diverse
function. Gen. Comp. Endocrinol., 95: 387-398.

219