Ucm t28514

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Departamento de Qumica Analtica
ACUMULACIN-INTERACCIN DE ESPECIES DE MERCURIO Y SELENIO EN TEJIDOS ANIMALES: DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGAS DE ANLISIS
MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR POR Ana Isabel Cabaero Ortiz
Bajo la direccin de las Doctoras: Carmen Cmara Rica Yolanda Madrid Albarrn
Madrid, 2005
ISBN: 84-669-2837-5

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
ANA ISABEL CABAERO ORTIZ Madrid, 2005

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
Directoras: Dra. Carmen Cmara Rica Dra. Yolanda Madrid Albarrn
ANA ISABEL CABAERO ORTIZ Madrid, 2005
Ciudad Universitaria 28040 Madrid (Espaa) Telef. 913944331 Fax. 913944329

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
D CARMEN CMARA RICA, CATEDRTICA DEL DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID, y
D.
YOLANDA
MADRID
ALBARRN,
PROFESORA
TITULAR
DEL
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
HACEN CONSTAR QUE: El presente trabajo, titulado ACUMULACIN-INTERACCIN DE ESPECIES DE MERCURIO Y SELENIO EN TEJIDOS ANIMALES: DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGAS DE ANLISIS, ha sido realizado en este Departamento por la Licenciada D. Ana Isabel Cabaero Ortiz, constituyendo as la Tesis Doctoral de su autora.
Madrid, 12 de mayo de 2005
Fdo. Carmen Cmara Rica
Fdo. Yolanda Madrid Albarrn
Deseo agradecer a la Dra. Carmen Cmar y a la Dra. Yolanda Madrid, directores de este trabajo, su ayuda constante y su estmulo contuno en la realizacin del mismo, as como la formacin desintersada brindada durante estos aos. Tambin quiero expresar mi gratitud a las personas e instituciones que aportaron los medios econmicos para llevar a cabo la experimentacin, sobre todo al Dto. de Qumica Analtica de la Universidad Complutense y a su director, D. Jose M. Pingarrn y a la Universidad Complutense por la concesin de una beca. Muchsimas gracias a todos los compaeros del laboratorio que supieron compartir los buenos, los no tan buenos y los malos momentos, que estuvieron dispuestos a escuchar, a y ayudar en los problemas tcnicos. A los que estuvieron (Beln, Marta, Eva, Isabel, Pilar); a los que estn (Roco, Christian, Jon, Mer, Diego, Zoyne, Carmen, Estrella, Ana), y a los que siempre han estado (M Carmen, Rosa y Patricia). Por ltimo quisiera dar las gracias a todos aquellos que de alguna manera han contribuido a la realizacin de este trabajo ya sea en el aspecto cientfico como personal.
A mis apoyos incondicionales, mis padres, mi hermanos y mis abuelos
Mirar hacia el futuro es pensar en aquello que otros creyeron imposible. Soar que ser algo ms que una ilusin.
ndice
ndice
NDICE
A. OBJETIVOS.. 1 B. INTRODUCCIN
CAPTULO I. MERCURIO: ELEMENTO TXICO PARA LOS SERES VIVOS
1. MERCURIO EN EL MEDIO AMBIENTE
1.1. EMISIONES.... 1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL...... 1.3 CICLO BIOGEOQUMICO DEL MERCURIO.....
9
9 15 18
2. IMPORTANCIA TOXICOLGICA DEL MERCURIO Y SUS DERIVADOS.

2.1. COMPUESTOS INORGNICOS. 2.2. MERCURIO ELEMENTAL.... 2.3. COMPUESTOS ORGANOMERCRICOS....
22
22 23 24
3. FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO...

3.1. EXPOSICIN OCUPACIONAL Y ACCIDENTES MEDIOAMBIENTALES.. 3.2. EXPOSICIN A TRAVS DE LA DIETA: BIOACUMULACIN.
26
26 29
4. BIBLIOGRAFA....................
33
CAPTULO II. SELENIO: ELEMENTO ESENCIAL PARA LOS SERES VIVOS

1. SELENIO EN EL MEDIO AMBIENTE
1.1. EMISIONES.... 1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL...... 1.3 CICLO BIOGEOQUMICO DEL SELENIO..
41
41 42 46
2. RELEVANCIA BIOLGICA DEL SELENIO..

2.1. ESENCIALIDAD..... 2.2. EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE SELENIO 2.3. EFECTOS DEL EXCESO DE SELENIO: TOXICIDAD DEL ELEMENTO.... 2.4. METABOLISMO DEL SELENIO EN ANIMALES SUPERIORES..
48
48 55 60 61
3. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA Y SU BIODISPONIBILIDAD..

3.1. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA..... 3.2. BIODISPONIBILIDAD DEL SELENIO....
64
64 65
4. BIBLIOGRAFA......
68
ndice
CAPTULO III. INTERACCIN MERCURIO-SELENIO

1. FORMA QUMICA Y EFECTO PROTECTOR / ANTAGNICO.... 2. EFECTOS DEL SELENIO EN LA DISTRIBUCIN DEL MERCURIO EN RGANOS Y TEJIDOS. 3. POSIBLES MECANISMOS DE PROTECCIN DEL SELENIO FRENTE A LA TOXICIDAD DEL MERCURIO
3.1. REDISTRIBUCIN DEL MERCURIO. 3.2. COMPETENCIA POR LOS MISMOS PUNTOS DE UNIN.. 3.3. FORMACIN DE COMPLEJOS Hg-Se..... 3.4. CONVERSIN DE LAS FORMAS TXICAS DE MERCURIO EN OTRAS FORMAS MENOS TXICAS... 3.5. PREVENCIN DEL DAO OXIDATIVO
80 83 86
86 88 89 93 94
96
CAPTULO IV. TRATAMIENTO DE MUESTRA Y TCNICAS ANALTICAS PARA LA ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y NUTRICIONAL 1. TRATAMIENTO DE MUESTRA... 103 2. EXTRACCIN DE ESPECIES DE MERCURIO 106
2.1. EXTRACCIN CIDA... 2.2. EXTRACCIN ALCALINA.... 2.3. DESTILACIN... 2.4. EXTRACCIN CON FLUIDO SUPERCRTICO... 2.5. EXTRACCIN-PRECONCENTRACIN DE ESPECIES DE MERCURIO.. 106 107 107 108 109
3. DETERMINACIN DE ESPECIES DE MERCURIO.... 111

3.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS.... 3.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS..... 111 120
4. EXTRACCIN DE ESPECIES DE SELENIO...

4.1. EXTRACCIN CON DISOLVENTES..... 4.2. HIDRLISIS DE PROTENAS.....
122
122 124
5. DETERMINACIN DE ESPECIES DE SELENIO...

5.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS.... 5.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS.....
130
131 138
139
II
ndice
C. PARTE EXPERIMENTAL
CAPITULO V. PROCESOS DE TRATAMIENTO DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE Hg, Se Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y NUTRICIONAL
1. EVALUACIN DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE MERCURIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE PESCADO Y POSTERIOR DETECCIN CON FI-CV-AFS Y GC-PYRO-AFS. 2. EXTRACCIN DE SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS BIOLGICAS MEDIANTE EL USO DE LA SONDA DE ULTRASONIDOS Y POSTERIOR DETECCIN CON ICP-MS Y HPLC-ICP-MS.
157
167
CAPITULO VI: DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO
1. CUANTIFICACIN Y ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN ESPECIES DE PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO EN ESPAA Y PORTUGAL .. 2. DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES BIOACCESIBLES EN MUESTRAS DE PESCADO MEDIANTE UN MTODO DE DIGESTIN IN VITRO ...
181
193
CAPITULO VII: ACUMULACIN, DISTRIBUCIN Y TRANSFORMACIN DE MERCURIO EN AVES. EFECTO PROTECTOR DEL SELENIO
1. EFECTO DEL ENRIQUECIMIENTO DE PIENSOS CON SELENIO Y ARCILLAS EN LA BIOACUMULACIN DE MERCURIO. 2. ESTUDIO DE LA ACUMULACIN DE SELENIO Y SU INTERACCION CON Hg MEDIANTE EL USO DE CV-AFS, ICP-MS Y HPLC-ICP-MS... 3. ESTUDIO DE LA INTERACCIN MERCURIO-SELENIO EN HGADO DE POLLO MEDIANTE EL USO DE CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR ACOPLADA AL ICP-MS..
213
223
245
D. DISCUSIN INTEGRADORA.. 275 E. CONCLUSIONES... 299 F. ANEXO: GLOSARIO DE TRMINOS. 303
III
Objetivos
Objetivos
OBJETIVOS DEL TRABAJO

La presencia de mercurio en el medio ambiente se ha incrementado durante los ltimos aos como consecuencia de la actividad antropognica, lo que puede suponer un riesgo tanto medioambiental como de salud pblica. Las caractersticas fsico-qumicas del mercurio hacen de l uno de los metales ms ubicuos, presentndose en todos los compartimentos medioambientales. Esto, unido a la elevada toxicidad (efectos tetarognicos, inmunotxicos y especialmente neurotxicos) de sus especies, hace necesario conocer, por un lado, los niveles de concentracin en los que se encuentra, y por otro, los diferentes procesos biolgicos que controlan su acumulacin y metabolismo. Por otro lado, es un hecho probado la esencialidad del selenio como micronutriente, destacando por sus funciones biolgicas, antioxidantes y catalticas. Es un elemento indispensable para el adecuado funcionamiento del sistema inmune y su ingesta podra estar asociada con la disminucin del riesgo de padecer cncer. Asimismo, existen evidencias de que el selenio podra contrarrestar la toxicidad del mercurio. Por todo lo expuesto, presenta un gran inters el conocimiento de los procesos vitales en los que este elemento est implicado, as como la identificacin de sus especies. La obtencin de informacin relacionada con los mecanismos de acumulacin, distribucin, transformacin de especies e interaccin de ambos elementos se ha convertido en uno de los retos cientficos actuales. Sin embargo, esto no es una tarea fcil. Estos analitos se encuentran en muy bajos niveles de concentracin en el medio ambiente, dificultad que se incrementa cuando se quieren determinar las especies. Por todo ello, se requiere disponer de una metodologa analtica adecuada que combine un tratamiento de muestra que preserve las especies, una separacin eficaz de las mismas y un sistema que permita su deteccin a los bajos niveles de concentracin en que se encuentran habitualmente. Esto permitira aadir una nueva dimensin en la comprensin y entendimiento del papel de estos elementos.
Considerando estos aspectos, los objetivos ms relevantes de la presente memoria se han centrado en los siguientes apartados:
1. Desarrollo de nuevas metodologas destinadas al aislamiento y a la cuantificacin de Hg y Se total y sus especies en muestras de inters biolgico y nutricional.
Evaluacin de nuevos procedimientos de tratamiento de muestra que permitan la determinacin de las diferentes especies de mercurio presentes en alimentos, preservando la forma qumica original de las especies.
Objetivos
Desarrollo de una metodologa innovadora de tratamiento de muestra (mediante el empleo de una sonda de ultrasonidos) ms rpida y sencilla que la disponible para la extraccin de selenio en materiales biolgicos, y posterior identificacin, evitando el riesgo de transformacin de las mismas.
Aplicacin de las metodologas desarrolladas a la identificacin de las formas qumicas del Hg y Se presentes en muestras reales (pescados). Uno de los objetivos primordiales de este estudio ser estimar la eficiencia del aporte de estos elementos a travs de la dieta, despus de evaluar su biodisponibilidad.
2. Elucidacin de los mecanismos de acumulacin, distribucin, transformacin e interaccin del mercurio y selenio en aves.
Evaluacin de la biodisponibilidad y acumulacin de especies de Hg y Se (administradas a travs de la dieta) en aves. Estudio del efecto que ejerce sobre la distribucin y acumulacin de mercurio en las aves la suplementacin en la dieta de materiales absorbentes y antagnicos de la toxicidad del mercurio (Se).
Identificacin de las formas qumicas de Hg y Se y posibles biotransformaciones de estos elementos en los seres vivos como resultado de su interaccin.
Introduccin
Hg
1.1. EMISIONES 1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL 1.3. CICLO BIOGEOQUMICO DEL MERCURIO
2.
IMPORTANCIA TOXICOLGICA DEL MERCURIO Y SUS DERIVADOS

2.1. COMPUESTOS INORGNICOS 2.2. MERCURIO ELEMENTAL 2.3. COMPUESTOS ORGANOMERCRICOS
3.
FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO

3.1. EXPOSICIN OCUPACIONAL Y ACCIDENTES MEDIOAMBIENTALES 3.2. EXPOSICIN A TRAVS DE LA DIETA: BIOACUMULACIN
4.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
MERCURIO: ELEMENTO TXICO PARA LOS SERES VIVOS
Captulo I
Mercurio en el medio ambiente
MERCURIO: ELEMENTO TXICO PARA LOS SERES VIVOS

