Manual de Microbiología - QFBS 025L

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
VICERRECTORÍA DE DOCENCIA
DIRECCIÓN DE EDUCACIÓN SUPERIOR
Facultad de Ciencias Químicas
Manual de Microbiología General
2016
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Vicerrectoría de Docencia
Dirección de Educación Superior
PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Químico Farmacobiólogo
ÁREA: Ciencias Microbiológicas
ASIGNATURA: Laboratorio de Microbiología
CÓDIGO: QFBS025L
CRÉDITOS: 7
FECHA: 2021
2
PE: Licenciatura en Químico Farmacobiólogo
“El presente documento es Propiedad Intelectual de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, conforme a lo previsto en el
artículo 8 de su Ley y 137 del Estatuto Orgánico Universitario. La utilización del mismo, es para uso exclusivo de la Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla y los integrantes de la comunidad universitaria, en cumplimiento de los fines de docencia,
investigación y extensión de la cultura. Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de su contenido o cualquier uso,
distintos a los señalados en el párrafo anterior”.
1. DATOS GENERALES
Nivel Educativo: Licenciatura
Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Químico Farmacobiólogo
Modalidad Académica: Presencial
Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Microbiología
Ubicación: Nivel Básico

Correlación:
Asignaturas Precedentes: S/R
Asignaturas Consecuentes: Microbiología Médica Diagnóstica, Inocuidad

Microbiana de los Alimentos, Bacteriología Médica,
Microbiología Ambiental, Seguridad Alimentaria
2. CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE

TOTAL DE HORAS
CONCEPTO HORAS POR SEMANA
POR PERIODO
Horas prácticas 3 54
3. REVISIONES Y ACTUALIZACIONES
D.E.D. Ana Bertha Escobedo López
M.S.P Carlos Cabrera Maldonado
M.S.P. María de la Cruz Meneses Sánchez
Autores:
D.C. Alma López García
M. C. Alejandro Ruiz Tagle
D.E.D. Claudy Lorena Villagrán Padilla
Fecha de diseño: 2016
Fecha de la última actualización: 2021
Fecha de aprobación por parte
de la academia de área,
departamento u otro.
3
D.C. Alma López García

M.C. Alejandro Ruiz Tagle
Revisores: M.S.P. Carlos Cabrera Maldonado
M.S.P. María de la Cruz Meneses Sánchez
D.E.D. Ana Bertha Escobedo López
Se implementaron las Prácticas 1, 5, 13 y 16
Se actualizó en gran parte el contenido de las
Sinopsis de la revisión y/o prácticas existentes
actualización: Se actualizaron los cuestionarios de todas las
prácticas
Se actualizó toda la bibliografía
4. PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA

ASIGNATURA:
Disciplina profesional: Químico Farmacobiólogo, Químico Biólogo
Parasitólogo o área afín
Nivel académico: Licenciatura, preferentemente Maestría o
Doctorado en el área de la Microbiología
Experiencia docente: Mínima cinco años en el área de microbiología
Experiencia profesional: 3 años en el área de Microbiología
5. PROPÓSITO:
Proporciona un panorama amplio y general de los microorganismos estableciendo las
diferencias estructurales, fisiológicas, bioquímicas, de crecimiento y genéticas de cada
uno de ellos. Establece los fundamentos teórico-metodológicos mediante el curso teórico
y sesiones de laboratorio para el trabajo básico del Q.F.B. en su desempeño como futuro
profesionista respetando la vida biológica y el medio ambiente.
6. COMPETENCIAS PROFESIONALES:
Valora las principales contribuciones de los científicos en el desarrollo y evolución de la
microbiología; así como las aportaciones de la microbiología a otras áreas de
conocimiento y sus aplicaciones biotecnológicas.
Analiza los criterios y características principales que se utilizan para la clasificación,

nomenclatura e identificación de microorganismos, principalmente los de interés
ambiental, sanitario y clínico.
Emplea de forma adecuada los métodos de uso en el laboratorio de microbiología

para esterilización, descontaminación; desinfección, asepsia y antisepsia, y comprender
las imitaciones de los mismos. Selecciona de forma adecuada diferentes medios de
cultivo conforme a su composición, clasificación y usos, para el aislamiento de
microorganismos, en condiciones in vitro y utiliza las diversas propiedades bioquímicas
para su identificación. Aplica diversas técnicas para el aislamiento, cultivo y observación y
4
recuento de microorganismos; a partir de muestras problema e interpreta los resultados

de forma correcta.
Determina la influencia del medio ambiente en el desarrollo de los microorganismos,

observa y cuantifica el desarrollo de un cultivo incubado en diferentes condiciones de
temperatura y de medios de cultivos gelificados y líquidos e interpreta los resultados
correctamente.
Realiza tinciones diferenciales para la observación microscópica de muestras fijadas

y posterior clasificación del microorganismo: tinción de Gram, tinción de esporas (verde
malaquita), tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen) e interpreta los resultados
correctamente.
Emplea pruebas bioquímicas, entre las que se incluye el crecimiento del

microorganismo problema en muy diversos medios de cultivo que pondrán de manifiesto
peculiaridades de su metabolismo / fisiología e interpretar correctamente los resultados
con objeto de la clasificación e identificación.
Analiza los componentes celulares de los microorganismos; su bioquímica, estructura

y función, así como las propiedades básicas de su metabolismo, fisiología y reproducción
que se emplean para su clasificación e identificación.
Analiza los fundamentos de los mecanismos de virulencia de los microorganismos,

así como los aspectos fundamentales de la organización de los genomas de bacterias y
las generalidades de los mecanismos de transferencias de material genético que éstas
poseen.
Aplica las normas nacionales e internacionales vigentes en materia de

regulación sanitaria y ambiental, de aplicación en el laboratorio, para el adecuado
manejo de material biológico y sustancias químicas; incluyendo seguridad,
manipulación y disposición de residuos peligrosos y el registro de actividades.
5
7. CONTENIDOS TEMÁTICOS
NÚMERO DE
CONTENIDO TEMÁTICO BIBLIOGRAFÍA
PRÁCTICA
Lara-Villegas, HH., Ayala-Núñez, NV.

Rodríguez-Padilla, C. (2008). Bioseguridad
en el laboratorio: medidas importantes para
el trabajo seguro. Bioquímica, 33(2): 59 –
70.
Practica 1 Seguridad en el Laboratorio Secretaría de Salud. Norma Oficial

Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002.
Protección ambiental. Salud ambiental.
Residuos peligrosos infecciosos.
Clasificación y especificaciones de manejo.
Diario Oficial de la Federación. 17 de
febrero de 2003.
Madigan, M. T., Martinko, J. M., Bender, K.

S., Buckley, D. H., & Sathl, D. A. (2015).
Práctica 2 Observación de grupos microbianos
Biología de los Microorganismos (14 ed.).
España: Pearson.

Práctica 3 Microscopio
España: Pearson.
Prats, G. (2013). Microbiología y
Preparación de material y medios de
Práctica 4 Parasitología Médicas (3 ed.). España:
cultivo
Panamericana.
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2016).
Práctica 5 Esterilización Microbuology an Introduction (12 ed.). USA:
Pearson
Wiley, J., Sherwood, L. M., & Woolverton, C.
Práctica 6 Técnicas para recuento de bacterias J. (2016). Prescott's Microbiology (10 ed.).
USA: Mc Graw Hill
Brooks, G. F., Butel, J. S., Carroll, K. C.,
Aislamiento de microorganismos por Morse, S. A., & Mietzner, T. A. (2016).
Práctica 7
estría cruzada Jawetz,Melnick y Adelberg Microbiología
Médica (27 ed.). México: Mc Graw Hill.
6

Práctica 8 Morfología colonial
España: Pearson.
Empleo de tinciones en el laboratorio
Práctica 9 de Microbiología
España: Pearson.
Efecto de los factores físicos Prats, G. (2013). Microbiología y
Práctica 10 sobre el crecimiento de los Parasitología Médicas (3 ed.). España:
microorganismos Panamericana.
Efecto de los agentes químicos Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2016).
Práctica 11 sobre el crecimiento de los Microbuology an Introduction (12 ed.). USA:
microorganismos Pearson.
Crecimiento de microorganismos Wiley, J., Sherwood, L. M., & Woolverton,
Práctica 12 gramnegativos en diferentes C. J. (2016). Prescott's Microbiology (10
medios de cultivo ed.). USA: Mc Graw Hill
Cowan y Steel. 1988. Manual para la
identificación de bacterias de interés
médico. Editorial Panamericana.
Winn, C., Allen, D., Janda, M., Koneman,

W., Procop, W., Schereckenberg, C., &
Woods, L. (2006). Koneman Diagnóstico
Microbiológico. Argentina: 6th ed Editorial
Seminario: Pruebas bioquímicas Médica Panamericana
Práctica 13 para bacterias gramnegativos y
positivos Brooks, G. F., Butel, J. S., Carroll, K. C.,
Morse, S. A., & Mietzner, T. A. (2016).
Jawetz,Melnick y Adelberg Microbiología
Médica (27 ed.). México: Mc Graw Hill.
MacFaddin J.F. (2003). Pruebas

bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica. (3 ed.).
Editorial Médica Panamericana S.A.
BrocK Biología de los Microorganismos (14
ed.). España: Pearson.
Pruebas bioquímicas para
Práctica 14
gramnegativos
bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica. (3 ed.).
7
Crecimiento de microorganismos Prats, G. (2013). Microbiología y

Práctica 15 grampositivos en diferentes medios Parasitología Médicas (3 ed.). España:
de cultivo Panamericana.

Pruebas bioquímicas para bioquímicas para la identificación de
Práctica 16
grampositivas bacterias de importancia clínica. (3 ed.).
8. ESTRATEGIAS, TÉCNICAS Y RECURSOS DIDÁCTICOS
Estrategias y técnicas didácticas Recursos didácticos
• Lluvia de ideas
• Representaciones gráficas (mapas • Textos y artículos científicos
mentales, conceptuales y cuadros • Materiales manipulativos: pizarrón
sinópticos) • Materiales audiovisuales:
• Grupos de discusión diapositivas, videos
• Solución de Problemas • Programas informáticos en línea
• Aprendizaje Basado en Problemas • Páginas Web, correo electrónico
• Presentaciones • Guía de aprendizaje basado en
• Búsqueda y recuperación de problemas
información a partir de base de • Material de cómputo y proyector
datos
• Aprendizaje basado en proyectos
9. EJES TRANSVERSALES
Eje (s) transversales Contribución con la asignatura
Promover dentro y fuera del aula un clima de
convivencia plural y responsable; con libertad de
Formación Humana y Social expresión y pensamiento buscando la equidad, sin
discriminación y respeto a los derechos de los
demás.
Se promoverá para el logro de los objetivos de
aprendizaje, que los productos académicos de los
Desarrollo de Habilidades en el uso
estudiantes sean diseñados a través de las TIC´s,
de las Tecnologías de la
utilizando los laboratorios de cómputo y
Información y la Comunicación
disciplinarios, bibliotecas, auditorios, plataformas
virtuales y áreas de esparcimiento.
Se promoverá la reflexión y toma de decisiones de
Desarrollo de Habilidades del
manera crítica, creativa, flexible, adaptativa y
Pensamiento Complejo
propositiva a partir de analizar y relacionar
8
elementos desde una visión compleja e

interdisciplinaria para generar alternativas de
solución de acuerdo a las necesidades de su
contexto y afrontar la incertidumbre.
Se implementarán estrategias para que el
estudiante desarrolle habilidades para comunicarse
Lengua Extranjera a través de la expresión oral y escrita en una
lengua extranjera y en la lengua materna, para la
comprensión de textos y/o artículos.
Desarrollar talentos de emprendimiento e
innovación para integrar y conducir equipos de alto
Innovación y Talento Universitario
desempeño con base a una metodología de
autoconocimiento y trabajo colaborativo
Se implementarán estrategias para desarrollar en
el estudiante las habilidades de investigación, con
el fin de mejorar las experiencias de aprendizaje,
Educación para la Investigación
generando una cultura de la indagación, el
descubrimiento y la construcción de nuevos
conocimientos.
10. CRITERIOS DE EVALUACIÓN (Criterio del docente)

