CARACTERIZACION Y OBTENCION DE ENZIMA ALFA AMILASA POR MEDIO DEL METODO DE COLOR FIJO Y TIEMPO VARIABLE 1.

OBJETIVOS

y y

Caracterizar la presencia de alfa amilasa presente en la malta de cebada. Conocer y aplicar el mtodo de color fijo tiempo variable para la determinacin de alfa amilasa Conocer los diferentes aplicaciones de la alfa amilasa par a la produccin industrial.

2. INTRODUCCION En todos los procesos vitales estn implicadas la enzimas, las actividades que desempean son sumamente importantes y de una diversidad tal que van desde el mantenimiento de la vida y su propagacin hasta la utilizacin de recursos naturales, la obtencin de alimentos, la produccin de alimentos, la produccin de medicamentos, el tratamiento de residuos domsticos e industriales y otras aplicaciones en muy diversos campos. Las enzimas pueden ser obtenidas a partir de microorganismos, tejidos animales o de las plantas. La cebada es una materia prima importante en la elaboracin de cerveza para algunos pases en va de desarrollo como Mxico y algunos ya desarrollados como la Comunidad Europea, estados Unidos y Canad, este cereal se utiliza en la elaboracin de malta y para consumo animal. Para la utilizacin de la cebada por la industria Maltera, este cereal debe reunir ciertos parmetros en el grano a fin de obtener malta de buena calidad. En la malta para ser utilizada como materia prima en la fabricacin de cerveza, una de las especificaciones que tiene mayor relevancia es el contenido de alfa amilasa, la cual esta presente en el grano de cebada en cantidades poco apreciables pero aumenta su proporcin en forma significativa en la germinacin que ocurre durante el proceso de malteo. Esta enzima acta sobre las molculas de almidn gelatinizado y rompiendo la capa de amilopectina (a-D glucosa) en los enlaces glucosidicos a1-4, reduciendo las estructuras a dextrinas y de manera mas lenta es capaz de producir maltosa. La cuantificacin de la alfa amilasa en malta se lleva a cabo en lneas de generaciones avanzadas de cebada con el fin de verificar el potencial diasttico y de produccin de malta de calidad En el presente trabajo se evalo el mtodo Tiempo fijo y color variable (Figueroa 1985)para determinar la actividad de la enzima utilizando la disminucin de la capacidad del almidn para formar la coloracin azul caracterstico con el yodo, adems de la disminucin de la viscosidad de la suspensin de almidn.

3. MARCO TEORICO 3.1. - amilasa

Cataliza la hidrlisis al azar de los enlaces -1, 4 glucosidicos de la regin central de la cadena de amilosa y amilopectina, exceptuando las molculas cercanas a la ramificacin, obteniendo como resultado maltosa y oligosacaridos de varios tamaos (Cruger y Cruger, 1933). Esta enzima tiene un pero molecular de 50.000 Daltons, es estable a pH 5.5-8.0 con actividad optima de 5.9. las -amilasas son enzimas dependientes de calcio, aunque el catin no este integrado en el centro activo de la enzima, se encuentra fuertemente unida a la enzima y solo puede ser removidos a pH bajos por el uso de agentes quelantes. La completa remocin del calcio conlleva a una prdida total de actividad (Pedroza, 1999). Se cree que el calcio Ca2+ estabiliza la conformacin global de la enzima, encontrndose hasta 10 iones por molcula de enzima (GodFey y Reinchelt, 1993). La importancia radica en que mantiene la molcula de la enzima en la configuracin ptima para generar una mxima actividad y estabilidad. A menudo se nombra la -amilasa como una enzima licuante, debida a su rpida accin para disminuir la viscosidad de las soluciones de almidn (Pedroza, 1999). La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminucin de la capacidad de la solucin de almidn para forma el color azul caractersticos con el yodo o midiendo las disminucin de la viscosidad de la suspensin de almidn (GodFey y Reinchelt, 1993). Las principales aplicacin de la enzima extracelulares que degradan el almidn consisten en la conversin del almidn en jarabes que contienen glucosa, maltosa y oligosacarido, en la produccin de azucares fermentables en cervecera y en la obtencin de bebidas alcohlicas y en la modificacin de la harina de panadera 3.2. Cebada Malteada

Se entiende exclusivamente por cebada malteada o malta de cebada sometido a germinacin parcial y posterior deshidratado y/o tostado en condiciones tecnolgicas adecuadas. El malteado es la germinacin controlada de la semilla, seguida por su desecacin tambin controlada, durante este se considera a la semilla de cebada como un sistema complejo fisiolgico donde los principales procesos son la sntesis de enzimas amiloliticas y proteolticas y la degradacin de las estructuras del endospermo. El objetivo del malteado es producir alta actividad enzimtica, con una mnima prdida de peso seco. El grano seleccionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo y estar libre de pajas, granos rotos y hongos (Hoseney, 1991) La actividad durante el malteado de estas enzimas es sorprendentemente limitada, ya que durante ste se solubiiiza de un 15 a un 18% del almidn del endospermo, del que difunde al embrin, para procesos respiratorios y biosintticos (un 11-12%). Slo un 4- 6% se convierte en azcares simples y en dextrinas; (Hough, 1990; Nagadawithma and Reed, 1993).