El mercurio (Hg), se encuentra presente en todos los compartimentos del medio ambiente (atmsfera, geosfera, hidrosfera y biosfera) y a diferencia de lo que sucede con los compuestos orgnicos su degradacin no se produce en el medio. Por lo tanto, la cantidad de mercurio total ha permanecido constante desde la formacin del planeta aunque, como es natural, la distribucin de este elemento no es uniforme ni homognea. Durante ms de veinte siglos el mercurio ha sido conocido y utilizado por sus especiales caractersticas por diversas culturas, sin embargo, su uso se extendi a partir de la revolucin industrial. En la actualidad sirve como materia prima en mltiples sectores industriales y tambin para la produccin de diversas manufacturas. Por lo tanto, y tal como muestran diversos estudios1,2, la cantidad de mercurio movilizado y que se aade a la biosfera se ha incrementado en los ltimos 150 aos. Hay que sealar que la demanda industrial de mercurio en los pases ms desarrollados y por tanto, su produccin se ha reducido en casi un 50% en la ltima dcada, debido a la mayor preocupacin por las consecuencias de los incrementos de la concentracin de mercurio que se estn encontrando en el medio ambiente. Su actividad como neurotoxina, su facilidad para acumularse en la cadena alimentaria y los diferentes episodios de envenenamiento, han hecho que el mercurio est incluido en todas las listas de organismos internacionales como uno de los contaminantes ms peligrosos presentes en el medio ambiente. El conocimiento de los diferentes procesos qumicos, fsicos, hidrolgicos, minerales y biolgicos que controlan el transporte y acumulacin del mercurio constituye un paso clave para evaluar adecuadamente la toxicidad y peligrosidad de la presencia del mercurio y sus derivados en nuestras vidas3. En estos ltimos veinte aos se ha avanzado mucho en este sentido, pero todava hay procesos, reacciones y variables por estudiar para tener un conocimiento exhaustivo del comportamiento del mercurio y todos sus derivados en el medio ambiente.
1.1. EMISIONES Los niveles de mercurio en el medio ambiente han aumentado considerablemente desde el inicio de la era industrial. La actividad del hombre ha generalizado los casos de exposicin, y las prcticas del pasado han dejado un legado de mercurio que afectan adversamente a los seres humanos y al medio ambiente. Hasta las regiones donde se
registran emisiones mnimas de mercurio, como el rtico, se han visto adversamente afectadas debido al transporte transcontinental y mundial del mercurio. La fuente ms importante de mercurio es la emisin antropognica a la atmsfera, aunque tambin se producen emisiones de mercurio que van directamente al agua y a la superficie terrestre. Una vez liberado, el mercurio permanece en el medio ambiente, donde circula entre el aire, el agua, los sedimentos, el suelo y la biota en diversas formas. Las emisiones actuales junto con el mercurio ya existente en el mundo hacen que este se siga movilizando, depositndose en la tierra y el agua y volviendo a movilizarse. La forma en que se libera el mercurio vara segn los tipos de fuentes y otros factores. La mayora de las emisiones a la atmsfera son en forma de mercurio elemental, que es transportado a regiones alejadas de las fuentes de emisin. Las emisiones restantes se producen en forma de mercurio gaseoso, inorgnico, inico (como el cloruro de mercurio) o consolidado en partculas. Estas formas tienen un perodo de vida ms corto en la atmsfera y se pueden depositar en tierras o masas de agua a distancias aproximadas de 100 a 1000 kilmetros de su fuente4. El mercurio elemental en la atmsfera puede oxidarse, lo que origina una va importante de depsito en la superficie terrestre y en las aguas. Una vez depositado, el mercurio puede cambiar de forma (principalmente por metabolismo microbiano) y convertirse en metilmercurio, que tiene la capacidad de acumularse en organismos (bioacumulacin) y concentrarse en las cadenas alimentarias (biomagnificacin), especialmente en la cadena alimentaria acutica (peces y mamferos marinos). El metilmercurio es, pues, la forma que causa mayor preocupacin. Las numerosas fuentes de emisin de mercurio a la biosfera que contribuyen a los flujos globales del mercurio se clasifican en tres categoras: Emisiones antropognicas: la movilizacin o emisin de mercurio derivada de actividades humanas, con transferencia de masa de mercurio a la atmsfera. Emisiones naturales: la movilizacin o emisin del mercurio generado de forma natural en la corteza terrestre, por actividad volcnica o por erosin de las rocas, con una transferencia de masa de mercurio a la atmsfera. Re-emisiones de mercurio: la transferencia de masa de mercurio a la atmsfera por procesos biolgicos y geolgicos movilizando el mercurio que anteriormente se haba depositado en la superficie terrestre por actividades humanas o naturales.
10
Emisiones antropognicas La mayor parte del mercurio presente actualmente en la atmsfera es producto de muchos aos de emisiones provenientes de actividades antropognicas. Es difcil estimar el componente natural de la carga total atmosfrica, pero en todo el planeta hay indicios de que las emisiones antropognicas de mercurio han generado ndices de deposicin actuales entre 1.5 y 3 veces mayores a los existentes en la poca preindustrial5. Adems, dentro de las reas industriales y en sus inmediaciones los ndices de deposicin han aumentado de 2 a 10 veces durante los ltimos 200 aos. La aplicacin del mercurio en la extraccin de plata en las minas del Nuevo Mundo (Mxico, Bolivia y Per) por parte de los conquistadores espaoles entre 15701820 posiblemente constituy la mayor emisin antropognica continuada de mercurio al medio ambiente. Se ha estimado un consumo medio de 468 Tm ao-1 de mercurio en las minas de plata, originando una emisin de 351 Tm ao-1, lo que supone aproximadamente un 20% del total del Hg emitido por fuentes naturales6. Estudios recientes sitan las emisiones antropognicas en 2.000-4.500 Tm ao-1, de las cuales cerca del 95% se depositan en la superficie terrestre, un 3% en las aguas y un 2% en el aire. Las fuentes antropognicas ms importantes que liberan Hg al medio ambiente son: la industria del cloro-lcali, la combustin de combustibles fsiles (principalmente carbn), la produccin de cemento, la minera, actividades metalrgicas y la incineracin de desechos mdicos y municipales. Stein y col.7 estimaron que aproximadamente el 80% de las emisiones antropognicas de mercurio son emisiones de mercurio elemental a la atmsfera, principalmente de la combustin de combustibles fsiles, actividad minera e incineracin de desechos. Un 15% se introduce directamente en el suelo a travs de la aplicacin de fertilizantes y fungicidas y el vertido de desechos municipales (ej. bateras y termmetros). El 5% restante ocurre mediante el vertido de residuos industriales al agua. Estudios realizados sobre las emisiones antropognicas a la atmsfera en los pases econmicamente desarrollados8 (Tabla 1) indican que la mayor fuente de mercurio es la combustin. Sin embargo, en aquellos pases donde hay explotaciones mineras de oro, sta es la principal fuente de emisin de mercurio. Las autoridades sobre el medio ambiente de algunos pases consideran al mercurio como contaminante prioritario por sus conocidos efectos perjudiciales y son conscientes de los problemas que causa su uso y liberacin al medio ambiente. Por ello, se han adoptado medidas internacionales encaminadas a abordar el problema mundial que supone el mercurio. Gracias a estos esfuerzos se han reducido las emisiones antropognicas de algunas fuentes importantes en Amrica y Europa. Adems, en algunos pases desarrollados se han disminuido las emisiones antropognicas totales en la
11
atmsfera durante la ltima dcada. Por ejemplo, en Canad las emisiones se redujeron de 33 a 6 toneladas mtricas entre 1990 y 2000. Tabla 1. Emisin antropognica de mercurio a la atmsfera en los Estados Unidos (1997)
% del total de emisiones 26 22 22 13 4 3 7 Especies de mercurio (%) Hg0 20 20 50 50 85 70 80 Hg2+ 60 60 30 30 10 30 10 Hgp 20 20 20 20 5 0 10
Fuente de emisin Incineracin residuos mdicos Desechos municipales Calderas de carbn, gas y aceite Calderas de plantas trmicas y otras industrias Fundicin metales (excluido hierro) Industria cloro-lcali Otras fuentes puntuales Fuentes difusas (preparacin amalgamas dentales, rotura lmparas fluorescentes, uso en laboratorios) TOTAL
Toneladas 58.6 49.8 48.5 28.5 8.7 6.5 16.2
6.9
100
223.7
100
41
41
18
* Hg0= vapor mercurio elemental, Hgp=mercurio asociado a partculas
A pesar del endurecimiento de la legislacin durante los ltimos aos y de la reduccin de consumo mundial de mercurio (la demanda global es menos de la mitad de lo que era en 1980) se ha reducido la contaminacin atmosfrica ocasionada por la produccin industrial, pero la contaminacin de las aguas debido a la actividad minera sigue siendo significativa9.
Emisiones naturales La importancia del conocimiento de las fuentes y flujos globales de las emisiones naturales de mercurio radica en que este tipo de emisiones no son controlables y por lo tanto no pueden ser reducidas. Desgraciadamente, es muy difcil distinguir entre las emisiones naturales y las emisiones antropognicas indirectas (re-emisiones), ya que el mercurio acumulado de manera natural participa de las mismas reacciones y procesos de transformacin que el de origen antropognico.
12
El mercurio es movilizado o liberado a la atmsfera a travs de una serie de procesos naturales, incluyendo la desgasificacin y erosin de la corteza terrestre, erupciones forestales volcnicas, la evaporacin desde la hidrosfera y los incendios
10,11,12,13
. Las emisiones naturales de mercurio estn fuera de nuestro control y
deben considerarse como parte de nuestro entorno vital a escala local y mundial. En algunas partes del mundo las concentraciones de mercurio en la corteza terrestre se elevan de manera natural, y contribuyen a elevar las concentraciones locales y regionales de mercurio en esas reas. Se cree que el Hg es liberado de fuentes naturales principalmente en la forma de Hg vapor, pero el mercurio unido a partculas en suspensin/aerosoles pueden originarse en algunos procesos naturales (ej. erupciones volcnicas). Lindqvist y col.14 estimaron las emisiones de Hg natural entre 2.500 y 30.000 toneladas. El flujo global de las erosiones15 y desgasificaciones, y la contribucin de las erupciones volcnicas16,17 al flujo de mercurio hacia la atmsfera se ha establecido en unas 700 y 830 toneladas de mercurio al ao, respectivamente. La cantidad de mercurio que se emite a la atmsfera desde las capas ms profundas de la tierra y que se infiltra a travs de grietas del manto terrestre se ha estimado en un valor de entre 3.000 y 6.000 toneladas al ao de mercurio. Por ltimo, dentro de este apartado, hay que evaluar la contribucin al flujo global del mercurio que tienen los intercambios que se realizan entre los compartimentos medioambientales (agua, suelos, vegetacin). El principal mecanismo que gobierna todas estas emisiones es la diferencia en concentraciones de un medio a otro. Este gradiente se produce principalmente entre el aire y los sistemas acuticos, donde hay una saturacin de especies voltiles de mercurio, aunque tambin se ha observado para los suelos y el aire18. Una serie de parmetros (el aumento en la temperatura del suelo, bajas presiones baromtricas y tierras hmedas) influyen en estos gradientes de concentracin y hacen incrementar el flujo de mercurio hacia la atmsfera19. Las condiciones atmosfricas tambin influyen en el transporte del mercurio entre el agua y el aire. As, altos vientos y oleaje incrementan el flujo de mercurio hacia la atmsfera. El papel que juega la vegetacin parece ser ambiguo y necesita de mayor investigacin. Varios estudios indican que la vegetacin participa en el intercambio de mercurio entre los suelos y la atmsfera pero lo hacen de una manera bidireccional, dando lugar a un flujo global casi nulo20,21. Sin embargo, los incendios que se producen con frecuencia en la biosfera juegan un papel fundamental dentro del flujo producido por la vegetacin. Estudios realizados en el rea amaznica sitan los niveles de emisin entre 2 y 9 toneladas al ao por la quema de la selva amaznica brasilea22.
0
13
Re-emisiones naturales Esta denominacin hace referencia a la movilizacin y emisin a la atmsfera de mercurio de origen antropognico depositado previamente en aguas y suelos. La emisin a la atmsfera desde vertidos de mercurio en suelos contaminados, o las emisiones desde aguas contaminadas son ejemplos de estas emisiones antropognicas indirectas23. Este proceso ampla enormemente el tiempo medio de permanencia del mercurio en el medio ambiente. Investigaciones recientes de Lindberg y col.24 muestran ndices de re-emisin de aproximadamente 20% durante un periodo de dos aos, segn mediciones de istopos estables de mercurio en el noroeste de Ontario (Canad). Por su enorme superficie, el sistema marino es de especial importancia en la distribucin, transporte y acumulacin del mercurio y juega un doble papel de fuente y de depsito. Desafortunadamente, dada la cantidad de variables que tienen influencia en el flujo global que se produce en las superficies de los ocanos, existen muy pocos estudios de medidas directas y reales de estos flujos. Las estimaciones realizadas2,25 indican un flujo global de emisin de unas 2.000 toneladas al ao de mercurio hacia la atmsfera. Las superficies de algunos lagos han sido tambin evaluadas para determinar la contribucin de las aguas terrestres al flujo de mercurio hacia la atmsfera26. Estos concluyen que los intervalos de emisin se encuentran entre 3 y 20 ng m-2 h-1. Estos intervalos estn influidos en gran medida por la concentracin de mercurio en los lagos y en menor medida por la temperatura y la radiacin solar. Pocos estudios similares se han llevado a cabo para establecer la contribucin de los ros a esta re-emisin del mercurio limitndose la mayora al estudio de estuarios. De una manera global, se ha estimado que solamente el 10% del mercurio presente en los ros tiene origen antropognico27, aunque a nivel local estas proporciones pueden cambiar enormemente. Comparados con los sistemas acuticos, los flujos producidos en los suelos han sido mucho ms estudiados. Los suelos prximos a grandes focos de emisin de mercurio (como plantas industriales de cloro, generacin de electricidad, etc.) actan como depsitos que acumulan el mercurio emitido. Se ha establecido que cerca del 30% de la emisin anual de mercurio por parte de estos grandes focos antropognicos se deposita dentro de un radio de 5 km28. Pero hay que tener en cuenta que cuando estos suelos dejan de recibir el flujo de la contaminacin antropognica, se convierten en potentes focos de emisin de mercurio29 llegando a valores tan altos de ndices de emisin como 150.000 ng m-2 h-1. Similares estudios de suelos con alto contenido natural de mercurio (Almadn, Espaa) establecen un flujo de entre 600 y 700 ng m-2 h-1. Las tierras cercanas a aguas contaminadas en las que se depositan sedimentos durante inundaciones o subidas peridicas del nivel del agua constituyen otro tipo de suelo
14
contaminado con mercurio, muy comn en estuarios de ros contaminados. La contribucin global de los suelos de la capa terrestre hacia la atmsfera se ha estimado en unas 2.000 toneladas al ao.
1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL
ATMSFERA En la atmsfera, el mercurio se encuentra mayoritariamente (>95%) como vapor metlico (Hg0)30,31,32,33. El resto, aparece en la forma Hg2+ tanto unido a partculas en suspensin como, en menor medida, en forma gaseosa. Debido a la lenta oxidacin del mercurio elemental su tiempo de residencia en la atmsfera es de aproximadamente un ao, tiempo suficiente para que se distribuya sobre todo el planeta antes de su deposicin en la superficie terrestre. Como consecuencia, y aunque las principales emisiones de mercurio proceden de fuentes puntuales localizadas en zonas industriales, la contaminacin por mercurio es global y afecta a zonas remotas del planeta34. La forma oxidada del mercurio (Hg2+) se deposita en un tiempo ms corto que va desde horas a cerca de meses a travs de deposiciones hmedas (precipitaciones) o secas. Se ha encontrado que el escaso Hg2+ que se encuentra en forma gaseosa es depositado por va hmeda de manera mucho ms rpida que el Hg2+ unido a partculas35. Adems, se estima que el Hg2+ unido a partculas ms pequeas tiene tiempos de residencia en la atmsfera muy parecidos al mercurio vapor36. Estudios recientes del mercurio atmosfrico indican que las actividades antropognicas han multiplicado los niveles generales del mercurio en la atmsfera por un factor de 3 desde el comienzo de la era industrial.
SUELOS Y SEDIMENTOS En los ltimos 125 aos se han emitido a la atmsfera casi 200.000 toneladas de mercurio, de los cuales cerca del 95% ha sido depositado en la superficie terrestre, convirtiendo los suelos en el principal depsito de este elemento. Esta reserva se convierte en una continua fuente de mercurio, que continuar emitiendo mercurio hacia la atmsfera durante muchos aos37. Como se ha indicado, los procesos de re-emisin del mercurio a la atmsfera son importantes y vienen controlados principalmente por la transformacin de
15
Hg2+ a Hg0 que tiene lugar en la superficie del suelo por accin de la luz y diversas sustancias hmicas38. Una vez depositadas, las especies de mercurio estn sujetas a un amplio espectro de reacciones qumicas y biolgicas. Las condiciones de pH, temperatura y contenidos de sales y componentes orgnicos del suelo favorecen la formacin de complejos del ion inorgnico (Hg2+) como HgCl2, Hg(OH)2 o complejos orgnicos39. Aunque los complejos inorgnicos son bastante solubles en agua y, por tanto, de gran movilidad, muchos de ellos forman nuevos complejos con la materia orgnica (principalmente con los cidos flvicos y hmicos) y coloides minerales del suelo o sedimento. Son este tipo de complejos los que principalmente definen el comportamiento del mercurio. Otra de las especies que condicionan la qumica del mercurio en el suelo y sedimentos es el muy insoluble sulfuro de mercurio (HgS Ks=10-53 mol2 l-2). Este compuesto de limitada movilidad, es la principal especie presente en los sedimentos contaminados por mercurio40, debido a la reduccin del Hg2+ por parte de bacterias sulfato reductoras bajo condiciones anaerbicas41,42. Por otro lado, el Hg2+ presente en los suelos y sedimentos en determinadas condiciones se transforma a metilmercurio por diversos mecanismos, siendo los procesos microbianos el principal de ellos. Aproximadamente, y segn las caractersticas de los diferentes suelos y sedimentos, entre el 1 y 3% del mercurio se encuentra como metilmercurio. Las especies inorgnicas restantes se hallan mayoritariamente unidas a compuestos orgnicos.
AGUAS El mercurio que llega a un medio natural acuoso lo hace fundamentalmente como Hg ; solo una pequea fraccin (0.15 ng l-1) se introduce directamente como metilmercurio a travs de las precipitaciones43. Estos compuestos pueden ser asimilados por las especies biolgicas presentes en el medio, precipitar bajo formas qumicas diversas en los sedimentos o reducirse a mercurio vapor y vaporizarse para volver nuevamente a la atmsfera. Estas transformaciones dependen de diversos factores medioambientales como la actividad microbiana, la temperatura, disponibilidad de carbono orgnico, la presencia de partculas en suspensin, el oxgeno disuelto y el pH. Como en los suelos, la qumica del mercurio viene determinada por las diferentes variables biolgicas, fsicas y qumicas de las aguas. Por ello, hay que tener en cuenta las condiciones existentes en las aguas superficiales que hacen diferentes las especies de mercurio presentes en aguas continentales (ros, lagos, arroyos), en aguas ocenicas y
2+
16
tambin en los estuarios y costas de los ocanos que son fases intermedias entre las otras dos. En las aguas dulces superficiales de reas no contaminadas, el mercurio se encuentra en concentraciones de 1-20 ng l-1 y se distribuye en varias formas qumicas: mercurio elemental que es voltil pero poco reactivo, especies mercricas y mercurio orgnico, principalmente metilmercurio (MeHg+), dimetilmercurio (Me2Hg), y etilmercurio (EtHg+) en pequeas cantidades. La distribucin de este metal entre la fase acuosa, las fases coloidales y las partculas en suspensin vara espacial y temporalmente. En general, la concentracin de Hg0 es mayor cerca de la interfase aire-agua mientras que los niveles de Hg2+ y MeHg+ son ms altos cerca de los sedimentos. En las aguas dulces continentales no contaminadas, el Hg2+ no se encuentra como ion libre sino formando complejos con OH- (Hg(OH)+, Hg(OH)2, Hg(OH)3-), mientras que en estuarios y ocanos los clorocomplejos (HgCl+, HgClOH, HgCl2, HgCl3-, HgCl2-4) son las especies predominantes. En ambientes anxicos que contengan sulfuro, el mercurio se combina para formar el precipitado de sulfuro (HgS)44. Tambin en disolucin en presencia de sulfuro, se encuentran los complejos de sulfuro (HgS2H2, HgS2H- y HgS22-) como mayoritarios45. Adems, una fraccin de Hg2+ es probable que se encuentre unida a los cidos hmicos. Las reacciones del ion mercrico son relativamente rpidas y se cree que en ellas existen varias especies en equilibrio incluidas aquellas unidas a material particulado. El metilmercurio se comporta en trminos qumicos igual que el mercurio inorgnico, encontrndose principalmente unido a partculas y a la materia orgnica disuelta46. El complejo con cloruro (CH3HgCl) en el medio marino y el hidroxocomplejo neutro (CH3HgOH) en aguas continentales son mayoritarios . En presencia de sulfuro se forma el CH3HgS-, pero ste tiene menos importancia que los complejos sulfricos del mercurio inorgnico. En el ocano las especies organomercuriales se generan por debajo del termoclinae, a profundidades comprendidas entre los 300-500 m en las que los niveles de oxgeno son inferiores a 100 M. En cambio, la transformacin y eliminacin de estas especies tiene lugar en las aguas superficiales. En la Tabla 2 aparecen recogidas las concentraciones de Hg total en distintas matrices medioambientales.
17
Tabla 2. Concentraciones medias de mercurio total en diferentes muestras medioambientales
Medios Aire Agua de lluvia Medio rural Medio urbano Medio rural Medio urbano Ocano no contaminado Ro no contaminado Ro contaminado Lagos ricos en c. hmicos No contaminado Contaminado Ocano no contaminado Ocano contaminado Baha de Minamata Ro contaminado Sin contaminar (ro) Sin contaminar (ocano) Contaminados
Mercurio total 1-10 ng m-3 50-170 ng m-3 4-90 ng l-1 100-1000 ng l-1 0.5-5 ng l-1 < 5 ng l-1 10-200 ng l-1 1-20 ng l-1 < 200 ng g-1 0.2- 100 g g-1 50-500 ng g-1 1-100 g g-1 908 g g-1 50-200 g g-1 0.2-1 g g-1 0.01-1 g g-1 1-10 g g-1
Agua
Suelos
Sedimentos
Peces
1.3. CICLO BIOGEOQUMICO DEL MERCURIO Como se ha comentado, los compuestos de mercurio estn muy distribuidos en los distintos compartimentos o estados que completan su ciclo global. La concentracin, transformacin, movilidad y acumulacin de mercurio en un estado dado depender de numerosos factores tales como el pH, la temperatura, presencia de componentes orgnicos, as como de las actividades microbianas y antropognicas. El conjunto de estos procesos constituye el ciclo biogeoqumico del elemento que se esquematiza en la Figura 1.
18
Figura 1. Distribucin del Hg en los diferentes compartimentos medioambientales
Las reacciones de transformacin de las especies de mercurio presentes en la atmsfera rigen, de un modo general, la distribucin y deposicin del mercurio. El principal mecanismo de transformacin entre especies es la oxidacin del Hg0 por el ozono (O3), que ocurre mayoritariamente en las gotas de agua de las nubes47. Hg0(g) Hg0(aq) Hg0(aq) + O3(aq) Hg2+(aq) Hg2+(aq) + partculas o polvo Hg2+(p) Otros mecanismos de oxidacin/reduccin del mercurio por los radicales/especies:
OH, HOCl/OCl-, HO2, H2O2, NO3 se dan tambin en la atmsfera, pero en menor La especie divalente del mercurio, que tiene una constante de Henry mucho ms
extensin . pequea que el mercurio vapor, pasa mucho ms fcilmente a la fase acuosa y se deposita por accin de la lluvia. Este proceso es el mayoritario, pero como se ha indicado existen otros, como la deposicin del mercurio divalente por deposicin seca. Por el
19
contrario, el mercurio vapor no se deposita por va hmeda o seca ya que tiene una alta presin de vapor y una baja solubilidad en agua. Parte del Hg2+ depositado desde la atmsfera, es reducido a Hg0 y nuevamente volatilizado a la atmsfera, establecindose un flujo de Hg0, en especial en aguas ocenicas, volatilizndose de nuevo desde la hidrosfera hacia la atmsfera. Este proceso es uno de los principales reguladores de la concentracin de mercurio en las grandes masas de agua y puede tener lugar mediante dos mecanismos en funcin de la concentracin de Hg2+ en el medio circundante. Cuando esta concentracin es la natural, del orden de unos pocos picogramos, la reduccin es debida a un proceso fotoqumico48, sin embargo en aguas contaminadas, con concentraciones de Hg2+ superiores a 50 pM, el mecanismo predominante es de naturaleza microbiana49. El mecanismo exacto de la fotorreduccin se desconoce aunque se sabe que estn implicados la materia orgnica disuelta (cidos hmicos) y posiblemente el hierro y el manganeso presentes. Este tipo de reacciones producen unas concentraciones de Hg0 que van desde el 5% en aguas continentales al 40% en aguas marinas. El Hg0 se acumula en las aguas superficiales para posteriormente y, como consecuencia del gradiente de concentracin, pasar de nuevo a la atmsfera50. Estudios recientes indican que tambin se producen reacciones de oxidacin de Hg0 a mercurio inorgnico (Hg2+) sobre todo en aguas marinas51, debido a la presencia de partculas de gran tamao que actan como catalizadores y de elevadas concentraciones de cloruro52. La metilacin de mercurio en las aguas naturales y sedimentos es otro de los procesos claves en el ciclo global del mercurio53. La metilacin del mercurio se ve favorecida por la ausencia de oxgeno por ello tiene lugar mayoritariamente en las aguas anaerobias y sedimentos por procesos biticos. Tambin se han propuesto mecanismos alternativos abiticos con metilaciones a travs de la materia orgnica disuelta (cidos hmicos)54 o transmetilaciones con otros derivados organometlicos de estao y plomo55. Otros estudios han identificado bacterias reductoras de sulfuro Desulfovibrio desulfiricans como las principales responsables de la metilacin en los sedimentos anxicos56,57. La cantidad neta de metilmercurio presente en las aguas es el resultado de un balance entre los procesos de metilacin-demetilacin. ste ltimo es tambin un proceso biolgico que implica actividad bacteriana que opone resistencia a los organomercuriales y es factible por la presencia del gen organomercurial liasa que permite a la bacteria romper el enlace mercurio-carbono58. Ambos fenmenos dependen de la disponibilidad del carbono orgnico disuelto fcilmente degradable. El metilmercurio es un producto intermedio y el producto final es el dimetilmercurio, el cual es inestable a pH bajo, produciendo metilmercurio. Es por ello que esta especie slo se encuentra en ocanos a grandes profundidades, donde no hay luz y el pH es alto y no en superficies ni en aguas
20
continentales59. La concentracin resultante de metilmercurio nunca excede el 10% del mercurio total en aguas ocenicas y el 20% en aguas continentales. El metilmercurio es particularmente inquietante porque entra a formar parte de la cadena trfica, bioacumulndose, y por lo tanto biomagnificndose. De hecho, en muchos peces de agua dulce y salada, as como en mamferos acuticos, se han encontrado concentraciones de mercurio muy superiores a las de las aguas circundantes (factores de 105-106).
21
Importancia toxicolgica
2. IMPORTANCIA TOXICOLGICA DEL MERCURIO Y SUS DERIVADOS El significado biolgico del mercurio se limita a su toxicidad, ya que no se han encontrado evidencias de que sea un elemento esencial para el hombre, flora o fauna. La toxicidad del mercurio depende de su forma qumica y, por lo tanto, los sntomas y signos varan segn se trate de exposicin al mercurio elemental, a los compuestos inorgnicos de mercurio, o a los compuestos orgnicos de mercurio (en particular los compuestos de alquilmercurio como sales de metilmercurio y etilmercurio). Los derivados orgnicos del mercurio y el mercurio vapor se han identificado en general, como especies ms peligrosas que las especies inorgnicas dado que la permeabilidad de las membranas biolgicas es mayor para stos. Debido a sus efectos adversos, junto a dos importantes episodios de contaminacin por mercurio que tuvieron lugar al sur de Japn (Minamata, 1940-1960) y en Irak (1971-1972), se han realizado numerosos estudios sobre el metabolismo y los efectos txicos del mercurio en animales y seres humanos. Las investigaciones de la ltima dcada muestran que los efectos txicos pueden generarse a concentraciones cada vez ms bajas, y podran afectar a ms poblacin mundial de lo que se haba pensado. Por ello, el grado de toxicidad de estas sustancias, sobre todo la del metilmercurio, est actualmente en discusin.
2.1. COMPUESTOS INORGNICOS De los compuestos inorgnicos, el catin Hg2+ es el que se considera ms txico. La qumica del Hg2+ dentro de los seres vivos viene determinada por su alta tendencia a unirse a los grupos tiol que abundan en los diferentes tejidos, bloqueando de este modo grupos biolgicos esenciales. En concreto, se une a los grupos SH de los restos del aminocido cistena que constituye el centro cataltico activo de determinadas enzimas por lo que se inhibe su actividad. La principal va de llegada de estos compuestos a los seres vivos son las pequeas partculas de polvo o aerosol, o tambin por su presencia en alimentos o agua60. La toxicidad de esta especie viene especialmente definida por su solubilidad y, por tanto, las especies menos solubles, como el HgS o HgSe, prcticamente no presentan toxicidad mientras que sales de cloruro del mercurio son las ms txicas. La baja solubilidad incide directamente en la baja absorcin de estas sales en el aparato digestivo, alrededor de un 7%. Sin embargo, estas mismas especies cuando llegan a travs de aerosoles o tambin a travs de la piel (uso de cremas para la cura de la sfilis) son absorbidas con coeficientes muy altos. Una vez incorporado a travs del tracto gastrointestinal o la piel, el Hg2+ tiende
22
a acumularse en los riones donde afecta a los tbulos renales proximales61, mientras que la acumulacin en el cerebro y la placenta son mnimas. Se elimina en su mayor proporcin por la orina, teniendo un periodo de residencia medio dentro del ser humano de unos 42 das62. Los casos crnicos terminan desarrollando serias deficiencias renales, trastornos psquicos, fatiga, prdida de memoria, etc. En cuanto a carcinogenicidad, la evaluacin general del IARC (Internacional Agency for Research on Cancer, 1993) concluye que el mercurio metlico y los compuestos inorgnicos de mercurio no son clasificables en cuanto a carcinogenicidad para los seres humanos (grupo 3).
2.2. MERCURIO ELEMENTAL La volatilidad del mercurio elemental, as como su continua emisin derivada de la aplicacin industrial de mercurio hacen de l un txico potencial. La mayora de la informacin que se posee de la toxicidad del mercurio vapor proviene de los estudios de exposiciones al mercurio en lugares de trabajo o accidentes, y son stas tambin las principales causas de contaminacin. Los efectos que tiene el mercurio vapor sobre la salud se revisaron ampliamente en una reunin del Comit de Expertos de la Organizacin Mundial de la Salud63. El mercurio vapor, siendo un gas monoatmico sin carga, tiene una alta difusibilidad y es soluble en lpidos, atravesando con gran facilidad las paredes celulares. Una vez que ha atravesado la pared celular, el mercurio elemental puede oxidarse en los tejidos corporales a la forma divalente inorgnica por medio de perxido de hidrgeno y catalasa64. Este es el camino mayoritario de oxidacin, aunque no el nico. Una vez oxidado el Hg0, el ion mercrico Hg2+ es la especie txica, y la diferencia en las pautas de toxicidad que presenta con las intoxicaciones con el mercurio inorgnico que antes se han descrito son atribuidas a las diferencias en la movilidad y la deposicin en los tejidos. La va principal de exposicin al mercurio elemental es por inhalacin de sus vapores. Cerca del 80% de los vapores inhalados es absorbido por los tejidos pulmonares. Este vapor tambin penetra con facilidad la barrera del cerebro y placenta y su neurotoxicidad est bien documentada. Sin embargo, la absorcin intestinal de mercurio elemental es baja. El mercurio absorbido tiene un periodo de residencia medio de 58 das, aunque en el rea del cerebro este periodo es slo de 21 das . El mercurio as absorbido es eliminado en parte a travs de la orina y una pequea parte a travs del aire exhalado. Se han observado trastornos neurolgicos y de comportamiento en seres humanos tras inhalacin de vapor de mercurio elemental. La exposicin aguda a niveles altos de
23
mercurio vapor (>1.000 g m-3) puede causar neumona y otros signos de dao pulmonar. Exposiciones ms largas a niveles menores (100 g m-3) dan lugar a gingivitis, temblores de manos y eretismo (desordenes de personalidad y psicolgicos que incluyen delirio, alucinaciones, cambios de comportamiento, etc.). Las exposiciones crnicas a niveles ms bajos (25-100 g m-3) estn asociadas con sntomas ms suaves como temblores casi imperceptibles, irritabilidad, insomnio o lasitud. Tambin se ha observado disminucin en la memoria a corto plazo o disminucin de la velocidad de respuesta nerviosa. En estos niveles, el mercurio vapor produce afecciones renales. Mucho se ha discutido en el mundo cientfico sobre los intervalos de exposicin que proporcionan las amalgamas de mercurio que se utilizan en la reparacin de las dentaduras65 y, aunque no se ha llegado ningn resultado concluyente, se han encontrado correlaciones entre las superficies de estas amalgamas y los niveles de mercurio en orina66. Lo que todava constituye un misterio es cmo el mercurio vapor que se convierte a Hg
2+
dentro de las paredes celulares puede actuar sobre la multitud de enzimas que
determinan el comportamiento del ser humano. Ningn otro metal muestra semejante actividad sobre el sistema nervioso central y posiblemente muchas drogas alucingenas no tengan efectos tan notorios67.
2.3. COMPUESTOS ORGANOMERCRICOS Entre los compuestos orgnicos de mercurio, el metilmercurio ocupa un lugar especial porque gran parte de la poblacin est expuesta a l, y su toxicidad est mejor caracterizada que la de otros compuestos orgnicos de mercurio. Se considera que, dentro del grupo de los compuestos orgnicos de mercurio, los compuestos de alquilmercurio (en particular, etilmercurio y metilmercurio) son similares en cuanto a toxicidad. En cambio, otros compuestos orgnicos de mercurio, como el fenilmercurio, se asemejan ms al mercurio inorgnico en lo que respecta a toxicidad. La bioqumica del metilmercurio en los seres vivos es muy similar a la del mercurio inorgnico, mostrando una alta afinidad por los grupos tiol presentes en los tejidos. Dentro de los seres vivos, el metilmercurio se encuentra unido a los grupos tioles tanto de grandes molculas (protenas) como de pequeas (cistena y glutanina). Los complejos con estas molculas de bajo peso molecular son responsables de la alta movilidad que tiene el metilmercurio a travs de tejidos y clulas, llegando fcilmente al cerebro. El metilmercurio se absorbe eficazmente a travs de la pared intestinal, pasando a la sangre y de ah al resto de rganos y tejidos. Una vez en los diferentes rganos se
24
acumula y se va transformando poco a poco en mercurio a travs de radicales libres que rompen el enlace mercurio-carbono. Hay tejidos en los que el metilmercurio se acumula ms eficazmente que en otros. El pelo, con concentraciones de 200:1 con respecto a la sangre, o el cerebro (20:1) son dos ejemplos claros. Actualmente muchos grupos de investigacin usan la concentracin de mercurio y metilmercurio en el pelo como un indicador de la exposicin e intoxicacin de estos compuestos. Este compuesto se caracteriza por atravesar rpidamente la barrera placentaria y la barrera hematoenceflica, y adems, es un neurotxico que puede afectar muy negativamente el desarrollo del cerebro. Adems, basndose en su evaluacin general, el Centro Internacional de Investigacin sobre el Cncer (International Agency for Research on Cancer, IARC, 1993) considera que los compuestos de metilmercurio pueden ser carcingenos para los seres humanos (grupo 2B). El metilmercurio tiene por lo tanto, efectos adversos para los seres humanos y el medio ambiente. La caracterstica ms remarcable de la toxicidad del metilmercurio en animales en general y mamferos en particular es el dao selectivo que causa al sistema nervioso central68 y en menor medida al sistema perifrico. El metilmercurio consigue acabar muy particularmente con una gran cantidad de neuronas del cerebelo, de la corteza visual y otras reas. El origen de este fenmeno selectivo est todava bajo estudio. Las principales patologas que presenta son de dficits sensoriales y motores, cambios en el comportamiento, ataxia muscular, prdida de campos visuales y, en menor medida, espasmos que aparecen al continuar la intoxicacin69. Una vez prohibido el uso de metilmercurio como fungicida, tal y como se observ en Minamata y Niigata (Japn) el mayor riesgo para los humanos viene a travs del consumo de pescado contaminado. El metilmercurio es particularmente inquietante porque sufre un proceso de bioacumulacin a travs de la cadena alimenticia que hace que de concentraciones de ng l-1 en aguas se pase a g g-1 en los peces depredadores, siendo el consumo de stos muy peligroso.
25
Fuentes de exposicin
3. FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO
3.1. EXPOSICIN OCUPACIONAL Y ACCIDENTES MEDIOAMBIETALES La exposicin humana actual es un fiel reflejo de las fuentes naturales de mercurio, junto con el constante cambio que el hombre ha dado a este metal. La elevada produccin, dispersin y acumulacin de mercurio en el medio ambiente propicia el deterioro y la contaminacin del mismo, lo cual representa un peligro potencial para la supervivencia de los seres vivos y el hombre. Esta situacin ha generado la aparicin en el ser humano de ciertos desrdenes clnicos ocasionados por la toxicidad de los compuestos de mercurio. La poblacin ms afectada est constituida por personas sometidas ambiental u ocupacionalmente a la inhalacin de vapores metlicos, personas que ingieren alimentos contaminados o que habitan en reas circunvecinas a fuentes contaminantes. Entre los metales pesados, el mercurio es el contaminante ambiental y/u ocupacional ms peligroso no slo por la gravedad de las enfermedades que causa sino por los efectos irreversibles que provoca en los seres humanos. Por lo tanto, es importante monitorizar clnica y toxicolgicamente a los individuos que ocupacionalmente se encuentran expuestos a este metal; as como tambin, a las personas que habitan en zonas prximas a las industrias emisoras de Hg.
EXPOSICIN OCUPACIONAL El Grupo de Expertos del Mercurio designado por la Organizacin Mundial de la Salud, en su ultima publicacin en relacin al mercurio, afirma: "El mayor riesgo para la salud humana derivado de la presencia del mercurio en la Naturaleza se centra en la exposicin ocupacional a este metal" 4. Los ambientes de trabajo considerados como fuentes potenciales ocupacionales de exposicin al mercurio incluyen: minera del cinabrio, plata y oro, industrias del clorolcali, y la industria relacionada con la manufacturacin y/o uso de instrumentos que contengan mercurio lquido70, siendo la principal ruta de exposicin ocupacional de mercurio la inhalacin en fase vapor de las atmsferas de los puestos de trabajo71. Segn RTES (Registro de los Efectos Txicos de las Sustancias Qumicas)72 un total de 151.947 trabajadores estuvieron potencialmente expuestos al mercurio o varios compuestos de mercurio en EEUU en el ao 1998. Algunos casos significativos de secuelas muy graves ocasionadas por la exposicin ocupacional se detallan a continuacin.
26
La capacidad para formar amalgamas fue la principal aplicacin del mercurio en las antiguas civilizaciones. Fenicios y Cartaginenses (2.700 A.C.), que comercializaban Hg de las minas de Almadn (Espaa) ya conocan el proceso de amalgamacin y las propiedades txicas del mercurio, puesto que en ellas slo trabajaban esclavos y criminales13 debido a que la esperanza de vida media de un minero se encontraba en torno a los seis meses. La primera apreciacin de los efectos txicos del vapor de mercurio como riesgo laboral aparece en el trabajo de Ulrico Ellenber Von der Grifftigen Bensen Terupffen von Reiichen der metal (1473) o 60 aos ms tarde en el escrito de Paracelso Von der Bergsucht und auderen Baykrnakheiten (1553). Pero tal vez, la imagen ms popular es la transmitida por Lewis Carrol en Alicia en el Pas de las Maravillas. El famoso sombrerero loco no era sino una vctima del riesgo laboral por exposicin al mercurio, y refleja la constatacin de los efectos del envenenamiento habitual de estos artesanos que utilizaban soluciones de nitrato de mercurio para fabricar sombreros de fieltro. La revolucin industrial y tecnolgica de los siglos XIX y XX trajo consigo un gran nmero de nuevas aplicaciones para el mercurio y muchos de sus compuestos, pero tambin otras tantas posibles vas de contaminacin medioambiental y exposicin ocupacional. La exposicin de trabajadores a concentraciones de mercurio que excedan los lmites mximos permitidos (25 g m-3) ha ocasionado distintas patologas en distintos pases. La exposicin de mujeres rusas empleadas de una fundicin, donde la concentracin del mercurio en aire era de 80 g m-3, se asoci a un incremento significativo en el nmero de abortos si se compara con los valores basales63. En Italia, en una fbrica de lmparas, las mujeres expuestas a una concentracin media de 50 g m-3 durante 4 aos, y a una concentracin de 10 g en los aos sucesivos mostraron anormalidades congnitas73. En Polonia, y teniendo en cuenta que los dentistas pueden estar expuestos al mercurio como resultado de la preparacin de amalgamas dentales se llev a cabo un estudio con 81 dentistas, y se detect no slo un incremento en el nmero de abortos, sino en la aparicin de malformaciones (espina bfida)74.
ACCIDENTES El mercurio se conoce desde hace ms de 3500 aos, pero su uso se ha
extendido a partir de la revolucin industrial y en especial en los ltimos 150 aos. En 1881 se descubri que el sulfato de mercurio catalizaba la conversin de acetileno en acetaldehdo13. Entre los aos 1920 y 1950, una fbrica qumica japonesa emple el mercurio como catalizador para la produccin de acetaldehdo y cloruro de
27
vinilo. El metilmercurio, un subproducto de estos procesos catalticos, fue liberado a la Baha de Minamata, en la costa suroeste de Kyushu (Japn)75. Este compuesto se concentr en el mar Shirunui, donde por la accin del plankton y otros microorganismos se bioacumul a lo largo de toda la cadena trfica76,77. Los peces acumularon MeHg sin sufrir ningn sntoma de toxicidad, pero comenzaron a diagnosticarse misteriosos casos de enfermedades neurolgicas en familias de pescadores y en los animales domsticos que con ellos vivan. Desgraciadamente, no fue hasta el ao 1959 cuando descubrieron el origen de este desastre ecolgico. Durante cuatro dcadas se liberaron cerca de 150 toneladas de MeHg, originando durante los aos 60 y 70 la muerte de 61 personas y la hospitalizacin y posteriores secuelas para ms de 2.200. Las principales patologas fueron dao crnico cerebral, retraso mental, enfermedades hepticas, hipertensin y modificacin del metabolismo de nios cuyas madres se expusieron a los peces contaminados. Se dio lugar a una enfermedad del sistema nervioso central conocida como Enfermedad Minamata78. Un segundo caso epidmico de esta enfermedad se dio en Niigata (Japn) donde el pescado procedente del ro Agano se contamin de forma anloga, originando resultados catastrficos similares a los anteriormente descritos76,77. A comienzos del siglo XX las potentes propiedades fungicidas de los compuestos organo-mercuriales llevaron a su uso en la industria y agricultura. El fenilmercurio se emple extensamente como biocidas en la pulpa de papel y en las industrias de pintura de ltex, y para tratar grano en agricultura. Del uso del mercurio como fungicida tambin se derivan distintos episodios de contaminacin detectados en Irak, Pakistn, Ghana, Rusia, Nuevo Mjico y Guatemala79,80,81. Uno de los mayores desastres para la salud humana por contaminacin qumica tuvo lugar en Irak en el invierno de 1971-72. La importacin de una gran cantidad de grano por la escasez producida por las inundaciones y el posterior tratamiento por error con metilmercurio como fungicida de este grano condujo a la hospitalizacin de cerca de 6.500 personas y la muerte, segn las estadsticas oficiales, de 459 personas, aunque datos posteriores evaluaron un nmero mucho mayor82. Desde entonces el metilmercurio ha sido prohibido como biocida en semillas y plantas y se ha eliminado en algunos de los procesos industriales en los que se usaba. Al haber cada vez ms conciencia sobre los posibles efectos perjudiciales del mercurio en la salud y el medio ambiente, el nmero de usos (de mercurio orgnico e inorgnico) as como la cantidad de mercurio utilizado han disminuido sustancialmente en muchos de los pases industrializados, sobre todo durante las ltimas dos dcadas, aunque desgraciadamente, siguen dndose casos de envenenamiento.
28
Recientemente, el empleo de un producto de belleza fabricado en Mjico ha originado mltiples casos de envenenamiento, puesto que dicho producto contena cloruro de mercurio (calomel) en concentraciones 6-8%83.
3.2. EXPOSICIN A TRAVS DE LA DIETA: BIOACUMULACIN Aunque las condiciones locales pueden influir en la exposicin al mercurio de ciertas poblaciones, la mayora de la poblacin est expuesta principalmente al mercurio por medio de los alimentos. Un factor muy importante de los efectos del mercurio en el medio ambiente es su capacidad para acumularse en organismos y ascender por la cadena trfica. Hasta cierto punto, todas las especies de mercurio pueden llegar a acumularse, pero el metilmercurio se absorbe y acumula ms que otras especies. El metilmercurio entra a formar parte de la cadena alimentaria y se acumula a travs de sta3, llegando a factores de 105-106. En una primera etapa, el metilmercurio es absorbido por el zooplancton y pequeos microorganismos presentes en los medios acuosos para despus pasar a pescados y moluscos. En este proceso, se pasa de concentraciones en el agua de ng l-1 a concentraciones en los peces de g g-1. La explicacin de esta bioacumulacin frente al comportamiento de otras especies de mercurio no es totalmente conocida. Algunos estudios indican que la diferencia responde a que el mercurio inorgnico se une a las paredes de las membranas de las diatomeas marinas mientras que el metilmercurio se acumula en la parte soluble de las diatomeas84. Los organismos que se alimentan de estas diatomeas normalmente no asimilan las paredes celulares, con lo que excreta el mercurio inorgnico, quedndose con el metilmercurio. Se ha demostrado que otros organismos monocelulares y sus depredadores tienen un comportamiento parecido85. La biomagnificacin que sufre en etapas superiores de la cadena alimentaria, sobre todo en peces, se explica considerando la alta especificidad de la absorcin del metilmercurio en el intestino, mientras que el mercurio inorgnico es solamente absorbido en la interfase de microvilli, resultando una tasa mucho ms baja de absorcin86. Adems, la mayor parte del metilmercurio forma enlaces covalentes con grupos sulfhidrilo proteico, con lo que la vida media de eliminacin resulta larga (aproximadamente de dos aos). Como consecuencia, se genera un enriquecimiento selectivo de metilmercurio (en comparacin con el mercurio inorgnico) cuando se pasa de un nivel trfico al siguiente nivel trfico superior (Tabla 3).
29
Tabla 3. Biomagnificacin de mercurio inorgnico y metilmercurio en la cadena alimentaria85
Nivel trfico Agua Fitoplancton Zooplancton Pescados
Mercurio Inorgnico 10 10 10
5.7 5.9
Metilmercurio 1 10 10
5 5.5
% Metilmercurio 10 15 30 95
105
106.5
Por ello, la Organizacin Mundial de la Salud estableci como la fuente de exposicin de metilmercurio ms significativa a la dieta, particularmente la dieta a base de pescados y mariscos (Tabla 4). Tabla 4. Ingesta media diaria y retencin de los compuestos de mercurio por la poblacin general3,63
Fuente de exposicin Aire Alimentos Pescado Otros
Mercurio elemental vapor 0.030 (0.024) 0 0 0 3.8-21 (3-17) 3.9-21 (3-17)
Compuestos de mercurio inorgnico 0.002 (0.001) 0.600 (0.042) 3.6 (0.25) 0.050 (0.0035) 0 4.3 (0.3)
Metilmercurio 0.008 (0.0064) 2.4 (2.3) 0 0 0 2.41 (2.31)
Agua potable Amalgamas dentales Total
*Nota: Datos estimados de la ingesta diaria en g da-1 por la poblacin general no expuesta ocupacionalmente al mercurio. Los nmeros en parntesis reflejan la cantidad estimada retenida en el cuerpo humano de un adulto.
En muchas partes del mundo, el pescado constituye un componente muy valioso de la dieta humana, ya que proporciona nutrientes (protenas y cidos grasos omega-3, entre otros) que, por regla general, no se encuentran en otras fuentes alimenticias. El pescado se suele exportar a diversas naciones de todo el mundo, a lugares muy alejados de su lugar de origen. Por lo tanto, la contaminacin con mercurio de lagos, ros y especialmente ocanos constituye una importante amenaza para esta fuente de alimentos
30
y es una cuestin verdaderamente mundial, que afecta a las industrias pesqueras y a los consumidores de pescado de todo el mundo. Los peces depredadores ms grandes, como el lucio, tiburn, sierra, lucioperca americana, barracuda, atn, pez espada y aguja, as como las focas y ballenas dentadas, contienen las concentraciones ms altas de mercurio. Los datos existentes indican que el mercurio est presente en todo el mundo (especialmente en peces) en concentraciones en algunos casos perjudiciales para los seres humanos. Tales niveles han ocasionado que en algunos pases se formulen recomendaciones sobre el consumo de pescado y, en algunos casos, de mamferos marinos, para que la poblacin, sobre todo los subgrupos vulnerables (como mujeres embarazadas y nios pequeos) reduzca o evite el consumo de ciertos tipos de pescado. No es probable que el consumo moderado de pescado (con niveles bajos de mercurio) ocasione exposiciones de consideracin. En cambio, la poblacin que consume grandes cantidades de pescados o mamferos marinos contaminados puede quedar muy expuesta al mercurio y, por consiguiente, se encuentra en riesgo. Existen muchos factores que determinan la exposicin y el riesgo al metilmercurio del consumo de pescado, como entre otros, las diferentes especies de pescados consumidas, la cantidad, y la frecuencia de este consumo. Como es natural, hay una gran variabilidad entre diferentes personas en la alimentacin y en concreto, en el consumo de pescado, lo que implica una gran variabilidad en la exposicin a metilmercurio en la poblacin. La dosis de referencia (RfD) es la cantidad de metilmercurio que tomada diariamente durante un periodo largo de tiempo, se considera que no tiene efectos adversos sobre la salud de los humanos, incluidas las subpoblaciones ms sensibles. A una exposicin igual o menor que la RfD no se esperan efectos sobre la salud. Actualmente el RfD determinado por la Agencia de Proteccin Medioambiental de los EEUU (US-EPA)87 basado en los estudios derivados a raz de la intoxicacin sufrida por la poblacin iraqu en 1971 es de 1 g kg-1 da-1. Estudios realizados ms recientemente88 con poblaciones de las Islas Seychelles, cuya ingesta de metilmercurio se puede asemejar a la que podra sufrir cualquier otra poblacin a travs del consumo pescado, aconsejan bajar esos lmites a 0.5 g kg-1 da-1 o incluso menores89, como actualmente ha establecido la Unin Europea (0.3 g kg-1 da-1). En la actualidad adems del consumo directo de pescado se ha de tener en cuenta que se emplean productos derivados de la pesca en la alimentacin animal debido a su alto contenido en minerales y a que proporciona una fuente rica de protenas. La utilizacin de harinas de pescado en la crianza de aves ha supuesto una serie de ventajas como: rpido crecimiento y mejor conversin del alimento, incremento de la inmunidad, mejor desarrollo del sistema nervioso y estructura sea, etc. Por ello, la presencia de mercurio en productos de consumo animal est aumentando considerablemente.
31
El empleo de piensos que contengan harinas de pescado puede originar niveles de mercurio no deseados, puesto que incluso bajos niveles de mercurio pueden causar su acumulacin por encima de 0.033 mg kg-1 (lmite permitido en la mayora de los pases para alimentos no derivados de la pesca)90. Por lo tanto, la carne procedente de animales alimentados con productos derivados de la pesca podra contribuir a la exposicin del hombre al mercurio91. De hecho, este tipo de exposicin podra explicar los altos valores de MeHg encontrados en individuos con un bajo consumo de pescado y tambin la posible influencia del consumo de aves alimentadas con harinas de pescado en las concentraciones de MeHg encontrada en cordn umbilical humano en un estudio realizado en Suecia92.
32
Referencias bibliogrficas
1
Expert panel on Mercury Atmospheric Processes, 1994, Mercury atmospheric processes:
a synthesis report. EPRI Report No TR-104214. Electric Power Research Institute, Palo Alto, California.
2 3
Mason R.P., Fitzgerald W.F., Morel M.M., Geochem. Cosmochim. Acta, 1994, 58, 3191. WHO (World Health Organization), Methylmercury Vol. 101, IPCS International Program
on Chemical Safety, 1990, World Health Organization, Ginebra.

4
Evaluacin mundial sobre el mercurio. Programa de las naciones unidas para el medio Mason R.P., Reinfelder J.R., Morel F.M.M., Mercury as a global pollutant. Proceedings of
ambiente, 2002, PNUMA Productos Qumicos, Ginebra, Suiza.

5
the Third International Conference Whistler, British Columbia: Bioaccumulation of mercury and methylmercury, 1995, pp 915-921. Porcella D.B., Wheatley B. (Eds). Kluwer Academic Publishers, Boston, EEUU.
6 7 8
Camargo J.A., Chemosphere, 2002, 48, 51. Stein E.D., Cohen Y., Winer A.M., Crit. Rev. Environ. Sci. Technol., 1996, 26(1), 1. Bullock O.R., Langrangian modelling of mercury air emission, transport and deposition:
An analysis of model sensitivity to emissions uncertainty, 1997, Atmospheric Sciences Modelling Division Air Resources Laboratory, National Oceanic and Atmospheric Administration, Research Triangle Park, NC.
9
Boening D.W., Chemosphere, 2000, 40, 1335. Schroeder W.H., Munthe J., Atmospheric Environ., 1998, 32(5), 809. Lin S., Pehkonen S.O., Atmospheric Environ., 1999, 33, 2067. Rasmussen P.E., Environ. Sci. Technol., 1994, 28, 2233. Clarkson T.W., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1997, 34(3), 369. Lindqvist O., Jernelv A., Johansson D., Rodhe H., Mercury in the Swedish environment:
10 11 12 13 14
global and local sources, 1984, SNV PM 1816, Swedish Environmental Protection Board, S-171 85 Solna, Sweden.
15 16 17
Gavis J., Ferguson J.F., Water Res., 1972, 6, 986. Varemkap J.C., Buseck P.R., Appl. Geochem., 1986, 1, 65. Fitzgerald W.F., Mercury Emissions from Volcanoes, 1996, 4th International Conference Kim K.H., Lindberg S.E., Meyers T.P., Atmos. Environ., 1995, 29, 267. Advokaat E.M., Lindberg S.E., Effect of Rainfall Exclusion on Air/Surface Exchange
on Mercury as a Global Pollutant. Book of Abstract. Hamburg, Agosto 4-8.

18 19
Rates of Mercury Over Forest Soils, 1996, 4th International Conference on Mercury as a Global Pollutant. Book of Abstract. Hamburg, Agosto 4-8.
20 21
Lindberg S.E., Meyers T.P., Munthe J., Water, Air and Soil Pollut., 1996, 85, 2265. Fleck J.A., Grigal D.F., Nater E.A., Water, Air and Soil Pollut., 1999, 115, 513.
33
22
Lacerda L.D., Prieto R.G., Marins R.V., Azevedo S.L.C., Pereira M.C., Anthropogenic
Mercury Emissions to the Atmosphere in Brazil, 1995, Proceeding of International Conference on Heavy Metals in the Environment. Hamburg.
23
Ebinghaus R., Tripathi R.M., Wallschlger D., Lindberg S.E., Mercury Contaminated
Sites: Natural and Anthropogenic Mercury Sources and Their Impact on the Air-Surface Exchange of Mercury on Regional and Global Scales, 1999, Ebinghaus R., Turner R.R., de Lacerda L.D., Vasiliev O., Salomons W. (Eds). Springer-Verlag, Berlin.
24
Lindberg S., Brooks S., Lin J., Abstracts of Papers of American Chemical Society 222 Vandal G., Fitzgerald W.F., Rolfhus K., Russ C., Lamborg C., Sources and Cycling of
66-envr, 2001 part 1 Agosto.

25
Mercury and Methylmercury in Long Island Sound: Preliminary Results, 1996, 4th International Conference on Mercury as a Global Pollutant. Book of Abstracts. Hamburg, Agosto 4-8.
26
Schroeder W.H., Global and Regional Mercury Cycles. Sources, Fluxes and Mass
Balances: Estimation of Atmospheric Input and Evasion Fluxes to and from the Great Lakes, 1996, Baeyens W., Ebinghaus R., Vasiliev O. (Eds). Kluwer Academic Publishers. Netherlands.
27
Cossa D., Coquery M., Gobeil C., Martin J.M., Global and Regional Mercury Cycles.
Sources, Fluxes and Mass Balances: Mercury Fluxes at Ocean Margins, 1996, Baeyens W., Ebinghaus R., Vasiliev O. (Eds). Kluwer Academic Publishers. Netherlands.
28
Ebinghaus R., Krger O., Global and Regional Mercury Cycles. Sources, Fluxes and
Mass Balances: Emission and Local Deposition Estimates of Atmospheric Mercury in North Western and Central Europe, 1996, Baeyens W., Ebinghaus R., Vasiliev O. (Eds). Kluwer Academic Publishers, Netherlands.
29 30
Lindberg S.E., Nature, 1977, 268, 133. Fitzgerald W.F., Global Biogeochemical Cycling of Mercury, 1996, Presentado en la Slemr F., Schuster G. Sller W., J. Atmospheric Chem., 1985, 3, 407. Schroeder W. H., Yarwood G., Nik H., Water, Air and Soil Pollution, 1991, 56, 653. Morel F.M.M., Kraepiel A.M.L, Amyot M., Annu. Rev. Ecol. Syst., 1998, 29, 543. Fitzgerald W.F., Mason R.P., Metal Ions Biol. Syst., 1997, 34, 53. Petersen G., Iverfelt ., Munthe J., Atmospheric Environ., 1995, 29, 47. Porcella D.B., Chu P., Allan M.A., Global and Regional Mercury Cycles: Sources, Fluxes
reunin de la DOE/FDA/EPA sobre Metilmercurio y Salud. Bethesda.