Criterios Porcentaje
Exámenes
Participación en clase
Exposiciones
Tareas y actividades
Entrega de reportes
Total 100%
11. REQUISITOS DE ACREDITACIÓN

Estar inscrito como alumno en la Unidad Académica en la BUAP
Asistir al 100% de las sesiones para tener derecho a la calificación correspondiente al
laboratorio
Cumplir con las actividades académicas establecidas en el Syllabus correspondiente
En caso de no acreditar el laboratorio deberá cursar nuevamente la asignatura.
9
Práctica No. 1
Seguridad en el Laboratorio
Introducción
La seguridad al interior de un laboratorio es esencial. Cuando los estudiantes ingresan por
primera vez a los laboratorios de Microbiología, es muy común que todo lo que haya a su
alrededor le llame la atención, su curiosidad no tiene límites, empieza a tocar todo tipo de
superficies, materiales, abrir estufas bacteriológicas, cajas Petri y tubos de ensaye con
crecimiento bacteriano o fúngico, antes de que inicien las actividades, sin tener conciencia
de lo que significa el riesgo biológico.
Es importante recordar que todo proceso genera residuos, por mencionar algunos
ejemplos de la cotidianidad de manera rápida: los habitantes en una casa generan
sobrantes de comida (residuos orgánicos), residuos inorgánicos reciclables como papel,
botellas de vidrio o plástico, latas de aluminio, etc. En la industria sin importar su rubro, la
basura se separa en orgánica, plástico, vidrio, papel, metal, baterías, etc.
En los laboratorios clínicos al igual que en una casa se produce basura municipal y
los llamados residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI) provenientes de la
obtención de especímenes clínicos como algodones con sangre, muestras de sangre,
coágulos, líquidos corporales, exudados, orinas, materia fecal, espejos vaginales
desechables, material de vidrio roto, agujas, tubos, lancetas, portaobjetos, etc., además
de los materiales con que se procesan las muestras en las diversas secciones del
laboratorio.
Puntualmente, en el área de Microbiología después de concluida una práctica de

laboratorio, hay producción de RPBI como las placas con medios de cultivo y crecimiento
bacteriano, tubos con pruebas para ensayos de identificación fenotípica, etc. Estos
materiales no se pueden someter a un proceso de lavado común, como si fueran
utensilios de cocina de una casa o tirarlos junto con la basura municipal. Previamente
deben inactivarse para su lavado. En el caso de materiales reciclables como materiales de
vidrio (tubos con tapón de rosca, cajas Petri, etc.) deben inactivarse para su lavado
posterior o, en caso de ser de plástico desechables deben ser colocados en contenedores
especiales (bolsas rojas) y finalmente ser transportados por una empresa especializada
contratada para su destrucción final (incineración).
Todo el personal que trabaja en los laboratorios clínicos, institucionales, privados,

consultorios médicos, dentales, etc., incluidos los laboratorios de docencia, deben realizar
el manejo adecuado de los RPBI como lo determina la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 (SSA,
10
2003), y de esta manera dar cumplimiento con la Legislación Mexicana en materia de

salud y ambiente. Además, del uso prioritario del equipo de protección personal (bata,
guantes, cofia, cubrebocas y en la actualidad, la careta protectora), lavado de manos y
aplicación de gel antibacteriano.
La omisión de la consulta y lectura de la NOM-087-ECOL-SSA1-2002, por parte de los

alumnos, combinado con su inexperiencia o carencia de cultura en la prevención de
accidentes les harían incurrir de manera involuntaria en errores frecuentes, que pueden
ser motivo de una llamada de atención, un accidente de trabajo o una multa al
establecimiento donde laboren en el futuro y constituye un riesgo para los alumnos
durante su permanencia en estos sitios.
Objetivo
Conocer los riesgos que implica el trabajo en el laboratorio de Microbiología, así como las
medidas de seguridad que debe implementar para evitar infectarse con algún agente
patógeno.
Material
Equipo de protección personal
Botiquín, extintor, manta ignífuga
Llaves de paso de agua, gas, contactos eléctricos
Equipos de laboratorio (microscopios, autoclaves, horno eléctrico, estufa bacteriológica,
baño María, balanzas granatarias, etc.
Reglamento Interno de Laboratorio de Microbiología
Manual de prácticas de laboratorio
Desarrollo
1. Ingresa al laboratorio con equipo de protección personal (bata, cofia, guantes,
cubrebocas, lentes de seguridad o careta y mantener sana distancia)
2. Atiende las indicaciones del docente sobre el Reglamento Interno de Laboratorio de
Microbiología y las de Protección Civil Universitaria
3. Guarda los útiles escolares en los sitios reservados para este fin.
4. Mantén los pasillos despejados
5. Ubica las salidas de emergencia en el laboratorio.
6. Ubica el botiquín, extintor y manta ignífuga
7. Ubica las llaves de paso de agua, gas, contactos eléctricos
8. Ubica los equipos de laboratorio (microscopios, estufa bacteriológica, horno eléctrico,
baño María, balanzas granatarias, etc.)
9. Ubica el material de vidrio (matraces, probetas, tubos de ensaye, etc.)
10 Ubica el almacén de los medios de cultivo
11. Ubica el área de inactivación y lavado de material
12. Ubica el sitio destinado para los RPBI en el laboratorio y el almacenamiento temporal
en el edificio
Cuestionario
11
1. ¿Qué precauciones generales se deben tomar en cuenta para ingresar al laboratorio de

microbiología?
2. ¿Por qué no es recomendable la aplicación de cosméticos, comer, beber, masticar
chicles, fumar en el laboratorio de microbiología?
3. Escribe 3 razones por las cuales no es conveniente que los alumnos realicen
experimentos sin la autorización del docente.
4. ¿A qué riesgos estarán sujetos los alumnos por el uso de bufandas, pulseras y otros
objetos en el laboratorio?
5. ¿Cuáles son los pictogramas que deben estar visibles en el laboratorio de
microbiología?
6. ¿Qué son las hojas de seguridad de los medios de cultivo y cuál es su utilidad en el
laboratorio?
7. ¿Cuántas y cuáles es son las partes que forman las hojas de seguridad en los medios
de cultivo?
8. Indica con número consecutivos del 1 al 6, las fases que deben seguirse en el manejo
de RPBI en los laboratorios de microbiología
( ) Almacenamiento temporal.
( ) Envasado de los residuos generados.
( ) Recolección y transporte externo.
( ) Disposición final.
( ) Tratamiento.
( ) Identificación de los residuos.
9. Define el concepto de establecimientos generadores de RPBI y cita 5 ejemplos
10. ¿En qué tipo de contenedores se deben colocar los siguientes materiales?
a) Materiales de curación con abundante sangre
b) Pieza quirúrgica
c) Coágulos sanguíneos y residuos de sueros
d) Material de laboratorio de vidrio roto
e) Cajas Petri con crecimiento bacteriano
12
Práctica No. 2
Observación de grupos microbianos
Introducción
La Microbiología estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su morfología,
función, relación con el ambiente y los métodos que nos llevan a su identificación. Los
estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas específicas de la
Microbiología, como son:
• Bacteriología (bacterias)
• Micología (hongos)
• Ficología (algas)
• Protozoología (protozoarios)
• Virología (virus)
El objeto de la Microbiología es determinado por la metodología apropiada para

poner en evidencia a los agentes microbianos y poder estudiarlos dependiendo de cuál
sea, está determinado por:
• Microscopio
• Técnicas de cultivo puro en laboratorio
La mayoría de estos pueden tener función Simbiótica con los seres huésped que
los alojan como en el caso de las bacterias del tracto intestinal (flora normal), que
ayudan a descomponer los alimentos y a facilitar su digestión, pero por otro lado tenemos
los que son perjudiciales a la salud llamados patógenos.
En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basándose en tres puntos

principales (ver fig. 1):
• Complejidad celular (procariontes y eucariontes)
• Complejidad tisular (unicelular, multicelular multinucleados)
• Nutrición (absorción, fotosíntesis, ingestión) los cuales son: Monera, Protista,
Fungí, Vegetal y Animal.
Reino Protista: Formado por organismos unicelulares, eucarióticos de nutrición diversa

que incluye la fotosintética, absortiva, ingestiva y combinaciones diversas de ellas. Se
incluye a los protozoos y helmintos, presentan un tamaño variable entre los 3 y los 1.000
micrómetros (ver fig. 2).
Reino Fungi: Comprende organismos unicelulares y multicelulares, eucarióticos, de

nutrición absortiva, a este reino pertenecen los Hongos. En cuanto a su tamaño es
variable, presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme. Los hongos
filamentosos son multicelulares, tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de
hifas es denominado MICELIO. Tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con
crecimiento radial. Estos están presentes en un 95%, teniendo un tamaño de 3 a 12 μm
de diámetro.
13
Figura 1. Árbol filogenético basado en datos de secuenciación de ARNr, que muestra la

separación de familias de bacterias, arqueobacterias y eucariotas. Tomado de Riedel et al, 2020
Los hongos levaduriformes son unicelulares, se caracterizan por su tipo de multiplicación

o división llamado GEMACIÓN. Algunos géneros forman el llamado pseudomicelio, las
colonias de levaduras son de aspecto cremoso. Su tamaño es similar al de los hongos
filamentosos, 3-10 μm de diámetro (ver fig. 2).
Reino Monera: Incluye organismos procariotes, unicelulares, de nutrición absortiva

aunque algunos son de nutrición fotosintética, a este reino pertenecen las Algas azul
verdosas y las Bacterias. Se reproducen por fisión binaria, pueden ser móviles por la
presencia de flagelos simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esféricas
(cocos), alargadas (bacilos), helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse en
pares, cadenas, racimos o tétradas, dependiendo del género, razón por la que su tamaño
puede variar entre los 0,1 y los 5 micrómetros (µm).(fig.2)
Un grupo importante de microorganismos son las archeas cuya forma fundamental

es diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en forma
cuadrangular, la característica principal de este grupo microbiano es su crecimiento,
requieren condiciones especiales extremas, como altas temperaturas o concentraciones
de sal.
14
Los virus no son considerados microorganismos porque son moléculas de ácido

nucleico (RNA o DNA) cubiertas por proteínas, pueden invadir células y replicarse dentro
de ellas. Según su simetría existen 4 tipos:
• Simetría helicoidal: Similar a cilindros. Pueden ser rígidos o flexibles