3.3.

Proceso De Malteo

El malteo es un proceso fisico qumico controlado en el cual se busca producir alta actividad enzimtica con el sabor caracterstico y con la prdida mnima de peso seco. La filidad de este es la obtencin de malta, la cual puede ser de cualquier cereal que se someta a una germinacin controlada, seguida por su desecacin tambin controlada. El grano selecionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo y estar libre de pajas y granos rotos y relativamente libre de mohos (Hoseney, 1991). Es muy importante que la cebada a transformarse en malta rena ciertas condiciones de las que depender en gran parte la cantidad y calidad de los productos a obtener. Una buena cebada con destino a la produccin de malta debe tener una alta capacidad genninativa, mayor del 90%, gran contenido en almidn y bajo en nitrgeno, cscara finamente reticulada, aspecto harinoso, color amarillo plido uniforme, no contener granos rotos y ausente de olor mohoso (Kent, 1994). La obtencin de malta se logra sometiendo al grano de cebada a tres operaciones: remojo, germinacin y secado en donde se controla la temperatura, humedad y aireacin. 3.3.1. Remojo Es el proceso que tiene como objetivo fundamental introducir agua dentro del grano a una temperatura determinada y una adecuada oxigenacin, eliminando as los inhibidores de la germinacin, sustancias naturales que se encuentran en la cascarilla. La cebada limpia se coloca en agua hasta que su humedad se incremente aproximadamente hasta un 45%, el tiempo vara entre las 36 y 48 horas dependiendo de la temperatura del agua, de la hura de la cascarilla y de la estructura interna del grano. En esta etapa se disuelven las sustancias solubles que se encuentran en el grano y promueven el desarrollo del embrin. En esta fase, las sustancias nutritivas son transportadas por smosis al embrin, el cual disgrega las hormonas que activan los sistemas enzimticos destinados a Hidrolizar substancias insolubles y convertirlas en solubles y asimilables (Figueroa, 1985; Hoseney, 1991 y Molina C., 1991). 3.3.2. Germinacin La germinacin es un proceso bioqumico en el cual el grano comienza acelerar sus actividades biolgicas cuando existen condiciones apropiadas de humedad, temperatura y oxigenacin. Una vez que el grano ha absorbido la cantidad necesaria de agua, dispone de oxgeno y est a la temperatura conveniente, el embrin pasa del estado de vida latente a un estado de actividad e induce la secrecin de enzimas que se difunden por todo el endospermo y desdoblan el almidn, las protenas, los fosfatos orgnicos, las grasas, etc.. En la base del grano empiezan aparecer las rakillas, mientras se va desarrollando la plmula, que se dirige hacia el extremo y en el interior empieza a producirse la disolucin de las paredes celulares. Como consecuencia de esta disolucin el endospermo se vuelve friable, y a este fenmeno se le llama desagregacin de la malta. El desarrollo del embrin durante la germinacin, la formacin de raicillas que posteriormente se pierden y la combustin de una parte de los hidratos de carbono como consecuencia de la respiracin del grano, provocan una merma que se debe reducir a lo indispensable. Por esta razn el maltero deber escoger el momento de detener la germinacin; si sta es demasiado corta, la merma ser pequea, pero la desagregacin puede no ser suficiente, y si es demasiado larga, la malta estar bien desagregada, pero la merma ser antieconmica. El objetivo de la germinacin es conseguir la mnima cantidad de crecimiento que produzca el mximo rendimiento de malta de alta actividad enzimtica, aunque esta actividad depende de la variedad de cebada. La germinacin se realiza en camas, aqu el grano se mantiene con 42 a 45% de humedad durante 5 das como mximo. Como regla general el proceso de germinacin se termina cuando el acrospiro alcanza 2/3 de la longitud del grano. El

producto de la etapa de germinacin es la malta verde. (Figueroa, 1985; Bnggs D.E., et.al., 1981; Hoseney, 1991 y Molina, 1991). 3.3.3. Secado El objetivo de este proceso es acondicionar al grano para una molienda apropiada que proporcione altos rendimientos de sustancias extractables, as como la estabilizacin de la actividad enzimtica para el buen almacenamiento de la malta, como tambin el desarrollo de color, sabor y aroma,. evitando al mismo tiempo el rompimiento y vitrosidad del grano (Figueroa, 1985) 3.4. Mtodos para determinar la actividad de aifa amilasa Existen muchos mtodos disponibles para la determinacin de la actividad alfa amilsica. Estos mtodos incluyen viscometra, tincin de substrato, turbidometra, fluorometra, colorimetra, dision de gel. Al seleccionar un mtodo se toma en cuenta la rapidez simplicidad, costo, especificidad, sensibilidad y aceptabiiidad. Normalmente uno o ms de estos criterios deben ser cumplidos dependiendo de los requerimientos de uso.