31 32 33 34 35 36
and Mass Balances: Inventory of North American Mercury Emissions to the Atmosphere: Relationships to the Global Mercury Cycle, 1996, Baeyens W., Ebinghaus R., Vasiliev O. (Eds). Kluwer Academic Publishers, Netherlands.
37
Swedish EPA. Mercury in the Environment: Problems and Remedial Measures in
Sweden, 1991.
34
38 39 40
Carpi A., Lindberg S.E., Environ. Sci. Tech., 1997, 31, 2085. Schuster E., Water, Air and Soil Pollut., 1991, 56, 667. Barnett M.O., Harris L.A., Turner R.R., Stevenson R.J., Henson T.J., Melton R.C., Revis N.W., Osborne T.R., Holdsworth G., Water Air Soil Pollut., 1989, 45(1-2), 105. Revis N.W., Osborne T.R., Holdsworth G., Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1990, 19, Bloom N.S., Watras C.J., Sci. Tot. Environ., 1989, 87, 199. Dryssen D., Wedboorg M., Water, Air and Soil Pollut., 1991, 56, 507. Jay J.A., Morel F.M.M., Hemond H.F., Environ. Sci. Technol. , 2000, 34, 2196. Hintelmann H., Welbourn P.M., Evans R.D., Environ. Sci. Technol., 1997, 31, 489. Munthe J., Atmos. Environ., 1992, 26A, 1461. Amyot M., Lean S., Mrele G., Environ. Toxicol. Chem., 1997, 16, 2054. Manson R.P., Morel F.M.M., Hemond H.F., Water, Air and Soil Pollut., 1995, 80, 775. Fitzgerald W.F., Vandal G.M., Mason R.P., Dulac F., Mercury Pollution, Integration and
Hoffman D.P., Environ. Sci. Tech., 1997, 31, 3037.

41 42
221.
43 44 45 46 47 48 49 50
Synthesis: Air-Water Cycling of Mercury in Lakes, 1994, Watras C.J., Huckabee J.W. (Eds). CRC Press. Boca Raton.
51 52 53
Yamamoto M.,Chemosphere, 1996, 32, 1217. Amyot M., Gill G.A., Morel F.M.M., Environ. Sci. Technol., 1997, 321, 3606. Ullrich S.M., Tanton T.W., Abdrashitova S.A., Critical Rev. Environ. Sci. Tech., 2001, 31, Weber J.H., Chemosphere, 1993, 26, 2063. Wood J.M., Heavy Metals in the Aquatic Environment: Metabolic Cycles for Toxic Compeau G.C., Bartha R., Appl. Environ. Microbiol., 1985, 53, 498. King J.K., Harmon S.M., Fu T.T., Gladden J.B., Chemosphere, 2002, 46, 859. Oremland R.S., Culberstson C.W., Winfrey M.R., Appl. Environ. Microb., 1991, 57(1), Mason R.P., Sullivan K.A., Deep-Sea Res. Part II- Top. Stud. Oceanogr., 1999, 46, 937. Ratcliffe H.E., Swanson G.M., J. Toxicol. Environ. Health, 1996, 49, 221. Casas J.S., Moreno V., Snchez A., Snchez J.L., Sordo J., Qumica bioinorgnica: Rahola T., Hattaula T., Korolainen A., Ann. Clin. Res., 1973, 5, 214. WHO (World Health Organization), Environmental Criteria 118: Inorganic Mercury 1991, Sichak S.P., Mavis R.D., Finkelstein J.N., Clarkson T.W., J. BioChem. Tox., 1986, 1, 53.
241.
54 55
Elements in the Environment, 1975, Krenkel P.A. (Ed). Pergamon Press, Oxford.
56 57 58
130.
59 60 61
Introduccin a la toxicologa metlica: Cd, Hg y Pb. Ed. Sntesis.

62 63
World Health Organization, Ginebra.

64
35
65
Committee to Coordinate Environmental Health and Related Programs. Dental Amalgam:
a Public Health Service Strategy for Research, Education and Regulation, 1992, Subcommittee on Risk Management. U.S. Public Health Service, Washington D.C.
66 67 68 69 70
Skare I., Engqvist A., Arch. Environ. Health, 1994, 49, 384. Clarkson W., J. Trace Elem. Exp. Med., 1998, 11, 303. Wolfe M.F., Schwarzbach S., Sulaiman R.A., Environ. Toxicol. Chem., 1998, 17, 146. Eto K., Tox. Pathol., 1997, 25, 614. Stokinger H., Patty's Industrial Hygiene and Toxicology, 1981, pp 1769-1792. Clayton NIOSH-TR-044-73. Criteria for recommended standard: Occupational exposure to
G.D., Clayton F.E. (Eds). John Wiley & Sons, Nueva York.
71
inorganic mercury, 1973, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD.
72
RTECS. Registry of Toxic Effects of Chemical Substances (RTECS), 1998, National De Rosis F., Anastasio S.P., Selvaggi L., Beltrame A., Moriani G., Br. INdMed, 1985, 42, Sikorski R., Juszkiewicz T., Paszkowski T., Szprengier-Juszkiewicz T., Int. Arch. Occup. Tsubaki T., Irukayama K., Minamata Disease, 1977, Kodansha Ltd, Tokio. Powell P.P., South Med. J., 1991, 84, 1352. Harada M., Crit. Rew. Toxicol., 1995, 25, 1. Graeme K.A., Pollack C.V., J. Emerg. Med., 1998, 16, 45. Zepp E.A., Thomas J.A., Knotts G.R., Clin Pediatr., 1974, 13, 783. Gotelli C.A., Astolfi E., Cox C., Cernichiari E., Clarkson T.W., Science, 1985, 227, 638. Igata A., Environ Res., 1993, 63, 157. Greenwood M.R., J. Appl. Toxicol., 1985, 5, 148. Villanacci J.F., Beauchamp R., Perotta D.M., Arch. Dermatol., 1996, 13, 1533. Mason R.P., Reinfelder J.R., Morel F.M.M., Environ. Sci. Technol., 1996, 30, 1835. Watras C.J., Bloom N.S., Limnol. Oceanogr., 1992, 37, 1313. Boudou A., Ribeyre F., Metal Ions Biol. Syst., 1997, 34, 289. Mercury Study Report to Congress. Vol. V: Health Effects of Mercury and Mercury Davidson P.W., Myers G.J., Cox C., Axtell C., Shamlaye C., Sloane-Reeves J.,
Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH). Computer database online.
73
488.
74
Environ. Health, 1987, 59, 551.

75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
Compounds. 1997, USEPA.(http://www.epa.gov/ttn/oarpg/t3/reports/volume5.pdf)

88
Cernichiari E., Needham L., Choi A., Wang Y., Berlin M., Clarkson T.W., JAMA, 1998, 280, 701.
89
Clewell H.J., Gearhart J.M., Gentry P.R., Covington T.R., VanLandingham C.B., Crump
K.S., Shipp A.M., Risk Anal., 1999, 19, 547.
36
90
Savage G.P., Mercury in Fish and Fishmeals, 1992, Trace Elements: Roles, risks and Lindberg A., Ask Bjornberg K., Vahter M., Berglund M., Environ. Res., 2004, 96, 28. Ask Bjornberg K., Vahter M., Petersson-Graw K., Glynn A., Cnattingius S., Darnerud
proceedings of the New Zealand trace elements group conference, 11-22.

91 92
P.O., Atuma S., Aune M., Becker W., Berglund M., Environ. Med., 2003, 111, 637.
37
Se
1.1. EMISIONES 1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL 1.3. CICLO BIOGEOQUMIICO DEL SELENIO
2.
RELEVANCIA BIOLGICA DEL SELENIO

2.1. ESENCIALIDAD 2.2. EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE SELENIO 2.3. EFECTOS DEL EXCESO DE SELENIO: TOXICIDAD DEL ELEMENTO 2.4. METABOLISMO DEL SELENIO EN ANIMALES SUPERIORES
3.
FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA Y SU BIODISPONIBILIDAD

3.1. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA 3.2. BIODISPONIBILIDAD DEL SELENIO
4.
SELENIO: ELEMENTO ESENCIAL PARA LOS SERES VIVOS
Captulo II
Se en el medio ambiente
SELENIO: ELEMENTO ESENCIAL PARA LOS SERES VIVOS

El selenio (Se) es un elemento traza esencial de inters clnico y nutricional, cuyas funciones biolgicas (antioxidante y cataltica) se ejercen a travs de las selenoprotenas. Es necesario para el funcionamiento adecuado del sistema inmune, podra tener efectos beneficiosos en el tratamiento del SIDA y parece ser un oligoelemento esencial para contrarrestar la virulencia de la hepatitis. Por otro lado, una ingesta adecuada de selenio puede prevenir el riesgo de padecer cncer. Adems, en el contexto de sus efectos sobre la salud, el bajo aporte de selenio en algunas partes del mundo, entre los que se encuentran algunos pases europeos, es motivo de preocupacin. Por todo ello, es de gran inters el conocimiento de los diferentes procesos fsicos, qumicos y bioqumicos en los que este elemento y sus especies estn implicados. Este hecho queda reflejado por el gran inters que el selenio est despertando en los ltimos aos en la comunidad cientfica por su incidencia en la salud pblica.
1.1. EMISIONES
Las fuentes que contribuyen a la presencia del elemento en la atmsfera pueden ser de origen natural o antropognico. Los procesos de emisin natural de selenio incluyen la erosin de las rocas y suelos, emisiones volcnicas y la actividad de microorganismos y plantas1. Por su parte, el gas volcnico es la ms importante de las fuentes naturales seguido de los procesos de biometilacin del selenio presente en suelos, plantas, aguas y sedimentos por la accin de bacterias, hongos, algas y plantas superiores que liberan compuestos voltiles de selenio fundamentalmente dimetilselenio (DMSe), aunque tambin dimetildiselenio (DMDSe) y otras especies similares2. Las emisiones naturales del selenio a la atmsfera constituyen un proceso fundamental dentro del ciclo biogeoqumico del selenio puesto que contribuyen entre 50 y 70% al flujo global del selenio3. Las principales fuentes de selenio procedentes de la actividad antropognica son: la combustin de carburantes fsiles, las fundiciones y refineras, las fbricas de vidrio y cermica, y otras industrias4,5. Otras emisiones proceden de la incineracin de basuras6, o del humo de los cigarrillos, en los que se han encontrado niveles de 0.001-0.0063 g Se cigarrillo-1 7. Estas emisiones son mayoritariamente en forma de partculas diminutas de xidos de selenio8.
41
Entre las fuentes antropognicas, la combustin de carbn y combustibles fsiles es la principal fuente de incorporacin del selenio al aire. Aunque en las combustiones se forma SeO2, la presencia de SO2 hace que se reduzca con rapidez a selenio elemental, que se une a cenizas y a partculas atmosfricas. De manera global se ha estimado en 7700-8000 Tm ao-1 la cantidad vertida a la biosfera como resultado de la combustin de fsiles y de actividades industriales y agrcolas9. De hecho, a travs de la agricultura se drena agua con un contenido medio de selenio de 1.4 g l-1
11 10
, considerndose que el vertido de selenio al mar es de unas 800
toneladas anuales . Sin embargo, no existen indicaciones de aumento global en la concentracin de selenio en la atmsfera, posiblemente debido a una rpida sedimentacin del selenio atmosfrico12. Tampoco existen evidencias de aumento global de la concentracin de selenio en el agua de mar, considerndose el valor de 0.09 g l-1 constante en el tiempo y el espacio. La contaminacin por selenio en los ecosistemas acuticos es de especial inters en extensas zonas del planeta. En California y otras regiones semiridas del oeste de Amrica del Sur, los altos niveles encontrados ponen en peligro el futuro de la agricultura en estas zonas. Por ello, en la actualidad se estn realizando distintos estudios encaminados a desarrollar mtodos de recuperacin de aguas y suelos contaminados por selenio mediante procesos biolgicos y/o qumicos13,14.
1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL
ATMSFERA
En la atmsfera, el selenio puede estar presente en forma gaseosa, aunque, al igual que el resto de elementos de su grupo, tiende a concentrarse en partculas en suspensin que forman aerosoles muy finos, fciles de inhalar y con un elevado tiempo de residencia en la atmsfera, de forma que pueden ser transportadas a distancias considerables de la fuente de emisin. El selenio se emite de forma natural a la atmsfera en forma de alquilseleniuros voltiles, selenio elemental y dixido de selenio, el cual puede sufrir transformaciones qumicas responsables de la presencia de selenito y seleniato en el agua de lluvia, tales como: hidratacin, reduccin por la presencia de SO2 u oxidacin por accin del oxgeno del aire15. Por lo tanto, las especies qumicas de selenio presentes en los aerosoles dependern, entre otros factores de la acidez del medio16. Adems, el nivel de selenio en la atmsfera estar influenciado por factores estacionales (siendo mayor en verano que en invierno) as como por el clima y la altitud17.
42
El selenio que se encuentra en forma particulada no constituye generalmente una fuente de selenio disponible para plantas y animales. En el caso de las emisiones de selenio derivadas de combustiones, la mayor parte del selenio es reducido a Se0 y este se une a cenizas y a partculas atmosfricas siendo imposible su uso en sistemas biolgicos. Sin embargo, el aire contiene pequeas cantidades de compuestos de selenio voltiles, los cuales son producidos y utilizados por sistemas biolgicos. El compuesto voltil predominante es dimetilselenio18. La concentracin media de selenio en la atmsfera se sita en el rango 0.1-10 ng m3 en funcin de su localizacin, pudiendo llegar a 500 ng m3 cerca de las fuentes de emisin, por lo general en reas urbanas e industrializadas19. El valor umbral lmite para compuestos de selenio en el aire es de 0.1-0.2 mg m-3, excepto para el H2Se que es de 0.5 mg m-3, cantidades que se encuentran reguladas para zonas de exposicin industrial20.
SUELOS
El selenio se incorpora a los suelos por distintos mecanismos como: precipitacin, adsorcin en la superficie o absorcin en minerales o materia orgnica21. Las formas inorgnicas son las mayoritarias en suelos, si bien las especies concretas dependern, sobre todo, de las condiciones redox, el pH y la presencia de microorganismos. En suelos oxigenados alcalinos abundan generalmente los seleniatos, que son solubles, asimilables por las plantas y con mayor riesgo de lixiviacin. Por el contrario, en los suelos cidos con elevado contenido en materia orgnica como cidos hmicos y flvicos predominan las formas reducidas (selenitos y seleniuros), que forman compuestos insolubles con Fe3+ y Al de baja biodisponibilidad22. La adsorcin depender del pH, de la naturaleza de los minerales y de la presencia de otros aniones en el suelo que puedan actuar como competidores. La accin microbiana puede transformar el selenio del suelo por oxidacin, reduccin o volatilizacin del mismo. As, los microorganismos reducen las especies inorgnicas y producen selenio elemental o selenocompuestos orgnicos, algunos de los cuales son especies voltiles como DMSe (la principal especie voltil producida por microorganismos) o DMDSe que puede difundirse en la atmsfera23. En la mayora de los suelos las concentraciones de selenio varan entre 0.01 y 2 g g
-1 24
, correspondiendo los valores ms bajos a zonas deficientes en este elemento,
como Nueva Zelanda, China y Finlandia donde la concentracin media suele ser de 0.1 g g-1. Por el contrario, en reas selenferas, como Irlanda y parte de los Estados Unidos, las concentraciones suelen ser superiores a 80 g g-1
9,12
, asocindose, por lo general, los
43
valores ms elevados, a suelos formados a partir de materiales sedimentarios de origen marino25. A menudo la concentracin del elemento aumenta con la profundidad, la cercana al mar y la presencia de materia orgnica , ya que los cidos hmicos constituyen la principal reserva de selenio en los suelos26.
AGUAS
El selenio se presenta en aguas naturales preferentemente como seleniato y en menor proporcin como selenito, aunque tambin pueden formarse especies metiladas voltiles como resultado de transformaciones microbiolgicas. Adems puede encontrarse de manera particulada, debido a la presencia de productores primarios como el fitoplancton, bacterias, detritos, material inorgnico en suspensin y sedimentos27. La disponibilidad del selenio en agua depende de distintas variables
medioambientales como el pH, la salinidad, la dureza y la presencia de otras sustancias qumicas. Por esto, la alteracin de estas variables puede producir un cambio en los procesos de biotransformacin. En aguas alcalinas, aparecen sales solubles del cido selnico, siendo el seleniato de sodio uno de los compuestos de selenio con mayor movilidad en el medio debido a su baja adsorcin a las partculas del suelo. Al ser el selenioso un cido dbil, el ion biselenito es el predominante en aguas con un pH entre 3.5 y 9. Por su parte, a pHs bajos (<7) la presencia de hierro disminuye el nivel de selenio en agua debido a la precipitacin del selenito frrico, que es insoluble , mientras que a pHs elevados (>7), tiene lugar la oxidacin a seleniatos solubles, incrementndose la concentracin normal de selenio en aguas por encima de 10-400 g l-1 28,29. El nivel de concentracin de selenio en aguas superficiales y subterrneas es generalmente bajo, entre 0.02 y 10 g l-1, si bien puede verse notablemente afectado por factores geolgicos, llegando a superar los 6 mg l-1 28,30. En el medio marino, los niveles de selenio varan de la superficie a las profundidades en funcin de la especie; encontrndose valores de 0.004 y 0.03 g l-1 (en la superficie) y de 0.06 g l-1 y 0.12 g l-1 (en las profundidades) para selenito y seleniato, respectivamente31. La fraccin orgnica no ha sido caracterizada, aunque cabe esperar que existan selenoaminocidos y sus derivados. El nivel de selenio en agua constituye un importante criterio para determinar la idoneidad de la misma para diferentes usos, y es el compartimento ambiental donde el selenio se encuentra ms controlado por la legislacin. La Directiva 98/83/CE del Consejo, de 3 de noviembre de 1998, relativa a la calidad de las aguas de consumo humano (DOCE L 330, de 5 de diciembre de 1998) y la Agencia Americana para la Proteccin de Medio
44
Ambiente (US-EPA) han fijado los niveles mximos de selenio permitidos en agua de bebida y de riego son 10 ng ml-1 y 20 ng ml-1 respectivamente. Por su parte, el nivel mximo de selenio en el agua para la fauna est en 5 ng ml-1, aunque ciertos autores han propuesto reducir dicho umbral hasta 1 ng ml-1 debido a la posible bioacumulacin del elemento, que podra poner en peligro la salud de ciertos mamferos y pjaros especialmente sensibles al selenio32.
PLANTAS
En las plantas, el selenio se encuentra en forma de compuestos orgnicos, fundamentalmente como selenometionina (SeMet). En granos de cereales la SeMet constituye el 50% del selenio total33. Otros compuestos identificados en plantas son seleno-metil-selenometionina (Se-metil-SeMet), selenocistina (SeCys2) y seleno-metilselenocistina (Se-metil- SeCys2)34. Las plantas son capaces de incorpora selenio (a partir del suelo, agua o atmsfera), transportarlo y metabolizar distintas especies del elemento, empleando para todo ello mecanismos anlogos a los del azufre . La capacidad para absorber, acumular y metabolizar selenio vara de unas especies a otras. As, existen diferencias sustanciales en cuanto a la concentracin y tolerancia en funcin de la especie vegetal35. Existen especies de plantas acumuladoras de selenio, generalmente no comestibles, que crecen en suelos selenferos y pueden alcanzar concentraciones de entre 100 y 10000 g g-1. En estas plantas la concentracin de selenio llega a ser superior a la del suelo en el que crecen. En este grupo se incluyen varias especies del gnero Astragalus, la Oonopsis condensaya y la Stanleya pinnata entre otras , mientras que en plantas no acumuladoras, entre las que se encuentra la mayora de las plantas de cultivo, el contenido en selenio vara entre 0.05-1 g g-1 5, 36. La absorcin de selenio tiene lugar preferentemente en forma de SeO42-, anin que interfiere en las reacciones bioqumicas esenciales de las plantas, al sustituir al azufre e incorporarse a los aminocidos proteicos para formar selenocistena (SeCys) y selenometionina35,37. En el caso de las plantas acumuladoras, el selenio se incorpora a aminocidos no proteicos por lo que no interfiere en el metabolismo de las mismas. En algunas ocasiones, los compuestos de selenio son transformados por plantas y algas a formas voltiles (DMSe, DMDSe y dietilselenio (DESe)) como mecanismo de defensa frente a la toxicidad38 observndose importantes diferencias en cuanto a las especies volatilizadas en funcin de la especie vegetal. Las plantas acumuladoras producen DMDSe, mientras que las no acumuladoras volatilizan una menor cantidad de selenio en forma de DMSe39,40. Tal es la importancia del selenio para el desarrollo de las
45
plantas y su influencia en la cadena trfica, que incluso algunos pases han tomado la decisin de incorporarlo artificialmente a sus suelos cuando stos son deficitarios. As, el hecho de que slo un 5% del selenio del suelo de Finlandia fuera disponible para las plantas, motiv que se incorporara artificialmente en forma de seleniato en los fertilizantes de este pas41.
En la Tabla 5 aparecen recogidas las concentraciones de selenio total en algunas matrices medioambientales. Tabla 5. Concentraciones de selenio total en algunas matrices medioambientales12
Contenido de Se (g g-1) 0.09 0.05 0.05 0.08 0.47-8.1 2.4-7.5 0.1-0.4 0.01-2 40.0-80.0 0.8 0.01-3.3 0.13 0.06-0.12 0.08 0.085-0.37 0.052 0.16
Matriz Corteza terrestre (promedio) gneas arenisca piedra caliza carbn aceite normal seco selenfero marinas csped ingls trbol de mar (Pacfico Norte) de lago (cerca California) de ro de lluvia (California) de grifo
Rocas
Combustibles fsiles
Suelos
Plantas
Agua
1.3. CICLO BIOGEOQUMICO DEL SELENIO
Para conocer el comportamiento del selenio en el medioambiente es necesario estudiar las biotransformaciones que conforman su ciclo biogeoqumico, lo que implica conocer su disponibilidad geolgica y su qumica orgnica e inorgnica, as como la actividad biolgica de los organismos que utilizan este elemento.
46
La concentracin, transformacin, movilidad y acumulacin de selenio en un ambiente dado depende de numerosos factores tales como el pH, las condiciones redox, la temperatura, la presencia de determinadas materias minerales, as como de la actividad microbiana y antropognica42. El conjunto de estos procesos est esquematizado en la figura 2. En dicho ciclo se indican algunas de las especies identificadas en los distintos compartimentos ambientales. No obstante, muchas especies de selenio y sus mecanismos bioqumicos son an desconocidos.
Figura 2. Distribucin del Se en los diferentes compartimentos medioambientales
El selenio puede moverse y concentrarse por desgaste del suelo y evaporacin posterior o por deposicin del agua de lluvia en climas ridos y semiridos . Las sales de SeO42- son muy solubles en agua, siendo este anin el predominante en disoluciones de los suelos bsicos bien drenados. Las sales de SeO32- son menos solubles y adems se adsorben fcilmente en las partculas de suelo, por lo que su movilidad en ecosistemas acuticos est muy limitada, al contrario que el seleniato, que adems entra en la cadena trfica a travs de las plantas. Por otro lado, el selenio elemental, Se0, es muy insoluble en agua y tiene una cintica extremadamente lenta, por lo que es frecuente su presencia en
47
Importancia biolgica
forma particulada en medios oxidantes a pesar de ser termodinmicamente inestable en ellos43. Las transformaciones microbianas del selenio pueden afectar a la biodisponibilidad de este elemento respecto a plantas y animales44,45. Las bacterias anaerbicas pueden utilizar SeO42- como aceptor final de electrones en su respiracin (reduccin disimilatoria) y de esta forma reducirlo a SeO32- y en ltimo trmino a Se0 46. Tambin se ha observado la reduccin microbiana de SeO42- a SeO32- y finalmente a Se0 en procesos no relacionados con la respiracin, posiblemente como mecanismos de detoxificacin45,47. Los microorganismos tambin son capaces de volatilizar selenio en las formas DMSe y DMDSe tras la reduccin del selenio presente en el medio externo a seleniuro orgnico . El proceso de metilacin microbiana del selenio parece tener una funcin detoxificadora48. La transferencia de selenio desde el medioambiente al hombre y animales procede principalmente de dos vas: inhalacin e ingestin. La incorporacin de este elemento a travs del aire es muy baja, proporcionando al cuerpo alrededor de 0.02 ng g-1, mientras que la ingestin de agua y alimentos produce del orden de 0.1 g g-1 5. Existe evidencia de que el selenio puede acumularse en los tejidos corporales de los organismos y puede ser transportado en la cadena alimenticia hacia niveles superiores. Normalmente esta biomagnificacin de selenio comienza cuando los animales ingieren plantas o invertebrados inferiores con un elevado contenido en selenio. Algunos estudios indican que la ingesta de la fraccin de selenio disuelta por los invertebrados inferiores (como el zooplancton y los bivalvos) es despreciable frente a la fase particulada, postulndose que la entrada de este analito en la cadena trfica tiene lugar de esta manera49. Por ello, el estudio de la bioacumulacin de selenio en estos invertebrados suele considerarse como factor crtico en la determinacin de sus efectos en los organismos superiores, ya que los predadores superiores (como peces y pjaros) se alimentan de los mismos. Los mayores aportes de selenio en el hombre proceden del consumo de vegetales, pescados y mariscos debido a que su capacidad de bioconcentracin alcanza un factor de 400.
2. RELEVANCIA BIOLGICA DEL Se
2.1. ESENCIALIDAD
La evidencia de los efectos beneficiosos del selenio para los seres vivos es relativamente reciente, fue descrita por primera vez en 1957 por Schwartz y Foltz50, que constataron que el selenio protega a ratas deficientes en vitamina E de necrosis heptica y a pollos de diatesis exudativa y degeneraciones necrticas. Pero su esencialidad
48
nutricional no se demostr hasta 1973 cuando se comprob su funcin bioqumica en animales51. Se descubri una funcin biolgica importante del selenio debida a su accin reductora, a travs de la selenocistena presente en la enzima glutatin peroxidasa (GPx). Desde entonces se han identificado otras funciones bioqumicas y fisiolgicas del selenio relacionadas con su presencia como selenoprotenas en los tejidos y los fluidos biolgicos de los mamferos. El nmero de selenoprotenas en estos animales ha sido estimado entre 30 y 5052. En la actualidad se han identificado unas 35 selenoprotenas, de ellas, 18 han sido secuenciadas53 y se conoce la funcin enzimtica de ms de 10.
En la Tabla 6 se muestra un resumen de las principales selenoprotenas identificadas.
Tabla 6. Principales selenoprotenas identificadas en seres vivos