• Simetría icosaédrica: Poliedro regular con 20 caras triangulares (triángulos
equiláteros) y 12 vértices.
• Simetría mixta
• Simetría compleja
Figura 2. Tamaño de los microorganismos. Comparación de tamaño entre varios átomos, moléculas y
microorganismos. No está dibujado a escala. Tomado de: Pommerville, 2004
Objetivos
Observar y diferenciar a diferentes grupos microbianos, mediante la morfología y
agrupación usando microscopía óptica.
Observar diferentes crecimientos macroscópicos para su estudio de morfología colonial.
Material
Preparaciones fijas de bacterias, hongos y protozoarios.
Placas de cultivo con crecimiento de hongos y bacterias.
Tubos con parásitos
Microscopio óptico
15
Desarrollo
1. Realiza la observación microscópica y macroscópica de cada preparación
proporcionada, cultivos.
2. Dibuja tus observaciones.
Cuestionario
1. Menciona las diferencias morfológicas entre hongos y bacterias
2. Investiga y menciona la clasificación de los organismos del Reino Protista
3. Explica la importancia de los grupos microbianos
4. Menciona 5 virus con DNA y 5 virus con RN
5. Realiza un esquema (dibujos) donde coloques en forma ascendente en tamaño los
organismos observados
16
Práctica No. 3
Microscopio
Introducción
Para identificar un microorganismo desconocido, las primeras etapas importantes estriban
en determinar su forma, movimiento, reacciones de tinción y otras características visibles
todas las cuales requieren una clara visión de las células aisladas.
Aunque Leeuwenhoek pudo ver bacterias con amplificaciones muy pequeñas, la

microbiología moderna, analítica y diferencial requiere el empleo del microscopio óptico
que utiliza la luz visible, así como también de otros tipos de microscopio como son el de
luz ultravioleta, campo oscuro, fluorescencia, contraste de fase y electrónico este último
no emplea luz sino haces de electrones invisibles y puede ser de barrido y transmisión.
El microscopio óptico ha sido una herramienta básica para el desarrollo de la

microbiología como ciencia y sigue siendo un instrumento muy útil en la investigación
microbiológica.
Se compone de dos series de lentes (lentes del objetivo y lentes del ocular) que
funcionan conjuntamente para producir la imagen. Con este tipo de microscopio las
muestras se visualizan gracias a las diferencias de contraste entre ellas y el medio que las
rodea.
Las diferencias de contraste se producen porque las células absorben o dispersan la

luz a diferentes grados. Muchas células bacterianas son difíciles de observar bien con el
microscopio óptico debido a su falta de contraste con el entorno. Los microorganismos
pigmentados son una excepción, pues su color añade contraste y mejora la visualización
de las células.
Todos los microscopios utilizan lentes para aumentar la imagen de una célula de
modo que se puedan observar sus detalles estructurales. Además del aumento es
importante la resolución, propiedad que permite observar dos puntos adyacentes como
puntos separados.
Aunque el aumento se puede incrementar prácticamente sin límite, no ocurre lo

mismo con la resolución, que está limitada por las propiedades físicas de la luz. Por lo
tanto, es la resolución y no el aumento lo que en último término marca los límites de lo
que podemos ver.
La microscopia es la ciencia que se encarga de la investigación de las estructuras

pequeñas y se define como el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible
los objetos de estudio que por su pequeño tamaño están fuera del rango de resolución del
ojo humano. Para realizar una observación al microscopio se necesita tener una
preparación en fresco o un frotis.
17
Una preparación en fresco requiere de una solución que puede ser un colorante o
solución salina isotónica, portaobjetos y cubreobjetos, la observación se debe realizar con
el objetivo de 40x y se emplea en la observación de hongos y parásitos.
Un frotis o llamado también preparación fija debe ser teñido con colorantes los cuales
dependen de la técnica de tinción a seguir, ya sea que se quiera llevar a cabo una tinción
simple, diferencial o específica para observar una estructura en particular y se emplea
entre otras cosas para la observación de bacterias.
Objetivos
Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.
Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qué casos se recomienda una u
otra.
Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del aceite de
inmersión.
Material
Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc.
Colorantes para tinción:
Cristal violeta
Safranina
Azul de metileno
Microscopio y aceite de inmersión
Desarrollo
Bacterias del yogurt
1. Realiza el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de
agua.
2. Fija con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Tiñe con cualquiera de los colorantes proporcionados durante 1-2 minutos.
4. Observa al máximo aumento del microscopio.
5. Realiza los dibujos de cada observación
Bacterias del sarro dental

1. Con un palillo toma una pequeña porción de sarro dental y extiéndela en una gota de
agua sobre el portaobjetos.
2. Deja secar y fija con calor.
3. Tiñe de 2-3 min, lava el exceso de colorante y deja secar.
Bacterias del suelo

1. Deja parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta
2. Después de varios días, las bacterias se habrán adherido al vidrio y sólo habrá que
fijarlas por calor y teñirlas con cualquier colorante proporcianado. Previamente hay que
limpiar los bordes del portaobjetos, así como la parte que no se va a teñir.
18
Cuestionario
1. ¿Cuál es la función de cada parte del microscopio?
2. Define que es el poder de resolución de un microscopio
3. Menciona las partes del microscopio que constituyen el sistema mecánico, óptico y de
iluminación
4. ¿A qué se le denomina en microscopia índice de refracción?
5. ¿Cuál es la composición química del aceite de inmersión?
6. Completa la figura 3
Figura 3. Partes del microscopio.

Tomado de: Areaciencias, 2021
19
Práctica No. 4
Preparación de material y medios de cultivo
Introducción
En el laboratorio de microbiología es fundamental que se trabaje con material estéril como
recipientes, instrumental y medios de cultivo para que no exista un riesgo de
contaminación en los procesos a realizar principalmente en la(s) muestra(s) ya que con
esto se garantiza un buen trabajo en el estudio microbiológico que se realice. Dentro de
los recipientes e instrumentales están los matraces, vasos de precipitado, pipetas, etc.
éstos deben estar limpios antes de utilizarlos, de esterilizarlos y protegerlos (envoltura)
después para que no se contamine.
Los medios de cultivo en los que se harán crecer y desarrollar a los

microorganismos a estudiar se deben de garantizar su buena preparación y esterilización
para no tener una contaminación por microrganismos no deseados o inesperados en el
trabajo.
El medio de cultivo es un conjunto de componentes, sustrato o nutrientes que

crean las condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos
en el laboratorio, permitiendo observar su morfología colonial y microscópica.
El medio de cultivo es un conjunto de componentes, sustrato o nutrientes que

crean las condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos
en el laboratorio, permitiendo observar su morfología colonial y microscópica.
Los medios de cultivo para microbiología se fabrican de forma granulada o de

polvo, ambas presentaciones son higroscópicas, por lo que deben mantenerse
perfectamente cerradas y en ambientes secos. Su composición debe estar conformado de
agua, sales inorgánicas, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y metales que son
necesarios para los microorganismos, porque presentan diversidad bioquímica y
fisiológica, así como también hay microorganismos llamados auxótrofos que necesitan de
cierto nutriente para desarrollarse se denomina “factor de crecimiento”. Los medios de
cultivo son una parte importante en la investigación de laboratorio de rutina debido a que
permiten el aislamiento e identificación in vitro de los microorganismos, con fines tanto de
diagnóstico como educativo.
Los medios de cultivo se pueden clasificar con base al:

• Material gelificante que es el agar el más utilizado en microbiología, es un
polisacárido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas
que la mayoría de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. Por lo que
pueden ser:
•
Líquidos o caldos: no contienen agar
Semisólidos: 0.2-0.5% de agar
Sólidos: 1 a 2% de agar
20
• Función: la utilización de cada uno de ellos dependerá de las necesidades en el

laboratorio, por ejemplo, simples, diferenciales, selectivos, enriquecidos, transporte
y mantenimiento
Actualmente el trabajo requerido en la preparación de medios es ya simplificado,

mediante la utilización de medios deshidratados que se obtienen comercialmente, en las
variedades deseadas. Sólo es disolver una cantidad conocida (etiquetado) en un volumen
medido de agua, repartir en los recipientes necesarios (tubos de ensayo, matraces,
frascos, etc.) y esterilizar.
Objetivo
Aprender a preparar el material necesario para el uso en el Laboratorio de Microbiología
Aprender a preparar correctamente los diferentes medios de cultivo (líquido, semisólidos y
sólidos) para el uso en el laboratorio de Microbiología.
Material
Algodón
Cajas Petri estériles
Matraz Erlenmeyer
Pipetas
Mechero
Medios de cultivo en polvo
Probeta
Balanza
Espátula o cuchara
Parrilla de calentamiento
Guantes para calor
Aplicadores
Papel manila o de estraza
Desarrollo
1. Prepara diferentes materiales que se utilizan para el aislamiento de los
microorganismos.
2. La forma en la cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada etiqueta y
depende del fabricante. Leé detenidamente las instrucciones del fabricante, porque no
todos los medios de cultivo se esterilizan. Se recomienda lo siguiente:
Utiliza un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar (matraces o
vasos de precipitado)
3. Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejándolo
reposar unos 15 minutos.
4. Si es necesario calienta el medio, este calentamiento debe ser paulatino y agitando
continuamente, evita el calentamiento prolongado.
6. Si se preparó medio de cultivo para hacer placas se introduce el recipiente a la
autoclave tapado con tapón de algodón y una cubierta de papel
21
7. Si el medio es para tubos, vetirlo en ellos, taparlos (tapón algodón o rosca) y meterlos
en una rejilla o bote, taparlo y luego en la autoclave.
8. Procede a esterilizar el material y medios de cultivo para su posterior utilización.
9. Si en la etiqueta se especifica que no se debe de esterilizar el medio de cultivo, solo
debes vertirlo en las placas estériles y espera a que gelifiquen
Cuestionario
1. Menciona la clasificación de los medios de cultivo según su utilización
2. ¿Qué es el agar y que otros componentes debe tener los medios de cultivo?
3. ¿Qué punto consideras importante en la preparación del material a utilizar?
4. ¿Por qué algunos medios de cultivo no se deben de esterilizar?
5. ¿Por qué consideras que en algunos medios de cultivo preparados en tubos se utiliza
tapón de algodón y otros tapones de rosca?
22
Práctica No. 5
Esterilización
Introducción
Los procesos de esterilización y/o desinfección se llevan a cabo a diario tanto en los
laboratorios clínicos, farmacéuticos, de alimentos y por supuesto el de microbiología,
donde son fundamentales para evitar la contaminación de medios, cultivos, placas,
material de vidrio, etc. Además, en otros ámbitos tales como los hospitales, donde fallas
en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes. La esterilización
es indispensable realizarla en los medios de cultivo antes de utilizarlos para garantizar la
ausencia de microorganismos no deseados para solo cultivar a los que se van a trabajar o
aislar.
• Esterilización. - proceso que destruye o elimina todas las formas de vida

microbiana de un objeto o entorno, incluyendo esporas bacterianas altamente
resistentes y virus. Se trata de un término absoluto, donde un objeto está estéril o
no lo está, sin rangos intermedios.
• Desinfección. - proceso que elimina muchos o todos los microorganismos

patógenos reconocidos, excepto las esporas bacterianas de un objeto o entorno.
Es un término relativo, donde existen diversos niveles de desinfección, desde una
esterilización química, a una mínima reducción del número de microorganismos
contaminantes. Estos procedimientos se aplican únicamente a objetos inanimados.
Los métodos de esterilización pueden ser evaluados a través de agentes físicos