3.4.1. Viscometra El descenso del nmero de Hagberg (Hagberg 1961, citado por Kuger ,et.al. , 1991). Este mtodo y el mtodo del amilogrfo se conocen como mtodos autolticos en los cuales el substrato por la enzima es el almidn con el cual la enzima esta asociada. Esta prueba es normalmente hecha en trigo o arroz molido. Viscosidad de Tipples. Se emplea un viscosimtro simple que consta de un tubo en forma de U, en este se determina el decremento de la viscosidad del almidn gelatinizado. El mtodo es sensitivo y solo en granos de trigo puede ser analizado. Desafortunadamente B amilasa interfiere con el mtodo. 3.4.2. Substrato hmedo Este mtodo utilizado para la cuantificacin de aifa amilasa se basa en el uso de un enlace cruzado. insoluble, el substrato enlazado al almidn da una tincin azui, el que dan un color azul, el cual puede ser detectado visualmente o con colormetro o rompimiento de este substrato cataliza alfa amilasa liberando productos de la reaccin liberando productos de la reaccin que dan un color azul, el cual puede ser detectado visualmente o con colormetro o espectofotmetro. La cantidad de color azul formado es proporcional a la cantidad de color azul formado es proporcional a la cantidad de enzima. La desventaja de esta tcnica es que no da informacin precisa del contenido de alfa amilasa indicando nicamente baja, media y altas concentraciones enzima. La desventaja de esta tcnica es que no da informacin precisa del contenido de alfa amilasa indicando nicamente baja, media y altas concentraciones. 3.4.3. Turbidometra El mtodo turbidmetro (nefelomtrico) emplea un analizador de amilasa, en donde la enzima se extrae del cereal y se coloca en una suspensin turbia. La turbidez de la suspensin disminuye conforme se da la degradacin enzimtica, y la dextrina es determinada despus de 1 2 minutos de incubacin a 37C.

3.4.4. Prueba colorimtrica con yodo En esta prueba el grado de decremento yodo-dextrina es evaluado mediante uno u otro color fijo en el punto final o a diferentes tiempos de reaccin.Ya que este mtodo comprende el tiempo consumido parece ser usado en recientes aos en favor de mtodos simples. 4. METODOLOGIA 4.1. Proceso de malteo Se pesaron 80 g de sebada base seca y se pusieron a remojar por un promedio de 60 horas a 16 C, cambiando el agua diariamente y oxigenando el material durante 1 hr. Una vez finalizado el tiempo de remojo, la muestra se retiro y se colo en papael absorvente, se ajusto su pero a 45% de humedad mediante adicion de agua destilada. 4.1.1. Germinacion Las muestras con 45 % de humedad en peso, llevaron a germinacin a una temperatura de 18 C, una vez que el acrospiro alcanzo de a de la longitud del grano se detuvo la germinacin. Esta se alcanzo en cinco das. 4.1.2. Secado Al termino de la germinacin las muestras se colocaron en recipientes y se dejaron dejaron secar naturalmente. 4.2. Humedad de la malta Se determin la humedad en estufa a 135C por media hora en la muestra como especifica Figueroa (1985). 4.3. Anlisis del contenido de alfa amilasa Para la determinacin de alfa amilasa el mtodo empleado fue el mtodo de color fijo y tiempo variable (ASBC, 1992 y Figueroa, 1985). En este mtodo los reactivos son como se describen en Malt-7 ASBC (1992). Substrato buffer lmite dextrina (alfa amilo dextrina). Preparar una suspensin de 5 g de almidn especial base seca en 50 mL de agua fra y lentamente vaciar dentro de 150 mL de agua hirviendo. Hervir con agitacin por 1 2 minutos, enfriar a temperatura ambiente, adicionar 12.5 mL de solucin buffer y 0.125 g de -amilasa disuelta en una pequea cantidad de agua. Hacer una solucin de almidn a 250 mL con agua destilada saturada con tolueno y almacenar o mantener a 20C por no menos de 18 horas y no ms de 72 horas despus de preparado. Solucin buffer. Disolver 164g de acetato de sodio anhidro en agua. Adicionar 120 ml, de cido actico glacial y diluir la solucin a 1 litro.