Selenoprotena Glutationas Peroxidasas Glutationa celular (GPx1) Glutationa gastrointestinal (GPx2) Glutationa plasmtica (GPx3) Fosfolpido hidroperoxidasa (GPx4) Yodotironina deyodinasas Tipo 1 (ID1) Tipo 2 (ID2) Tipo 3 (ID3) Tiorredoxina reductasa Selenofosfato sintetasa Selenoprotena P 30 30 30 11 50 57 88 (22x4) 88 19 KDa Funciones Antioxidante Antioxidante y reserva de Se Antioxidante (proteccin frente hidroperxidos lipdicos) Antioxidante Antioxidante (proteccin frente hidroperxidos lipdicos en membrana celular) Regulacin del tiroides Produccin T3 Produccin T3 Degradacin T3 Antioxidante, regulacin procesos redox intracelulares y proliferacin celular Sntesis de selenofosfato, precursor de SeCys Antioxidante, transporte, reserva de Se Posible funcin redox y antioxidante involucrado en metabolismo cardaco Funcin redox Movilidad espermatozoides Reserva Tiroides, hgado, rin Glndula tiroidea, glndula pituitaria, SNC, esqueleto, msculo cardaco Cerebro, piel, placenta Clulas cancergenas, tejidos, piel, tiroides Bacterias Plasma sanguneo de mamferos, tiroides, hgado, corazn, pulmn Msculo, bazo, testculos, cerebro Prstata, tiroides Espermatozoides (ratas) Rin y otros tejidos Citosol Tracto gastrointestinal, hgado Plasma, leche materna, rin Membrana celular, ncleo, citosol y/o mitocondrias, espermatozoides Localizacin
Selenoprotena W Selenoprotena-15 kDa Selenoprotena-34 kDa Selenoprotena-18 kDa
15 15 34 18
49
Veamos brevemente el papel biolgico de algunas de las selenoprotenas ms conocidas.
Glutationas Peroxidasas
Fueron descubiertas en 1957 por Mills, aunque hasta 1973 no se demostr que el selenio era un componente esencial de las mismas54. Al ser las primeras selenoprotenas descritas, su estructura y funcin son las que estn mejor definidas. La principal funcin de esta familia de selenoprotenas es la proteccin de las clulas frente a la oxidacin por parte de especies activadas de oxgeno como superxido, perxido de hidrgeno y radicales hidoxilo. Para ello las GPxs catalizan la reduccin de perxidos e hidroperxidos que podran causar daos a clulas y tejidos a travs de la oxidacin del glutatin reducido (GSH) en glutatin oxidado (GSSG) (Figura 3).
GSH-Px
H2O2
H2O
2GSH
GSSG
GR + FAD NADP
+
NADPH
NADPH: sustrato FAD (flavina adenina dinucletido): cofactor GR: Glutatin reductasa
Figura 3. Eliminacin del perxido de hidrgeno de las clulas y su transformacin en H2O por la enzima glutatin peroxidasa.
La principal participacin fisiolgica de la GSH-Px es aportar una segunda lnea de defensa contra los hidroperxidos, manteniendo niveles adecuadamente bajos de perxido de hidrgeno (H2O2) dentro de las clulas, reduciendo de esta forma el estrs oxidativo. Como consecuencia, el selenio, como parte de las glutationas peroxidasas, es considerado un agente antioxidante y tiene funciones independientes de la vitamina E, el hierro (como catalasa) y el zinc y el cobre (como superxido dismutasa)55. Estos antioxidantes evitan la accin de los radicales libres, que pueden daar el ADN, protenas, carbohidratos y lpidos en el organismo55,56.
50
Se han identificado 4 GPxs diferentes, cada una de las cuales contiene un residuo de selenocistena por subunidad. Son estructural, cintica, inmunolgica, electrofortica y genticamente diferentes y tienen funciones tanto individuales como comunes57, por lo que en caso de deficiencia de Se su regulacin es diferente58. stas son: La forma GPx1 tambin denominada glutationa peroxidasa celular, clsica o citoslica es un homotetrmero de unos 88 kDa que est presente en el citosol de todas las clulas59, fundamentalmente en el hgado y en los eritrocitos. Es la protena ms abundante en mamferos considerada como una de las principales protenas antioxidantes60. La actividad de la glutationa peroxidasa celular ha sido durante mucho tiempo la nica funcin bioqumica conocida del selenio, por lo que la medida de la actividad de esta enzima se ha empleado para evaluar el estatus nutricional de selenio de los individuos . Estados deficientes de selenio originan importantes prdidas en su actividad, mayores que las que se producen en otras selenoprotenas, y su recuperacin es ms lenta tras la administracin de complementos nutricionales en animales en estado de carencia. Por ello, se piensa que esta enzima podra tener una doble funcin, como antioxidante y como reserva de selenio61,62,63. Tambin parece estar asociada a las propiedades anticancergenas del selenio, dado que su expresin se ve alterada en las clulas malignas. La GPx2 o glutationa peroxidasa gastrointestinal es un tetrmero formado por subunidades idnticas de 22 kDa. De estudios con animales se concluye que su actividad principal se encuentra en el tracto gastrointestinal y juega un papel importante en la proteccin de los mamferos frente a la toxicidad de hidroperxidos lipdicos ingeridos64.
Se-GSH-Px ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + ROH
Los hidroperxidos lipdicos son inestables en presencia de metales de transicin que pueden descomponerlos y producir nuevos radicales libres y aldehdos citotxicos65: ROOH + Fe2+ ROOH + Fe3+ RO* + OH- + Fe3+ ROO* + H+ + Fe2+
La forma plasmtica (GPx3) difiere del resto en que es una glucoprotena de unos 88 kDa y la nica de carcter extracelular. Fue purificada y caracterizada en el plasma humano, aunque tambin se ha encontrado en la leche materna66 y parece que se sintetiza en las clulas del rin67. Sus niveles de concentracin en el plasma son extremadamente
51
bajos, por lo que sus propiedades antioxidantes son mucho menores que las de otros substratos como la tiorredoxina o la tiorredoxina reductasa. Es la selenoprotena ms abundante en el plasma despus de la selenoprotena P. Por ltimo, la GPx4 o fosfolpido hidroperoxidasa, cuya funcin principal consiste en reducir los cidos grasos hidroperxidos que son esterificados a fosfolpidos68. Tambin se ha demostrado que reduce los hidroperxidos del colesterol y del ester del colesterol en membranas y lipoprotenas de baja densidad (LDL)69,70. Es una de las selenoprotenas ms abundantes en mamferos. Est constituida por un monmero de unos 19 kDa, y puede encontrarse libre y soluble o enlazada en la membrana celular. Se localiza tanto en el ncleo como en el citosol y mitocondria60,71. En condiciones deficientes de selenio, la incorporacin del analito a esta enzima es preferente frente a la GPx1. Se encuentra en elevadas concentraciones en los espermatozoides, y participa en la maduracin del esperma y en la prevencin de la apoptosis celular . Se ha sugerido que puede ejercer una funcin en el sistema reproductivo masculino con un doble carcter: con una funcin estructural necesaria para la correcta movilidad del esperma maduro y como antioxidante en los espermatozoides72,73.
Yodotironinas deyodinasas
Se han identificado tres yodotironina deyodinasas diferentes (denominadas tipo 1, 2 y 3), codificadas por distintos genes y que muestran diferente especificidad , pero que estn muy relacionadas entre s. Estas selenoprotenas contienen selenocistena en el sitio activo y son esenciales para la regulacin del metabolismo de la hormona tiroidea. De ellas la tipo 1 (yodotironina 5-deyodinasa) es probablemente la ms importante. Actan produciendo y regulando el nivel de la forma activa de la hormona tiroidea 3,3-5 triyodotironina (T3) a partir de tiroxina74. Tambin catalizan la desyodonizacin de la tiroxina (T4) a triyodotironina, sta ltima necesaria para el correcto metabolismo de la hormona tiroidea, de ah las funciones endocrinas del selenio y su papel en el correcto crecimiento y desarrollo72,75,76,77. La yodotironina deyodinasa tipo 1 (ID1) fue la primera en ser caracterizada como una selenoenzima. Se trata de un dmero con dos subunidades idnticas cada una de las cuales contiene un residuo de selenocistena. Fue la primera selenoprotena en la que se observ la secuencia de insercin de la SeCys mediante el triplete UGA . Se encuentra fundamentalmente en la tiroides y en tejidos perifricos como hgado y riones58,75. La forma ID2 presenta un peso molecular de unos 30 kDa y se expresa en la glndula pituitaria, sistema nervioso central, placenta y tejido adiposo de humanos y ratas, as como en la glndula tiroidea, esqueleto y msculo cardiaco de humanos, pero no de ratas. Su funcin fisiolgica principal es la produccin de T3 local (intracelular) . Finalmente la
52
yodotironina deyodinasa tipo 3 (ID3) se encuentra en cerebro, piel y placenta, y es la responsable de la degradacin de la forma activa de la hormona tiroidea para formar distintas especies inactivas.
Tiorredoxina reductasa
Selenoenzima que acta como antioxidante y se encuentra en todos los tejidos . Es responsable de la degradacin de perxidos e hidroperxidos fuera de las membranas celulares. Tambin recicla el cido lipoico y la vitamina C, regula el metabolismo de la vitamina K3, el crecimiento celular y la actividad de la protena p53 supresora de tumores78. Junto con la tiorredoxina, la tiorredoxina reductasa constituye un sistema eficaz de reduccin de disulfuros proteicos79. Adems, es responsable del incremento de los niveles de selenio en la clula. La adicin de selenio a los humanos mediante suplementos incrementa su actividad antioxidativa 40 veces en clulas epiteliales80. Est formada por dos unidades idnticas de 5.5 kDa, donde la SeCys constituye el penltimo residuo antes del extremo C-terminal, a diferencia de la mayora de las selenoprotenas que contienen este selenoaminocido en el extremo N-terminal . La tiorredoxina reductasa es una enzima que controla y reduce la expresin de tiorredoxina, cuyo aumento ha sido observado en diversos tumores humanos. Estudios recientes demuestran que bajos niveles de selenio disminuyen la actividad de la enzima y pueden estar relacionados con la habilidad de la clula para sufrir apoptosis, lo que incrementa el riesgo de padecer cncer .
Selenofosfato sintetasa
Es una de las enzimas necesarias para la incorporacin de la selenocistena en las selenoprotenas. En humanos se han identificado dos formas de esta enzima: Sp181 y Sp282 sin embargo, slo la Sp2 es una selenoprotena. Su funcin especfica es catalizar la produccin de selenofosfato, un donante de selenio en las reacciones biolgicas55,83.
Selenoprotena P
Polipptido glicosilado de unos 57 kDa, mayoritario en el plasma sanguneo de los mamferos. Contiene aproximadamente la mitad del selenio total presente en el plasma y es la nica selenoprotena caracterizada que contiene mltiples residuos SeCys84,85. En estados carenciales de selenio, su sntesis parece ser preferente frente a la de las glutationas peroxidasas58,86.
53
Su funcin biolgica no es muy clara, aunque originalmente se pens que tena una funcin de transporte, distribuyendo el Se a los diferentes rganos. Aunque no se admite de forma generalizada, el alto nmero de residuos de selenocistena por molcula y su facilidad para degradarse han hecho pensar en un posible papel como forma de transporte de dicho aminocido a travs del organismo para utilizarlo en la sntesis de otras protenas87. Tambin se ha asumido que acta como antioxidante extracelular contribuyendo a la descomposicin del peroxinitrito, accin que comparte con otras selenoprotenas. Esta funcin antioxidante la llevara acabo principalmente en el sistema vascular y adems podra proteger de la oxidacin a las membranas celulares88. Se sintetiza principalmente en hgado, corazn y pulmones, desde donde se libera al aparato circulatorio. Por otro lado, es capaz de unirse a metales pesados debido a que posee gran nmero de residuos de histidina y cistena . En este sentido, varios trabajos han relacionado a la selenoprotena P con la capacidad del selenio para disminuir la toxicidad de los metales pesados89, concretamente mercurio, plata, cadmio, plomo, platino, estao y talio90. El mecanismo de accin sugerido91,92,93,94,95 implica la formacin de complejos metal-selenio que se unen posteriormente a la selenoprotena P originando complejos ternarios del tipo [(Se-metal)n]m-Selenoprotena P.
Selenoprotena W
Se trata de una selenoprotena de bajo peso molecular (15 kDa) que contiene un solo residuo de selenocistena en un centro redox activo en el extremo N-terminal y se encuentra principalmente en los msculos, aunque tambin en el bazo, los testculos y el cerebro. Su funcin se ha asociado con la enfermedad del msculo blanco, un desorden metablico caracterizado por la calcificacin de los msculos esquelticos, que remite cuado se lleva a cabo una suplementacin con selenio . Asimismo, se ha especulado con la posibilidad de que la selenoprotena W est involucrada en el metabolismo cardaco y muscular, sin descartar un posible efecto antioxidante96.
Selenoprotena de 15 kDa
Protena que contiene un nico residuo de SeCys en la mitad de la cadena peptdica Cys-Gly-SeCys-Lys. No presenta analogas en la secuencia con ninguna de las anteriores y su funcin, aunque desconocida, parece estar relacionada con una proteccin anticancergena en las clulas secretoras. Se ha detectado en una gran variedad de tejidos, fundamentalmente en la prstata y el tiroides de humanos, ratones y ratas72,75,76.
54
Selenoprotena en la cpsula mitocondrial de los espermatozoides
Selenoprotena de unos 34 kDa identificada en 1978 por Calvin en los espermatozoides de ratas, y que no ha sido encontrada en ningn otro tejido, aunque en la actualidad existe cierta controversia sobre si se trata de una nica selenoprotena o es una variedad de la GPx497,98. Algunos estudios indican que la sntesis de esta protena se inhibe cuando existe deficiencia de selenio, producindose esterilidad por disminucin en la movilidad de los espermatozoides, lugar donde se encuentran los niveles de concentracin ms altos de selenio en los tejidos de mamferos55,75.
Selenoprotena mitocondrial de 18 kDa
Localizada en las membranas mitocondriales de numerosos tejidos como el rin, el hgado y el cerebro. Aunque su funcin no ha sido elucidada, se ha comprobado que, en estados carenciales de selenio, se sintetiza de forma preferente, fundamentalmente en los rganos con funcin endocrina, lo que podra estar relacionado con su importancia biolgica.
2.2. EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE SELENIO
La deficiencia de selenio afecta a distintos tipos de tejidos en diferentes vas como consecuencia de la existencia de distintas selenoprotenas. La biosntesis de selenoprotenas depende de la disponibilidad de selenio. Como consecuencia, las selenoprotenas con una funcin biolgica poco relevante responden ms rpidamente a la deficiencia de selenio, perdiendo su actividad, mientras que las selenoprotenas con una funcin biolgica de mayor importancia permanecen estables en estados carenciales de tipo moderado, y slo disminuyen su actividad cuando la deficiencia es sustancial y prolongada52,99. Estas protenas se recuperan rpidamente tras la ingesta complementos nutricionales con selenio
100
de
. En general, el aporte de selenio al cerebro y a
los rganos de los sistemas endocrino y reproductor se mantiene, en la medida de lo posible, en los niveles ptimos. Por su parte, el corazn, los msculos esquelticos, el hgado y los glbulos rojos son los menos prioritarios para el elemento , lo cual explica que estos sean los tejidos en los que primero aparecen lesiones cuando el aporte de selenio no es el adecuado101,102.
55
El reconocimiento del importante papel de las selenoprotenas en el metabolismo ayuda a explicar las consecuencias adversas de la deficiencia del selenio en la salud de los animales y humanos. En animales, los desrdenes asociados con la deficiencia en selenio han sido identificados principalmente en zonas cuyos suelos presentan bajo contenido en el elemento. As, desde 1950 se han identificado enfermedades que afectan a la reproduccin y el crecimiento, as como la llamada enfermedad del msculo blanco . En pollos y aves de corral, los estados carenciales de selenio estn asociados a una disminucin en la produccin de huevos, problemas de fertilidad y aumento de la mortalidad embrionaria . El descubrimiento de desrdenes clnicos asociados a la falta de selenio como la enfermedad de Keshan en China y la aparicin de miopatas y cardiomiopatas en pacientes con alimentacin parenteral han puesto de manifiesto la importancia del selenio en estados carenciales103. Por otro lado, existen evidencias de que la deficiencia de selenio puede aumentar la susceptibilidad a ciertas enfermedades y dificultar as el mantenimiento de un estado de salud ptimo. Niveles bajos del elemento pueden contribuir en algunos casos a las causas de la enfermedad, pero en otros pueden ser una consecuencia de la propia enfermedad capaz de agravar su progresin. A continuacin se recogen y comentan brevemente algunos de los desrdenes y enfermedades en humanos asociados con la deficiencia de selenio en la dieta. En el hombre, la aparicin de enfermedades debidas a la deficiencia de selenio se produce por ingesta de cantidades inferiores a 50 g da-1 104. La primera observacin se hizo en la provincia de Keshan en China y desde entonces se observ en otras zonas incluyendo Nueva Zelanda y Finlandia en donde las concentraciones de Se en el suelo son tambin bajas. Se caracteriza por unos niveles de selenio extremadamente bajos, y ha podido ser controlada mediante la suplementacin con selenio. Sin embargo, a pesar de la suplementacin, se dan casos crnicos que sugieren que la falta de selenio predispone a la enfermedad pero no es su causa primaria , que podra tener relacin con infecciones virales52,53. Tambin se ha asociado a deficiencias de selenio la enfermedad de Kashin-Beck, que es una osteoartropata caracterizada por atrofia, degeneracin y necrosis de los cartlagos que afecta primordialmente a nios entre 5-13 aos. Fue descrita por primera vez en Siberia aunque tambin se han presentado casos en China105. La causa de esta enfermedad no est clara, aunque la deficiencia de selenio y de yodo, la contaminacin de la comida con hongos y la presencia de elevados contenidos orgnicos (p.e. cido flvico) en el agua han sido propuestos como factores que contribuyen a la aparicin de la enfermedad19,53.
56
Por otro lado, la deficiencia de selenio podra crear un ambiente susceptible parar reducir la resistencia del individuo a otro tipo de fatigas como infecciones virales o microtoxinas . Numerosos estudios apuntan que la deficiencia de selenio est acompaada por la prdida de inmunocompetencia que probablemente est relacionada con el hecho de que el selenio se encuentra normalmente en tejidos del sistema inmune como hgado, bazo y ndulos linfticos. En este sentido, las clulas del sistema inmunolgico podran tener una importante necesidad funcional de selenio. De hecho, la suplementacin con selenio, incluso cuando no hay deficiencia, produce efectos estimulantes del sistema inmune. Los dispositivos celulares de defensa frente a una infeccin implican a las enzimas antioxidantes, entre ellas las GPxs y probablemente la Selenoprotena P. Como la biosntesis de estas selenoprotenas no es prioritaria en caso de deficiencia de selenio, el deterioro de la defensa antioxidante es uno de los primeros sntomas de dicha deficiencia . Por ello no sorprende que la deficiencia de selenio est asociada con la aparicin, virulencia y progresin de ciertas infecciones vricas. Por otra parte, los virus podran ser capaces de secuestrar el selenio del individuo para incorporarlo a las selenoprotenas del propio virus, mermando la capacidad de respuesta inmune del enfermo . El selenio parece ser un nutriente crucial para individuos afectados por el VIH (virus de inmunodeficiencia humana) y es un potente inhibidor de la replicacin del virus in vitro. En los primeros estadios de la enfermedad, aparece una disminucin de los niveles de selenio. Adems, el nivel de selenio en plasma permite predecir las consecuencias de la infeccin por VIH. As, los pacientes de VIH con deficiencia de selenio tienen 20 veces ms posibilidades de morir por causas relacionadas con el virus que los pacientes con un nivel adecuado de selenio53,55,76. El selenio tambin parece proteger a individuos afectados por el virus de la hepatitis B o C contra la progresin de la enfermedad a cncer de hgado. El selenio juega un papel esencial en la reproduccin animal. De hecho, la deficiencia del mismo est relacionada con la aparicin de abortos. Algunos estudios realizados en humanos han encontrado niveles de selenio significativamente bajos en el suero sanguneo de mujeres que han sufrido abortos durante el primer trimestre o de forma recurrente106. Los abortos podran estar relacionados con una proteccin insuficiente de las membranas biolgicas y del ADN frente a la oxidacin, debido a los bajos niveles de GPx. Adems, el selenio es esencial en la fertilidad masculina, siendo necesario para la biosntesis de la testosterona y para la formacin y desarrollo normal de los espermatozoides . Se ha encontrado que una deficiencia de selenio se traducira en una disminucin de la cantidad de phGPx, afectando a la fertilidad . Existen numerosas evidencias de que el selenio es muy importante para el funcionamiento adecuado de otros rganos, como el cerebro o el corazn. En estados carenciales, el cerebro recibe un suministro prioritario. El estrs oxidativo y generacin de especies reactivas de oxgeno estn fuertemente implicadas en algunas enfermedades
57
neuronales y neuromusculares como la apopleja, Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrfica y distrofia muscular. Por ello el selenio, gracias a su efecto antioxidante, podra proteger al organismo frente a dichas enfermedades107. Por otro lado, y a pesar de que bajos niveles de selenio en sangre se han asociado con la incidencia de infarto de miocardio y con tasas de mortalidad por enfermedades cardiovasculares elevadas55,108, el papel del selenio no ha sido establecido con claridad. Otros efectos beneficiosos del selenio estn relacionados con sus propiedades antioxidantes y antinflamatorias, actuando frente a la pancreatitis y mejorando los sntomas de ciertas enfermedades, como el asma o la artritis reumatoide . Por ltimo, estudios epidemiolgicos, experimentos con animales y ensayos clnicos llevados a cabo en los ltimos aos han demostrado la existencia de una correlacin importante entre los niveles de selenio y la incidencia de algunos tipos de cncer. Este descubrimiento ha contribuido enormemente a que se hayan multiplicado las investigaciones en torno al papel de este elemento. Aproximadamente una tercera parte de las afecciones cancergenas desarrolladas en humanos tienen un origen medioambiental, observndose una disminucin de un 50% en su incidencia, en dietas ricas en selenio109. Por otro lado, estudios experimentales realizados en animales indican que exposiciones supranutricionales de selenio pueden reducir significativamente las proliferaciones tumorales. El efecto anticancergeno depender de la dosis y de la forma qumica del selenio
110
. Entre las especies naturales de selenio, las capaces de producir fcilmente monometiladas han demostrado ser especialmente activas53,111,112. El
especies
monometilselenol es considerado como un metabolito crtico para la proteccin de ciertos cnceres . Adems, algunos compuestos sintticos de selenio, que no son utilizados en la sntesis de selenoprotenas, tambin muestran efectos anticancergenos53,60,111. En este grupo destacan algunos compuestos aromticos de selenio que presentan menor toxicidad, reduciendo los posibles efectos secundarios, y mayor potencial quimiopreventivo del cncer que los naturales113,114. El selenio es capaz de inhibir cnceres inducidos tanto por virus como qumicamente y no slo se inhibe la iniciacin de la enfermedad sino tambin su desarrollo. Adems, el efecto del selenio parece ser reversible115. En este sentido, se han propuesto cinco posibles mecanismos por los que el elemento podra desarrollar su papel de agente protector frente al cncer115,116.
A travs del efecto antioxidante de las selenoprotenas, que puede proteger a los organismos frente al cncer (puesto que los perxidos y las especies activas de oxgeno provocan dao gentico y posiblemente cncer). Gracias a las propiedades antioxidantes de las glutationas peroxidasas se puede eliminar el ADN daado por
58
perxidos y regular el sistema redox, crtico en el crecimiento de algunos cnceres, como el de piel por incidencia de la radiacin ultravioleta117. Sin embargo, el papel quimiopreventivo del selenio requiere un aporte supranutricional del elemento , que no eleva los niveles de las selenoprotenas antioxidantes en los tejidos por encima de los que se dan cuando el nivel de selenio es adecuado , con la excepcin de la tiorredoxina reductasa118.
Por el estmulo del sistema inmunitario que se produce como respuesta a niveles supranutricionales de selenio . Sin embargo, no existen suficientes evidencia para considerar que el mecanismo por el que el selenio detiene el avance de los tumores est claramente relacionado con este efecto.
Debido al efecto del selenio en el metabolismo de los agentes cancergenos . As el selenio podra prevenir el cncer reaccionando con los agentes cancergenos para evitar que stos se unan al ADN originando mutaciones .
A travs de efectos sobre el ciclo celular. En cultivos celulares, ciertos compuestos de selenio afectan de forma significativa a la viabilidad de las clulas, al ciclo celular, a la sntesis de protenas y a la integridad del ADN111,119. Por ello, algunos autores consideran que el selenio podra proteger al organismo frente a procesos cancerosos ya iniciados interfiriendo en el ciclo de clulas tumorales. Aunque los mecanismos moleculares por los que el selenio produce paradas del ciclo celular y apoptosis son desconocidos, se sabe que su actividad est relacionada con la selenoprotena P (que se expresa en la prstata) y con la selenoprotena de 15 kDa, que se encuentra en niveles muy bajos en enfermos afectados por cncer de prstata120.
Por inhibicin de la proliferacin celular. El hecho de que el selenio acte como anticancergeno a dosis superiores a las requeridas para que la actividad de las selenoprotenas sea mxima, da pie a pensar que ciertos metabolitos del elemento puedan inhibir el crecimiento de las clulas tumorales . Este es el caso de las yodotironinas deyodinasas, al ser reguladoras del metabolismo de la hormona tiroidea y, por tanto, afectar al crecimiento de clulas malignas .
Sin embargo, slo se ha demostrado el papel anticarcinognico del selenio en determinadas dosis, emplendose como complemento en dietas de pacientes afectados por determinados tumores (prstata, pulmn, estmago, colon, hgado,..).
59
2.3. EFECTOS DEL EXCESO DE SELENIO: TOXICIDAD DEL ELEMENTO
Adems de los posibles efectos beneficiosos anteriormente mencionados, el selenio puede llegar a provocar efectos txicos cuando se adquiere en concentraciones superiores a 200 g da-1 104. Sus efectos txicos se conocen desde hace mucho tiempo. Ya en el siglo XIII, Marco Polo descubri plantas selenferas en una regin montaosa de China cuya ingesta causaba la prdida de las pezuas en los animales. La toxicidad del selenio depende de factores tales como la forma qumica, la especie biolgica, la concentracin y las posibles transformaciones que puede sufrir en su interaccin con el medio. Las especies orgnicas de los elementos suelen considerarse ms txicas que las especies inorgnicas, por su naturaleza lipoflica, al poseer mayor facilidad para difundir rpidamente a travs de las membranas celulares. Sin embargo, muchas especies orgnicas de selenio, como es el caso de los selenoaminocidos, son esenciales y forman parte de las protenas, por lo que su toxicidad potencial se reduce. Las especies metiladas de selenio, salvo el trimetilselenonio (TMSe+), son voltiles y txicas a niveles de concentracin elevados. Las especies monometiladas son generalmente bien toleradas, debido a que pueden transformarse fcilmente a DMSe y TMSe+, con menor actividad biolgica y fcil excrecin del organismo9,121. Dentro de las formas inorgnicas, el selenio elemental parece ser el menos txico por ser el ms insoluble y por tanto difcilmente asimilable por los organismos. La especie selenito es ms txica que el seleniato, pero a ambas se les otorgan propiedades mutagnicas30,122. El hombre se ha mostrado menos sensible que los animales a sobredosis de selenio . Se desconocen los niveles precisos en la dieta para producir intoxicacin crnica, pero cantidades del orden de 2-8 mg kg-1 son capaces de producir graves lesiones. Se han dado casos de selenosis crnica en zonas geogrficas extremadamente ricas en selenio (zonas de China y Venezuela)123. Entre los aos 1961 y 1964 se detect en Enshi (China) en la poblacin humana una enfermedad endmica manifestada por prdida de cabello, uas, irritacin de la piel y los ojos, y debilidad de los dientes . Otros sntomas de toxicidad son anorexia, dolor abdominal, diarrea, fatiga, irritabilidad, depresin, edema pulmonar, hemorragias, necrosis de hgado y rin, mal aliento, deterioro neurolgico, ceguera y caries dental. Este mal se atribuy a un alto contenido de selenio en el maz. Sin embargo, la poblacin con ms riesgo de sufrir selenosis est constituida por personas que trabajan en la industria del selenio. De hecho, existen casos de envenenamiento por exposicin industrial de especies de selenio voltiles como SeO2, SeOCl2 y SeH2 124. Otro aspecto relacionado con la toxicidad del selenio es la selenofilia, nombre con el que se conoce la intoxicacin por selenio derivada de la utilizacin abusiva de
60
suplementos de dicho elemento para prevenir, aliviar o curar diversas patologas que no muestran relacin directa con el selenio nutricional. La automedicacin en este caso no es inocua y existe riesgo de intoxicacin debido al estrecho rango de esencialidad del elemento. En Estados Unidos se han dado numerosos casos de intoxicacin por esta prctica125,126.
2.4. METABOLISMO DEL SELENIO EN ANIMALES SUPERIORES
El
metabolismo
del
selenio
en
animales
superiores
est
encaminado
principalmente a la sntesis de selenoprotenas, que incorporan residuos de selenocistena en su sitio activo, de tal forma que la presencia del elemento es indispensable para realizar su funcin cataltica. La mayora de las formas en que se encuentra el selenio en la dieta (formas inorgnicas y orgnicas) se biotransforman siguiendo las principales rutas metablicas que se muestran en la figura 4.
RUTA NO REGULADA
SeCH3 CH2
SeMet
Reservorio de Met
Protenas que contiene Se
CH2 C CONH CONH
Se-homocistena
,-liasa
SeH CH2 CH S I N T E S I S P R O T E I N A S
Se-cistationa SeO42R E D U C C I N
CONH CONH
SeO324GSH GS-SG
SeCys
-liasa
Selenoprotenas
ATP
AMP + PI
GSSeSG
NADPH NADP+ +GS-GS
H2Se
CH3
Selenofosfato
Ser Serina
Se-cysSe-cys ARNt
Se-cis
ARNt
tARNSec
ORINA
E X C R E C I N
(CH3)Se (DMSe)
Selenoazucar
CH3
EXHALADO
(CH3)2Se (DMSe)
CH3
ORINA
(CH3)3Se (TMSe)
RUTA REGULADA HOMEOSTTICAMENTE

Ser: Serina ARNt: ARNt especfico para la Se-cis
Se-cis
Figura 4. Esquema de la ruta metablica del selenio en animales superiores
Varios estudios indican que los compuestos de selenio se metabolizan mediante dos vas principales: reduccin seguida de metilacin (excrecin) o incorporacin directa a
61
las protenas (asimilacin). As, el selenito y el seleniato inorgnico ingeridos son transformados respectivamente a
127
seleniuro
de
hidrgeno
en
los
glbulos
rojos
el
hgado
tras un mecanismo reductivo que implica la formacin de intermedios
(selenodiglutationa selenotrisulfuro, GSSeSG) con la glutationa peroxidasa. Sin embargo, la selenometionina se convierte en selenocistena (formando como intermediarios Sehomocistena y Se-cistationina sucesivamente por una ruta que no requiere enzimas especficas para el selenio sino que son comunes para selenio y azufre152 y sta se transforma finalmente en seleniuro por efecto de la -liasa128. Como puede verse, la ruta metablica seguida por el selenio en animales tiene como intermediario al seleniuro (Se2-) independientemente de la forma en la que el elemento es suministrado. El seleniuro de hidrgeno (ionizado como HSe- a pH fisiolgico) se considera un compuesto intermedio en la sntesis de selenocistena en protenas, as como en la sntesis de productos de detoxificacin129,130, puesto que puede activarse a selenofosfato, con la consiguiente incorporacin a las selenoprotenas, o ser eliminado a travs de compuestos metilados131. A partir del seleniuro se forma selenofosfato a travs de un proceso catalizado por la enzima selenofosfato sintetasa en el que el nucletido ATP (adenosin trifosfato) es el responsable de la fosforilacin . El selenio es transferido desde el selenofosfato a una molcula de ARN de transferencia especfica para la selenocistena (Se-cisARNt) que contiene serina (Ser), la cual es convertida en selenocistena por accin de la enzima selenocistena sintetasa, obtenindose dicho selenocompuesto unido al ARNt (Se-cisSecis
ARNt). El ARNt traslada la selenocistena a los ribosomas para incorporarla a la cadena
proteica travs de su propio triplete de insercin (codn UGA) . Dicha incorporacin est determinada genticamente, de manera que las protenas resultantes necesitan el selenio para realizar su funcin. Es por ello que se denominan selenoprotenas. Estas selenoprotenas son las responsables de la esencialidad del elemento para los animales y en ellas el selenio participa en reacciones redox, constituyendo el centro activo de las selenoenzimas. Se han encontrado evidencias de que los niveles de selenoprotenas en los tejidos estn controlados de forma homeosttica, ya que la administracin de altas dosis de selenio no eleva dichos niveles por encima de los alcanzados con ingestas de selenio adecuadas . El seleniuro, como se ha comentado anteriormente, no es slo el punto de partida comn para la formacin de selenoprotenas, sino que la excrecin del elemento tambin parte de l. El exceso de selenio ingerido as como el procedente de la utilizacin o degradacin de las selenoprotenas es eliminado a travs de la orina o del aliento en forma de seleniuros metilados, concretamente como selenio mono-, di-, o tirmetilado. El metabolito principal en la orina ha sido identificado como un selenoazcar132,128 y su precursor ha sido encontrado en el hgado por Kobayashi y col., que han propuesto un
62
mecanismo de sntesis133. Tambin la forma trimetilada, que corresponde al in trimetilselenonio (TMSe), se elimina por la orina tras la exposicin a dosis excesivas del elemento. Por lo que respecta al dimetilseleniuro (DMSe, la forma dimetilada), se elimina a travs del aliento pero slo tras dosis inusualmente elevadas de selenio. Estudios con animales han demostrado que la selenometionina se degrada directamente mediante la accin de ,-liasas en el hgado a monometilselenonio, el cual es convertido posteriormente a TMSE134,135. Otras formas de eliminar el selenio son a travs de las heces (como seleniuros metlicos y selenio elemental) o a travs del pelo, como protenas no especficas (con selenometionina) que una vez en el cabello quedan retenidas y no pueden ser metabolizadas136. Por lo que respecta a las heces, el selenio eliminado por esta va suele corresponder a fracciones del elemento no absorbidas137. Aparte de la ruta comn para todas las especies de selenio, la selenometionina puede seguir otra ruta metablica por la que es incorporada intacta a protenas comunes de forma inespecfica en lugar de la metionina, pues el organismo no es capaz de diferenciar ambas molculas . En estas protenas el selenio no est implicado en la funcin biolgica correspondiente, por lo que no se clasifican como selenoprotenas sino que se trata simplemente de protenas que contienen selenio . La incorporacin de la SeMet en lugar de la metionina es aleatoria, y esta sustitucin no altera de forma significativa la estructura proteica. Sin embargo, pueden producirse cambios en la actividad enzimtica cuando la sustitucin se realiza en las proximidades del centro activo, ya que el grupo CH3-Se presente en la SeMet es ms hidrofbico que el correspondiente CH3-S de la metionina . A travs de este mecanismo es posible almacenar selenio en el organismo que, si es necesario, puede ser reutilizado siguiendo los cauces metablicos normales . Cuando la cantidad de metionina es baja, el porcentaje de selenometionina incorporada inespecficamente aumenta de forma significativa . Por otro lado, esta incorporacin de selenometionina a protenas no est regulada por ningn mecanismo homeosttico, por lo que slo un exceso de selenio administrado como selenometionina puede elevar el contenido de selenio en el cuerpo por encima de los niveles adecuados (homeostticos). Las protenas que contienen selenometionina se forman en rganos que presentan una elevada velocidad de sntesis de protenas, como msculos esquelticos, eritrocitos, pncreas, hgado, rin, estmago, etc . A diferencia de lo que sucede en las plantas, es importante resaltar que los animales superiores no son capaces de sintetizar selenometionina .
63
Fuentes de selenio
3. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA Y SU BIODISPONIBILIDAD
3.1. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA
Excepto en circunstancias poco frecuentes de exposicin laboral o de ingesta accidental de reactivos, la nica fuente significativa de aporte de selenio para el hombre es la dieta138, razn por la cual los conocimientos sobre su abundancia o carencia en los alimentos son de especial inters. La cantidad diaria recomendada (Recomendad Dietary Allowance, RDA) en EEUU est establecida en 70 y 55 g para hombres y mujeres respectivamente, pero hay que tener en cuenta que la contribucin del selenio procedente de los distintos alimentos puede ser muy variable segn el pas y la concentracin de este elemento en el suelo139. El estado y la concentracin del selenio en los alimentos de origen vegetal son altamente variables y dependen principalmente de las condiciones del suelo en el que se han cultivado140 puesto que los vegetales incorporan el selenio absorbido del suelo en las protenas, principalmente en forma de selenometionina o selenocistena. Desde los aos setenta se han venido realizando algunos estudios en los granos de cereales que han puesto de manifiesto que la forma qumica mayoritaria en la que se encuentra el selenio en el trigo, semillas de soja, arroz y maz es la selenometionina141. Sin embargo, en los alimentos de origen animal el contenido de selenio no vara tanto como en los vegetales porque los animales pueden conservar el selenio en estados de bajo aporte, y excretar grandes cantidades en caso de suplementos excesivos142. En los animales el selenio, bajo la forma de selenocistena, se encuentra en protenas especficas, sobre todo en la GSHPx, mientras que la selenometionina de origen alimentario sigue la ruta metablica de la metionina y es incorporada en su lugar en las protenas, constituyendo as una forma de reserva. S la selenometionina fuera necesaria para las clulas, sufrira una proteolisis fisiolgica y se liberara de forma retardada. Las fuentes principales de selenio en la dieta humana son la carne, pescados y mariscos, en los que el selenio se encuentra unido a protenas. Los riones, seguidos del hgado, son los tejidos animales con mayor contenido en selenio. En general, de todos los alimentos adquiridos en la dieta, la ternera, el cerdo, el pollo y el pescado suponen, aproximadamente, el 36% del selenio total ingerido; mientras que el pan y los cereales el 22%55,76. Las concentraciones aproximadas del selenio en los principales grupos de alimentos destinados al consumo humano se recogen en la siguiente Tabla:
64
Fuentes de selenio
Tabla 7. Contenido de selenio en los principales grupos de alimentos
Alimento Carnes (msculo) rganos (hgado, rin) Marisco Cereales y granos Productos lcteos Vegetales y frutas
g Se en 100 g alimento 10-40 40-150 10-80 10-30 <10
En Espaa son la carne, el pescado, la leche y los cereales los alimentos que aportan la mayor parte de este mineral a la dieta143.
3.2. BIODISPONIBILIDAD DEL SELENIO
Para establecer el balance correcto de selenio, tanto en el hombre como en los animales, es necesario estimar la eficacia del aporte de este elemento traza a travs de la dieta. Como ocurre en el resto de elementos traza, no basta con determinar el contenido total, sino que es preciso conocer su biodisponibilidad, cantidad que se absorbe y es utilizada por el organismo144, ya que en la mayora de los alimentos slo una parte es disponible. La biodisponibilidad del selenio depende, no slo de su absorcin en el intestino sino tambin de su conversin en una forma biolgicamente activa145. Por ello, Foster y Sumar146 la definen como la porcin de selenio ingerido que despus de ser absorbido es incorporado en una forma biolgicamente activa. El selenio es un ejemplo de nutriente esencial consumido en diferentes formas qumicas, por lo que es necesario conocer tanto la biodisponibilidad como el metabolismo de estas formas para: establecer las ingestas dietticas y txicas permisibles147, evaluar la adecuacin de la dieta a las recomendaciones (RDR), y seleccionar los compuestos ms eficaces para la absorcin del selenio y as poder establecer recomendaciones para la restauracin, suplementacin o enriquecimiento de los alimentos o productos dietticos148. En general las formas orgnicas del selenio son ms biodisponibles que las inorgnicas149; la selenometionina (forma orgnica predominante del selenio en la dieta) se absorbe bien, con un intervalo comprendido entre el 76 y el 100%, mientras que dentro de las formas inorgnicas del selenio (que representan slo una pequea fraccin del total en el alimento y suelen emplearse como suplementos nutricionales), el seleniato se absorbe ms eficientemente (>90%) que el selenito (>60%)150, aunque una fraccin significativa se
65
Fuentes de selenio
excreta en la orina antes de que pueda ser incorporado en los tejidos y el selenito se retiene mejor. Se estima que la selenometionina ingerida se absorbe en el intestino delgado mediante mecanismos similares a los de la metionina. La SeMet que no es inmediatamente metabolizada se incorpora a las protenas de rganos tales como msculos del esqueleto (47% del Se total)151, eritrocitos, pncreas, hgado, rin, estmago y mucosa gastrointestinal. Tambin se ha detectado en el cerebro y en el plasma, generalmente unida a la albmina152. Las diferencias encontradas entre las tres especies son debidas a que el aminocido sigue rutas metablicas similares a las de su homlogo con azufre y se incorpora en los tejidos del cuerpo de forma no especfica e irregular, mientras que los compuestos inorgnicos siguen un proceso con regulacin homeosttica. El selenio inorgnico es rpidamente absorbido, pero, igualmente, es rpidamente excretado, mientras que la SeMet queda retenida en el cuerpo153. La vida media de la seleniometionina y el selenito en humanos se ha estimado en 252 y 102 das respectivamente, lo que indica que la selenometionina es utilizada y reutilizada extensamente154,155. Existen distintas formas de medir la biodisponibilidad del selenio en alimentos. La mayora de los autores consideran el incremento provocado en la actividad de las GPxs en diferentes tejidos156,157,158,159, aunque tambin se utilizan las concentraciones del elemento en plasma, hgado y otros tejidos, as como la actividad de otras selenoenzimas160 para establecer dicha disponibilidad. Debido a que el selenio puede encontrarse en diferentes formas qumicas en los alimentos, no debe sorprendernos la considerable variacin en su biodisponibilidad segn el tipo de alimento . En los cereales, la levadura de cerveza y en la mayor parte de los productos vegetales la disponibilidad del selenio es muy elevada, entre el 85 y el 100%, mientras que en el pescado se encuentra entre el 20 y el 50%161. En el caso de la carne y los productos crnicos la biodisponibilidad se halla en torno al 15% . Con respecto a los derivados lcteos, un estudio de Shen162 ha puesto de manifiesto que la biodisponibilidad de la leche materna es significativamente superior a la de las leches de vaca, cabra y oveja. Se supone que las diferencias se deben principalmente a las diferencias en la composicin proteica y la forma qumica del selenio. Los estudios de la bioaccesibilidad in vitro de un determinado elemento pretenden calcular, mediante la simulacin de una digestin gastrointestinal, el porcentaje del nutriente que puede ser transformado en el intestino en una forma absorbible163, constituyendo as un mtodo sencillo, rpido y barato. Los resultados obtenidos en distintas investigaciones han mostrado distinta solubilidad para el selenio tras las digestiones gstrica e intestinal en funcin del alimento: mejilln (84%)164, gamba (70%)165, bacalao (61%)166 y ostras (90%)167.
66
Fuentes de selenio
Por lo tanto, la absorcin y biodisponibiliadad del selenio en los alimentos estarn determinadas por la forma qumica, la absorcin intestinal y la composicin de la dieta. Otro factor que tambin podra afectar al contenido y la biodisponibilidad de este animal sera el tratamiento de los alimentos, por lo que la medida de los niveles de este elemento presente en un alimento antes de su procesado, cocinado y empaquetado no sera reflejo de la cantidad real consumida por el hombre168. El proceso de molienda de trigo para la obtencin de harina, y el calentamiento y molienda de cereales durante su produccin supone prdidas importantes de este elemento. Sin embargo, las prcticas culinarias ms usuales (coccin, asado, desecacin, etc) no producen cambios en el contenido de selenio en los alimentos169.
67
1 2
Cutter G.A., Anal. Chem., 1985, 57, 2951. Thomson-Eagle E.T., Frankenberger W.T., Karlson V., Appl. Environ. Microbiol., 1989,
55, 1406.
3 4
Amouroux D., Donard O.F.X., Marine Chem., 1997, 58, 173. NAS, Medical and Biological Effects of Environmental Pollutants: Selenium, 1976,
National Academy of Sciences,Washington, EEUU.