(termopares y termómetros), químicos (cinta testigo) y biológicos (ampolletas conteniendo
esporas bacterianas).
Dentro de los procesos físicos para la esterilización se encuentra el calor (húmedo

y seco), la filtración, las radiaciones, ultracentrifugación y ultrasonido. Dependiendo de la
naturaleza del material (ya sea termorresistente o termolábil) se deberá elegir el método
de esterilización (ver fig. 4).
Los métodos de esterilización más empleado en microbiología son mediante calor

tanto húmedo y seco, ya que la temperatura elevada inactiva enzimas y desnaturaliza
proteínas por consiguiente la muerte de los microorganismos, así como también el tiempo
de exposición puede ejercer el efecto. El método de esterilización más empleado por calor
húmedo es autoclave (ver fig. 5), a 121°C, 15 min y 15 lb/pulg2. Con el ambiente húmedo
en forma de vapor saturado a presión se favorece la penetración más rápidamente del
calor a la célula, provocando una coagulación de las proteínas. Se aplica para esterilizar
medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos
que se desechan.
El calor seco (aire caliente) es un método térmico cuyo efecto en los

microorganismos es por oxidación de componentes celulares vitales y crea un medio
23
interno árido, así quema a los microorganismos lentamente. Se puede realizar por varios
métodos:
• Aire caliente. - proceso que se lleva a cabo por hornos a 150-180°C durante 2
horas. Es utilizado en materiales generalmente de vidrio, limpios y secos, como
cajas de Petri, pipetas, algunos instrumentos quirúrgicos, etc.
• Llama directa. - Consiste en colocar el material directamente al fuego como es el

caso de la esterilización del asa o el filamento en la llama del mechero hasta que
se ponga al rojo vivo.
• Incineración. - El material a esterilizar se coloca en cámaras especiales que

alcanzan elevadas temperaturas, quemando los contaminantes hasta reducirlos a
cenizas.
Figura 4. Métodos físicos de esterilización
Figura 5. Partes de una autoclave
24
Proceso de esterilización en autoclave

1. Verifica el nivel de agua de la autoclave.
2. Introduce a la autoclave los matraces con los medios de cultivo perfectamente cubiertos
con un tapón de algodón y una cubierta de papel, (en el caso de esterilizar medios de
cultivo en tubos con tapón de rosca, estos no deben estar COMPLETAMENTE tapados y
cerrados, junto con el material que se utilizará para la práctica.
3. Cierra la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de poner
válvula de presión.
4. Esteriliza a 121°C (15 lb/pulg2 de presión) por 15 min.
5. Deben incluirse controles de esterilización para autoclave.
Compuestos termolábiles no deben ser esterilizados en autoclave
Cuestionario
1. ¿Qué tan importante consideras la esterilización del material y medios de cultivo antes
de su utilización?
2. Menciona las diferencias entre la esterilización por calor húmedo y por calor seco
3. Consideras que los métodos de esterilización por calor seco son eficientes para
material de vidrio y porque
4. ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?
5. Menciona ejemplos de materiales que se pueden esterilizar por radiaciones y gases
25
Práctica No. 6
Técnicas para recuento de bacterias
Introducción
Existen diferentes métodos para determinar el crecimiento microbiano. Algunos permiten
el recuento de los microorganismos totales presentes en la muestra mientras que otros
facilitan el recuento exclusivamente de los microorganismos vivos (viables). Los métodos
que permiten el recuento de microorganismos viables son especialmente importantes para
determinar el número de microorganismos en alimentos y bebidas. En el área de la
microbiología denominada inocuidad microbiana de los alimentos se evalúa si el alimento
cumple con el número permitido de microorganismos de acuerdo con las reglas o normas
establecidas.
Si se pretende conocer el número total de microorganismos presentes en una

muestra líquida o sólida, es recomendable que se encuentren ésta última en forma líquida
y homogenizada, además de utilizar un método apropiado. Es importante señalar que el
número no guarda relación con el tipo de microorganismos patógenos, por lo que no
puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse como un indicador
de las características higiénicas de la muestra.
Además, dependiendo de las características del medio utilizado y de las

condiciones de incubación, los microorganismos analizados serán miembros de
poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios
o aerotolerantes aunque en ciertas situaciones puede ser de interés hacer recuentos
anaerobios totales.
Objetivo
Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema utilizando el
método de diluciones y vertido en placa.
Material
Muestra de agua o de alimento.
Mechero bunsen.
3 matraces conteniendo 500 mL de agar nutritivo estéril cada uno.
30 pipetas de 10 mL o puntas azules estériles y micropipeta con capacidad de 1000 µL.
20 tubos conteniendo 9 mL de solución salida isotónica estéril (diluyente).
30 cajas Petri estériles desechables.
Benzal
Algodón
Marcador de tinta permanente
26
Desarrollo
1. Recolecta 100 mL de muestra en un frasco estéril.
2. Limpia el área de trabajo con benzal y algodón.
3. Coloca en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 mL de solución salina estéril (diluyente) y
numerarlos.
4. Toma 1 mL de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo que
contenga 9 mL de diluyente, así se obtiene una dilución 10-1, homogeniza el contenido.
5. Transfiere 1 mL a un tubo de dilución que contenga 9 mL de diluyente, agitalo
vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilución 10-2.
6. Realiza sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 mL de la muestra a
otro tubo con 9 mL de diluyente para obtener las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 como se
indica en el esquema.
7. Pipetea 1 mL de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por separado a
una caja Petri estéril vacía.
8. Adiciona inmediatamente en las cajas Petri de 10 a 15 mL de agar nutritivo mezclando
el inóculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la derecha, a la izquierda y
de arriba abajo.
9. Deja gelificar las placas.
10. Rotula las placas indicando la dilución que contienen y el tipo de muestra, incluye su
nombre, así como la fecha de ingreso y de salida del material.
11. Coloca las placas en la estufa bacteriológica y dejarla durante 24 h a 37° C.
12. Limpia nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón.
13. Evalúa el crecimiento a las 24 h, realiza el recuento de las unidades formadoras de
colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias y registra los resultados.
14. Selecciona la placa representativa que corresponda a la dilución que presente entre
30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC).
15. Multiplica el No. de UFC por el inverso de la dilución para obtener el No. de unidades
formadoras de colonias/ mL presentes en la muestra.
16. Coloca el material RPBI generado en la práctica en el cuarto de lavado.
17. Escribe el número de UFC encontradas en las placas sembradas en las diferentes
diluciones:
10-1____________ 10 –2____________ 10 –3_____________
10 –4____________ 10 –5 ____________ 10 –6_____________
18. ¿Cuál fue tu placa representativa y cuál fue la dilución de la placa?

19. Calcula el no. de UFC/mL presente en la muestra (ver fig. 6)
27
Figura 6. Método de diluciones y vertido en placa
Cuestionario
1. Investiga una Norma Oficial Mexicana (NOM) indicando el alimento, el procedimiento
de análisis y el límite de crecimiento permitido.
2. Enuncia cuatro técnicas usadas para el recuento microbiano indicando si permiten una
cuenta total o viable.
3. Según tu criterio ¿cuáles son las ventajas y desventajas del método de dilución y
vertido en placa para la determinación del crecimiento microbiano?
4. ¿Cuántas diluciones decimales deben realizarse para realizar el recuento microbiano?
Explica tu respuesta.
5. Si se espera que el contenido microbiano de la muestra (carga microbiana) sea muy
bajo. 6. ¿Qué procedimiento usarías para efectuar el recuento? Explica tu respuesta
28
Práctica No. 7
Aislamiento de microorganismos por estría cruzada
Introducción
En la naturaleza las bacterias se presentan como cultivos mixtos que contienen una muy
grande diversidad de géneros y especies por lo que es necesario que las bacterias sean
cultivadas en el laboratorio en medios de cultivo específicos, considerando como medio
de cultivo un conjunto de nutrientes en los cuales crecen y se multiplican estos
microorganismos en el laboratorio con el propósito de aislar diversas especies bacterianas
para obtener cultivos puros y con la finalidad de poder identificarlas.
Un cultivo puro se considera como un cultivo que contiene bacterias de una solo
especie y a partir de los cuales se realizan pruebas bioquímicas y serológicas para poder
llegar a su identificación.
Para alcanzar este objetivo es necesario emplear la técnica de aislamiento por estría
cruzada considerada como una técnica adecuada, la cual se debe realizar empleando
medios de cultivo sólidos conocidos como agares y que deben estar contenidos en placas
Petri.
La técnica por estría cruzada se lleva a cabo utilizando un asa bacteriológica

previamente esterilizada, realizar series de estrías en la superficie del agar la cual en
cada bloque de estrías deberán estar separadas lo mejor posible.
Para considerar que la técnica de aislamiento por estría cruzada alcanzo su objetivo
se deben obtener colonias separadas unas de otras.
Como colonias consideramos a una población de células que pueden observarse

macroscópicamente es decir a simple vista y que crecen en un medio solido procedentes
de una sola célula y como aislamiento a la separación de un determinado microorganismo
del resto de la población que le acompaña.
Para poder llevar a cabo un aislamiento es necesario tener un inóculo que no es otra
cosa que la cantidad o número de bacterias que son introducidas en los medios de cultivo
contenidos en placas Petri
Objetivo
Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas con medio de cultivo simple,
con el asa bacteriológica por el método de estría cruzada.
29
Material
2 Placas con agar nutritivo.
Mechero Bunsen.
Asa bacteriológica.
Cepa bacteriológica: Escherichia coli
Benzal
Algodón
Desarrollo
1. Limpia el área de trabajo con benzal y algodón.
2. Flamea el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.
3. Deja enfriar el asa.
4. Destapa el tubo o placa conteniendo la cepa problema.
5. Toma la muestra con el asa bacteriológica y volver a tapar el tubo.
6. Realiza estrías sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el esquema
de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de estrías y enfriarla en
una orilla de la placa. Con la última serie de estrías no volver a tocar la primera serie de
estrías (ver fig. 7)
7. Rotula material que se va a meter a incubar con los siguientes datos: nombre, fecha de
ingreso y de salida
8. Coloca las placas en la estufa bacteriológica y déjalas durante 24 horas a 37° C.
9. Limpia nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón.
10. Evalúa el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias aisladas y
determinar si hubo cultivo puro o mixto.
11. Coloca el material RPBI generado en la práctica en el cuarto de lavado.
Figura 7. Estría cruzada
30
Otras formas para la siembra de cepas con asa bacteriológica empleadas en microbiología
se muestran en la figura 8
Figura 8. Diferentes estrías para inocular en medios de cultivo
Cuestionario
1. ¿Qué es un cultivo axénico?
2. ¿Qué factores se deben considerar para obtener un buen aislamiento por estría
cruzada?
3. De las técnicas de aislamiento bacteriano utilizadas cual considera la mejor y porqué
4. ¿En qué tipo de medio de cultivo se puede sembrar una muestra?
5. Defina que es un medio de cultivo
31
Práctica No. 8
Morfología colonial
Introducción
La morfología colonial bacteriana son aquellas características representativas que ayudan
a los investigadores a determinar y completar la identificación de una especie bacteriana
cultivable. Hay que considerar que muchas bacterias en un medio con agar pueden
distinguirse fácilmente por las características de su crecimiento en forma de colonias.
La evaluación macroscópica de las colonias se lleva a cabo usualmente mediante el

examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar.
Esta particularidad de las colonias bacterianas es visible fácilmente en medios de

cultivo sólidos, que hayan sido inoculados con cultivos puros o bien con cultivos mixtos,
en cuyo caso muchas veces se emplea como perfil para la identificación del género y
especie de la bacteria en cuestión.
La morfología colonial bacteriana es muy variable, tanto desde una perspectiva

macroscópica como microscópica, situación que se determina a partir de la apreciación de
colonias mediante microscopía electrónica de barrido, donde se puede evaluar los
detalles extraordinarios de su ultraestructura.
Ya que, para las bacterias, así como para otros microorganismos es importante
conocer su capacidad para crecer sobre superficies sólidas en forma de colonias,
considerando que el conocimiento de las características de este tipo de crecimiento es
muy importante para aquellos investigadores que se dedican a la identificación minuciosa
de los microorganismos.
Una vez aisladas las colonias los pasos a seguir para llegar a la identificación del
tipo bacteriano son:
• Determinar las características de la morfología colonial.

• Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.
• Observación de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad
metabólica.
• Realizar pruebas metabólicas diferenciales.
Las características que determinan la morfología colonial son (ver fig. 9):
• Tamaño de las colonias en milímetros.

• Color de las colonias.
• Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa
• Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada
• Superficie: lisa, rugosa, granular
• Aspecto: húmedo, seco.
• Bordes: enteros, ondulados, filamentosos
32
• Luz reflejada: brillante o mate.

• Luz transmitida: opaca, translúcida, transparente.
• Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.
Figura 9. Morfología colonial

Tomado de: SlideShare, 2013
Objetivo
Realiza la descripción macroscópica de las unidades formadoras de colonias (morfología
colonial)
Material
Mechero
Asas bacteriológicas
Placas sembradas con diferentes microorganismos
Desarrollo
1. Identifica las características morfológicas de las colonias crecidas en los diferentes
agares.
2. Realiza la tinción de Gram y dibuja tu observación.
3. Completa la tabla 1
33
Tabla 1. Características morfológicas de colonias crecidas en diferentes medios de cultivo

Característica Agar: Agar: Agar: Agar:
Nombre cepa:
1. Tamaño (mm)
2. Color
3. Forma:
Puntiforme
Circular
Irregular
4. Elevación:
Elevada
Convexa
Pulvinada
Umbonada
5. Superficie:
Lisa
Rugosa
6. Aspecto:
Húmedo
Seco
7. Bordes:
Enteros
Irregulares
Filamentosos
8. Luz reflejada:
Brillante
Mate
9. Luz transmitida:
Opaca
Translúcida
Transparente
10. Consistencia:
Friable
Mucoide
Butirosa
Dura
34
Cuestionario
1. ¿La morfología colonial de un género bacteriano es la misma independientemente del
medio de cultivo en donde se aísle? Sí, no ¿por qué?
2. A tu criterio de los parámetros de morfología colonial mencionados cuáles consideras
los más representativos y ¿por qué?
3. De los parámetros que se consideran para la lectura de la morfología colonial
bacteriana consideras que son los esenciales o faltan algunos, de ser así ¿cuáles
propones?
4. ¿Podríamos suponer que dos especies bacterianas que pertenecen al mismo género
presentarían la misma morfología colonial? sí, no ¿por qué?
5. ¿De qué depende el color de una colonia bacteriana?
35
Práctica No. 9
Empleo de tinciones en el laboratorio de Microbiología
Introducción
La identificación inicial en condiciones in vitro de un agente etiológico (bacterias, hongos,
levaduras, protozoarios) provenientes de un espécimen clínico o de su desarrollo en los
medios de cultivo, puede realizarse mediante la adición de un colorante sobre un frote o
extendido fijado con calor, para contrastar y resaltar las formas o agrupaciones
estructurales de los microorganismos, debido a que no se aprecian colores cuando se
observan en el microscopio. En el laboratorio de Microbiología, de manera rutinaria se
pueden utilizar diferentes técnicas de tinción, como las preparaciones en fresco, tinciones
simples y tinciones diferenciales.
Por ejemplo, una preparación en fresco se realiza a partir de cultivos bacterianos

en medios líquido o sólidos, depositando una gota de colorante sobre un portaobjetos y
con la ayuda de un asa bacteriológica (estéril) se toma una gota del crecimiento en el
medio líquido o una colonia del medio sólido, se homogeniza y se coloca un cubreobjetos
sobre la muestra para ser observado al microscopio con el objetivo 40X.
Mientras que una tinción microbiológica es una técnica de laboratorio que permite
observar a los microorganismos por la capacidad que presentan para conservar o retener
los colorantes empleados debido a la carga que posee la célula que se desea teñir y las
características químicas del colorante, por lo que las tinciones se clasifican en simples o
diferenciales.
En la realización de una tinción simple solamente se usa un colorante, como tinta

china, azul de metileno, safranina u otro colorante. El fundamento de esta técnica de
tinción es por el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la
de su entorno, como en el caso de la tinción negativa que se usa tinta china, para resaltar
el contorno de la cápsula bacteriana y se observa al microscopio usando el objetivo 100X.
Para las tinciones diferenciales se utilizan dos colorantes: el colorante primario y el

colorante de contraste, lo que permiten clasificar a las bacterias en diferentes grupos,
según su capacidad de tinción. Por ejemplo, la tinción de Gram, clasifica a las bacterias
en grampositivas (si se tiñen de cristal violeta -moradas-) y gramnegativas (si se tiñen
con safranina -rojo-); la tinción de Ziehl-Neelsen también llamada BAAR (baciloscopia
ácido alcohol resistentes) clasifica a las bacterias en BAAR positivas (si se tiñen con
carbol fuscina, rojo) y BAAR negativas (si se tiñen con azul de metileno -azul-) o la tinción
de Sheaffer-Fulton que se utiliza para evidenciar las endoesporas bacterianas que se
tiñen con verde de malaquita y el soma bacteriano con safranina (rojo).
36
Objetivo
Realizar preparaciones en fresco, tinción de Gram, tinción negativa, tinción de Ziehl-
Neelsen y tinción de Sheaffer-Fulton
Observar las tinciones en el microscopio
Material
Microscopio óptico
Aceite de inmersión
Mechero bunsen
Asa bacteriológica
Portaobjetos
Cubreobjetos
Puente de tinción
Piseta
Benzal
Algodón
Preparaciones en fresco (Frasco gotero con azul de metileno)
Tinción negativa (Frasco con tinta china negra)
Tinción de Gram (Frascos goteros con cristal violeta, yodo-lugol, alcohol-acetona,
safranina)
Tinción de Ziehl-Neelsen (Frascos goteros con carbol fuscina, alcohol ácido, azul de
metileno)
Tinción de Sheaffer-Fulton (Frascos goteros con verde de malaquita, safranina)
Material biológico:
Tubos con caldo nutritivo conteniendo las siguientes cepas:
a) Escherichia coli
b) Klebsiella pnuemoniae
c) Staphylococcus aureus
d) Bacillus subtilis
e) Saccharomyces cerevisiae
Desarrollo
Preparación en fresco:
1. Realiza la limpieza del área de trabajo.
2. Introduce el asa bacteriológica en la flama del mechero hasta que quede al rojo vivo y
deja enfriar.
3. Coloca una gota del colorante azul de metileno sobre la superficie del portaobjetos (en
la parte central).
4.-Toma una gota del crecimiento del tubo con caldo que contiene la cepa
Saccharomyces cerevisiae, homogeniza y coloca un cubreobjetos sobre la preparación.
5. Observa al microscopio óptico con el objetivo 40X.
37
Tinción simple (Tinción negativa):

1. Realiza un frote, sobre la superficie de un portaobjetos colocar 2 ó 3 asadas de la cepa
Klebsiella pnuemoniae, extiende, deja secar al aire y fija la muestra pasando la laminilla 3
veces en la flama del mechero.
2. Coloca el frote sobre el puente de tinción y adiciona la tinta china color negro para que
cubre toda la muestra durante un minuto.
3. Agrega agua para eliminar el exceso de colorante, deja secar.
4. Observa al microscopio óptico con el objetivo 100X agregando aceite d einmersión.
Tinción de Gram (ver fig. 10):

1. Realiza varios frotis, sobre la superficie de un portaobjetos coloca 2 ó 3 asadas de la
cepa Escherichia coli, otros frotis con las cepas Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y
Saccharomyces cerevisiae, c/u, deja secar al aire y fija con calor la muestra pasando las
laminillas 3 veces en la flama del mechero para fijar la muestra en la laminilla
2. Coloca los frotis sobre el puente de tinción y adiciona el colorante cristal violeta (color
púrpura) sobre la superficie de la muestra y deja actuar durante un minuto.
3. Agrega agua para eliminar el exceso de colorante, y adiciona el yodo-lugol, deja actuar
durante un minuto
4. Agrega agua para eliminar el exceso de yodo-lugol e inclina la laminilla en un ángulo de
45º para adicionar 3 ó 4 gotas de alcohol-acetona para decolorar
5. Agrega agua para eliminar el exceso de alcohol-acetona, adiciona el colorante
safranina (color rojo) y deja actuar durante 30 segundos
6. Agrega agua para eliminar el exceso de safranina, secar
7. Observa al microscopio óptico con el objetivo 100X
Figura 10. Técnica de la tinción de Gram

Tomado y modificado de: EduLabC, 2019
NOTA:
Si tienen formas alargadas se denominan bacilos
Si tienen formas redondas se denominan cocos
Si las bacterias se observan de color púrpura, se denominan grampositivos
Si las bacterias se observan de color rojo, se denominan gramnegativos
38
Tinción de Ziehl-Neelsen
1. Realiza un frote, sobre la superficie de un portaobjetos coloca 2 ó 3 asadas de la cepa
Klebsiella pnuemoniae, extiende, deja secar al aire y fija la muestra pasando la laminilla 3
veces en la flama del mechero
2. Coloca el frote sobre el puente de tinción y sobre la muestra coloca un pedazo de papel
filtro de las dimensiones de la laminilla y adiciona el colorante carbol fuscina (color rojo),
debe cubrir totalmente toda la superficie de la laminilla a emisión de vapores durante 5
minutos. Si se evapora el colorante, agrega más carbol fuscina
3. Decolora adicionando alcohol ácido para eliminar la totalidad del colorante en ambos
lados de la laminilla
4. Agrega agua para eliminar el exceso de alcohol ácido
5. Adiciona el colorante azul de metileno (color azul) sobre la superficie de la laminilla,
dejar actuar durante un minuto
6. Agrega agua para eliminar el exceso de colorante azul de metileno, secar
NOTA: En la sesión de laboratorio, solo se pretende que el estudiante reproduzca la

técnica de tinción de Ziehl-Neelsen, ya que en la práctica diaria se investiga la presencia
de Mycobacterium tuberculosis, que es el agente causal de la tuberculosis y se realiza en
condiciones controladas para que no haya ningún tipo de contagio para el analista.
Mycobacterium tuberculosis, es un bacilo alargado que se observa al microscopio óptico
de color rojo (carbol fuscina) y un fondo azul, por lo que se designa con el nombre de
BAAR +
Tinción de Sheaffer-Fulton
1. Realiza un frote, sobre la superficie de un portaobjetos coloca 2 ó 3 asadas de la cepa
Bacillus subtilis, extiende, deja secar al aire y fija con calor la muestra pasando la laminilla
3 veces en la flama del mechero
2. Coloca el frote sobre el puente de tinción y adiciona el colorante verde de malaquita
(color verde), debe cubrir totalmente toda la superficie de la laminilla a emisión de vapores
durante 5 minutos. Si se evapora el colorante, agregar más verde de malaquita
3. Agrega agua para eliminar el exceso de colorante verde de malaquita, adiciona el
colorante safranina (color rojo) y deja actuar durante un minuto
4. Agrega agua para eliminar el exceso de safranina, secar
NOTA: El colorante verde de malaquita y la aplicación de calor permite que el colorante

atraviese las diferentes capas que forman la espora. Las endoesporas se observan de
color verde y el cuerpo de la bacteria se observa de color rojo
39
Observaciones
Hacer los dibujos a color de c/u de las observaciones realizadas empleado las diferentes
técnicas de tinción y completar la tabla 2
Tabla 2. Observaciones de las diferentes tinciones realizadas en la práctica