Solucin de cloruro de sodio 0.5%. Disolver 5 gramos de cloruro de sodio en 1 litro de agua. Solucin stock de yodo. Disolver 5.50 gramos de cristales de yodo y 11 gramos de yoduro de potasio en agua y diluir la solucin a 250 mL. Solucin de yodo diluida. Disolver 20 gramos de yoduro de potasio en agua destilada, adicionar 2 mL de solucin de stock de yodo y diluir la solucin a 500 mL. Los equipos empleados en cada mtodo se muestran en el Cuadro 1. . METODO COLOR FIJO Y TIEMPO VARIABLE Bao a temperatura constante 20 C. Comparador de color. Balanza. Tubos de ensayo 13 x 100 ml. Matraces Erlenmeyer de 125 ml. Matraces volumtricos de 100 ml. Embudos de 20 cm. Pipetas de 1, 5, 20 y 100 ml. Papel filtro de 18.5 cm. Cronometro. Una vez tenido todo lo necesario para trabajar se procedo a experimentar por ambos mtodos simultneamente como se muestra en los cuadro 2:

Cuadro 2. Procedimiento para el anlisis de alfa amilasa (Figueroa, 1985) Preparacin de la Pesar 5 gr. De malta. Temperatura constante 20 infusin de maltaAgregar 100 ml de C. cloruro de calcio. cloruro de sodio al 0.5 %. Poner a bao Mara durante 2.5 horas. Agitar cada 20 minutos. Filtrar y regresar los primeros 25 ml de filtrado. Tomar 10 ml y diluir con cloruro de calcio 0.2 % a 100 ml. Preparacin de Colocar 20 ml de la Ajustar la temperatura a substrato solucin substrato en un 20C. matraz Erlenmeyer. Preparacin de Medir 5 ml de solucin de indicador. yodo diluir y colocarlos en un tubo de ensayo.

Dextrinizacin.

Tomar 5ml de la Mantener a temperatura infusin de malta cloruro constante de 20 C. de calcio. Transferirlos al matraz que tiene el substrato. Tomar el tiempo. A los 5 minutos tomar 1 ml y colocarlo en el tubo de ensayo y agitarlo. Comparar la coloracin con el color estndar. Muestrear cada minuto si la coloracin obtenida antes no es igual. Anotar el tiempo en el que se obtuvo el mismo color. El clculo para este mtodo se hace con la siguiente frmula:

Donde: UD a 20C= Unidades de dextrinifcacin a 20C. T= Tiempo en minutos en el que se obtuvo la Dextrinizacin. H= Humedad en la malta

5.

RESULTADOS

Resultados obtenidos de la determinacin cualitativa por color.

El tiempo 22 minutos fue cuando la muestra alcanzo una coloracin parecida a la del blanco.

Resultados obtenidos en la cuantificacin de alfa amilasa en malta Muestra Cebada malteada Tiempo (min.) 22 % Humedad 7,6 U.D. (BS) 23,61

El contenido de alfa amilasa debe ser de 35-50 unidades de dextrinizacin (U.D.), deacuerdo a las especificaciones cerveceras. En este saco el valor obtenido fue de 28.86 U.D, este valor indica el bajo contenido de a-amilasas, debido tambin al genotipo diferente de cebada que fue empleada para la obtencin de la malta. 6. CONCLUSIONES

7.

BIBLIOGRAFIA

1.-Crueger, W., y Crueger, A. 1993. Biotecnologia: manial de microbiologa industrial. Editorial acribia. Zaragoza, Espaa 213-231 p 2.-Hoseney, R. C. 1991. Principios de ciencia y tecnologa de los cereale. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. 23-106 p. 3.-Hough, J.S, 1990. Biotecnologia de la cerveza y de la malta. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza. Espaa. 9-154 p. 4.-L. Carolina Espitia. R. 2009. Determinacin De La Concentracin De Alfa Amilasa Y Beta Amilasas Industriales En La Produccin De Etanol A Partir De Almidn De Cebada Empleando Sacharomyces cereviceae. Trabajo de grado para obtener titulo de Microbiologa industrial. Pontificia Universidad Javeriana Facultada de Ciencias. Bogota, Colombia.

ANEXOS

PROCEDIMIENTO PARA EL ANALISIS DE ALFA AMILASA

Preparacin de la infusin de malta-cloruro de sodio

 5gr. de malta molida fina  100mL de NaCl 0,5%  Bao maria: 2,5hr (agita c/20min).  Filtrar y regresar los primeros 25mL de filtrado.  Toma 10mL y diluir con CaCl2 0,5% en 100mL

Preparacin del sustrato

 20mL de la solucin sustrato

Preparacin del indicador

 5mL de solucin de Yodo diluido y colocarlos en tubos de ensayo

Dextrinizacion

 5mL de la solucin de malta-cloruro de calcio.  Transferirlos al matraz del sustrato.  A los 14min colocar en un tubo y agitarlo.  Comparar la coloracin con el color estndar.