5 6 7
Bennett B.G., Sci. Total Environ., 1983, 31, 117. Hashimoto Y., Hurang J.Y., Yanagisawa S., Environ. Sci. Technol., 1970, 4, 157. Jenkins R.A., Environmental Carcinogenesis, Selected Methods of Analysis, 1985. ONeill
I.K., Schuller P., Fishbein L. (Eds). International Agency for Research on Cancer, Lyon, Francia.
8 9
Germani M.S., Zoller W.H., Environ. Sci. Technol., 1988, 22, 1079. Fishbein L., Metals and their compounds in the environment: Selenium, 1991, pp 1153-
1191. Fishbein L. (Ed). Washington, EEUU.

10
Knight A.W., Maier K.J., Foe C., Ogle R.S., Williams M.J., Kiffney P., Melton L.A., Trace
Subst. Environ. Health, 1987, 21, 361.

11
Merian E, Carcinogenic and Mutagenic Compounds, 1985, pp.25-32. Merian E., Frei
R.W., Hrdi W., Scjhlatter C. (Eds). Gordon & Breach, Londres, Inglaterra.
12 13 14
Raptis S.E., Kaiser G., Tlg G., Fresenius Z. Anal. Chem, 1983, 316, 105. Camps Aberstain M., Edafologa, 2001, 8, 31. Herbel M.J., Johnson T.M., Tanji K.K., Gao S., Bullen T.D., J. Environ. Qual., 2002,
31(4), 1146.
15
Robberecht H., Trace Substances in Environmental Healh, 1980, Van Grieken R.,
Hemphill D.D. (Eds). University of Missouri, Columbia, EEUU.

16 17 18
Ross H.B., NATO ASI series, 1990, G-23, 523. Haygarth P.M., Jones K.C., Harrison A.F., Sci. Total Environ., 1991, 103, 89. Combs G.F., Combs S.B., The role of selenium in nutrition, 1986, pp 19. Jovanovich H.B.
(Ed). Academic Press Inc.

19 20 21 22 23 24
Barceloux D.G., Clin. Toxicol., 1999, 37, 145. Wilber C.G., Chem. Toxicol., 1980, 17, 171. Fox P.M., LeDuc D.L., Hussein H., Lin Z., Terry N., ACS Symp. Ser., 2003, 835. Sby F., Potin-Gautier M., Lspes G., Astruc M., Sci. Total Environ., 1997, 207, 81. Dungan R.S., Frankenberger W.T., Biorem J., 1999, 3, 171. Mayland H.F., Selenium in the Environment, 1994, pp 29-45. Frankenberger W.T.,
Benson Jr., Benson S. (Eds). Marcel-Dekker Inc., Nueva York.

25
Presser T.S., Selenium in the Environment, 1994, pp 139-156. Frankenberger W.T.,
Benson Jr., Benson S. (Eds). Marcel-Dekker Inc., Nueva York.
68
26 27
Conde J.E., Sanz Alaejos M., Chem. Rev., 1997, 97, 1979. Fan T., Cutter G., Report on the Peer Consultation Workshop on Selenium Aquatic
Toxicity and Bioaccumulation, 1998. United States Environmental Protection Agency (USEPA), Washington, EEUU.
28
Glover J., Levander O., Parizek J., Vouk V., Handbook on Toxicology of Metals, 1979,
pp.555-577. Fridberg L., Nordberg G.F., Vouk V.B. (Eds). Elsevier/North Holland Biochemical Press, Amsterdam, Holanda.
29
Newland N.W., The handbook of environmental chemistry 3, Part B, Anthropogenic
Compounds, 1982, pp. 45-57. Hutzinger O. (Ed). Springer, Verlag, Heidelberg.

30
Einbrodt H.J., Michels S., Metalle in der Umwelt, 1984, pp. 541-554. Merian E. (Ed).
Verelag Chemie, Weinheim-Deerfield Beach/Florida-Basel.

31
Bruland, K.W., Chemical oceanography: Trace elements in seawater, 1983, pp 157-220.
Riley J.P., Chester R. (Eds). Academic Press London, Londres.

32 33 34 35 36
Dhillon K.S., Dhillon S.K., Hydrol J., 2003, 272, 120. Olson O.E., Palmer I.S., Metabolism, 1976, 25, 299. Surai P.F., Worlds Poultry Sci. J., 2002, 58, 333. Brown T.C., Shrift A., Biol. Rev., 1982, 57, 59. Wu L., Selenium in the Environment, 1994, pp 279-342. Frankenberger W.T., Benson J.,
Benson S. (Eds). Marcel Dekker Inc., Nueva York.

37 38 39 40 41 42 43
Luchli A., Bot. Acta, 1993, 106, 455. Dauchy X., Potin-Gutier M., Astruc M., Fresenius J. Anal. Chem., 1994, 348, 792. Lewis B.G., Johnson C.M., Broyer T.C., Plant Soil, 1974, 40, 107. Duckart E.C., Waldron L.J., Donner H.E., Soil Sci., 1992, 53, 94. Aro A., Alfthan G., Varo P., Analyst, 1995, 120, 841. Gautier M.P., Analusis, 1997, 25, 22. McNeal J., Balistrieri L.S., Selenium in Agriculture and the Environment, 1989, pp 1-14.
Jacobs L.W. (Ed). SSSA Special Publ. No. 23, Madison, Wisconsin, EEUU.
44 45
Doran J.W., Adv. Microbiol. Ecology, 1982, 6, 1. Oremland R.S., Selenium in the Environment, 1994, pp 389-420. Frankenberger W.T.,
Benson J., Benson S. (Eds). Marcel-Dekker, Inc. Nueva York.

46
Oremland R.S, Hollibaugh J.T., Maest A.S., Presser T.S., Miller L.G., Culbertson C.W.,
Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55, 2333.

47
Lortie L., Gould W.D., Rajan S., McCready R.G.L., Cheng K.J., Appl. Environ. Microbiol.,
1992, 58, 4042.

48 49 50 51
Losi M.E., Frankenberger W.T., Soil Sci., 1997, 162, 692. Luoma S.N., Presser T.S., USGS report 00-416, 2000. Schwarz K., Foltz C.M., J. Amer. Chem. Soc., 1957, 79, 3292. Van Dael P., Deelstra H., Internat. J. Vit. Nutr. Res., 1993, 39, 2040.
69
52
Floh J., Brigelius-Floh R., Bck A., Grtner R., Meyer O., Floh L., Biol. Chem., 2000,
381, 849.
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67
Birringere M., Pilaqa S., Floh L., Nat. Prod. Rep., 2002, 19, 693. Floh L., Gnzler W.A., Schock H.H., FEBS Letters, 1973, 32, 132. Holben D.H., Smith A.M., J. of the American Dietetic Association, 1999, 99(7), 836. Fang Y.Z., Yang S., Wu G., Nutrition, 2002, 18, 872. Daniels L.A., Biol. Trace Elem. Res., 1996, 54, 190. Patching S.G., Gardiner P.H.E., J. Trace Elem. Med. Biol., 1999, 13, 193. Burk R.F., Hill K.E., Annu. Rev. Nutr., 1993, 13, 65. Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D., Biomedicine & Pharmacotherapy, 2003, 57, 134. Burk R.F., Gregory P.E., Arch. Biochem. Biophys., 1982, 213, 73. Yang J.G., Hill K.E., Burk R.F., J. Nutr., 1989, 119, 1010. Sunde R.A., Annu. Rev. Nutr., 1990, 10, 451. Chu F.F., Doroshow J.H., Esworhty R.S., J. Biol Chem., 1993, 268, 2571. Diplock A.T., Molecular Aspects of Medicine, 1994, 15, 295. Bhattacharya I.D., Picciano M.F., Milner J.A., Biol. Trace Elem. Res., 1988, 18, 59. Avissar N., Ornt D.B., Yagil Y., Horowitz S., Watkins R.H., Kerl E.A., Takahashi K.,
Palmer I.S., Cohen H.J., Am. J. Physiol., 1994, 266, C367.

68 69 70
Ursini F., Maiorino M., Greogolin C., Biochim. Biophys. Acta, 1985, 839, 62. Thomas J.P., Maiorino M., Ursini F., Girotti A.W., J. Biol. Chem., 1990, 265, 454. Thomas J.P., Geiger P.G., Maiorino M., Ursini F., Girotti A.W., Biochim. Biophys. Acta,
1990, 1045, 252.

71 72 73 74 75
Patrick N.D.L., Alternative Medicine Review, 2004, 9, 239. Gladishev V.N., Hatfield D.L., J. Biomed. Sci., 1999, 6, 151. Himeno S., Imura N., J. of Health Science, 2000, 46(6), 393. Larsen P.R., Berry M.J., Annu. Rev. Nutr., 1995, 15, 323. Behne D., Hammel C., Pfeifer H., Rthlein D., Gessner H., Kyriakopoulos A., Analyst,
1998, 123, 871.

76 77
Rayman M., Lancet, 2003, 356, 233. Germain D.L., Selenium, its Molecular Biology and Role in Human Health, 2001, pp 69-
81. Hatfield D.L (Ed). Kluwer Academic Publishers, Boston.

78 79 80 81
Mustacich D., Powis G., J. Broche., 2000, 346, 1. Holmgren A., Bjornstedt M., Methods Enzymol., 1995, 252, 199. Gallegos A., Berggren M., Gasdaska J.R., Powis G., Cancer Res., 1997, 57, 4965. Safe practices for parenteral nutrition formulations. J. Parenter. Enter. Nutr., 1998, 22,
49.
70
82
Guimaraes M.J, Peterson D., Vicari A., Cocks B.G., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins
N.A., Ferrick D.A., Kastelein R.A., Bazan J.F., Zlotnik A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 15086.
83 84 85 86 87 88 89
Stadtman T.C., Annu. Rev. Biochem., 1996, 65, 83. Burk R.F., Hill K.E., Bioassays, 1999, 21, 231. Hill K.E., Loyd R.S., Yang J.G., Read R., Burk R.F., J. Biol. Chem., 1991, 266, 10050. Persson-Moschos M., Huang W., Srikumar T.S., kesson B., Analyst, 1995, 120, 833. Suzuki K.T., Ishiwata K., Ogra Y., Analyst, 1999, 124, 1749. Arteel G.E., Sies H., Environ. Toxicol. Pharmacol., 2001, 10, 153. Frieden E., Biochemistry of the Essential Ultratrace Elements, 1984, Frieden E. (Ed).
Plenum Press, Nueva York.

90 91 92 93 94 95 96 97
Edmonds J.S., Morita M., Appl. Organomet. Chem., 2000, 14, 133. Suzuki K.T., Ogra Y., Phosphorus Sulfur Silicon, 2001, 171, 135. Yoneda S., Suzuki K.T., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1997,143, 274. Yoneda S., Suzuki K.T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 231, 7. Suzuki K.T., Sasakura C., Yoneda S., Biochem. Biophys. Acta, 1998, 1429, 102. Sasakura S., Suzuki T.T., J. Inorg. Biochem., 1998,7.1, 159. Whanger P.D., Cell. Mol. Life Sci., 2000, 57, 1846. Roveri A., Casasco C., Maiorino M., Dalan P., Calligaro A., Ursini F., J. Biol Chem.,
1992, 267, 6142.

98 99
Roveri A., Maiorino M., Nissii C., Ursini F., Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1208, 211. Mller C., Wringler K., Brigelius-Floh R., Biol. Chem., 2003, 384, 11. Brigelius-Floh R., Free Radical & Medicine, 1999, 27 (9/10), 951. Behne D., Hilmert H., Scheid S., Gessner H., Elger W., Biochem. Biophys. Acta, 1988,
100 101
966, 12.
102
Behne D., Weiss-Nowak C., Kalcklsch M., Westphal C., Gessner H., Kyriakopoulus A.,
Analyst, 1995, 120, 823.

103
Association of Official Analytical Chemists, Official methods of analysis, Vol. 1, 1990,
pp. 237. Arlington.

104
Cmara C., Cobo M.G., Palacios M.A., Muoz R., Donard O.F.X., Quality Assurance for
Environmental Analysis, 1995, pp. 235-262. Quevaullier, Maier, Griepink (Eds). Elsevier Science.
105 106
Lockitch L., Clin. Rev. Clin. Lab. Sci., 1989, 27, 483. Barrington J.W., Lindsay P., James D., Smith S., Bowen-Simpkins P., J. Obstet.
Gynaecol., 1997, 17, 199.

107 108 109
Chen J.M., Berry M.J., J. Neurochem., 2003, 86, 1. Vila M., Rev. Cien., 200, 25-26, 145. Clark L.C., Combs G.F., Turnbull B.W., J. Am. Med. Assoc., 1996, 276, 1957.
71
110 111 112 113
Spallholz J.E., The Bulletin of Selenium-Tellurim Development Association, 2001, May. Ip C., J. Nutr., 1998, 128, 1845. Ip C., Lisk D.J., Carcinogenesis, 1994, 15, 573. Thompson H.J., Wilson A., Lu J., Singh M., JIang C., Upadhyaya P., El-Bayoumy K., Ip
C., Carcinogenesis, 1994, 15, 183.

114 115 116
Sugie S., Tanaka T., El-Bayoumy K., J. Health Sci., 2000, 46, 422. Combs G.F., Gray W.P., Pharmacol. Ther., 1998, 79, 179. Spallholz J.E., The Bulletin of Selenium-Tellurim Development Association, 2001,
October, 1
117
Combs F.G., Junxuan L., Selenium, its Molecular Biology and Role in Human Health,
2001, pp 205-217. Hatfield D.L. (Ed). Kluwer Academic Publishers, Boston.

118 119 120
Ganther H.E., Carcinogenesis, 1999, 20, 1666. Jiang W., Zhu Z., Ganther H.E., Ip C., Thomson H.J., Cancer Lett., 2001, 162, 167. Calvo A., Xiao N., Kang J., Best C.J., Leiva I., Emmert-Burck M.R., Jorcyk C., Green
J.E., Cancer Res., 2002, 62, 5325.

121
Levander O.A., Selenium, its Molecular Biology and Role in Human Health, 2001, pp
307-309. Hatfield D.L. (Ed). Kluwer Academic Publishers, Boston.

122
Hgber J., Alexander J., Handbook on the Toxicology of Metals, 1986, Vol II, pp. 482-
520, Fridberg L., Nordberg G.F., Vouk V.B. (Eds). Elsevier Science Publishers, Amsterdam.
123 124 125 126 127 128 129 130 131
Yang G., Wang S., Zhou R., Sun S., Am. J.Clin. Nutr., 1983, 37, 872. Olson O.E., J. Am. Coll. Toxicol., 1986, 5, 45. Herrero E., Rojas P., Rev. Cien., 2000, 25-26, 1. Helzlsouer K., Jacobs R., Morris S., Fed. Proc., 1985, 44, 1670. Shiobara Y., Ogra Y., Suzuki K.T., Analyst, 1999, 124, 1237. Suzuki K.T., Ogra Y., Food Addit. Contam., 2002, 19, 974. Sunde R.A., J. Am. Oil Chem. Soc., 1984, 61, 1891. Hsich H.S., Ganther H.E., Biochemistry, 1975, 14, 1632. Thomson H.J., Selenium, its Molecular Biology and Role in Human Health, 2001, pp
284-289. Hatfield D.L. (Ed). Kluwer Academic Publishers, Boston.

132
Ogra Y., Ishiwat K., Takayama H., Aimi N., Suzuki K.T., J. Chromatogr. B, 2002, 767,
301.
133
Kobayashi Y., Ogra Y., Ishiwhata K., Takayama H., Aiii N., Suzuki K.T., Proc. Natl,
Acad. Sci. USA, 2002, 99, 15932.

134
Nakamuro K., Nakanishi K., Okuno T., Hasegawa T., Sayato Y, Jpn. J. Toxicol. Environ.
Health, 1997, 43, 182.

135
Okuno T., Kubota T., Kuroda T., Ueno H., Nakamuro K., Toxicol. Appl. Pharmacol.,
2001, 176(1), 18.
72
136 137
Shiobara Y., Yoshida T., Suzuki K.T., Toxicol. Appl, Pharmac., 1998, 152, 309. Ebdon L., Pitts L., Cornelis R., Crews H., Donard O.F.X., Quevauviller P., Trace
Element Speciation for Environtment, Food and Health, 2001. Ebdon L., Pitts L., Cornelis R., Crews H., Donard O.F.X., Quevauviller P. (Eds). Royal Society of Chemistry, Cambridge.
138 139 140
Litov R.E., Combs G.F., Pediatrics, 1991, 87, 339. Hazell T., Word Rev. Nutr. Diet, 1985, 46, 1. Levander O.A., Trace Elements in Human and animal Nutrition: Selenium, 1985, pp.
209-279, Merz W. (Ed), Academic Press, Orlando, Florida.

141
Ortuo J., Ros G., Periago M.J., Martnez C., Lpez G., Food Sci. Techn. Intern., 1996,
2, 135.
142 143
Fenwick G.R., Heaney R.K, Food Chem., 1983, 11, 249. MAPA (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin), Dieta alimentaria espaola
1991. MAPA. Direccin General de Poltica Alimentaria, Madrid.

144
ODell B.L., Trace Elements in Nutrition of Children: Bioavailability and interaction
among trace elements, pp 41-62. Chandra R.R. (Ed), Raven Press, Nueva York.
145 146 147 148
Sanz M., Daz C., Clin. Chem., 1993, 39, 10, 2040. Foster L.H., Sumar S., Nutr. Food Sci., 1995, 5, 17. Moser-Veillon P.B., Mangels A.R., Patterson K.Y., Veillon C., Analyst, 1992, 177, 559. Haschke F., Ziegler E.E., Edwards B.B., Fomon S.J., J. Pediatr. Gastr. Nutr., 1986, 5,
768.
149 150 151 152 153 154
Fox J.M., Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 1992, 14, 4, 275. Thomson C.K., Robinson M.F., Am. J. Clin. Nutr., 1986, 44, 659. Oster O., Schmiedel G., Prellwitz W., Biol. Trace Elem. Res., 1988, 15, 23. Schrauzer G.N., J. Nutr., 2000, 130, 1653. Thomson C.D., Analyst, 1998, 123, 827. Swanson C.A., Patterson B.H., Levander O.A., Veillon C., Taylor P., Helzsouer K.,
McAdam P.A., Zech L.A., Am. J. Clin. Nutr., 1991, 54, 917.
155
Patterson B., Levander O., Helzsouer K., McAdam P., Lewis S., Taylor P., Veillon C.,
Zech L.A., Am. J. Physiol., 1989, 257, R556.

156 157 158
Chansler M.W., Mutanen M., Morris V.C., Levander O.A., Nutr. Res., 1986, 6, 1419. Mutanen M., Intert. J.Vit. Nutr. Res., 1986, 56, 297. Meltzer H.M., Bibow K., Paulse I.T., Mundal H.H., Norheim G., Holm H., Biol. Trace
Elem. Res., 1993, 36, 229.

159
Wen Y.H., Davis R.L, Shi B., Chen J.J., Chen L., Boylan M., Spallholz J.E., Biol. Trace
Elem. Res., 1997, 58, 43.

160 161
Ip C., Lisk D.J., Nutr. Cancer, 1993, 20, 129. Nve J., Henry M., Peretz A., Mareschi J.P., Can. Nutr. Dit. XXII, 2, 145.
73
162 163 164
Shen L., Dael P.V., Luten J., Deelstra H., Intern. J. Food Sci. Nutr., 1996, 47, 75. Barber R., Farr R., Rev. Esp. Cienc. Tecnol. Aliment., 1992, 32, 381. Luten J.B., Bouquet W., Burggraaf M., Rus J., Analytical Chemistry in Medicine and
Biology: Trace Elements, 1987, pp 509. Bratter P., Schramel P. (Eds). Galter de Gruter, Nueva York.
165 166
Hassan S., Hakkarainen J., Lindberg P.J., Vet. Med., 1987, 34, 353. Crews H.M., Clarke P.A., Lewis D.J., Owen L.M., Strutt P.R., J. Anal. Atomic.
Spectrom., 1996, 11, 1177.

167
Vzquez M.S., Gutirrez A.M., Gmez M.M., Palacios M.A., Qumica Analtica, 1994,
13, 144.
168
Mason A.C., Trace Minerals in Foods: Selenium, 1988, pp. 325-355. Smith K.T. (Ed).
Marcel Dekker Inc., Nueva York.