Tinción Cepa de estudio Dibujo
Preparación en fresco
Tinción negativa
Tinción de Gram
Tinción de Ziehl-Neelsen
Tinción de Sheaffer-Fulton
Cuestionario
1. Escriba las definiciones de mordente, cromóforo y auxocromo
2. ¿Cómo se clasifican los colorantes?
3. ¿Cuál es el fundamento de las siguientes tinciones: negativa, Gram, Ziehl-Neelsen,
Sheaffer-Fulton, utilizadas de rutina en el laboratorio de microbiología
4. ¿Cómo se llama la tinción para visualizar los flagelos?
5. ¿Qué tinciones se pueden ocupar para teñir el material de reserva en las bacterias?
6. ¿Cuál es la utilidad de las tinciones en el laboratorio clínico?
7. Investiga 5 nombres de géneros de bacterias cocos grampositivos y negativos.
8. Investiga 5 nombres de géneros de bacterias bacilos grampositivos y negativos.
9. Investiga 3 nombres de BAAR positivos.
10. Investiga 5 nombres de bacterias capsuladas.
40
Práctica No. 10
Efecto de los factores físicos sobre el crecimiento de los microorganismos
Introducción
Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben satisfacer
todos sus requerimientos nutricionales, para ello deben inocularse en condiciones de
cultivo que aseguren, por un lado, el suministro de los sustratos adecuados y por otro
proporcionar los requerimientos físicos que permitan el óptimo crecimiento de los
microorganismos. Los factores físicos más importantes y sobre los cuales se debe
mantener un control preciso, son la temperatura, el pH y la presión osmótica.
La temperatura es probablemente el factor físico más importante, influye sobre las

reacciones metabólicas que cada microorganismo realiza, de manera que cada especie
se desarrolla mejor en ciertos rangos de temperatura. Por ejemplo, los microorganismos
que crecen a temperaturas menores de 20°C se denominan psicrófilos. En el otro
extremo, los microorganismos que crecen a temperaturas mayores de 45°C son llamados
termófilos, por último, los que crecen en rangos de 20 a 45°C y se les llama mesófilos. En
los rangos, los extremos superior e inferior se designan como temperaturas máxima y
mínima de crecimiento respectivamente, sin embargo, los microorganismos se desarrollan
mejor a un valor específico de temperatura que se designa temperatura óptima de
crecimiento.
De acuerdo con el pH al que se desarrollan las bacterias se clasifican en acidófilos

cuando crecen en un rango de pH entre 1 y 5; neutrófilos cuando crecen entre 5.5 y 8.5 y
los basófilos crecen entre 9 y 12.
La presión osmótica puede afectar de diferente forma a los microorganismos, una

presión elevada ocasiona que la célula pierda agua necesaria evitando su crecimiento, en
consecuencia, es muy importante vigilar las concentraciones de sales u otros solutos
como el azúcar en los medios de cultivo empleados. Existen organismos que para su
crecimiento necesitan de altas concentraciones de sales y se les denomina halófilos,
mientras otros soportan esas altas concentraciones denominándose sal tolerante, debe
entenderse entonces que en el primer caso se refiere a un requerimiento mientras en el
segundo es una adaptación a las condiciones de cultivo.
Objetivos
Determinar las condiciones óptimas de crecimiento de microorganismos cultivados bajo
diferentes variables de temperatura, pH, concentración de sal y de azúcar.
Determinar las diferencias en los parámetros anteriores de acuerdo al grupo microbiano.
Material
Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida spp, Staphylococcus aureus
Tubos con caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables:
pH: 2, 5, 7 y 12.
NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%.
41
Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%.

Normales para incubación a diferentes temperaturas.
Desarrollo
1. Forma un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables de
cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearán para analizar el
comportamiento de una sola cepa
2. Inocula con una asada de la cepa correspondiente cada uno de los 16 tubos anteriores.
El procedimiento se ilustra en la figura 11
3. Incuba todos los tubos de pH, NaCl y sacarosa a 37°C durante 24 h.
4. Incuba los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes
temperaturas: 4, 25, 37 y 45°C durante 24 h.
5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporta los resultados en la tabla
3.
6. Para el llenado siga el método de las cuatro cruces. Comparando simultáneamente los
cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigna valores de 1-4 cruces según la
turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.
7. Construye una gráfica para cada factor físico.
8. Determina las condiciones óptimas de crecimiento para las diferentes cepas empleadas
con respecto a cada factor valorado.
Figura 11. Esquema de trabajo para inocular los tubos con caldo nutritivo
42
Tabla 3. Crecimiento de las cepas de estudio bajo diferentes condiciones

Temperatura
Microorganismo
4°C 25°C 37°C 45°C
1
pH
Microorganismo
2 5 7 12
1
% NaCl
Microorganismo
0.85 5.0 7.0 10.0
1
% Sacarosa
Microorganismo
2.5 5.5 10 20
1
Cuestionario
1. Indica el rango de temperaturas en el cual pueden crecer los microorganismos
psicrófilos, mesófilos y termófilos.
2. De acuerdo con sus temperaturas de crecimiento, indique en que grupo se clasifican
los microorganismos que crecen bien a las temperaturas del refrigerador pudiendo causar
deterioro de los alimentos.
3. Describe algún método empleado en el laboratorio para cultivar microorganismos
anaerobios.
4. Investiga un medio de cultivo empleado para el crecimiento de microorganismos
halófilos.
5. Si después de incubar tus cultivos observas diferencias en la cantidad de crecimiento
para cada una de las 4 condición de crecimiento. Elabora una explicación del motivo.
43
Práctica No. 11
Efecto de los agentes químicos sobre el crecimiento de los microorganismos
Introducción
Desde los trabajos de Lister quien fue el primero en utilizar el ácido carbólico (fenol) para
controlar las infecciones que se daban en los quirófanos, los agentes químicos se han
usado para controlar el crecimiento microbiano. Generalmente estos agentes destruyen
solo las formas vegetativas de vida microbiana alcanzando la desinfección o antisepsia.
Sin embargo, algunos agentes tienen la capacidad de destruir endosporas bacterianas y
de esa manera pueden empelarse como esterilizantes.
Algunos de los efectos de los agentes químicos sobre los microorganismos son:
• Ruptura de pared celular

• Alteración de la naturaleza coloidal del protoplasma y la permeabilidad de la
membrana
• Inactivación de enzimas y desnaturalización de proteínas.
• Disminución de la tensión superficial.
Los agentes químicos se agrupan en categorías como los fenoles, halógenos,

alcoholes, metales pesados, o agentes tensoactivos como los jabones y detergentes.
Existen diferentes métodos para evaluar la efectividad de un agente químico para

inhibir el crecimiento microbiano, uno de los más reconocidos es el de difusión con disco.
Este método consiste en impregnar un disco de papel filtro con una cantidad determinada
del agente químico a probar y colocarlo sobre una superficie de agar en la cual se ha
distribuido un inóculo del microorganismo, se formará por difusión del agente químico un
gradiente de concentración alrededor del disco y la sensibilidad del microorganismo
estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. El
gradiente se forma aproximadamente en 6 horas y la zona de inhibición dependerá del
equilibrio entre la difusión del agente y la velocidad de crecimiento del microorganismo.
Objetivo
Observar el efecto de diversos agentes químicos sobre el crecimiento de los
microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.
Material
Placas con agar nutritivo
Hisopos estériles
Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:
• Agentes surfactantes: benzal, jabón, detergente y sales biliares
• Metales pesados: merthiolate
• Desinfectantes: Cloro, yodo
44
• Colorantes: cristal violeta, safranina

• Antibióticos
Pinzas
Cepas de microorganismos
Desarrollo
1. Ajusta el inóculo a 0.5 de densidad en SSI con un densitómetro.
2. Con la disolución, inocula las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando
hisopos estériles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en 3 diferentes
direcciones y alrededor de la placa (ver fig. 12)
Figura 12. Técnica de estriado masivo

3. Empleando pinzas flameadas en el mechero, coloca adecuadamente discos de papel
filtro, impregnados con el agente químico a probar. La distancia entre cada disco no debe
ser menor a 2 cm. Debido a que la difusión del disco comienza instantáneamente después
de apoyado sobre el agar, éstos no deben levantarse para cambiarlos de lugar.
4. Incuba todas las placas a 37°C durante 18-24 h.
5. Realiza la lectura midiendo en mm el diámetro de los halos de inhibición alrededor de
los discos de papel filtro impregnados con el agente químico (ver fig.13)
Figura 13. Medición de los halos de inhibición
45
6. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes

agentes químicos. Explica, ¿a qué crees que se deban las diferencias si las hay?
7. Completa la tabla 4 registrando los resultados de cada cepa.
Tabla 4. Registro de crecimiento de las cepas de estudio
Nombre de la cepa:
Tamaño del halo Sensible (S)
Agente químico de inhibición Intermedio (I)
(mm) Resistente (R)
Cuestionario
1. Menciona un ejemplo de compuesto cuaternario de amonio y sus principales
aplicaciones.
2. Describe el procedimiento para preparar el nefelómetro de MacFarland.
3. Indica un método para evaluar la eficacia de un agente químico diferente al empleado
en esta práctica.
4. Investiga cual es la concentración óptima recomendada de etanol para eliminar a los
microorganismos y explica la razón
5. Explica la importancia de realizar un antibiograma a los microorganismos asilados de
un paciente enfermo
46
Práctica No. 12
Crecimiento de microorganismos gramnegativos en diferentes medios de
cultivo
Introducción
El grupo de bacterias gramnegativas incluye una amplia variedad de tipos bacterianos. Se
encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos hospederos como parte de
su flora normal o hasta contaminando alimentos.
Dentro de este grupo se encuentran las enterobacterias que constituyen parte

importante de la microbiota del humano habitan principalmente en el intestino por eso su
nombre, además, este grupo tiene gran importancia clínica al producir una gran variedad
de enfermedades en el ser humano, clasificándose en enterobacterias patógenas
primarias y patógenas oportunistas, en el primer grupo se encuentran Salmonella,
Shigella, Yersinia y en ocasiones Escherichia coli relacionadas principalmente con
cuadros gastrointestinales.
En los últimos años las enterobacterias, así como algunas bacterias no

fermentadoras como Pseudomonas han presentado un aumento en la resistencia a los
antimicrobianos lo cual se relaciona con la gravedad de las infecciones que puedan
causar debido a la disminución en las opciones del tratamiento terapéutico por la
adquisición de resistencias. Estas bacterias pueden crecer en diversos medios de cultivo
como Mac Conkey (MC), Salmonella-Shigella (SS), Verde Brillante (VB), Sulfito de
Bismuto (SB), Eosina Azul de Metileno (EBM), Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD) entre
otros; todos estos medios comparten la característica de ser medios selectivos porque
contienen diferentes inhibidores que permiten en diferente medida el crecimiento de los
gramnegativos e inhiben a las bacterias grampositivas y son diferenciales porque
permiten distinguir alguna característica bioquímica importante para su identificación.
Objetivo
Conocer los medios de cultivo utilizados para bacterias gramnegativas, identificar su
morfología colonial en diferentes medios de cultivo e interpretar los cambios bioquímicos
presentados en ellos.
Material
Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: MC, EMB, VB y SB.
Mechero Bunsen
Asa bacteriológica
Cepa de bacteria gramnegativa en caldo nutritivo
47
Desarrollo
1. Inocula por el método de estría cruzada cada uno de los medios, con la cepa
proporcionada.
2. Incuba las placas sembradas a 37°C por 18-24 h.
3. Realiza la lectura detallando la morfología colonial en cada uno de los medios
inoculados
4. Dibuja las placas utilizadas en esta práctica antes y después de ser inoculadas
5. Completa la tabla 5.
Tabla 5. Registro de resultados

Dibujo de la placa sin Dibujo de la placa Morfología Fuente de
Medio
inocular inoculada colonial carbono utilizada
Nombre de la cepa utilizada:
MC
EMB
VB
SB
Cuestionario
1. Esquematiza la pared celular de las bacterias gramnegativas indicando cada estructura
que la conforman.
2. Menciona la función de la pared celular e indica ¿cómo se les llama a las bacterias que
han perdido su pared celular? y ¿Cuál es el riego que corren estás bacterias?
48
3. Indica, ¿cuál es la razón de que el medio de cultivo sulfito de bismuto no se esterilice

durante su preparación?
4. ¿Cuál es la función del indicador de pH en los medios de cultivo utilizados?
5. ¿Cuál de los dos medios, MC y SS es más selectivo y por qué?
6. ¿Qué otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta práctica, pueden ser
utilizados para el crecimiento de gramnegativos?
6. De los medios utilizados en la práctica completa la tabla 6
Tabla 6. Características de diferentes medios de cultivo para gramnegativos

Tipo de medio según Fuente de Fuente Vire del indicador de pH (color)
Indicador
Medio carbono de Inhibidor
de pH
Consistencia Composición Función fermentable nitrógeno Ácido básico Neutro
neutro
MC
EMB
VB
SB
49
Práctica No. 13
Seminario: Pruebas bioquímicas para bacterias gramnegativas y
grampositivas
Introducción
El aislamiento de bacterias de productos biológicos es un procedimiento de rutina en un
laboratorio clínico, que tiene como finalidad aislar e identificar al agente causal de algún
cuadro infeccioso. El éxito del aislamiento de bacterias depende en un principio de la
correcta toma de la muestra, que deberá ser representativa del estudio deseado (exudado
faríngeo, coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado ótico, hemocultivo, cultivo
de líquido cefalorraquídeo, etc.), el siguiente paso será la inoculación en medios de cultivo
adecuados como medios selectivos, diferenciales y/o enriquecidos dependiendo de los
microorganismos buscados, en la colonias aisladas obtenidas, esta acción se podrá llevar
a cabo mediante pruebas primarias basadas en los “Criterios de Cowan y Steel” con el fin
de identificar la familia o el género y posteriormente realizar pruebas secundarias para
llegar a la identificación más precisa del agente etiológico.
De tal manera que las pruebas bioquímicas son de gran interés debido a que
permiten identificar una gran diversidad de bacterias tomando en cuenta sus propiedades
bioquímicas y metabólicas. Dentro de los metabolismos bacterianos se producen una
gama de enzimas que han permitido su identificación mediante métodos bioquímicos.
La identificación de bacterias mediante el uso de pruebas bioquímicas tiene gran

aplicación en áreas como: microbiología médica, ambiental, farmacéutica, biotecnología,
ciencia forense, investigación científica entre otras.
Las pruebas bioquímicas pueden clasificarse en pruebas rápidas tras la incubación
de 2 a 6 h que identifican principalmente reacciones enzimáticas cromogénicas en donde
se utilizan sustratos comerciales modificados con un cromóforo y al ser hidrolizado por la
bacteria da color como es el caso de las galerías API® y pruebas lentas de 18 a 48 h en
donde se detectan enzimas tras ser utilizado un sustrato presente en el medio de cultivo o
por la detección de algún producto metabólico.
Ejemplo de algunas pruebas rápidas:

• Prueba de oxidasa
• Prueba de catalasa
• Detección enzima leucina aminopeptidasa (LAP)
• Hidrólisis del hipurato
• Coagulasa
• Aminopeptidasa PYR
• Indol
Ejemplo de algunas pruebas lentas:

• Metabolismo (O/F)
• TSI
50
• LIA
• MIO
• Citrato
• Urea
• DNAsa
• Lipasa
• Solubilidad en bilis
• Sensibilidad a novobiocina
• Sensibilidad a optoquina
• Sensibilidad a bacitracina
• Prueba de CAMP
Objetivo
Conocer el fundamento de las diferentes pruebas utilizadas para la identificación de
bacterias gramnegativas y grampositivas
Cuestionario
1. Menciona 2 pruebas bioquímicas que se usen para identificar CGP
2. Menciona 2 pruebas bioquímicas que se usen para identificar BGN
3. Menciona 2 pruebas bioquímicas que se usen en micología
4. Menciona un método semi-automatizado para identificación de bacterias y menciona
sus ventajas y desventajas
Tabla 7. Pruebas bioquímicas
Prueba Fundamento
Detección enzima leucina

aminopeptidasa (LAP)
Hidrólisis del hipurato
Aminopeptidasa PYR
Lipasa
51
Solubilidad en bilis
DNAsa
CAMP
Sensibilidad a novobiocina,
bacitracina y optoquina
Reducción de nitratos a nitritos
TSI
LIA
MIO
Citrato
Urea
52
Práctica No. 14
Pruebas bioquímicas para bacterias gramnegativas
Introducción
Para la identificación de un agente bacteriano primero se debe aislar en un medio de
cultivo adecuado, de una colonia aislada, realizar las pruebas primarias ó Criterios de
Cowan y Steel, con el fin de identificar a la familia o el género al que pertenece el agente
etiológico y posteriormente realizar pruebas secundarias que permitirán identificar hasta la
especie de la bacteria involucrada.
Las pruebas metabólicas o pruebas bioquímicas generalmente son pruebas

secundarias, que se basan en la determinación de enzimas, productos finales del
metabolismo, entre otros para conocer la especie de la bacteria implicada.
Las enterobacterias pertenecen a la familia Enterobacteriacea, ubicuas en la

naturaleza, son anaerobias facultativas, fermentadoras, algunas móviles, producen ácido
a partir de glucosa se consideran un grupo de gran importancia a nivel médico,
alimentario, farmacéutico entre otros debido a que pueden estar relacionados a procesos
infecciosos transmitidos por alimentos y agua, forman parte de la microbiota intestinal del
humano y de los animales, este grupo abarca a los coliformes y coliformes fecales
considerados como "organismos indicadores" porque su presencia indica un riesgo
potencial de contaminación bacteriana.
Dentro de las pruebas bioquímicas que se usan para identificación de

enterobacterias se encuentran: TSI, LIA, MIO, citrato y urea
Objetivo
Conocer el fundamento e interpretación de las pruebas secundarias como pruebas
bioquímicas para identificación de enterobacterias.
Material
Placa con agar Mac Conkey
Tubo con agar TSI
Tubo con agar LIA
Tubo con agar MIO
Tubo con agar Citrato
Tubo con agar Urea
Colorantes tinción de Gram
Sensidiscos para la prueba de oxidasa
Peróxido de hidrógeno para la prueba de catalasa
Mechero bunsen
Asa bacteriológica
53
Portaobjetos
Puente de tinción
Cepa de bacteria gramnegativa en agar nutritivo
Desarrollo
De una colonia aislada de la placa proporcionada
Realiza pruebas primarias (Cowan y Steel)
1.Tinción de Gram.
2. Prueba de catalasa, coloca sobre un portaobjetos una gota de peróxido de hidrógeno al
10% y con ayuda de un asa recta estéril tomar un poco de la colonia de interés y colocarla
sobre la gota.
3. Prueba de oxidasa, coloca sobre un portaobjetos un sensidisco de oxidasa y con un
asa recta estéril colocar un poco de colonia de interés sobre el sensidisco.
Realizar pruebas secundarias (pruebas bioquímicas)
NOTA: para realizar estas pruebas asegurarse de trabajar con un cultivo puro o una
colonia aislada.
4. Inocula el medio Mac Conkey por estría cruzada

5. Con el asa bacteriológica estéril en punta toma un inóculo de la colonia de interés y
deposítala en la parte superior del pico de flauta en el tubo con agar TSI.
6. Con la misma asa sin esterilizar inocula el tubo con el medio LIA picando dos veces el
tubo para asegurar dejar suficiente inóculo en el fondo y el pico inocularlo con una estría
en cola de ratón
7. Regresa al medio TSI, tomar un poco de inóculo con la misma asa sin esterilizar e
inocula por picadura el medio MIO
8. Esteriliza el asa para inocular los últimos dos tubos con agar citrato y urea que carecen
de carbohidratos e inocula solo los picos de flauta por cola de ratón.
9. Finalmente, inocula el tubo con agar TSI, toma inóculo de este mismo tubo, pica el
fondo del tubo con el asa recta y realiza una estría de cola de ratón en el pico de flauta.
10. Incuba los tubos a 37°C por 18-24 horas
11. Realiza la lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas.
NOTA: Para la lectura de producción de indol agregar una gota de reactivo de Kovac’s,
(Utiliza la tabla 9 para la identificación de la enterobacteria de estudio).
54
Tabla 8. Lectura de las pruebas bioquímicas
Prueba Dibujo Lectura Interpretación
Pruebas primarias
Tinción de Gram
Catalasa
Oxidasa
Familia
Pruebas secundarias
Mac Conkey
TSI
LIA
MIO
55
Citrato
Urea
Género y especie identificado