169
Higgs D.J., Morris V.C., Levander O.A., J. Agr. Food Chem., 1972, 20, 3, 678.
74
Hg-Se
1. 2. FORMA QUMICA Y EFECTO PROTECTOR/ANTAGNICO EFECTOS DEL SELENIO EN LA DISTRIBUCIN DEL MERCURIO EN RGANOS Y TEJIDOS 3. POSIBLES MECANISMOS DE PROTECCIN DEL SELENIO FRENTE A LA TOXICIDAD DEL MERCURIO
3.1. 3.2. 3.3. 3.4. REDISTRIBUCIN DEL MERCURIO COMPETENCIA POR LOS MISMOS PUNTOS DE UNIN FORMACIN DE COMPLEJOS Hg-Se CONVERSIN DE LA FORMAS TXICAS DE MERCURIO EN OTRAS FORMAS MENOS TXICAS 3.5. PREVENCIN DEL DAO OXIDATIVO
4.
Captulo III
INTERACCIN MERCURIO-SELENIO
Interaccin Hg-Se
INTERACCIN MERCURIO-SELENIO
El efecto protector que el selenio ejerce frente a la toxicidad del mercurio se conoce desde hace ms de tres dcadas siendo descrito por primera vez por Parizek y Ostadalova1. Estos investigadores demostraron la desaparicin del efecto txico del mercurio cuando ambos compuestos (Se(IV) y Hg(II)) eran administrados simultneamente a ratas. Los riones de estas ratas no mostraron variaciones a nivel macroscpico o dao histolgico, como necrosis en los tbulos renales, a diferencia de lo que ocurra cuando slo se les administraba mercurio. Aunque este estudio es considerado como el primer trabajo sobre la interaccin mercurio-selenio, hay algunos estudios descritos con anterioridad que podran haber conducido al inicio de la investigacin en esta rea mucho antes2. Por ejemplo, en los tejidos de las vctimas del desastre de Minamata se encontraron concentraciones inusualmente elevadas no slo de mercurio, sino de selenio. Doce aos ms tarde, Ganther y col.3 mostraron el efecto paliativo de la toxicidad del metilmercurio por parte del selenito sdico. A partir de este momento, son muchos los estudios que han tratado este fenmeno, promoviendo un gran nmero de investigaciones sobre la posible interaccin mercurio-selenio en distintos organismos y sistemas biolgicos, al igual que numerosos estudios sobre posibles mecanismos de proteccin. Dentro de las distintas lneas de investigacin existentes, cabe destacar la dirigida al estudio de varios organismos que a pesar de presentar elevadas concentraciones de mercurio no presentaron signos aparentes de envenenamiento. Para una mejor comprensin de este fenmeno, no slo se han realizado determinaciones de los contenidos de mercurio total, sino que igualmente se han determinado las concentraciones de selenio y se han estudiado posibles relaciones entre estos dos elementos en animales y seres humanos4. Koeman y col.5,6 encontraron una relacin molar 1:1 de mercurio y selenio en hgados de mamferos marinos. La correlacin lineal entre estos elementos fue tambin observada en estudios posteriores no slo en mamferos marinos (focas, orcas, osos polares)7,8,9,10,11 sino en humanos tanto expuestos ocupacionalmente al mercurio (mineros)12 como no expuestos13. La relacin equimolar se observ slo cuando la concentracin de mercurio superaba un determinado valor (1-100 mg kg-1 dependiendo de la especie analizada), lo que sugiere un proceso de detoxificacin en el que el selenio se ve involucrado cuando el mercurio alcanza una determinado nivel. Los niveles de mercurio y selenio ms altos que se han descrito en la bibliografa en mamferos marinos y aves alcanzan los siguientes valores: 510 ppm y 270 ppm de mercurio y selenio respectivamente, en hgados de focas Phoca hispida14 y 430 ppm y 120 ppm de mercurio y selenio respectivamente, en hgado del guila Haliaeetus leucocephalus15. A pesar de estos valores tan extremadamente altos, estos animales no
77
Interaccin Hg-Se
mostraron ningn signo de intoxicacin. Este hecho sugiere que la presencia de ambos elementos puede proporcionar proteccin al animal mediante un efecto protector del selenio frente a la toxicidad causada por el mercurio y viceversa. Sin embargo, la correlacin entre las concentraciones de mercurio y selenio presente en pescados no est bien establecida. Los resultados obtenidos por distintos autores no son concluyentes. Ganther y Sunde16 demostraron que el contenido de selenio en atn era superior en aquellos individuos que presentaban un elevado contenido en mercurio, alcanzando relaciones 1:1 en los animales ms contaminados. En el msculo del atn Thunnus alalunga la relacin selenio-mercurio tambin tendi a alcanzar la unidad17. Lo mismo se observ en las gnadas del pez espada18. Sin embargo, en otros estudios se detect un exceso de selenio en las muestras de pescado analizadas19,20,21. Consecuentemente, los resultados de estos estudios sugieren que la relacin molar 1:1 encontrada en mamferos marinos no se mantiene a lo largo de la cadena trfica y es independiente de la relacin molar de los eslabones inferiores de dicha cadena. Esto puede explicarse por los distintos mecanismos de interaccin que tienen lugar dentro de los organismos. Desgraciadamente, los estudios realizados en los pescados raramente incluyen la concentracin de estos elementos en agua y en los peces que constituyen su dieta, por lo tanto, es difcil establecer si la relacin mercurio-selenio se correlaciona o no con la que hay presente en la dieta. Experimentalmente se ha observado que los niveles de selenio presentes en pescados pueden ser lo suficientemente elevados como para proteger a los organismos de la toxicidad del mercurio. Ganther y col. describieron como la vida de codornices alimentadas con metilmercurio se vea prolongada cuando se las administraba conjuntamente atn incorporado a la dieta. Otro ejemplo del estudio sobre el efecto protector del selenio procedente de pescado fue llevado a cabo por Friedman y col.22. Los resultados mostraron que las ratas a las que se haba administrado metilmercurio y pez espada en la dieta no reflejaban ningn signo de envenenamiento por mercurio caracterizado por sus efectos neurotxicos, mientras que las ratas que no haban sido alimentadas con el pez espada s los manifestaron. La determinacin de la concentracin de selenio en el pez espada revel niveles que duplicaban el contenido en mercurio. Por lo tanto, se sugiri que el exceso de selenio existente en el pez espada era capaz de proteger a las ratas del metilmercurio administrado. Otros experimentos con animales ponen de manifiesto varios efectos protectores del selenio ante la toxicidad del mercurio. Algunos estudios llevados a cabo con ratas destacan una menor mortalidad, mejores ndices de crecimiento y ganancia de peso en los animales tratados con selenio y mercurio si se comparan con los tratados con mercurio exclusivamente23,24,25. En el pez pequeo de agua dulce Semotilus atromaculatus el
78
Interaccin Hg-Se
tratamiento con dixido de selenio previo a la administracin de mercurio (como cloruro de mercurio) supuso un menor ndice de mortalidad en comparacin con el grupo que fue tratado nicamente con mercurio. Adems, a bajas concentraciones de mercurio (0.1-0.16 ppm) se observ una menor acumulacin de este elemento en los animales pretratados con selenio26. En los peces Phoxinus phoxinus expuestos a mercurio junto con selenio se obtuvieron ndices de supervivencia significativamente mayores que los expuestos nicamente a mercurio27. En el mejilln Mytilus edulis, los tests de toxicidad letal aguda llevados a cabo empleando tratamientos de mercurio y mercurio-selenio demostraron que la mejor proteccin se obtena mediante la adicin simultnea (equimolar) de selenio y mercurio28. El selenio presente en sedimentos tambin ha sido eficaz en la inhibicin de la asimilacin del metilmercurio en el gusano Lumbriculus variegates29. A la inversa, los efectos txicos del selenio pueden ser tambin reducidos por el mercurio. La adicin de bajos niveles de cloruro de mercurio en dietas que contenan concentraciones txicas de selenio protegi a los pollos objeto de estudio de la inhibicin del crecimiento y de la mortalidad debidas al selenio. Conforme se increment el mercurio en la dieta, el efecto del selenio disminua progresivamente, aunque el mayor nivel de mercurio empleado fue aquel que supona una relacin molar con el selenio igual a la unidad30. Estudios relacionados con cultivos de tejido nervioso del cerebelo de ratas tambin han demostrado que el selenito y el seleniato sdico proporcionan un efecto protector importante frente a la neurotoxicidad del metilmercurio. Concentraciones de seleniato sdico entre 0.2 10-5 y 1.0 10-5 M protegieron los tejidos nerviosos de la toxicidad ocasionada por concentraciones de metilmercurio entre 1.0 10-5 y 1.5 10-5 M 31. Este hecho sugiere que concentraciones molares de selenio inferiores a las de mercurio son capaces de proteger de la toxicidad de este ltimo. A parte de los estudios realizados en laboratorios se han llevado a cabo estudios en ecosistemas experimentales para poder demostrar las posibles interacciones mercurioselenio. Turner32 demostr que la habilidad del selenio para reducir la bioacumulacin del mercurio en la biota dependa no slo de la dosis sino de la posicin del organismo en la cadena alimentaria. En pescados, la reduccin fue notable y proporcional a la cantidad de selenio acumulada, sin embargo, en los niveles ms bajos de la cadena, el efecto del selenio fue muy pequeo o incluso nulo. Adems, hay indicios de que el selenio incorporado a ecosistemas acuticos y por lo tanto, incorporado subsecuentemente a la cadena trfica podra interferir en la biomagnificacin del mercurio. El incremento en la cantidad de selenio redujo la asimilacin de mercurio procedente de la dieta entre un 10 y un 50% . Una reduccin mayor (75-85%) ha sido descrita por Paulssson y Lindbergh despus de incorporar en Suecia selenio a algunos lagos y medir sus efectos durante un perodo de tres aos33.
79
Interaccin Hg-Se
Asimismo, el selenio se ha empleado como un agente paliativo de la acumulacin de mercurio en sistemas acuticos con problemas severos de contaminacin. La adicin de selenio (100 g Se l-1) permiti que la acumulacin de mercurio por parte de pescados y otro biota acutica se viera disminuida por un factor de 2, aunque el efecto fue dependiente de la dosis y de las especies34.
1. FORMA QUMICA Y EFECTO PROTECTOR/ANTAGONISTA Se-Hg. Como se ha comentado anteriormente la forma qumica del mercurio y selenio afecta a la toxicologa de ambos elementos. Por ello, las interacciones entre el mercurio y el selenio dependern, en gran medida, de las formas qumicas en que ambos elementos se administren. En estudios con animales la cantidad de mercurio incorporada a travs de la alimentacin se ha visto afectada por la concentracin y forma qumica de selenio presente en la dieta. As, Turne y col.35 comprobaron como el lucio Esox lucius experimentaba una reduccin entre un 5 y 11% en la asimilacin del mercurio procedente de la dieta cuando se incrementaba la cantidad de selenio en su alimentacin (a base de la perca Perca flavescens). Sin embargo, cuando ambos elementos se administraban en disolucin acuosa, la concentracin de mercurio en varios tejidos de este pescado no se vio afectada por el estatus de selenio del animal. El mercurio y selenio empleados parar tratar el agua y el alimento del lucio (perca) se encontraba en forma de
203
Hg(NO3)2 y H2SeO3. Este hecho
sugiere que la diferente asimilacin del mercurio observada puede ser debida, en parte, a posibles transformaciones de ambos elementos (mercurio y selenio) previo a su consumo. La efectividad del selenio procedente de pescados conocidos por tener elevadas concentraciones de este elemento, como el atn, para detoxificar el mercurio se ha comparado con la efectividad del selenio inorgnico para poder determinar s existe alguna diferencia en el grado de proteccin proporcionado por ambas formas de selenio. El selenio administrado a travs del atn o en forma de selenito sdico mostr el mismo efecto protector en ratas expuestas a metilmercurio. Ambos mejoraron los ndices de crecimiento y disminuyeron la prdida de peso y el ndice de mortalidad de las ratas. Sin embargo, el selenito fue ms efectivo que el selenio procedente del atn en la prevencin de manifestaciones neurolgicas de la toxicidad del mercurio36. Puesto que el rin es uno de los rganos ms susceptibles al envenenamiento por mercurio, Fang37 ha realizado estudios de la efectividad de cuatro compuestos diferentes de selenio para reducir los niveles renales de mercurio (administrado como cloruro de mercurio). Los resultados mostraron que si se comparan equimolarmente, la eficiencia de los cuatro compuestos de selenio sigue el siguiente orden de efectividad:
80
Interaccin Hg-Se
selenometionina>selenocistina>seleniato>selenito. Los compuestos orgnicos de selenio parecen ser ms efectivos que las formas inorgnicas en la prevencin de la acumulacin del mercurio en los rganos diana. Sin embargo, otros estudios han mostrado diferentes resultados. Henz y Hoffman15 encontraron que la selenometionina y el metilmercurio interaccionaban de distinta forma en patos jvenes y adultos de la especie Anas platyrhynchos. La selenometionina protega a los patos adultos de la toxicidad del metilmercurio, pero acusaba los efectos txicos del metilmercurio en los individuos jvenes (menor supervivencia y crecimiento). Un estudio reciente revela que el selenito y seleniato no afectan significativamente a la acumulacin de Hg(II) o metilmercurio en diatomeas y mejillones, pero, la selenometionina favoreci la bioacumulacin del mercurio inorgnico e inhibi significativamente la bioacumulacin del metilmercurio38. Sharma y Davis39 observaron una leve proteccin frente al cloruro de mercurio y metilmercurio del selenio cuando este era administrado en forma de selenito sdico al pez Carasius auratus, mientras que la selenometionina no mostr ningn signo de proteccin. La comparacin de dos formas de selenio administradas a ratas tambin demostr que el selenito sdico fue ligeramente ms efectivo que la selenometionina en la reduccin de los sntomas de toxicidad del mercurio24,40,41. La neurotoxicidad del metilmercurio tambin se ha visto prevenida por el seleniato y el selenito sdico, aunque el selenito fue cuatro veces ms efectivo que el seleniato. Dosis tan bajas como 0.8 10-5 M de seleniato y 0.2 10-5 M selenito fueron efectivas frente a una concentracin de 1 10-5 M de metilmercurio . Estudios fisiolgicos han mostrado que aunque el transporte del metilmercurio se vea favorecido por el selenito, el transporte del cloruro de mercurio se vea de hecho afectado negativamente conforme se incrementaba la cantidad de selenio. El seleniato, por otra parte, increment ligeramente el transporte del cloruro de mercurio, a pesar de tener un menor efecto en el transporte del metilmercurio42. Esta variacin en los resultados de la efectividad de las diferentes formas qumicas de selenio frente a la toxicidad del mercurio es posiblemente indicador de la existencia de distintos mecanismos de actuacin en funcin de la forma en que ambos elementos coexisten y tambin del tipo de organismos. La interaccin del mercurio con las especies de selenio se ve tambin afectada por la forma qumica del propio mercurio. Estudios de bioacumulacin de selenio y mercurio en la ostra azul Mytilus edulis43 demostraron, que en ausencia de mercurio las ostras acumulaban selenio inorgnico y no acumulaban selenio orgnico. Sin embargo, cuando se adicion mercurio inorgnico al agua (30 g Hg l-1) la acumulacin del selenio inorgnico se duplic, y se triplic con la adicin de la misma cantidad de metilmercurio. Incluso el selenio orgnico se convirti en una especie biodisponible en presencia de metilmercurio. Sin embargo, este fenmeno no fue recproco, es decir, la presencia de
81
Interaccin Hg-Se
selenio no tuvo ningn efecto en la acumulacin del mercurio independientemente de su concentracin y forma qumica. El empleo de cloruro de mercurio y metilmercurio en presencia de selenito, selenitato y selenometionina marcados isotpicamente ha permitido evaluar la interaccin de distintas formas de mercurio y selenio durante su absorcin intestinal. El metilmercurio no afect a la absorcin y solubilidad de la selenometionina en el intestino delgado de los pollos. Sin embargo, el mercurio inorgnico s disminuy la absorcin del selenito y seleniato, sugiriendo una mayor interaccin entre el selenio y el mercurio en el lumen intestinal cuando estn en forma inorgnica44. Varios estudios relacionados con el efecto de los diferentes compuestos de mercurio (cloruro de mercurio, metilmercurio y acetato de fenilmercurio) en la distribucin del selenio no han permitido concluir que compuesto es ms efectivo que otro en la alteracin de los niveles de selenio en los tejidos. El metilmercurio increment la concentracin de selenio en el cerebro, mientras que el cloruro de mercurio y acetato de fenilmercurio causaron su reduccin. Por otra parte, el contenido de selenio en el hgado disminuy con la adicin de metilmercurio, mientras que el cloruro de mercurio y el acetato de fenilmercurio proporcionaron una mayor acumulacin del selenio en los riones. Los niveles de selenio en la sangre tambin se vieron incrementados por el metilmercurio y acetato de fenilmercurio, pero no por el cloruro de mercurio . Asimismo, la toxicidad del acetato de fenilmercurio en pollos disminuy en presencia de selenio en forma de difenilselenio. Sin embargo, el mercurio como cloruro de mercurio no mostr una interaccin biolgica significtiva con el difenilselenio. Adems, hay indicaciones de que la interaccin del acetato de fenilmercurio y el difenilselenio es diferente a la del cloruro de mercurio y el dixido de selenio. El efecto del difenilselenio en la toxicidad del acetato del fenilmercurio fue evidente en la relacin molar 1:4 a diferencia de la relacin molar 1:1 que se determin como la ms eficiente en la interaccin cloruro de mercurio con dixido de selenio . Por lo tanto, estos resultados sugieren que las interacciones entre los distintos compuestos de selenio y mercurio son extremadamente complejas y no se ha conseguido su dilucidacin. La presencia de otros elementos y compuesto pueden tambin modificar la interaccin entre el mercurio y el selenio. Por ejemplo, la presencia de arsnico en la forma arsenito sdico, alter la habilidad del selenio para modificar la toxicidad del metilmercurio en codornices. Aunque el arsenito por s solo no ejerce un efecto protector frente a la toxicidad del metilmercurio, mejor la efectividad del selenito incrementando la esperanza de vida si se compara con las codornices intoxicadas por mercurio45. La combinacin de cistina y selenito tambin supuso un efecto aditivo considerable al reducir la toxicidad del mercurio evaluado mediante el incremento en ndices de crecimiento y menor mortalidad en ratas .
82
Interaccin Hg-Se
2. EFECTOS DEL SELENIO EN LA DISTRIBUCIN DEL MERCURIO EN RGANOS Y TEJIDOS Uno de los efectos observados que el tratamiento con selenio ejerce en animales intoxicados por mercurio es la aparente modificacin de la distribucin del mercurio en distintos rganos y tejidos. En la Tabla 8 se recoge un resumen de los trabajos que han estudiado esta modificacin. De especial inters es el efecto del selenio en los niveles de mercurio en los riones, puesto que ste es uno de los rganos ms susceptibles a su toxicidad. Por este motivo no sorprende el nmero elevado de estudios realizados en riones de animales expuestos a este elemento. Algunos trabajos con ratas han demostrado que el pre-tratamiento con selenito sdico seguido de la administracin de cloruro de mercurio disminuye notablemente la concentracin de mercurio en los riones de estos animales (hasta un 90%)23,46, lo que se traduce en una disminucin de la bioacumulacin del mercurio. Otros autores han observado semejante comportamiento en los riones de otros animales como el pez Phoxinus phoxinus47, el pez Fundulus heteroclitus48, conejos49 y cerdos50 despus de un tratamiento con selenio. Por lo tanto, diversos estudios han demostrado que el selenito no slo afecta a la asimilacin de mercurio, sino que tambin a su retencin en los riones. Sin embargo, otros estudios han permitido concluir que la presencia de selenio incrementa la concentracin de mercurio inorgnico en estos rganos51. Junto con este incremento en la concentracin de mercurio en los riones, los niveles de selenio tambin se incrementaron cuando ambos elementos fueron administrados simultneamente52. La administracin de selenito y mercurio inorgnico tambin produce una reduccin de la excrecin urinaria del mercurio en ratas si se compara cuando slo se administraba mercurio53,54. A diferencia de lo que ocurre en los riones, en el hgado de ratas tratadas con selenito sdico, independientemente de la forma de mercurio administrada , se han encontrado niveles superiores de mercurio. Los mismos resultados fueron observados por distintos grupos de investigacin en los mismos animales cuando se administraron dosis equimolares de mercurio y selenio37,55,56. Por otro lado, en el hgado de un pato15 y del pez Fundulus heteroclitus , las concentraciones de mercurio no fueron modificadas significativamente cuando se les administr selenio. Varios estudios llevados a cabo con distintas aves ponen de manifiesto los distintos comportamientos ante la co-administracin de selenio y mercurio en funcin del ave, del nivel y forma del mercurio administrado, del sexo y de la edad de los individuos.
83
Interaccin Hg-Se
Tabla 8. Principales estudios del efecto del selenio en la distribucin del mercurio
ESPECIE ANIMAL Rata Pez Pez Conejo Cerdo
MERCURIO Hg(II) Hg(II) Hg(II) Hg(II) Hg(II) Hg(II)
SELENIO Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico
EFECTO [Hg] disminuye en el rin [Hg] disminuye en el rin [Hg] disminuye en el rin, aumenta en el hgado [Hg] disminuye en el rin [Hg] disminuye en el rin, aumenta en el bazo, el hgado y los pulmones [Se] aumenta en el bazo, el hgado, los pulmones y el rin [Hg] disminuye en el rin
REF 46 47 48 49 50
Selenito sdico Metilmercurio Hg(II) Metilmercurio Selenito sdico Selenometionina Metilmercurio SeO2 Metilmercurio Metilmercurio Selenito sdico Selenito sdico
Rata
[Hg] aumenta en el bazo y en el hgado, no se modifica en el rin [Hg] aumenta en el hgado [Hg] aumenta en la sangre y el hgado, disminuye el porcentaje de MeHg [Hg] disminuye en la sangre y en el hgado
23
Rata
56
Rata
55
Codorniz Ratn
Pollo Metilmercurio Selenito sdico Codorniz Metilmercurio Metilmercurio Metilmercurio Metilmercurio Metilmercurio Metilmercurio Fenilmercurio Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico Selenito sdico Selenometionina Selenito sdico Gallina Codorniz Cerdo Codorniz Pollo Pato Gallina
[Hg] aumenta en el cerebro y en el hgado [Se] aumenta en la sangre, el cerebro, el hgado y el rin [Hg] aumenta en cerebro, no se modifica en la sangre y en el rin [Hg] disminuye en el hgado (~ 50%) y el msculo, no se modifica el nivel en el cerebro mortalidad [Hg] se duplica en el hgado, no se modifica el nivel en el cerebro mortalidad [Hg] aumenta en el hgado [Hg] disminuye en el hgado [Hg] disminuye en la sangre, el hgado, el cerebro y el rin excrecin [Hg] disminuye en el hgado [Hg] disminuye en el hgado, efecto vara con el sexo del ave [Hg] no se modifica efecto antagnico en individuos adultos efecto sinrgico en individuos jvenes [Hg] disminuye en el msculo, el hgado y el rin
60 57
61
62 63 202 58 59 15 64
84
Interaccin Hg-Se
El-Begerami y col.60 observaron que codornices alimentadas con metilmercurio (530 ppm) junto con selenito sdico (12 ppm) duplicaban el contenido de mercurio en el hgado si se compara respecto a cuando slo se inclua el mercurio en su dieta. Adems, este incremento en la concentracin de mercurio vino acompaado por un incremento en la concentracin de selenio en la sangre, cerebro, hgado y rin. Resultados anlogos fueron descritos por Sell y Morai61 quienes alimentaron a codornices con 20 ppm de metilmercurio y 8 ppm de selenito sdico y por Emerick y col.62 quienes alimentaron a gallinas con ambos elementos simultneamente. Sin embargo, la adicin de selenio y mercurio a pollos supuso la reduccin de los niveles de mercurio en el msculo y en el hgado (prximo al 50%), al igual que en los experimentos de Welsh y Soares63. La interaccin selenio-mercurio se ha estudiado en general empleando Se(IV), SeMet, Hg(II) y MeHg, pero algunos experimentos han involucrado otras especies como en el caso del selenio el SeO2, que administrado conjuntamente con metilmercurio originaba una menor acumulacin de mercurio en sangre e hgado , y en el caso del mercurio el fenilmercurio que junto con Se(IV) vea disminuida su concentracin en el msculo, hgado y rin64. El mercurio no acumulado en los riones se piensa que puede ser redistribuido al msculo. En ratas, se encontr una cantidad de mercurio tres veces superior en el msculo del grupo tratado con selenio que en el grupo dnde slo se haba administrado cloruro de mercurio . Este mismo comportamiento tambin se observ en pez Fundulus heteroclitus. El selenio tambin se increment cuando se administr metilmercurio y mercurio inorgnico en este tejido. Estudios de la interaccin mercurio-selenio en sangre de conejo llevados a cabo in vivo e in vitro, han puesto de manifiesto una mayor asimilacin del mercurio por parte de los eritrocitos en comparacin con cuando slo se empleaba metilmercurio. Sin embargo, la incorporacin de selenio a la sangre s se vio reducida en presencia del mercurio65. Tambin se observaron incrementos significativos de los niveles de mercurio en ratas, despus de un tratamiento con selenio . Por otra parte, Scheline y Schmidt-Nielsen observaron que la sangre del pez Fundulus heteroclitus mostraba retenciones 3.5 veces inferiores de mercurio despus del tratamiento con selenio. En el intestino, el selenio favoreci el transporte del mercurio a travs del intestino delgado de las ratas. La acumulacin del mercurio prcticamente no se vio modificada con la adicin del selenito o seleniato en el caso del metilmercurio, pero s lo hizo en el caso del cloruro de mercurio. Adems, en otros tejidos, tales como cerebro37,53,66,67, corazn, pncreas , testculos23,46 y bazo23,37, la presencia de selenio mostr una tendencia general hacia el incremento en el contenido de mercurio.
85
Mecanismos de proteccin
Por lo tanto, el selenio no slo no parece manifestar los mismos mecanismos de interaccin con el mercurio inorgnico y mercurio orgnico, sino que pone de manifiesto la complejidad de las interacciones selenio-mercurio puesto que dependen no slo de las distintas formas en que estos elementos estn presentes sino de los seres vivos implicados.
3. POSIBLES MECANISMOS DE PROTECCIN DEL SELENIO FRENTE A LA TOXICIDAD DEL MERCURIO A pesar de la gran variedad de estudios existentes y de la informacin disponible, los mecanismos exactos de interaccin entre el mercurio y el selenio no se han conseguido dilucidar. La mayora de la informacin disponible proviene de los resultados obtenidos de un gran nmero de estudios, pero no son del todo concluyentes. A continuacin se enumeran y discuten algunos de los posibles mecanismos propuestos sobre la proteccin efectiva del selenio frente a la toxicidad del mercurio: redistribucin del mercurio en presencia de selenio, competencia por los mismos puntos de unin por parte de ambos elementos, formacin de un complejo mercurio-selenio, conversin de las formas txicas de mercurio en otras formas menos txicas y prevencin del dao oxidativo. Cada uno de estos posibles mecanismos se va a discutir a continuacin (Tabla 9).
3.1. REDISTRIBUCIN DEL MERCURIO Algunos estudios indican que la asimilacin del mercurio no disminuye por la presencia del selenio, de hecho, a veces se incrementa. Tambin se ha demostrado que en ciertos casos el selenio no favorece la eliminacin del mercurio sino su retencin. Sin embargo, un nmero notable de estudios concluyen lo contrario. Esta variedad de resultados indica, como se ha comentado anteriormente, que los mecanismos de proteccin del selenio frente a la toxicidad del mercurio observados pueden ser extremadamente complejos. La redistribucin del mercurio dentro de los organismos se he discutido previamente. Se cree que la redireccin del mercurio de un rgano a otro, y de una fraccin subcelular a otra es uno de los mecanismos generales involucrados en la accin protectora del selenio. Varios estudios muestran que el selenio promueve la redistribucin del mercurio de rganos y tejidos altamente sensibles como el rin a otros menos sensibles (msculo)46,48. La reduccin de los niveles de mercurio en el rin podra explicar los resultados obtenidos por Parizek y Ostadalova, quienes no encontraron dao
86
macroscpico o histolgico en el rin de ratas tratadas con niveles de mercurio y selenio por debajo de la dosis letal. Tabla 9. Mecanismos de proteccin del selenio frente a la toxicidad del mercurio
POSIBLES MECANISMOS DE PROTECCIN DEL SELENIO FRENTE A LA TOXICIDAD DEL MERCURIO Redireccin del Hg de rganos y tejidos altamente sensibles a otros menos sensibles Inhibicin de la metaloprotenas o bloqueo de la unin del Hg y estas protenas, alterando as el perfil proteico, favorecindose la unin a protenas de elevado peso molecular Hg y Se compiten por los mismos receptores, posiblemente receptores de Se
1. Redistribucin del Hg
2. Competencia por los mismos puntos de unin
Hg(II) Plasma: selenito se reduce a seleniuro y reacciona con el cloruro de Hg para formar un complejo equimolar Hg-Se que se enlaza a la selenoprotena P (complejo Hg-Se-Selenoprotena P). De esta forma se evita que alcance ciertos tejidos diana Hgado: formacin del complejo equimolar Hg-Se unido a especies de elevado peso molecular, posible precursor del HgSe cristalino (tiemanita) encontrado en el lisosoma heptico de mamferos marinos MeHg Sangre: formacin de un complejo inestable con relacin molar Hg:Se 2:1, posiblemente el seleniuro bis (metilmercrico) (CH3Hg)2Se MeHg El selenio favorece la conversin del MeHg a Hg(II) 4. Conversin de las formas txicas de Hg en otras formas menos txicas Evidencias: Mamferos y aves marinas biotransforman lentamente el MeHg de su dieta a Hg(II) en el hgado sin mostrar sntomas de contaminacin Elevadas concentraciones de Hg(II) encotradas en cerebros de monos alimentados crnicamente con MeHg y selenio El MeHg puede actuar como donante del grupo metilo para metilar al seleniuro (exhalacin de compuestos metilados de Se) Pre-tratamiento con Se puede paliar el efecto inhibidor del MeHg sobre la glutationa peroxidasa, asegurando la integridad de los componentes biolgicos de las clulas y tejidos va antioxidacin
3. Formacin de complejos Hg-Se
5. Prevencin del dao oxidativo
87
En la fraccin subcelular soluble de diversos tejidos animales, el mercurio se puede encontrar unido principalmente a metalotionenas (protenas de bajo peso molecular), puesto que la formacin de metalotionenas es inducida por la presencia de varios metales, incluido el mercurio68. La presencia de selenio puede suponer, a parte de los incrementos en los niveles de mercurio en la fraccin soluble, la alteracin del perfil proteico, favorecindose la formacin de molculas de elevado peso molecular46,52. Esto sugiere que el selenio bloqueara de algn modo la unin del mercurio y la metalotionena o podra inhibir la induccin de estas protenas. Otros experimentos avalan la tesis de la induccin de la liberacin del mercurio enlazado a protenas por accin del selenio. Tambin se ha demostrado que el selenio permite la liberacin del mercurio enlazado a cistena69. Puesto que la cistena es un componente mayoritario de las metalotionenas y se conoce que el mercurio interacta con los grupos sulfhidrilos de esto aminocido, el bloqueo de la induccin de metalonitonenas ejercido por el selenio al mercurio permitira que el mercurio tuviera la posibilidad de unirse a otras protenas, posiblemente a travs de los grupos sulfhidrilo. Las protenas de elevado peso molecular a las cuales el mercurio es redirigido no han sido caracterizadas, pero se cree que son menos sensibles al mercurio. Sin embargo, a diferencia de lo establecido por los estudios anteriores, Burk no observ diferencias significativas en el comportamiento de unin del mercurio al incluir el selenio en la dieta, permaneciendo el mercurio en los riones unido a las metalotionenas. No se describi ningn desplazamiento del mercurio a protenas de mayor peso molecular, por lo que no se ejercera ningn efecto sobre la induccin de las metalotionenas. Desgraciadamente la redistribucin del mercurio de rganos ms sensibles a menos sensibles no puede explicar los resultados de un gran nmero de estudios. Por ejemplo, el cerebro es un rgano altamente sensible al mercurio, y la presencia de selenio provoca un aumento en la acumulacin del mercurio en este rgano. Parece que la redistribucin del mercurio no puede explicar satisfactoriamente la reduccin del dao neurolgico inducido por el selenio, lo que implica que los mecanismos que interviene en la interaccin entre estos elementos son muy complejos.
3.2. COMPETENCIA POR LOS MISMOS PUNTOS DE UNIN Las relaciones mercurio-selenio encontradas en pescados comparadas con la concentracin de ambos elementos en el medioambiente condujo a la conclusin de que el mercurio y selenio compiten por los mismos receptores localizados en los tejidos animales. Este hecho podra explicar as el antagonismo toxicolgico manifestado. Se cree que los puntos de unin son receptores de selenio que incrementan en nmero con la edad. Es probable que estos receptores puedan ser ocupados por mercurio en funcin de su
88
biodisponibilidad en el medioambiente70. La idea de competicin tambin se ha empleado no slo parar explicar la variabilidad encontrada en las relaciones mercurio-selenio, sino que tambin se han empleado para explicar el ndice de eliminacin de ambos elementos. En las gambas Palaemosn elegans, se cree que la membrana permeable de las branquias es la ruta principal por la que se elimina el mercurio y selenio, mientras que la orina y heces contribuyen en un grado menor. Los bajos ndices de excrecin de ambos elementos cuando estn presentes conjuntamente puede deberse la a competicin entre ellos por los mismos transportadores71. El hecho de que ambos presentan una elevada afinidad por los grupos sulfhidrilo de los aminocidos induce a pensar en la idea de competicin de los transportadores de protenas, al igual que por otros puntos de unin.
3.3. FORMACIN DE COMPLEJOS MERCURIO-SELENIO La administracin simultnea de cloruro mercrico y selenito sdico a ratas provoca una alteracin radical de las protenas presentes en el plasma que se enlazan al mercurio y al selenio si se compara con las observadas cuando cada elemento es administrado individualmente. Adems, ambos elementos se han detectado en el plasma en concentraciones muy elevadas debido a su unin a una nica protena del plasma, permaneciendo prxima a la unidad la relacin molar Hg:Se, independientemente de las dosis empleadas. Estudios relacionados con la interaccin del selenito y mercurio inorgnico en la sangre de conejo han demostrado que el selenito se reduce en los glbulos rojos y es transportado al plasma en forma de seleniuro72,73,74, donde reacciona con el cloruro de mercurio para formar un complejo equimolar Hg-Se que se enlaza a una protena plasmtica especfica para formar el complejo Hg-Se-plasma75 (Figura 5). Esta protena especfica ha sido identificada como la selenoprotena P76,77. Yoneda y col.75,76 concluyeron que estos complejos contienen aproximadamente 100 tomos de mercurio y selenio. Estos resultados coinciden con los observados en un estudio llevado a cabo por Gailer y col.78. La especie de detoxificacin Hg-Se-S presente en el plasma como consecuencia de la interaccin del mercurio y selenio administrados a conejos fue considerada idntica a la especie Hg-Se-S sintetizada a partir del mercurio inorgnico, selenito y glutationa (GSH) tamponada. Por ello, se cree que la GPx juega un papel esencial en este proceso de detoxificacin. El complejo mercurio-selenio-protena podra desempear un papel importante en la prevencin de la toxicidad aguda ocasionada por el mercurio inorgnico mediante su unin al mercurio, y as, previniendo que alcanzase ciertos tejidos diana79.
89
Hg2+
HgSe
SeO32SeO32GSH
Se Se2-
2-
HgSe
ERITROCITO
SELENOPROTEINA P
HgSe HgSe
Figura 5. Esquema del posible mecanismo de formacin del complejo Hg-Se-Selenoprotena P
A parte del complejo mencionado hay evidencias de que el mercurio inorgnico se une a metabolitos o forma un complejo equimolecular Hg-Se que se une a especies de elevado peso molecular en el hgado80. Galier y col. asumen que las molculas de glutationa (GSH) se unen al HgSe para hacerlo soluble, y as el complejo resultante se une a una protena especfica. Este complejo Hg-Se podra ser el precursor del HgSe cristalino puesto que se ha comprobado que la hidrlisis enzimtica de estos complejos mediante proteasa conduce a la obtencin de mercurio y de selenio insoluble . Ikemoto y col.81 asumieron que la degradacin de las protenas unidas al complejo Hg-Se en los lisosomas, en los cuales se conoce la proteolisis intracelular, puede conducir a la formacin del HgSe cristalino a partir del complejo Hg-Se-protena (Figura 6). Esta suposicin es avalada por el hecho de que el HgSe se encuentra fundamentalmente presente en los lisosomas. Este compuesto tiene una menor solubilidad que sus anlogos seleniuros metlicos o sulfuro mercrico y es almacenado en los riones e hgados de distintos animales (mamferos marinos y aves82) en forma de partculas densas . El anlisis de estos complejos por espectroscopia de rayos-X y otras tcnicas ha revelado ser tiemanita83, siendo su cristalizacin el ltimo paso de un proceso de detoxificacin. Este principio podra explicar tambin la consistente relacin molar 1:1 encontrada entre le mercurio y selenio en organismos tales como focas y otros mamferos marinos5,6. Claramente, los pescados difieren de los mamferos marinos en este aspecto.
90
HIGADO
LISOSOMA DEMETILACIN CH3Hg Hg + Se(S) DEGRADACIN (Hg-Se(S))n MINERALIZACIN Metalotionena CITOSOL HgSe(S)
HMW-(Hg-Se(S))n
Figura 6. Esquema del mecanismo de detoxificacin que tiene lugar en el hgado de animales marinos situados en lo alto de la cadena trfica81
La presencia del mercurio hace que el seleniuro liberado durante la degradacin de las selenoprotenas se le pueda unir, reduciendo as la biodisponibilidad del selenio para la sntesis de protenas. Los mamferos marinos estn muy expuestos a la toxicidad del metilmercurio debido a su elevado consumo de pescados. Los procesos involucrados para la detoxificacin son fundamentalmente la eliminacin del metilmercurio y/o biotransformacin y bioacumulacin de productos no txicos. El metilmercurio sufre un proceso de demetilacin y puede experimentar los mismos mecanismos mencionados anteriormente para el mercurio inorgnico, segn muestra la figura 6. Adems, existen evidencias de que el metilmercurio como tal forma un complejo inestable mercurio-selenio con una relacin molar de mercurio:selenio de 2:184. Estudios llevados a cabo por Sumino demostraron que el metilmercurio enlazado a las protenas de la sangre del conejo se converta in vitro en metilmercurio libre y soluble en benceno mediante la adicin de selenito bajo condiciones fisiolgicas. Estudios posteriores muestran que cuando el cloruro de metilmercurio y el selenito sdico son aadidos a la sangre de conejo, la extraccin con benceno muestra una relacin molar 2:1 de mercurio-selenio. Otros estudios ponen de manifiesto que ambos elementos forman un nico compuesto identificado como seleniuro bis (metilmercrico) (SBM), (CH3Hg)2Se49,85. Se ha estudiado la participacin de la glutationa (GSH) en la formacin de este compuesto y se piensa que la glutationa reduce al selenito sdico qumicamente. Resultados procedentes de la adicin de glutationa a cloruro de metilmercurio y selenito sdico en sangre sugieren que la glutationa media en la produccin del seleniuro bis (metilmercrico) en la sangre.
91
SeO32+
GSH
GSSeSG
GSH
H2Se
H2Se
+ CH3Hg+
(CH3Hg)2Se
El mecanismo exacto por el cual la glutationa media la formacin de este producto todava no est muy claro. Se cree, sin embargo, que ejerce un papel muy importante en el efecto protector del selenio frente a la toxicidad del metilmercurio. Estudios con varios compuestos de selenio ensayados in vitro con metilmercurio demostraron que el seleniuro slo era capaz de formar el SBM, por lo tanto, la formacin de este compuesto se ver supeditada por la conversin previa del selenito en seleniuro . La caracterizacin del SBM revel que el complejo era inestable y se degradaba rpidamente en estudios in vitro en sangre de ratn. Adems, el SBM se detect en cantidades insignificantes en los tejidos inyectados con MeHg y selenio86. Se sugiri que el ciclo de formacin y descomposicin del SBM puede ocurrir repetidamente in vivo. Sin embargo, un estudio de la interaccin de ambos elementos en ratas indic que el selenito altera la distribucin del MeHg debido a la formacin de este complejo. En particular, el nivel de SBM en sangre se increment, siendo dicho aumento mayor 30 minutos despus de la inyeccin de selenito87. Aunque la formacin de este complejo se ha sugerido en varios tejidos, las propiedades hasta ahora elucidadas no pueden explicar completamente la habilidad del selenio para disminuir la toxicidad del metilmercurio. Parece que los procesos involucrados en la formacin del complejo mercurioselenio-protena y seleniuro bis (metilmercrico) en la sangre difieren notablemente, aunque ambos sugieren la participacin de la glutationa. De hecho, la formacin de ambos complejos conduce a dos relaciones molares diferentes entre el mercurio y el selenio. Adems, hay dos formas de mercurio involucradas en la formacin de estos complejos, aunque existe una posibilidad de que el cloruro de metilmercurio pueda tambin formar el complejo mercurio-selenio-protena establecido por Burk y colaboradores. Sin embargo, es cierto que el mercurio inorgnico ha de someterse primero a un proceso de metilacin para poder formar el seleniuro bis (metilmercrico). En la actualidad se desconoce s los procesos de formacin de ambos complejos se llevan a cabo simultneamente o son mutuamente excluyentes.
92
3.4. CONVERSIN DE LAS FORMAS TXICAS DE MERCURIO EN OTRAS FORMAS MENOS TXICAS La transformacin del metilmercurio a formas menos txicas puede ser uno de los posibles mecanismos de detoxificacin. Norseth y Clarkson88 observaron que una pequea cantidad de metilmercurio poda transformarse en mercurio inorgnico. Esta forma presenta una menor toxicidad y tiene una menor vida media biolgica89. Aunque el mecanismo exacto de demetilacin no est claro, se ha sugerido que los radicales oxgeno pueden jugar un papel muy importante en este proceso90. En mamferos y aves marinas el mercurio procedente de la dieta se encuentra fundamentalmente en forma de metilmercurio, y este es biotransformado lentamente a mercurio inorgnico dentro de sus organismos y acumulado principalmente en la fraccin nuclear, lisosomial y mitocondrial de sus clulas. Por ello, una fraccin elevada del mercurio acumulado en el hgado (rgano diana) se encuentra en forma de Hg(II). El mercurio inorgnico as formado se puede unir a metalotionenas o formar los complejos equimoleculares comentados anteriormente. Numerosos grupos de investigacin36,91,92,93,94,95 han sugerido que la conversin del metilmercurio a mercurio inorgnico se ve favorecida por la presencia de selenio . Esta hiptesis fue reforzada por los niveles txicos de mercurio y selenio encontrados en animales que no mostraban ningn sntoma de contaminacin por mercurio o selenio. Algunos estudios revelan que en el cerebro y el hgado96 de ratas la demetilacin del metilmercurio se vea favorecida por la presencia de selenito sdico. En cerebros de monos alimentados crnicamente con metilmercurio se detectaron elevadas concentraciones de mercurio inorgnico, siendo presumiblemente el resultado de un proceso de demetilacin97. Adems, se observ una correlacin positiva entre los niveles de mercurio inorgnico y de selenio y una correlacin negativa entre el mercurio orgnico y el selenio. Esto sugiri la formacin de un complejo Hginorgnico-Se en el cerebro como resultado de un proceso de detoxificacin. Urano y col.98 observaron que el metilmercurio suprime la secrecin biliar del selenio exgeno (administrado como selenito sdico), mientras que aumenta la exhalacin de compuestos metilados de selenio. La S-adenil metionina, donante del grupo metilo empleado para metilar al seleniuro y transformarlo as en la forma voltil, se requiere en bajas concentraciones cuando se administra simultneamente selenito sdico y metilmercurio, con respecto a un tratamiento exclusivo de selenito sdico. Aunque el mecanismo involucrado es desconocido, los autores sugieren que el metilmercurio puede actuar como donante del grupo metilo, reduciendo la concentracin de S-adenil metionina requerida para la metilacin del selenio, resultando as en la demetilacin del metilmercurio por el seleniuro99.
93
Esta tesis se ve avalada por los experimentos de Yamane y col.100 quienes observaron que la co-administracin de selenio y metilmercurio (marcado isotpicamente con
14
C) produca un aumento (entre 5 y 7 veces superior) en la exhalacin del
14
C en
forma de CH3SeCH3 y no en forma de CO2, lo que pone de manifiesto la ruptura del enlace carbono-mercurio y la metilacin del selenio. Estudios in vitro han puesto de manifiesto que el seleniuro favorece la demetilacin del metilmercurio en presencia de un exceso de GSH, lo que permite la formacin del H2Se101. Sin embargo, otros estudios concluyen lo contrario102,103. Por ejemplo, los descritos por Sheline y Schmidt-Nielsen , quienes consideraron como indicador de la demetilacin la determinacin de la ruptura del enlace carbono-mercurio. Emplearon
203 14
Cy
Hg para marcar el metilmercurio y determinar as la distribucin de ambos istopos en
los tejidos del pez Fundulus heteroclitus. Los resultados no mostraron ninguna diferencia en la distribucin de estos istopos, lo que llev a la conclusin de que no se produca la ruptura del enlace carbono-mercurio.
3.5. PREVENCIN DEL DAO OXIDATIVO El selenio es un componente intrnseco de la glutationa peroxidasa y el mercurio es conocido por inhibir la actividad de esta enzima104. Esto podra explicar en parte el efecto daino producido por el mercurio, particularmente en el hgado y el tejido nervioso. La glutationa peroxidasa es incapaz de proteger estos tejidos de los cambios oxidativos inducidos por el mercurio. Ganther105 propuso una posible implicacin de los radicales libres formados por la ruptura homoltica del metilmercurio en la induccin de los efectos neruotxicos. El metilmercurio sera absorbido por las membranas de los tejidos diana, tales como el cerebro, prximos a los lpidos y despus se iniciara una cadena de reacciones de peroxidacin de varios constituyentes lipdicos como resultado de la tendencia del metilmercurio a sufrir una fisin homoltica. Sin el tratamiento de selenio, el metilmercurio inhibira la actividad de la glutationa peroxidasa, haciendo imposible la descomposicin de los perxidos que iniciaran la ruptura del metilmercurio en los radicales libres metil y mercurio, y consecuentemente daara los tejidos. El tratamiento con selenio podra paliar totalmente el efecto inhibidor del metilmercurio sobre la glutationa peroxidasa, como muestran Chang y Suber106, asegurando la integridad de los componentes biolgicos de las clulas y tejidos va antioxidacin. Esto explicara tambin los efectos protectores de la vitamina E, un agente antioxidante, frente a la toxicidad del metilmercurio . Otros investigadores no han observado evidencias de la ruptura del enlace C-Hg en un gran nmero de tejidos , pero esto no necesariamente niega la hiptesis de Ganther
94
del radical libre. Incluso si hubiera una fisin homoltica del metilmercurio a los radicales libres metil y mercurio, tales radicales no tendran tiempo para redistribuirse independientemente en otros tejidos. Debido a su naturaleza inestable, interaccionaran inmediatamente con otras molculas, por ejemplo con lpidos y otros compuesto y se enlazaran eventualmente a ellos. A pesar de que se han postulado distintos mecanismos para explicar las distintas interacciones no se conocen completamente los procesos implicados. Por lo tanto, se aboga por un mayor esfuerzo desde la comunidad cientfica con el fin de alcanzar un conocimiento ms exhaustivo de todos los fenmenos involucrados.
95
1 2 3
Parizek J., Ostadalova I., Experientia, 1967, 23, 142. Watanabe C., Tohoku J. Exp. Med., 2002, 196, 71. Ganther H., Goudie C., Sunde M., Kopecky M., Wagner S., Hoekstra W., Science, 1972, Cuvin-Aralar M.A.A., Funess R., Ecotoxicol. Environ. Saf., 1991, 21, 348. Koeman J.H., Peeters W., Koudstaal-Hol C., Tijoe P.S., De Goeij J.J.M., Nature, 1973, Koeman J.H., Van de Ven W.S., De Goeij J.J.M., Tijoe P.S., Van Haaften J.L., Sci. Total Ping L., Nawasaka H., Matsumoto K., Suzuki A., Fuwa K., Biol. Trace Elem. Res., 1986, Nielsen C.O., Dietz R., Biol. Trace. Elem. Res., 1990, 24, 61. Skaare J.U., Degre E., Aspholm P.E., Ugland K.I., Environ. Pollut., 1994, 85, 153. Storelli M.M., Ceci E., Marcotrigiano G.O., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1998, 61, Storelli M.M., Marcotrigiano G.O., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2002, 69, 516. Kosta L., Byrne A.R., Zelenko V., Nature, 1975, 254, 238. Drash G., Wanghofer E., Roider G., Stobach S., J. Trace Elements Med. Biol., 1996, 10, Wagemann R., Muri D.C.G., Can. Field Nat., 1984, 86, 123. Heinz G.H., Hoffman D.J., Environ. Toxicol. Chem., 1998, 17, 2, 139. Ganther H.E., Sunde M.S., J. Food Sci., 1974, 39, 1. Kai N., Ueda T., Dataoka A., J. Shimonoseki Univ. Fish., 1983, 31, 69. Kai N., Ueda T., Takeda M., Dataoka A., Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish, 1986, 52, 553. Freeman H.C., Shum G., Uthe J.F., J. Environ. Sci. Health A, 1978, 13, 235. Luten J.B., Ruiter A., Ritskes T.M., Rauchbaar A.B., Riekwel-Booy G., J. Food Sci., Dietz R., Riget F., Born E.W., Sci. Total Environ., 2000, 245, 15. Friedman M.A., Eaton L.R., Carter W.H., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1978, 19, 463. Potter S., Matrone G., J. Nutr., 1974, 104, 638. Stillings B., Lagally G., Bauersfeld P., Soares J., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1974, 30, Burk R.F., Jordan F.E., Kiker K.W., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1977, 40, 71. Kim J.H., Birks E., Heisinger JF., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1977, 17, 132. Cuvin M.L.A., Furness R.W., Aquat. Toxicol., 1988, 13, 205. Micalleff S., Tyler P.A., Mar. Pollut. Bull., 1987, 18, 180. Nuutinen S., Kukkonen J.V.K., Biogeochemistry, 1998, 40, 267.
175, 1122.
4 5
245, 285.
6
Environ., 1975, 3, 279.