Tabla 9. Diferenciación de enterobacterias mediante pruebas bioquímicas
56
Práctica No. 15
Crecimiento de microorganismos grampositivos en diferentes medios de
cultivo
Introducción
Las bacterias grampositivas generalmente abundan en el suelo, aunque un número
importante de ellas son patógenos de plantas y animales. Un número menor de las
bacterias grampositivas son autótrofas y producen ácido acético a partir de dióxido de
carbono e hidrógeno.
El grupo de bacterias grampositivas se caracterizan por tener una pared más

gruesa de péptidoglucano que las bacterias gramnegativas, y sus paredes carecen de
lipopolisacárido, componente característico en las gramnegativas. Entro de las bacterias
grampositivas de interés médico se encuentran los cocos grampositivos de los géneros
Streptococcus y Staphylococcus que crecen en medios enriquecidos principalmente.
Algunos ejemplos de medios de cultivo en donde pueden crecer estas bacterias

son medios enriquecidos como agar sangre de carnero (ASC) y agar chocolate, pero
también pueden llegar a crecer en medios selectivos y diferenciales como el sal y manitol
(SyM) entre otros.
Objetivo
Conocer los medios de cultivo adecuados para bacterias grampositivas e interpretar los
cambios bioquímicos presentados en ellos.
Material
Placas Petri ASC, Agar chocolate y SyM
Mechero
Asa bacteriológica
Cepa de cocos grampositivos
Desarrollo
1. Inocula por el método de estría cruzada cada uno de los medios, con la cepa
proporcionada
2. Incuba las placas sembradas a 37°C por 18-24 h.
3. Realiza la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios
sembrados y determina el medio de cultivo óptimo para el aislamiento de cada cepa.
4. Para el caso del medio ASC, determinar el patrón de hemólisis presentado por cada
cepa de acuerdo al siguiente criterio:
• α-hemólisis: parcial aclaramiento alrededor de la colonia con decoloración verde
en el medio.
• β-hemólisis: zona de completo aclaramiento debido a la lisis total de los glóbulos
rojos.
• γ-hemólisis: no hemólisis.
57
5. De los medios utilizados completar la tabla 10

Dibujo de la placa Dibujo de la placa Morfología Fuente de
Medio
sin inocular inoculada colonial carbono utilizada
Nombre de la cepa de trabajo:
ASC
Agar
chocolate
SyM
Cuestionario
1. Realiza una tabla que contenga al menos 3 diferencias entre la pared celular de una
bacteria gramnegativa y una grampositiva
2. Menciona la importancia clínica de Staphylococcus epidermidis e indica en que medio
de cultivo puede crecer
3. Investiga la razón por la cual Streptococcus no puede crecer en el medio sal y manitol
4. Indica porque solamente los microorganismo halófilos y halófilos tolerantes pueden
crecer en el medio Sal y Manitol
58
Tabla 11. Características de medios de cultivo para grampositivos

Tipo de medio Vire del indicador de pH (color) Fuente de
Indicador
Medio Inhibidor carbono
Composición Consistencia Función de pH Ácido Neutro Básico fermentable
ASC
Agar
chocolate
SyM
59
Práctica No. 16
Pruebas bioquímicas para bacterias grampositivos
Introducción
Dentro del listado de bacterias de importancia médica destacan particularmente 2
géneros: Staphylococcus y Streptococcus, que se caracterizan por su forma esférica
(coco). Se les ha asignado el término de cocos grampositivos (CGP), debido a que
retienen el colorante primario (cristal violeta) de la tinción de Gram. Sin embargo, difieren
en la metodología utilizada para su identificación.
El género Staphylococcus, es un CGP, con agrupación en forma de racimo de

uvas, son anaerobios facultativos, catalasa positiva, inmóvil, es un microorganismo no
esporulado y produce coagulasa. Distribuida en toda la población del mundo, capaz de
originar una amplia variedad de enfermedades en la piel, mucosas, genera patologías que
afecta diferentes órganos del cuerpo humano. Además, Staphylococcus aureus, produce
una poderosa enterotoxina capaz de causar intoxicación alimentaria y es responsable de
infecciones intrahospitalarias. Es una bacteria que crece con facilidad en los medios de
cultivo simples, enriquecidos y en medios de cultivo con una concentración alta de NaCl
(halofílica).
Mientras que la mayoría de las especies del género Streptococcus, se caracterizan

por ser CGP, agrupados en cadenas, son anaerobios facultativos, catalasa negativa, para
su desarrollo en condiciones “in vitro” requieren de medios de cultivo enriquecidos con
sangre, por ser considerados bacterias exigentes o fastidiosas, además requieren
atmósferas de CO2 (capnofilia). Una primera forma de iniciar la identificación consiste
visualizar la producción de a y b hemólisis en placas de agar sangre de carnero. Varias
especies de Streptococcus son patógenos para la población humana y otras forman parte
de la microbiota de la piel y mucosas. Algunas especies puedan causar amigdalitis,
meningitis, neumonía, endocarditis y caries dentales.
La identificación final de los cocos grampositivos (CGP) mediante pruebas

fenotípicas es totalmente diferente a la identificación de bacilos gramnegativos (BGN),
porque no se utilizan las mismas pruebas de caracterización bioquímica.
Objetivo
Conocer el fundamento e interpreta las pruebas de caracterización bioquímica para cocos
grampositivas de uso frecuente para su identificación.
Material
Placa de sal y manitol
Placa de agar sangre de carnero
Placa de agar chocolate Microscopio óptico
Peróxido de hidrógeno (Agua oxigenada)
Sensidiscos de oxidasa
60
Colorantes tinción de Gram

Sensidiscos de: bacitracina, optoquina, novobiocina
Mechero bunsen
Asa bacteriológica
Portaobjetos
Puente de tinción
Material biológico:
a) Staphylococcus aureus
b) Staphylococcus epidermidis
c) Streptococcus a hemólico
d) Streptococcus b hemólico
Desarrollo:
Para la identificación de Staphylococcus spp:

Visualiza el crecimiento en las placas de agar sal manitol y agar sangre de carnero.
Valora si se trata de un cultivo puro o mixto. En ambas placas aplica los criterios de
morfología colonial. Revisa la utilización de la fuente de carbono (manitol) en las placas
de agar sal manitol. Las colonias manitol positiva, se observan de color amarillo, la acidez
producida por la fermentación del carbohidrato puede difundirse en el medio de cultivo,
que se aprecia de color amarillo. Para las colonias manitol negativa, la alcalinidad
producida, hace que el medio de cultivo se torne de color ligeramente rojo. Identifica el
tipo de hemólisis producida en las placas de agar sangre de carnero. Realiza la tinción de
Gram y realiza la observación al microscopio para determinar la forma microscópica y la
reacción al Gram.
Prueba de catalasa
El objetivo de la prueba es comprobar la presencia de la enzima catalasa presente en los
microorganismos, recordando que la catalasa es una enzima que poseen la mayoría de
las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen el sistema citocromo. Para
realizar la prueba coloca una gota de peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) sobre un
portaobjetos y con asa bacteriología previamente esterilizada a la flama del mechero al
rojo vivo, se deja enfriar y toma del centro de una colonia. Homogeniza y si se aprecia la
formación de burbujeo, se considera que la prueba de catalasa es positiva, si no hay
formación de burbujas la prueba de catalasa es negativa
Prueba de coagulasa
El propósito de la prueba es evidenciar la presencia de la enzima coagulasa, que tiene la
propiedad de coagular el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar especies de
Staphylococcus. Para realizar el ensayo se coloca 0.2 mL de plasma humano o de conejo
en un tubo de ensaye y se toma una o dos colonias, se homogeniza, se deja incubar a 37°
C durante 24 horas. Se considera positiva la prueba si hay formación de un coágulo.
61
Sensibilidad a novobiocina
Algunas especies del género Staphylococcus son resistentes a novobiocina y permite
diferenciarlos de los Staphylococcus coagulasa negativas. Del crecimiento en agar sangre
de carnero, se realiza una resiembra inoculando en forma masiva la superficie de otra
placa de agar sangre de carnero y se colocan un sensidisco de novobiocina, se deja
incubando 24 h a 37º C y se determina si es sensible o resistente. Del resultado obtenido
checar en tablas para la identificación de las especies de Staphylococcus
Para la identificación de Streptococcus spp:

Visualiza el crecimiento en las placas de agar sangre de carnero. Valora si se trata de un
cultivo puro o mixto. Aplica los criterios de morfología colonial. Revisa el tipo de hemólisis
producida en las placas de agar sangre de carnero, en caso de observarse α, β ó -
hemólisis. Realiza la tinción de Gram y realiza la observación al microscopio para
determinar la forma microscópica y la reacción al Gram.
Streptococcus β-hemolítico
Sensibilidad a bacitracina
Streptococcus pyogenes es sensible a bacitracina, lo que permite la separación de otras
especies de Streptococcus α-hemolíticos.
Streptococcus β-hemolíticos.
Del crecimiento de colonias puntiformes β-hemolíticas en agar sangre de carnero, se
realiza una resiembra inoculando en forma masiva la superficie de otra placa de agar
sangre de carnero y se colocan un sensidisco de bacitracina, se deja incubando 24 h a
37º C y se determina si es sensible o resistente. Los resultados obtenidos de los ensayos
deben compararse en tablas con resultados positivos y negativos para la identificación
final de las especies de Streptococcus.
Del resultado obtenido checar en tablas para la identificación de las especies de

Streptococcus.
Prueba de CAMP
Streptoccocus β-hemolítico del grupo B sintetizan un compuesto (CAMP) que acentúa la
zona de hemólisis de una cepa de Staphylococcus que produce b lisina. Sobre la
superficie de una placa de agar sangre de carnero inocula una asada de una cepa de
Staphylococcus aureus, con la característica de ser CAMP +, y en forma perpendicular a
esta estría se inoculan asadas de Streptoccocus β-hemolítico a probar. En la zona de
unión de las estrías de ambas cepas se genera una imagen similar a la punta de una
flecha con una acentuada hemólisis β
Streptococcus α-hemlitico
Sensibilidad a optoquina
Algunas cepas de Streptococcus α-hemolítico son sensibles a optoquina, lo que permite
su identificación. Del crecimiento de colonias puntiformes α-hemolíticas en agar sangre de
carnero, se realiza una resiembra inoculando en forma masiva la superficie de otra placa
de agar sangre de carnero y se colocan un sensidisco de optoquina, se deja incubando 24
62
h a 37º C y se determina si es sensible o resistente. El resultado obtenido debe

compararse en tablas para la identificación de las especies de Streptococcus.
Observaciones
Hacer los dibujos a color de c/u de los resultados de las pruebas de laboratorio realizadas
y completar la tabla 12:
Prueba Dibujo Lectura
Nombre de la cepa de trabajo:
Crecimiento en SyM
Crecimiento en ASC
Crecimiento en Agar chocolate
Pruebas primarias
Tinción de Gram
Catalasa
Oxidasa
63
Pruebas secundarias
Hemólisis
Coagulasa
Sensibilidad a novobiocina
Sensibilidad a bacitracina
Prueba de CAMP
Sensibilidad a optoquina
Cuestionario
1. Escribe las pruebas y los resultados que permiten hacer la identificación de:
a) Staphylococcus aureus
b) Staphylococcus epidermidis
c) Staphylococcus saprophyticus
d) Streptococcus pyogenes
e) Streptococcus agalactiae
f) Streptococcus pneumoniae
64
Bibliografía
Riedel, S., Morse, S., Mietzner, T., & Miller, S.. (2020). Microbiología medica
Jawetz, Melnick y Adelberg. LANGE. México: 28 a. McGraw-Hill.
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65

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Facultad de Ciencias Químicas

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ÁREA: Ciencias Microbiológicas

ASIGNATURA: Laboratorio de Microbiología

Nivel Educativo: Licenciatura

Nombre del Plan de Estudios: Licenciatura en Químico Farmacobiólogo

Modalidad Académica: Presencial

Nombre de la Asignatura: Laboratorio de Microbiología

Ubicación: Nivel Básico

Asignaturas Consecuentes: Microbiología Médica Diagnóstica, Inocuidad

2. CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE

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