7
11, 185.
8 9
10
541.
11 12 13
251.
14 15 16 17 18 19 20
1980, 45, 416.

21 22 23 24
243.
25 26 27 28 29
96
30 31 32 33 34
Hill C.H., J. Nutr., 1974, 104, 593. Kasuya M., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1976, 23, 136. Turner M.A., Rudd J.W.M., Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1983, 40, 2241. Paulsson K., LIndbergh K., Sci. Total Environ., 1989, 87-88, 495. Rudd J.W.M., Turner M.A., Townsend B.E., Swick A., Furutani A., Can. J. Fish. Aquat. Turner M.A., Swick A.L., Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1983, 40, 2241. Ohi G., Nishigaki S., Seki H., Tamura Y., Maki T., Konno H., Ochiai S., Yamada H., Fang S.C., Chem. Biol. Interact., 1977, 17, 25. Wang W-X., Wong R.S.K., Wang J., Yen Y-F., Acuatic Toxicol., 2004, 68, 39. Sharma D.C., Davis P.S., Indian J. Exp. Bio., 1980b, 18, 69. Magos L., Clarkson T.W., Hudson A.R., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1984, 228, 478. Magos L., Clarkson T.W., Sparrow S., Hudson A.R., Arch. Toxicol., 1987, 60, 422. Matsumoto H., Miki Y., Eisei Kagaku, 1981, 27, 348. Pelletier E., Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1986, 43, 203. Mykknen H.M., Metsniitty L., J. Nutr., 1987, 117, 1453. El Begearmi M.M., Ganter H.E., Sunde M.L., Poultry Sci., 1982, 61, 272. Chen R.W., Whanger P.D., Fang S.C., Pharmacol. Res. Commun., 1974, 6, 571. Cuvin-Aralar M.L.A., Furness R.W., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1990, 45, 775. Sheline J., Schimdt-Nielsen B., Physiological Responses of Marine Biota to Pollutants:
Sci., 1980, 40, 848.

35 36
Shimamura Y., Mizoguchi I., Yagyu H., Environ. Res., 1976, 12, 49.
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
Methilmercury-selenium Interaction in killifish, Fundulus heteroclitus, 1975, pp 119-130. Vernberg F. (Ed). Symposium, Milford, CN.
49
Imura N., Naganuma A., Advances in Mercury Toxicology, 1991, pp 275-288. Suzuki T. Hansen J.C., Kristensen P., Al-Masri S.N., Nord. Vet. Med., 1981, 33, 57. Groth D.H., Vignati L., Lowry L., Mackay G., Stokinger H.E., Mutual antagonistic and
(Ed). Plenum press, Nueva York.

50 51
synergistic effects of inorganic selenium and mercury salts in chronic experiments, 1972. Proceedings of the 6th Annual conference on Trace Substances in Environmental Health. University of Missouri, Columbia, Missouri, EEUU.
52 53 54 55
Komsta-Szumska E., Chmielnicka J., Arch. Toxicol., 1977, 38, 217. Cikrt M., Bencko V., Toxicolo. Letters, 1989, 48, 159. Chmielnicka J., Brzeznicka E., Sniady A., Arch. Toxicol., 1986, 59, 16. Seppnen K., Laatikaine R., Salonen J.T., Kantola M., Ltjnen S., Harri M., Nurminen Johnson S., Pond W.G., Nutr. Rep. Int., 1974, 9, 135. Glynn A.W., Lind Y., Pharmacol. Toxicol., 1995, 77, 41. Stoewsand G.S., Bache C.A., Lisk D.J., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1974, 11, 152.
L., Kaikkonen J., Nyyssnen K., Biol. Trace Elem. Res., 1998, 65, 197.
56 57 58
97
59 60 61 62 63 64
Ansari M.S., Britton W.M., Poultry Sci., 1974, 53, 1134. El-Begearmi M.M., Sunde M.L., Ganther H.E., Poultry Sci., 1977, 56, 313. Sell J.L., Horani F.G., Nutrition Reports International, 1976, 14(4), 439. Emerick R.J., Palmer I.S., Carlson C.W., Nelson R.A., Fed. Proc., 1976, 35, 577. Welsh S.O., Soares J.H., Fed. Proc., 1974, 33, 660. Kosutzka E., Pribilincova J., Ledec M., Maretta M., Acta Veterinaria (Beograd), 2002, Naganuma A., Hirabayashi A., Imur N., Eisei Kagaku, 1981, 27, 64. Komsta-Szumska E., Chmielnicka J., Clin. Toxicol., 1981, 18, 1327. Moffitt A.E.J., Clary J.J., Res. Com. Chem. Pathol. Parmacol., 1974, 7, 593. Winge D.R., Premakumar R., Rajagopalan K.V., Arch. Biochem. Biophys., 1975, 170, Sumino K., Yamamoto R., Kitamura S., Nature, 1977, 268, 73. Leonzio C., Focardi S., Bacci E., Sci. Total. Environ., 1982, 24, 249. Lucu C., Skreblin M., Mar. Environ. Res., 1981, 5, 265. Suzuki K.T., Itoh M., J. Chrom. B, 1997, 692, 15. Suzuki K.T., Shiobara Y., Itoh M., Ohmichi M., Analyst, 1998, 123, 63. Shiobara Y., Suzuki K.T., J. Chrom. B, 1998, 710, 49. Yoneda S., Suzuki K.T., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1997, 143, 274. Yoneda S., Suzuki K.T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 231, 7. Sasakura C., Suzuki K.T., J. Inorg. Biochem., 1998, 71, 159. Gailer J., George G., Pickering I.J., Madden S., Prince R.C., Yu E.Y., Denton M.B., Burk R.F., Foster K.A., Greenfield P.M., Kiker K.W., Pro. Soc. Exp. Biol. Med., 1974, Ikemoto T., Kunito T., Anan Y., Tanaka H., Baba N., Miyazaki N., Environ. Toxicol. Ikemoto T., Kunito T., Tanaka H., Baba N., Miyazaki N., Tanabe S., Arch. Environ. Nigro M., Leonzio C., Mar. Ecol. Prog. Ser., 1996, 135, 137. Martoja R., Berry J.P., Vie Milieu, 1980, 30(1), 7. Magos L., Webb M., Hudson A.R., Chem. Biol. Interact., 1979, 28, 359. Naganuma A., Imura N., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1980, 27, 163. Naganuma A., Kojima Y., Imura N., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1980, 30, Masukawa T., Kito H., Hayashi M., Iwata H., Biochem. Pharmacol., 1982, 31, 75. Norseth T., Clarkson T.W., Arch. Environ. Health, 1970, 21, 717. Norseth T., Clarkson T.W., Arch. Environ. Health, 1971, 22, 568.
52:5-6, 355.
65 66 67 68
242.
69 70 71 72 73 74 75 76 77 78
Younis H.S., Aposhian H.V., Chem. Res. Toxicol., 2000, 13, 1135.
79
145, 782.
80
Chem., 2004, 23, 2008.

81
Contam. Toxicol., 2004, 47, 402.

82 83 84 85 86
3159.
87 88 89
98
90
Hirayama K., Yasutake A., Methylmercury poisoning in Minamata and Niigata, Japan: In
vivo degradation of methylmercury-its mechanism and significance in methylmerucryinduced neurotoxicity, 2001, pp. 103-110. Takizawa Y. (Ed). Japan Public Health Assoc, Tokyo.
91
Itano K., Hawai S., Miyazaki N., Tatsukawa R., Fujiyama T., Agric. Biol. Chem., 1984, 48, Thompson D.R., Heavy metals in the marine environment: Metal levels in marine
1109.
92
vertebrates, 1990, pp 143-182. Furness R.W., Rainbows P.S. (Ed). CRC, Boca Raton, Florida, EEUU.
93
Law R.J., Environmental contaminants in wildlife, Interpreting tissue concentrations:
Metals in marine mammals, 1996, pp 357-376. Beyer W.N., Heinz G.H., Redmon-Norwood A.W. (Eds). CRC Press, Boca Raton, Florida, EEUU.
94 95
Yang J., Kunito T., Tanabe S., Miyazaki N., Fish. Sci., 2002, 68(1), 256. Nishigaki S., Tamura Y., Maki T., Yamada H., Shimomura Y., Ochiai S., Kimura Y., Tokio Brzeznicka E.A., Chmielnicka J., Environ. Health Perspect., 1985, 60, 423. Bjrkman L., Mottet K., Nylander M., Vahter M., Lind B., Friberg L., Arch. Toxicol., 1995, Urano T., Imura N., Naganuma A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 239, 862 Gregus Z., Gyurasics A., Csanaky I., Pintr Z., Toxicol Appl. Pharmacol., 2001, 174, 177. Yamane Y., Fukino H., Aida Y., Imagawa M., Chem. Pharm. Bull., 1977, 25, 2831. Iwata H., Masukawa T., Kito H., Hayashi M., Biochem. Pharmacol., 1981, 30, 3159. Komsta-Szumska E., Reuhal K.R., Miller D.R., J. Toxicol. Environ. Health, 1983, 12, Glynn A.W., Ilback N.G., Brabencova D., Carlsson L., Enqvist E.E., Netzel E., Hirota Y., Yamaguchi S., Shimojoh N., Sano K., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1980, 3, 174. Ganther H.E., Environ. Health Perspect., 1978, 25, 71. Chang L.W., Suber R., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1982, 29, 285.
Metr. Res. Lab. Pab Health, 1974, 25, 235.

96 97
69, 228.
98 99
100 101 102
775.
103
Oskarsson A., Biol. Trace Elem. Res., 1993, 39, 91.

104 105 106
99
1. 2.
TRATAMIENTO DE MUESTRA EXTRACCIN DE ESPECIES DE MERCURIO

2.1. EXTRACCIN CIDA 2.2. EXTRACCIN ALCALINA 2.3. DESTILACIN 2.4. EXTRACCIN CON FLUIDO SUPERCRTICO 2.5. EXTRACCIN-PRECONCENTRACIN DE ESPECIES DE MERCURIO
3.
DETERMINACIN DE ESPECIES DE MERCURIO

3.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS 3.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS
4.
EXTRACCIN DE ESPECIES DE SELENIO

4.1. EXTRACCIN CON DISOLVENTES 4.2. HIDRLISIS DE PROTENAS
5.
DETERMINACIN DE ESPECIES DE SELENIO

5.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS 5.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS
6.
TRATAMIENTO DE MUESTRA Y TCNICAS ANALTICAS PARA LA ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y NUTRICIONAL
Captulo IV
Tratamiento de muestra
TRATAMIENTO
DE
MUESTRA
TECNICAS
ANALTICAS
PARA
LA
ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y MEDIOAMBIENTAL

En la actualidad el mercurio y el selenio se encuentran en muy baja concentracin en el medio ambiente y en los sistemas biolgicos, por lo que es necesario disponer de tcnicas de elevada sensibilidad para proceder a su determinacin. La mayor parte de estas tcnicas analticas requieren un tratamiento de muestra ms o menos complejo en funcin del analito, su nivel de concentracin, el estado fsico de la muestra y sobre todo, si el objetivo final es la determinacin de especies. Aunque la determinacin del contenido total de mercurio y selenio y sus especies en matrices biolgicas y medioambientales de forma exacta y precisa puede resultar realmente complicada, el problema principal est estrechamente vinculado a las etapas de preparacin de muestra.
1. TRATAMIENTO DE MUESTRA El tratamiento de muestra es frecuentemente la etapa ms larga, laboriosa y crtica para la deteccin y cuantificacin de elementos metlicos a nivel de trazas1. Adems, estos procesos deben ser reproducibles y eficaces, siendo necesario evitar errores por prdidas y contaminaciones procedentes de los reactivos y materiales empleados2,3,4. En todo momento debe asegurarse la integridad tanto de la forma qumica como de la concentracin de la especie buscada. Las matrices en las que se han de determinar estos analitos pueden tener caractersticas muy diferentes, siendo necesario en primer lugar establecer metodologas de muestreo y conservacin de las muestras para despus aplicar mtodos de extraccin de las especies presentes. Existen distintos factores que pueden ocasionar prdidas, contaminacin o transformacin de las especies durante los procesos de toma y almacenamiento de la muestra. Las fuentes de error en la etapa de muestreo pueden ser importantes como consecuencia de las bajas concentraciones en que se encuentra el mercurio y el selenio en el medio ambiente. Por otro lado, durante el almacenamiento de la muestra se pueden alterar la concentracin y la forma original del analito como consecuencia de interacciones qumicas entre especies o con el material del recipiente, la accin microbiana, la temperatura, el pH, la luz, etc5,6,7, por lo que en muchos casos lo ms probable es que sea necesario aadir agentes conservantes para prevenir la degradacin de las especies antes del anlisis.
103
Por lo tanto, las muestras de origen biolgico y medioambiental requieren el anlisis inmediato o el almacenamiento a bajas temperaturas, con el fin de evitar su degradacin por actividad enzimtica o por procesos naturales de proteolisis y autolisis8. Sin embargo, hay que tener en cuenta que algunos procesos llevados a cabo para mejorar la homogeneidad y el almacenamiento de las muestras como es el caso de la liofilizacin, pueden constituir un riesgo en muestras biolgicas debido a la posibilidad de prdidas de voltiles, as como a la degradacin de protenas asociadas a metales. La mayora de las tcnicas analticas instrumentales empleadas para la determinacin de contenidos totales requiere la destruccin de la materia orgnica presente en la muestra. Generalmente, el anlisis de muestras biolgicas y de tipo medioambiental se lleva a cabo mediante procesos de mineralizacin por va hmeda. En la digestin por va hmeda es frecuente la adicin de uno o ms reactivos, generalmente cidos, con propiedades complementarias (cido-base, redox y/o complejantes) que mejoran el proceso de mineralizacin. La digestin se acompaa con un calentamiento en placa calefactora o en horno (200-300C), bien en recipientes cerrados o abiertos. En los recipientes cerrados se alcanzan no slo altas temperaturas sino tambin elevadas presiones que contribuyen a la destruccin de la materia orgnica. La digestin en abierto slo es adecuada cuando el analito a determinar no forma especies voltiles, por lo tanto para la determinacin de mercurio y de compuestos voltiles de selenio se recomienda realizar la mineralizacin por va hmeda en recipientes cerrados. En los ltimos aos, se ha extendido el empleo de hornos microondas como sistemas de calentamiento, por las mejoras que suponen en cuanto a la reduccin del tiempo de mineralizacin, la cantidad de reactivos, eficiencia y reproducibilidad. La digestin puede llevarse a cabo con HNO39, HNO3-H2O210,11,12, HNO3-H2SO4-H2O213,14 o con mezclas del HNO3 con otros cidos15. El horno de microondas es por tanto, un dispositivo muy adecuado para el anlisis de compuestos voltiles. Actualmente el desarrollo de tratamientos de muestra alternativos es un rea de gran inters que se encuentra en continuo desarrollo. A veces la disolucin de la matriz no est totalmente justificada y con tratamientos menos vigorosos se consigue extraer el analito de la matriz. Uno de estos procedimientos se basa en la extraccin del analito de la matriz slida mediante el empleo de disolventes. En estos procesos el objetivo es extraer el metal de la matriz orgnica sin que se produzca su descomposicin. Los procedimientos de extraccin por medio de cidos diluidos son el modo ms extendido para el pretratamiento de muestras biolgicas en la determinacin de metales. Bajo condiciones de trabajo moderadas, la energa de microondas tambin puede aplicarse a la extraccin cuantitativa de metales, aunque, tpicamente es la energa ultrasnica la que se emplea para la extraccin del analito. Esta tcnica tiene como ventaja la reduccin de posibles interferencias.
104
El ultrasonidos tiene numerosas aplicaciones en el campo de la qumica16,17. Entre algunas de sus caractersticas, facilita la lixiviacin de los metales en matrices slidas, mejorando la disgregacin de los slidos y aumentan la eficacia de la extraccin. Dentro de los generadores de ultrasonidos, los dispositivos ms comnmente empleados son el bao y la sonda de ultrasonidos. En los dispositivos tipo sonda, la transmisin de la energa acstica al medio de reaccin es directa, ya que la sonda se introduce fsicamente en el medio de trabajo. Su diseo instrumental permite amplificar la potencia, de forma que la energa que transmite puede llegar a ser del orden de 100 veces superior a la obtenida con el bao. Desgraciadamente, el contenido total de un determinado elemento en una muestra no proporciona la informacin necesaria para evaluar el papel biolgico que desempea, su toxicidad o su biodisponibilidad. De hecho, para explicar la actividad biolgica (biodisponibilidad, funcionalidad, toxicidad, etc.) de los elementos en el medioambiente y/o seres vivos es imprescindible la identificacin y cuantificacin de las especies presentes, es decir, es necesario lleva a cabo estudios de especiacin18,19,20. El creciente inters por la especiacin elemental ha impulsado el desarrollo de una nueva generacin de mtodos analticos suficientemente sensibles y selectivos para permitir la identificacin, caracterizacin y determinacin de las distintas formas fsicoqumicas de mercurio y selenio en matrices complejas. Estos mtodos deben incluir el menor nmero de etapas posibles para evitar contaminacin, prdidas y modificaciones de los equilibrios entre las especies presentes21.
105
Extraccin de especies de mercurio
2. EXTRACCIN DE ESPECIES DE MERCURIO La extraccin de las especies de mercurio es la etapa crucial de todo el proceso analtico siendo particularmente conflictiva en muestras slidas ya que las especies deben extraerse cuantitativamente preservando en todo momento su forma qumica. Las tcnicas de extraccin ms empleadas en la especiacin del mercurio presente en muestras biolgicas y medioambientales se pueden dividir en cuatro grandes grupos:
2.1. Extraccin cida Es con diferencia la opcin ms utilizada para extraer las especies de mercurio. Hacia finales de los aos 60, West desarroll un mtodo que permita la extraccin de metilmercurio en una gran variedad de muestras empleando HCl y benceno22,23. En este mtodo la muestra se somete a un medio fuertemente cido (HCl concentrado), adicionndose a continuacin cloruro sdico. Esto permite la liberacin del metilmercurio, pero no de la especie Hg(II) de la matriz, para ser posteriormente extrado a un a fase orgnica de benceno. La acidificacin de la muestra con cidos halogenados consigue por un lado la protonacin de aquellos centros activos de los componentes de la muestra (cidos hmicos, arcillas, etc.) que retiene a las especies de mercurio por fuerza inica. A su vez, la formacin de haluros de organomercurio facilita su extraccin hacia la fase orgnica de benceno24. El mtodo de West sigue siendo hoy en da uno de los ms empleados, si bien se han efectuado algunas modificaciones para la extraccin selectiva de metilmercurio, utilizando cidos minerales junto con NaCl25, KBr o cido yodo actico seguido de sucesivas extracciones con disolventes orgnicos como benceno26,27, tolueno28,29,30, cloroformo31 o diclorometano32. Algunos autores recomiendan una reextraccin de las especies a fase acuosa con el fin de limpiar o preconcentrar los extractos. West propuso una re-extraccin mediante la conversin de las especies de mercurio a hidrxido empleando hidrxido amnico saturado con sulfato sdico, pero actualmente, los reactivos que se utilizan son cistena o tiosulfato sdico. En el caso de la especiacin de metilmercurio, tambin se ha propuesto el uso de cloroformo junto con agentes complejantes para facilitar su extraccin y la adicin de HgCl2 o CuCl2 para favorecer la liberacin del MeHg+ unido a grupos SH en muestras slidas33. En los ltimos aos se ha extendido la utilizacin de las microondas como agente extractivo rpido y cmodo. La extraccin generalmente se lleva a cabo en un medio cido (HCl), si bien algunos autores se decantan por la combinacin tradicional HCl:Tolueno29,34 (inspirada en el mtodo de West), mientras que otros utilizan un medio cido a partir de cido ntrico35,36 o combinando HCl y HNO337,38. En todos los casos, los tiempos de
106
extraccin son muy cortos (entre 10 y 15 min), consiguindose rendimientos de extraccin reproducibles y en concordancia con valores certificados. Segn se describa en las conclusiones del Workshop of Sources of Error in Methylmercury Determination (Mainz, Wiesbaden 1998)39, de entre los muchos extractantes orgnicos ensayados, el CH2Cl2 parece dar muy buenos resultados. Aunque no se ha demostrado experimentalmente, algunos autores sugieren la posibilidad de que el tolueno forme artificialmente metilmercurio. En este aspecto, el benceno parece ser un disolvente ms adecuado, aunque debido a su toxicidad su aplicabilidad se ve restringida. As, el futuro debe dirigirse hacia el empleo de disolventes no txicos (evitando por ejemplo, benceno y organo-clorados). Una evidencia de ello es el borrador de el mtodo 3200 apuntado por la Agencia de Proteccin Medioambiental Americana (EPA), donde se proponen extracciones de varias especies de mercurio con mezclas de disolventes menos txicos40.
2.2. Extraccin alcalina Dentro de la extraccin alcalina destacan tanto la extraccin en medo bsico fuerte (KOH en medio metanol41,42,43,44,45), como en medio bsico dbil (hidrxido de tetrametilamonio, TMAH)38,44,46,47. La extraccin en medio bsico encontr sus primeras aplicaciones en el anlisis de especies de mercurio en pelo, sangre, peces y tejidos blandos, debido a su gran capacidad para romper los enlaces protena-Hg o lpido-Hg48,49, aunque en la mayora de los casos la extraccin alcalina es ms complicada que la cida. Algunos autores consideran que la digestin a temperaturas superiores a la ambiente en medio bsico, puede inducir tambin a la formacin artificial de metilmercurio a partil del mercurio inorgnico presente en la muestra39,46,50. Adems, da lugar a problemas en las etapas de preconcentracin, separacin y deteccin, debido a los altos niveles de materia orgnica, sulfuros e iones Fe3+ co-extrados junto con la especie de inters. Al igual que lo que suceda en la extraccin cida, el empleo de las microondas se ha extendido para disminuir el tiempo y aumentar el rendimiento de la extraccin alcalina36,38,51,52.
2.3. Destilacin Esta metodologa ofrece una menor versatilidad que la proporcionada por la extraccin con disolventes. La mayora de las publicaciones mencionan como nicos reactivos al agua, KCl o NaCl as como algn tipo de antiemulsionante. La temperatura de trabajo suele situarse entre los 140 y 180 C, facilitndose normalmente la destilacin
107
mediante una corriente de nitrgeno. Se debe adicionar una pequea cantidad de cido sulfrico a la mezcla momentos antes de iniciarse la destilacin. A pesar de ser una tcnica ampliamente extendida, ha sido tambin objeto de algunas crticas por la posible formacin artificial de metilmercurio46,39,53,54. Tiempos excesivamente largos de destilacin pueden facilitar la conversin abitica del mercurio inorgnico a metilmercurio. La conversin porcentual respecto al contenido de mercurio inorgnico es muy pequea, aunque esto puede suponer un error en la determinacin de metilmercurio muy importante, pues tambin lo es la proporcin de esta especie. La conversin parece estar facilitada por la elevada presencia de materia orgnica disuelta (DOC), de cidos carboxlicos, cidos hmicos o partculas con elevada rea superficial, mientras que no parece estar afectada por la presencia de materia orgnica no degradada. Este problema puede ser superado reduciendo el tiempo de destilacin y en consecuencia el volumen de destilado. De este modo, aunque se empeoran sensiblemente los rendimientos de extraccin se evitan en gran medida los problemas de formacin artificial de metilmercurio, tal y como ha quedado demostrado en la certificacin del material de referencia CRM-580, donde los grupos de investigacin que emplearon la destilacin como tcnica de extraccin obtuvieron resultados anlogos a otros grupos que utilizaron otras tcnicas extractivas55. Adems de la formacin de metilmercurio durante la etapa de extraccin, las tcnicas anteriores presentan otros inconvenientes, como son el elevado consumo de disolventes y el gran nmero de etapas necesarias para una extraccin cuantitativa, con los riesgos de contaminacin o prdidas, y el largo tiempo de anlisis por muestra que esto implica. Como alternativa se ha empleado la extraccin asistida por ultrasonidos56, el empleo de microondas focalizados y sistemas a presin31,34. De esta forma se consigue reducir el consumo de disolventes y el tiempo de extraccin, pero no se debe olvidar que estos mtodos emplean condiciones de presin y temperatura ms enrgicas, lo cual puede dar lugar a transformaciones o a prdidas de las especies.
2.4. Extraccin con fluidos supercrticos Esta tecnologa aplicada a la extraccin de compuestos de mercurio29,57,58 se encuentra todava en proceso de optimizacin, si bien las expectativas puestas en ella son altas. Los reactivos utilizados son baratos y nada txicos (principalmente dixido de carbono), mientras que los tiempos de extraccin son razonablemente cortos (alrededor de una hora). Sin embargo, los rendimientos conseguidos hasta el momento no son lo suficientemente elevados (entre el 50 y el 70%) como para ser considerada una tcnica de rutina en esta aplicacin concreta.
108
2.5. Extraccin-preconcentracin de especies de mercurio Desgraciadamente, las bajas concentraciones de mercurio encontradas en algunas muestras biolgicas y medioambientales hacen necesaria una etapa de preconcentracin previa al anlisis que permita alcanzar niveles de concentracin detectables por la tcnica analtica seleccionada. Dentro de las tcnicas de preconcentracin empleadas destacan la extraccin lquido-lquido y extraccin en fase slida, pero adems existen dos tcnicas comnmente utilizadas en la especiacin de mercurio caracterizadas por no emplear disolventes orgnicos que permiten la extraccin y preconcentracin simultnea de los analitos (microextraccin en fase slida y atrapamiento criognico). La microextraccin en fase slida (SPME) es una tcnica que ha suscitado un gran inters como tcnica de extraccin aplicable a muestras en estado slido, lquido o gaseoso. Se trata de un nuevo sistema que ana la etapa de muestreo, aislamiento y preconcentracin del analito de una forma muy sencilla, permitiendo su acoplamiento a una gran variedad de dispositivos instrumentales ya existentes. La tcnica se basa en el establecimiento de un equilibrio de absorcin o adsorcin de los analitos deseados sobre el recubrimiento de una fibra de slice fundida (divinil-benceno, DVB, carboxeno, CAR y polidimetilsiloxano, PDMS) siendo esta ltima la ms utilizada. Posteriormente, los analitos retenidos en la fibra se desorben, separan y cuantifican en un detector adecuado. La SPME es compatible tanto con la cromatografa de gases como con la de lquidos. En los ltimos aos, y debido a su fcil acoplamiento con la cromatografa de gases, su aplicacin se ha centrado en el y anlisis de compuestos . Para de mercurio la en muestras de la medioambientales
59,60,61,62
biolgicas
45,47,63,64
mejorar
eficacia
microextraccin, en el caso del metilmercurio se han utilizado fibras de slice fundida sin recubrimiento tratadas con HF durante tres horas y posteriormente acondicionadas a 200C65. La utilizacin de la SPME como sistema de aislamiento y preconcentracin de analitos voltiles minimiza los tiempos de tratamiento de muestra, lo que implica un menor riesgo de prdida de analitos de inters as como de transformaciones de las especies originales presentes en la muestra. Es, por tanto, una de las tcnicas con mayor proyeccin en el tratamiento de muestra. Por otra parte, el atrapamiento criognico (CT) permite extraer y preconcentrar los derivados voltiles de los analitos mediante una etapa previa de generacin de hidruro o etilacin y su posterior purga con una corriente gaseosa hacia una columna con un relleno anlogo al de una columna cromatogrfica (p.e. dimetilpolisiloxano) sumergida en nitrgeno lquido. Posteriormente las especies son desorbidas y separadas en funcin de sus puntos de ebullicin por calentamiento de la columna36,37,38,52,66,67 o bien slo desorbidas y separadas por una columna cromatogrfica adicional situada a la salida del
109
Especiacin de mercurio
atrapamiento . De esta forma, los analitos presentes en las muestras medioambientales pueden ser preconcentrados y separados sin necesidad de ningn tipo de extractante orgnico. Por lo tanto, los analitos de inters pueden ser analizados por cromatografa de gases a partir de una fase acuosa, adems de haber minimizado el tiempo empleado en el tratamiento de muestra.
3. DETERMINACIN DE ESPECIES DE MERCURIO
El creciente inters por la determinacin de especies de mercurio durante las dos ltimas dcadas ha conducido al desarrollo de un gran nmero de mtodos analticos basados en el acoplamiento de tcnicas de separacin con detectores especficos, capaces de discriminar entre las diferentes formas de un elemento. Estos quedan recogidos de manera resumida en la figura 6.
DETERMINACIN DE ESPECIES DE MERCURIO TCNICAS DETECTORES

CAPTURA ELECTRNICA (GC-ECD)
CROMATOGRAFA GASES
COLUMNAS CAPILARES COLUMNAS MULTICAPILARES
ALTO PODER RESOLUCIN, FCIL MANEJO Y FACILIDAD DE ACOPLAMIENTO
ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA (GC-PYRO-AAS/GC-CV-AAS) FLUORESCENCIA ATMICA (GC-PYRO-AFS/GC-CV-AFS) ESPECTROSCOPA DE EMISIN ATMICA ( GC-MIP-AES) ESPECTROMETRA DE MASAS (GC-ICP-MS) ESPECTROSCOPA UV-VIS (precedido preconcentracin) ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA (LC-CV-AAS) FLUORESCENCIA ATMICA (LC-CV-AFS) ESPECTROMETRA DE MASAS (LC-CV-ICP-MS/LC-ICP-MS)
CROMATOGRFICAS CROMATOGRFICAS CROMATOGRAFA LQUIDOS

HPLC FASE REVERSA APROPIADA SEPARACIN ESPECIES POLARES, ELEVADA VERSATILIDAD
ELECTROFORESIS CAPILAR NO CROMATOGRFICAS MTODOS DE ANLISIS SELECTIVOS

(REDUCCIN CON SnCl2, EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO)
ESPECTROMETRA DE MASAS (CE-ICP-MS)
ESPECTROSCOPA DE ABSORCI N ATMICA (AAS) FLUORESCENCIA ATMICA (CV-AFS/AFS) ESPECTROMETRA DE MASAS (ICP-MS)
Figura 6. Resumen de las diferentes tcnicas analticas empleadas para la determinacin de especies de mercurio
110
3.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS Aunque existen algunos sistemas no cromatogrficos para la separacin y determinacin de las especies de mercurio una vez extradas de la matriz, la mayora de las tcnicas utilizadas son cromatogrficas. Cromatografa de gases
Es la tcnica cromatogrfica ms utilizada de cuantas se aplican a la especiacin de mercurio desde que West propusiera su mtodo a finales de los aos 60, debido a su alto poder de resolucin, fcil manejo y facilidad de acoplamiento a un gran nmero de detectores. Inicialmente se empleaban columnas de longitud y dimetro interno variable (15-30 m y 0.3-0.75 cm respectivamente) empaquetadas con OV 101 absorbido sobre un soporte slido de Chromosorb W-HP49,68 o columnas de vidrio silanizado empaquetadas con DEGS-PS al 5%69. Este tipo de columnas presentaba sin embargo varios problemas70, entre los que destaca la aparicin de colas en los picos cromatogrficos, pobre eficiencia de la columna y reas de pico reducidos. El carcter polar del enlace Hg-haluro podra interaccionar fuertemente con la columna, dando lugar a picos cromatogrficos con importantes colas, incluso a aparentes reacciones de descomposicin71,72. Por ello, era necesaria la pasivacin de la columna, que se lleva a cabo mediante acondicionamientos con disoluciones de cloruro de mercurio, yoduro de mercurio o yoduro de metoxietilmercurio . Con la intencin de superar estos inconvenientes, se han evaluado diferentes tipos de columna capilares durante la ltima dcada utilizando tanto fases polares como fases no polares. Las separaciones se ven favorecidas empleando columnas capilares apolares, aunque se ha demostrado que el espesor de la pelcula de recubrimiento es el factor de ms peso en la eficacia de la columna73. Este tipo de columnas (mayor espesor de fase estacionaria y baja polaridad) ofrece mayor eficiencia en las separaciones y mejores resoluciones, a pesar de inyectar volmenes de muestra pequeos (1l) y se han aplicado en la especiacin de mercurio tanto en muestras biolgicas (fundamentalmente pescados) como medioambientales (aguas, sedimentos,..)25, , ,64,74,75,76,77. En la cromatografa de gases convencional es necesario disminuir el dimetro de la columna para mejorar la resolucin pero esto implica reducir el volumen de muestra y de esta forma, la sensibilidad se ve afectada negativamente. Otra forma de mejorar la separacin es aumentando la longitud de la columna, pero se incrementa el tiempo de anlisis. Estas desventajas pueden ser subsanadas mediante el empleo de columnas multicapilares. Estas columnas estn formadas por un conjunto de unos 1000 capilares con una longitud mxima de 1 m y entre 20-40 m de dimetro interno, que permiten llevar
111
a cabo la separacin en capilares finsimos y sin prdida de sensibilidad. Esto es posible gracias a que permite inyectar volmenes de muestra adecuados debido a que el analito se introduce en todos los capilares de forma simultnea. Para no perder resolucin, es muy importante conseguir una banda estrecha del analito al principio de la columna. Debido a la corta longitud de la columna los tiempos de anlisis son muy cortos. Estos capilares operan de un modo isotrmico, incluso a temperatura ambiente, evitando el uso de los voluminosos hornos de cromatografa de gases y facilitando su acoplamiento con otros sistemas. Entre las aplicaciones ms recientes destaca la separacin de compuestos metilados y etilados de mercurio en muestras biolgicas78 bajo condiciones isotrmicas (en 45 segundos), la separacin de metilmercurio y mercurio inorgnico en tejidos de pescado (en 35s) y la separacin de metilmercurio, mercurio inorgnico y propilmercurio en muestras medioambientales (en 45s). Tambin se ha aplicado a la separacin de varios elementos simultneamente: mercurio y estao79 y mercurio, estao y plomo80. Aunque existen numerosos trabajos70,81,82,83,84 en los que las especies de mercurio extradas en un disolvente orgnico se inyectan directamente en el cromatgrafo de gases, en otras ocasiones se prefiere la derivatizacin previa para as aumentar su volatilidad. De entre las posibles reacciones de derivatizacin, la etilacin en medio acuoso con tetraetilborato sdico (NaBEt4) y la posterior extraccin del producto de reaccin en un disolvente orgnico, es uno de los procesos ms aplicados en especiacin de mercurio debido a su eficacia y rapidez25,33,59,85,86. La reaccin que tiene lugar es: CH3Hg+ + Hg2+ + 3NaB(C2H5)4 CH3HgC2H5 + Hg(C2H5)2 + 3Na+ + 3B(C2H5)3 Algunos estudios mencionan sin embargo la posible formacin artificial de metilmercurio a causa de las impurezas presentes en el teraetilborato empleado en la alquilacin . Otra reaccin de derivatizacin muy utilizada es la butilacin con un reactivo de Grignard : CH3Hg+ + Hg2+ + C4H9MgCl CH3HgC4H9 + Hg(C4H9)2 Esta reaccin tiene lugar en un medio orgnico aprtico por lo que las especies tienen que ser transferidas desde fase acuosa a un disolvente orgnico por lo que se alarga el proceso de preparacin de las muestras. Adems, cabe destacar la derivatizacin de mercurio y sus especies mediante la generacin de hidruros con NaBH465,87 o SnCl2. La generacin de hidruros, comnmente conocida como vapor fro en el caso del mercurio, est basada en la reduccin del
112
mercurio inorgnico en mercurio elemental utilizando un agente reductor en medio cido. En el caso del mercurio inorgnico el reductor ms utilizado es el cloruro de estao (SnCl2): Hg2+ + Sn2+ Hg0 + Sn4+ Adems del cloruro estannoso tambin se puede utilizar el borohidruro de sodio (NaBH4) como agente reductor: Hg2+ + 2NaBH4 + 6 H2O Hg0 + 7H2 + 2 H3BO3 + 2 Na+ El borohidruro sdico es tambin el reductor empleado para la generacin del hidruro de metilmercurio ya que este analito no es reducido por el cloruro estannoso. Deteccin
Por lo que respecta a los detectores utilizados, el acoplamiento cromatgrafo de gases-detector de captura electrnico (GC-ECD) ha sido el ms empleado en el pasado28,34,88, aunque todava est incluido en metodologas de algunos trabajos89. Debido a su baja selectividad es necesario el empleo de etapas previas de limpieza (como la propuesta por Westw). En la mayora de los casos, la inyeccin de la muestra se hace en fase tolueno o benceno. Su principal desventaja, adems del largo tiempo de anlisis, es su inespecificidad. Sin embargo, en la actualidad, la especiacin de compuestos de mercurio en muestras medioambientales se basa fundamentalmente en el acoplamiento de la cromatografa de gases con detectores atmicos especficos y sensibles como: espectroscopa de absorcin, emisin, fluorescencia atmica o espectrometra ICP-MS. Algunos ejemplos de los acoplamientos ms utilizados son: GC-AAS. Este acoplamiento se lleva a cabo con una etapa previa de derivatizacin (vapor fro) o mediante un pirolizador (GC-pyro-AAS). La tcnica del vapor fro se ha aplicado en numerosas ocasiones para detectar compuestos organomercuriales a la salida de un cromatgrafo de gases. Longbottom y Dressman90 fueron pioneros en la aplicacin de este acoplamiento para la determinacin de organomercuriales con el que obtuvieron un lmite de deteccin para el dimetilmercurio de 20 pg. En el acoplamiento GC-pyro-AAS la lnea de transferencia entre la salida de la columna cromatogrfica y el detector es un capilar de slice desactivada que atraviesa un pirolizador. Este pirolizador se calienta a 800C descomponiendo as los compuestos
113
mercuriales presentes en el eluato en mercurio elemental que es conducido al detector mediante una corriente adicional de argn (make up)91. El acoplamiento GC-AAS en ambas modalidades se ha utilizado para la especiacin de organomercuriales en muestras medioambientales, pero actualmente ha sido sustituido por otros detectores ms sensibles. GC-AFS. La fluorescencia atmica una de las tcnicas de determinacin de mercurio ms sensibles y selectivas que existe en la actualidad. Su acoplamiento a la cromatografa de gases puede llevarse a cabo mediante un mtodo de derivatizacin on-line de las especies (vapor fro) , o mediante un pirolizador , al igual que lo que ocurra con la espectroscopa de absorcin atmica. En cuanto a la introduccin de muestra en el cromatgrafo, existen tanto mtodos donde se emplea la derivatizacin previa42,92 (alquilacin), como la inyeccin directa de la fase orgnica resultante de la extraccin . Bloom y col. y Fischer y col.93 desarrollaron este acoplamiento para la determinacin conjunta de mercurio inorgnico y metilmercurio en el campo medioambiental. Utilizando el acoplamiento GC-AFS, Alli y col. desarrollaron un mtodo de extraccin para metil- y etilmercurio basado en el protocolo de West. Este nuevo mtodo fue aplicado a muestras biolgicas por Armstrong y col.94 proporcionando un lmite de deteccin entre 0.2 y 0.3 pg para metil-, dimetil- y etilmercurio. GC-AES. La espectroscopa de emisin atmica acoplada a un cromatgrafo de gases se utiliza ampliamente para la deteccin de organomercuriales. Grossman y col.95 efectuaron el acoplamiento de un cromatgrafo de gases a un detector de plasma de microondas obteniendo un lmite de deteccin para mercurio como dimetilmercurio de 0.26 ng. Ms tarde Quimbyet y col.96 describieron el acoplamiento de un plasma de microondas mantenido a presin atmosfrica con un cromatgafo de gases obteniendo un lmite de deteccin como difenilmercurio de 1 pg. Actualmente el plasma inducido por microondas (MIP-AES) se ha convertido en uno de los detectores especficos ms populares para mercurio. La deteccin mediante medida de emisin atmica es ventajosa en el caso de los compuestos metilados, debido a su intensa emisin y baja seal de fondo, lo que proporciona una excelente sensibilidad y un alto grado de selectividad. En la mayora de los casos en los que se usa el sistema GC-MIP-AES, la muestra se introduce previa derivatizacin de los analitos (alquilacin)25,57,97,98, por lo que es posible eliminar los problemas ocasionados en la separacin de los haluros de mercurio. El sistema GC-MIP-AES se ha empleado tambin con el sistema de espacio de cabeza para la introduccin de muestra99 (Head
114
Space, HS). Con este fin se adiciona cido yodoacetico y cido sulfrico para facilitar la volatilizacin de los analitos. GC-ICP-MS. La introduccin del plasma ICP como fuente de iones para la espectrometra de masas durante los aos 80, ha popularizado su uso como detector de metales traza debido a su especificidad, alta sensibilidad y carcter multielemental. Adems acoplado a una tcnica de separacin se ha convertido en una tcnica muy extendida en estudios de especiacin. A diferencia del acoplamiento HPLC-ICP-MS, la unin de este detector a la cromatografa de gases es ms compleja y requiere del empleo de una interfase adecuada. Adems de sus buenas prestaciones, esta tcnica permite, mediante la medida de relaciones isotpicas, obtener informacin sobre las posibles transformaciones de las especies durante los procesos de extraccin. Hintelmann y col. utilizaron esta tcnica junto con trazadores isotpicos para la determinacin del grado de metilacin y demetilacin de las especies de mercurio presentes en sedimentos. Tambin estableci el porcentaje de formacin de metilmercurio durante los procesos de extraccin basados en destilacin mediante la adicin de
201 199
Hg(NO3)2 a las muestras. Por otro lado, Tu y col. evaluaron la posible
formacin de metilmercurio durante el pretratamiento de muestra mediante la adicin de Hg2+ a muestras biolgicas (pescado y marisco). Garca Alonso y col.100 emplearon estudios de relaciones isotpicas para evaluar la efectividad de la extraccin del material de referencia DOLT-2 con HCl concentrado, NaCl y agitacin mecnica. Para confirmar la ausencia de transformaciones durante esta etapa se aadi mercurio enriquecido en el istopo 202Hg. En la bibliografa se pueden encontrar otras combinaciones, como cromatografa de gases-absorcin atmica con cmara de grafito ,66,101 (GC-ETAAS) o cromatografa de gases-espectroscopa infrarroja con transformada de Fourier (GC-FTIR). En la Tabla 9 se recogen las principales aplicaciones de la cromatografa de gases a la especiacin de mercurio en muestras biolgicas y medioambientales, incluyendo los lmites de deteccin en cada caso.
115
Tabla 9. Principales aplicaciones de la cromatografa de gases para la especiacin de mercurio
116 COLUMNA CAPILAR CAPILAR CAPILAR CAPILAR EMPAQUETADA CAPILAR CAPILAR
DETECCIN
MUESTRA
ESPECIES
INFORMACIN ADICIONAL
LD
REF
GC-AFS
Sedimentos Pescados y agua de ro Agua de mar
MeHg2, MeHg, EtHg
Columna: DB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1 m ) Columna: DB-624 (30 m x 0.32 mm d.i., recubrimiento 1.8 m ) Columna: DB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1 m ) Columna: DB-624 (30 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 3 m ) Columna: Chromosorb W-HP recubierto con 10% SP-2100 Columna: DB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1m ) y DB-17 (30 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m ) Columna: DB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m )
MeHg, EtHg: 0.2 pg MeHg:6.7 ng l-1 Hg(II):8.7 ng l-1 MeHg, EtHg:0.01 ng l-1
70
GC-MS
MeHg, Hg(II)
59
GC-AFS
MeHg, EtHg
83
GC-AFS
Agua de lago Sedimentos, tejidos biolgicos y agua
MeHg, Hg(II)
MeHg, Hg(II): 0.5 pg
91
CT-GC-QFAAS
MeHg, Hg(II)
0.1 ng g-1- 3 ng g-1
36
GC-AFS
Suelos y sedimentos
MeHg, EtHg
0.01 ng g-1
84
GC-AFS GC-ICP-MS
Muestras marinas
MeHg, EtHg
AFS: 0.25 pg ICP-MS: 0.9 pg
94
COLUMNA
DETECCIN
MUESTRA
ESPECIES
INFORMACIN ADICIONAL Columna: DB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m) y DB-624 (30 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 3 m) Columna: DB-624 (30 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 3 m) y BP-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m) Columna: DB-5 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m) Columna: HP-5 (15 m x 0.32 mm d.i., recubrimiento 0.25 m) Columna: DB-5MS (30 m x 0.25 mm d.i., recubrimiento 0.25 m) Columna: MC-1 HT: 900 capilares x 1m x 40 m d.i., recubrimiento 0.2 m Columna: MC-1 HT: 900 capilares x 1m x 40 m d.i., recubrimiento 0.2 m
LD
REF
CAPILAR
GC-AAS GC-MIP-AES GC-MIP-AES GCICP-MS
Standards
MeHg, Hg(II)
-MIP-AES: 4.4 ng g-1 ICP-MS: 2.6 ng g-1 MeHg: 50 ng g-1 Hg(II): 80 ng g-1 0.08 pg MeHg: 1.5 ng g-1 Hg(II): 0.7 ng g-1 MeHg: 16 fg g-1 Hg(II): 257 fg g-1 MeHg: 0.027 pg g-1 Hg(II): 0.27 pg g-1
74
CAPILAR
Pescados
MeHg
50
CAPILAR
GC-CV-AFS
Pelo humano
MeHg, Hg(II)
63
CAPILAR
GC-MIP-AES
Gas
MeHg, Hg(II)
77
CAPILAR
GC-FAPES MCGC-ICPTOFMS MCGC-ICPTOFMS
Pescados
MeHg, Hg(II)
43
MULTICAPILAR
Pescados
MeHg, Hg(II)
52
MULTICAPILAR
Hielo (Antrtida)
MeHg, Hg(II)
47
117
118 COLUMNA DETECCIN MUESTRA ESPECIES INFORMACIN ADICIONAL LD MeHg: 0.11 pg g-1 Hg(II): 0.35 pg g-1 ng l-1 REF CAPILAR GC-ICP-MS Agua de mar MeHg, Hg(II) Columna: HP-5 (15 m x 0.32 mm d.i., recubrimiento 0.25 m) Columna: HP-5MS (30 m x 0.25 mm d.i., recubrimiento 0.25 m) Columna: SPB-1 (15 m x 0.53 mm d.i., recubrimiento 1.5 m ) Columna: HP-5MS (30 m x 0.25 mm d.i., recubrimiento 0.25 m) 64 CAPILAR GC-MS Aguas naturales MeHg, Hg(II) 62 CAPILAR GC-AFS Marisco MeHg, Hg(II) MeHg: 1.7-220 ng g-1 EtHg: 1.5 ng l-1 MeHg: 1.5 ng l-1 Hg(II): 1.0 ng l-1 75 CAPILAR GC-MS Aguas superficiales EtHg, MeHg, Hg(II) 76
Cromatografa lquida Una alternativa a la cromatografa de gases, es la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC). Aunque esta tcnica acoplada a detectores atmicos o de masas es menos sensible, resulta ms apropiada para la separacin de especies polares, lo que supone una ventaja en la especiacin de mercurio inorgnico y orgnico. Adems, la versatilidad de la cromatografa de lquidos, con ms mecanismos de separacin disponibles, es mayor que la de la cromatografa de gases, lo cual permite conseguir una mejor separacin de las especies de mercurio en muestras medioambientales complejas con un tratamiento de la muestra ms sencillo que no requiere etapas previas de derivatizacin . Prcticamente la totalidad de los mtodos encontrados en la bibliografa que emplean la tcnica de HPLC, se basan en la utilizacin de separaciones en fase reversa donde la fase estacionara se encuentra fijada a una base de slice102. Con el fin de mejorar la separacin cromataogrfica y/o evitar la adsorcin de las especies de mercurio en la fase estacionaria generalmente se emplean agentes complejantes como la cistena o -mercaptoetanol o agentes formadores de pares inicos69,102.
Deteccin En cuanto a los sistemas de deteccin, el espectrmetro ultravioleta-visible sigue siendo utilizado aprovechando la absorcin que en este intervalo del espectro presentan los complejos de mercurio-tioderivados24,103,104. Sin embargo, debido a los elevados lmites de deteccin, el acoplamiento HPLC-UVvis siempre va precedido de una etapa de preconcentracin donde se utiliza de nuevo el material cromatogrfico para fase reversa, aunque esta vez modificado con algn compuesto afn al mercurio, normalmente tioderivados como dietilditiocarbamato (DDTC) o ditizona. La deteccin ms efectiva en HPLC implica el uso de un detector atmico especfico para mercurio. En este caso la columna se acopla al detector mediante un mtodo de derivatizacin on-line de las especies separadas. As, mediante la generacin de vapor fro tanto CV-AAS105,106, CV-AFS51,107,108,109,110,111 como CV-ICP-MS112,113 se han acoplado a la cromatografa lquida, disminuyendo los lmites de deteccin, y facilitando as la deteccin de especies de mercurio en muestras de inters medioambiental, clnico y nutricional. A estos acoplamientos, se les puede incorporar lmparas de UV51,114,115,116 entre el cromatgrafo y el detector, u oxidar en lnea con KBr/KBrO3117,118, dicromato potsico con119,120 o sin121 cadmio o persulfato potsico acidificado en presencia de sulfato
119
de cobre122,123,124 con la finalidad de convertir las especies organomercricas a mercurio inorgnico. Quizs el sistema de deteccin ms utilizado en la actualidad, aplicado a las separaciones con HPLC de compuestos de mercurio es el espectrmetro de masas acoplado a una fuente de plasma inducido por radiofrecuencia (ICP-MS)108,112,125,126,127. Este sistema de deteccin permite en la mayora de los casos la deteccin directa sin necesidad de una etapa de preconcentracin. El punto crtico del acoplamiento es probablemente la interfase entre el cromatgrafo y el plasma, inconveniente que se ha logrado superar con sistemas como el nebulizador por inyeccin directa (DIN) o el nebulizador hidrulico de alta presin108 (HPF/HHPN).
3.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS Aunque las separaciones cromatogrficas son las ms habituales en la especiacin de mercurio, las no cromatogrficas pueden ser utilizadas con xito para la separacin de varias especies de mercurio en una determinada muestra. Dentro de las separaciones no cromatogrficas destaca la electroforesis capilar (CE). Esta tcnica no se encuentra en el mismo grado de desarrollo que las descritas con anterioridad en lo que a especiacin de mercurio se refiere. La tcnica CE se caracteriza por el empleo de capilares de dimetros internos muy pequeos, lo que le confiere una elevada eficiencia de separacin debido a la elevada movilidad electrofortica de las especies cargadas, pero a su vez limita su sensibilidad incluso cuando se acopla a detectores altamente sensibles128. El empleo de la electroforesis capilar como tcnica de separacin suele ir asociada a procesos de preconcentracin previos129 o al uso de los detectores ms sensibles como es el ICP-MS130,131. La incorporacin de una interfase (generacin de especies voltiles) entre la electroforesis capilar y el ICP-MS puede conducir a la mejora de los lmites de deteccin de la CE-ICP-MS convencional132. Por otra parte, la determinacin de las especies de mercurio puede llevarse a cabo basndose en el empleo de mtodos de anlisis selectivos para una de las formas qumicas del analito (generalmente el mercurio inorgnico). En estos casos el anlisis se realiza por etapas debido al distinto comportamiento de Hg(II) y MeHg+ frente a los agentes reductores. El mercurio inorgnico puede reducirse a Hg(0) empleando SnCl2, mientras que el MeHg+ no se reduce. De esta forma, la determinacin directa de mercurio en la muestra informa slo del contenido en mercurio inorgnico. Una segunda determinacin tras un tratamiento previo de la muestra en el que se oxida el metilmercurio
120
(foto-oxidacin133, oxidacin con KBr/KBrO3 o dicromato potsico)
proporciona el
contenido en mercurio inorgnico total. Por diferencia se puede conocer el contenido del mercurio orgnico presente en la muestra. Este hecho permite llevar a cabo una especiacin sencilla usando absorcin atmica como detector134,135,136. Adems, el metilmercurio y el mercurio inorgnico pueden ser separados mediante mtodos de extraccin lquido-lquido utilizando cidos halogenados y disolventes orgnicos137 y cuantificndolos de forma anloga a lo comentado anteriormente.
121
Extraccin de especies de selenio
4. EXTRACCIN DE ESPECIES DE SELENIO Las tcnicas de extraccin ms empleadas en la especiacin de selenio presente en muestras de inters nutricional, clnico y medioambiental se pueden dividir en dos grandes grupos: con disolventes y por hidrlisis.
4.1. Extraccin con disolventes La determinacin de especies de selenio en muestras biolgicas y
medioambientales requiere la extraccin previa de las mismas mediante el empleo de mtodos que aseguren la conservacin de la forma qumica y la distribucin del elemento original. En los ltimos aos, se ha producido un considerable aumento en el nmero de trabajos publicados que presentan diferentes mtodos para la extraccin de especies de selenio, basados en el empleo de disolventes. En estos procesos, el parmetro ms crtico es la eleccin del extractante ms adecuado, por lo que es necesario considerar factores tales como la forma qumica a extraer, la naturaleza de la muestra y la tcnica de deteccin seleccionada para la determinacin138. Algunos autores realizan la extraccin de especies de selenio orgnicas e inorgnicas en muestras biolgicas y medioambientales empleando distintos disolventes o mezclas de los mismos. El proceso tiene por finalidad tanto el desarrollo de mtodos no destructivos para el anlisis de especies de selenio en muestras slidas, como la determinacin de la fraccin de compuestos solubles. El porcentaje de extraccin (calculado con relacin al contenido total del analito en la muestra) vara en funcin de la naturaleza de la misma, aunque no suele ser superior al 50%. La extraccin con agua se ha aplicado a la extraccin de especies solubles en levaduras2,3,139,140,141 suplementos nutricionales142, plantas (champin143,144, coco de mono145), pescados140,141, etc. Los protocolos utilizados son muy variados, pudiendo oscilar el tiempo de tratamiento entre 1 hora y 24 horas. Adems, para evitar la actividad proteoltica de ciertas enzimas presentes en la propia muestra que podran provocar la destruccin de las protenas dando lugar a un error por exceso al cuantificar los selenoaminocidos libres, varios autores aaden al agua fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para extraer selenocompuestos solubles de levaduras146,147. Algunos autores han estudiado la extraccin de especies de selenio utilizando medios regulados a pH neutro. De esta forma Slejkovec y col.148 utilizaron una mezcla TrisHCl (0.05 M)-KCl (0.1 M) a pH 7.5, para extraer los compuestos de selenio presentes en muestras de champin, obteniendo recuperaciones del 70%. Sin embargo, en estudios realizados por Stefnka y colaboradores sobre este tipo de muestra, los porcentajes de extraccin obtenidos fueron del 40%, tanto en agua, como en Tris-HCl 0.05 M (pH=2.1) o
122
en fosfato 0.05 M (pH=7.6). nning y Bergdahl149 tambin llevaron a cabo la extraccin de los compuestos de selenio en un medio regulado a pH 7.5 (Tris-actico 20 mM:NH4Ac 0.14 M, 1:1). Este proceso fue aplicado a muestras de pescado, obtenindose recuperaciones del 47% para la platija y del 23% para el bacalao. Recientemente Roberge y col.150 llevaron a cabo estudios de especiacin de selenio en muestras de brcoli bajo 27 condiciones distintas, empleando 9 sistemas regulados diferentes (pH entre 1 y 9). Los mejores resultados fueron obtenidos para el medio fosfato a pH 7.0. Las extracciones con mezclas acuo-orgnicas tambin son frecuentes. As, Lindemann y col. utilizaron la mezcla MeOH:H2O en proporcin 1:1 para extraer selenocompuestos en pescado en un bao de ultrasonidos. De forma similar se ha empleado la mezcla MeOH:H2O (1:1) y la adicin de 0.28M HCl o 4% NH3151. De esta forma, Jakubowski y col.152 consiguieron un 30% de eficiencia en la extraccin de especies de selenio en huevos de gaviota, empleando la mezcla MeOH:H2O (9:1). Las mezclas EtOH:CHCl3 y CHCl3:H2O aplicadas a muestras de trbol blanco han permitido obtener eficiencias del 15 y 20%, respectivamente153. Los resultados obtenidos mejoran cuando el proceso se lleva a cabo con MeOH:H2O adicionando un 4% de NH4OH, consiguindose extraer el 45% del selenio presente en este material. La extraccin con la mezcla MeOH:CHCl3:H2O (5:3:2) tambin se ha propuesto154. Este mtodo fue posteriormente modificado por Potin-Gautlier y col.155 y Emteborg y col. y se aplic a diferentes matrices. Se obtuvieron recuperaciones del 19, 28, 37 y 47% cuando la extraccin se realizaba en MeOH:CHCl3:H2O: (5:3:2), MeOH:H2O (1:1), MeOH:H2O (1:1) en HCl 0.28M, y MeOH:H2O (1:1) en NH4OH al 4%, respectivamente. Igualmente la mezcla MeOH:CHCl3:H2O (12:5:3) se ha aplicado a muestras de cebolla enriquecida con selenio para la extraccin de compuestos de bajo peso molecular156. Recientemente se ha empleado la mezcla MeOH:H2O (1:1) junto con la tcnica de extraccin con disolventes acelerada (ASE) y se compar con procedimientos de extraccin tradicionales como la agitacin mecnica, sonicacin y Soxhlet. Los mejores resultados se obtuvieron con la tcnica ASE, aunque no superaron el 10% de extraccin157. Otros mtodos se basan en el empleo de disoluciones cidas. Larsen y col.158 han utilizado cido tricloroactico al 10% para extraer los selenocompuestos solubles en agua de muestras de algas. Tambin es bastante habitual el uso de HCl para extraer los selenocompuestos de muestras biolgicas. As, se han tratado suplementos nutricionales con HCl 0.1N y CHCl3 (1:1) en un bao de ultrasonidos (10 min)159, y tambin con HCl 2 M en un horno de microondas a 95C durante 2h. Otros autores han utilizado HCl 0.1M y agitacin durante toda la noche (a 37C) o incluso 24 horas para tratar diferentes muestras biolgicas160,161.
123
En otros trabajos se utilizan mezclas de metanol (10%) en HCl 0.2M y agitacin en ultrasonidos durante 1h, para la extraccin de las especies de selenio en ajo, cebolla y brcoli enriquecidos, obtenindose recuperaciones del 10%, para los dos primeros, y del 100 %, para el ltimo162. Una forma de extraccin de compuestos de selenio de bajo peso molecular consiste en la adicin de HClO4 0.4M seguido de un tratamiento en bao de ultrasonidos durante dos horas, o la mezcla HClO4:EtOH (8:2). Esta metodologa se ha empleado en la extraccin de selenio en frutos secos163 y cebolla . Los tensoactivos se han utilizado para la evaluacin de la fraccin de selenio enlazada a protenas en distintas muestras biolgicas (levadura, tejidos animales y vegetales) debido a la formacin de pares inicos con las protenas solubles en agua, lo que supone una mejora de la eficiencia de extraccin. El dodecil sulfato sdico (SDS) es un tensoactivo ampliamente utilizado para desnaturalizar protenas por formacin de micelas y ha sido muy empleado en la extraccin de selenoprotenas de tejidos de mamferos164,165. La extraccin suele llevarse a cabo a 4C en presencia de inhibidores de proteolisis, con el fin de retardar la actividad enzimtica de las enzimas liberadas durante el tratamiento. Casiot y col.2 aplicaron este proceso para la extraccin de compuestos de selenio en muestras de levadura, obtenindose eficiencias de extraccin del 22%. Recientemente Moreno y col.166 emplearon SDS (4%) en la extraccin de selenio de tejidos animales (ostras, mejilln, gamba, atn, trucha), tejidos vegetales (trbol blanco, harina trigo) y levadura enriquecida. La adicin de SDS supuso una mejora de extraccin del 50% si se compara con la extraccin en medio acuoso, alcanzado recuperaciones entre 20 y 90%.
4.2. HIDRLISIS DE PROTENAS El selenio en muestras de origen biolgico se encuentra mayoritariamente en forma de selenoaminocidos. La liberacin de los mismos de las protenas puede realizarse empleando mtodos de hidrlisis cida, bsica o enzimtica, basados en la ruptura de los enlaces peptdicos. Aunque la eficiencia de extraccin de estos procesos suele ser cuantitativa, se pierde la informacin relacionada con la forma original en que se encontraban las especies de selenio en las protenas.
Hidrlisis cida Estos procesos de hidrlisis se llevan a cabo en medio fuertemente cido, generalmente HCl y a temperaturas cercanas a 100C. Se recomienda el empleo de
124
condiciones anaerobias para prevenir la descomposicin por oxidacin de las especies, fundamentalmente la selenocistina, por lo que las muestras se suelen tratar con nitrgeno o helio167. El protocolo convencional para el anlisis de aminocidos en protenas es la hidrlisis con HCl 6M durante 24h a una temperatura prxima a los 110C168. Sin embargo, a pesar de que es un proceso bioqumico rutinario, presenta ciertas inconvenientes, tales como la incompleta hidrlisis de enlaces peptdicos prximos a aminocidos hidrofbicos, la prdida de aminocidos lbiles (cistina, tirosina, etc)169 y posible conversin entre la metionina y el sulfxido de metionina170. Los estudios de estabilidad realizados sobre patrones acuosos sometidos a este tratamiento, muestran resultados algo contradictorios. Broderick y col.171 afirmaron que SeMet y SeCys2 eran estables durante 22 horas en medio HCl 6M a 110C y condiciones anaerobias. Asimismo, Palacios y col.172 obtuvieron un 94% de recuperacin en el caso de la especie SeCys2, pero slo un 20% y un 10% para SeMet y TMSe+, respectivamente, tras el calentamiento a 110C durante 24h, en medio HCl 6M exento de oxgeno. Hammel y colaboradores173 propusieron en 1997, un mtodo basado en la carboximetilacin de los selenoaminocidos, con el fin de evitar su descomposicin durante la hidrlisis cida. El proceso se aplic a muestras de tejidos biolgicos y a protenas, identificndose las especies selenocistina y selenometionina. Algunos trabajos ponen de manifiesto las ventajas del calentamiento por microondas en la hidrlisis cida de tejidos biolgicos. Carvalli y col. llevaron a cabo la hidrlisis en medio HCl 6M, aadiendo fenol hasta una concentracin de 0.5% (v/v) para evitar la fcil oxidacin de algunos selenoaminocidos. El calentamiento se realiz a 645W durante 25 min, obtenindose recuperaciones de selenocistina superiores al 90%. Sin embargo, un estudio ms reciente revela que el triptfano, la metionina y la cistena/cistina son parcialmente destruidos durante un proceso de hidrlisis con microondas174. El empleo del cido metanosulfnico, de naturaleza no voltil, constituye una alternativa a los procesos de hidrlisis cida con HCl. Simpson y col.175 introdujeron esta tcnica, que posteriormente fue simplificada por Chiou y col.176. Recientemente, se ha publicado el empleo de cido metanosulfnico 4M y -mercaptoetanol de levadura y nueces del Brasil177. (calentando a reflujo durante 8h) para el estudio de las especies de este analito presentes en muestras
Hidrlisis bsica Los procesos de hidrlisis bsica se llevan a cabo en medios fuertemente alcalinos, empleando, por lo general, hidrxido de tetrametilamonio (TMAH), reactivo que favorece la solubilizacin de muestras de origen biolgico.
125
Se ha aplicado, entre otros, a la extraccin de selenio en muestras de trigo178 y en muestras de levadura enriquecida industrialmente en selenio2,157,179. En estos casos se obtuvo una buena recuperacin del elemento (>70%), si bien acompaada de una notable degradacin de las especies ya que el TMAH oxida los selenoaminocidos y las selenoprotenas a selenio inorgnico.
Hidrlisis enzimtica En la actualidad los tratamientos que han proporcionado los resultados ms prometedores para la extraccin cuantitativa de las especies de selenio en muestras slidas son los procesos de hidrlisis enzimtica. Las ventajas que ofrecen estos mtodos estn relacionadas con el alto grado de selectividad de las enzimas ya que se trabaja en condiciones controladas y moderadas de temperatura y pH. Como consecuencia, se previenen posibles prdidas por volatilizacin y se evita la alteracin de las distintas formas qumicas en que se encuentra el selenio, al no aplicar tratamientos agresivos180. Los procesos de hidrlisis enzimtica implican la adicin de una enzima sobre la muestra e incubacin en un medio regulado a una determinada temperatura. Para alcanzar la mxima actividad enzimtica se deben optimizar diversas variables entre las que se incluye la cantidad de enzima respecto a la masa de sustrato, el tiempo de incubacin, la naturaleza del medio de extraccin, el pH y la temperatura (siendo estos dos ltimos factores crticos sobre la actividad enzimtica). Generalmente se utilizan proteasas que rompen los enlaces peptdicos de forma inespecfica para liberar los selenoaminocidos, siendo la Pronasa E (proteasa XIV aislada de Streptomyces griseus)147,181,182,183,184 la ms empleada, aunque tambin hay ejemplos del uso de proteinasa K163,185, pepsina143,144, subtilisina166,184,186, tripsina143,147 o Flavourzyme187 (mezcla de peptidasas). En algunos casos, se utilizan distintas proteasas combinadas o bien se emplean mezclas de proteasas y otras enzimas capaces de romper ciertas estructuras presentes en las muestras para facilitar la extraccin de los selenocompuestos. As, se han combinado proteasas con lipasa188,189,190 (para degradar los lpidos), lisozima (para romper las membranas exteriores de las bacterias), celulasa (para romper las paredes celulares de los vegetales), etc. Los buenos resultados obtenidos con estos tratamientos han supuesto un gran auge de los mismos, por lo que, en los ltimos aos, numerosos grupos de investigacin han trabajado en el desarrollo y mejora de las condiciones experimentales ms idneas para llevarlos a cabo.
126
Este tipo de hidrlisis se ha aplicado a una amplia variedad de muestras biolgicas para llevar a cabo estudios de especiacin de selenio (suplementos nutricionales , plantas acumuladoras de selenio , championes143,144, frutos secos185,Error! pescados
166,188,191 Marcador no definido.
, mejillones
166,184,186
, ostras , gambas , hgado de delfn ), pero sin duda
las muestras ms ampliamente estudiadas son las levaduras17,147,157,166,181,182,189, donde se han alcanzado rendimientos de extraccin para el selenio prximos al 90%. La hidrlisis enzimtica suele llevarse a cabo en agua o en disoluciones reguladas de pH prximo al fisiolgico, y durante largos tiempos de incubacin (tpicamente entre 16 y 24 horas). Esto supone un elevado riesgo desde el punto de vista de la transformacin de especies ya que la estabilidad de los compuestos puede ser muy crtica. Algunos autores llevan a cabo la hidrlisis en la oscuridad. Tambin existen ejemplos de hidrlisis en dos etapas, de manera que tras una primera hidrlisis se adiciona ms enzima y se vuelve a incubar la muestra. Esta ltima modalidad ha demostrado elevar la eficiencia de la extraccin de forma significativa en tejidos de pescado, mejillones y ostras . Recientemente Capello y col. emplearon la sonda de ultrasonidos en el proceso de hidrlisis, lo que permite lleva a cabo la hidrlisis de una manera eficaz con proteasa en slo 30s en muestras de levadura, evitando as, los riesgos de prdidas e interconversiones de especies que suponen los largos protocolos tradicionales. Un caso especial de hidrlisis enzimtica es el proceso de hidrlisis gstrica. En este tratamiento, las condiciones de trabajo y las enzimas utilizadas simulan la digestin que ocurre en el estmago, siendo habitual el empleo de pepsina, HCl y NaCl. Este procedimiento es ms agresivo, aunque proporciona informacin que permite predecir la cantidad de selenio que puede ser absorbida durante la digestin, y subsecuentemente transformada a especies metablicamente activas. Las especies de selenio presentes en los alimentos se caracterizan por una absorcin, distribucin y toxicidad diferente, por ello para poder evaluar la biodisponibilidad del selenio presente en la dieta, se requiere conocer la concentracin del selenio en la fraccin bioaccesible, al igual que las especies presentes. Este proceso ha sido aplicado por varios grupos de investigacin a distintos muestras. Sutton y col.192,193 lo aplicaron a diez complejos nutritivos comerciales y Ponce de Len y col.194 a cebolla, ajo y levadura e identificaron diferentes aminocidos, como selenocistina, selenometionina, formas derivadas de ambas y selenoetionina en el primer caso, -glutamil-Se-metilSeCys2, Se-metil-L-SeCys2 y selenio inorgnico, en ajo y cebolla, as como L-SeMet, Se-DL-lantonina y Se-metil-SeCys2 en la levadura. Crews y col. investigaron los extractos gastrointestinales de bacalao cocinado, identificando la forma inorgnica de Se(IV). Tambin se han empleado enzimas no proteolticas con el fin de extraer compuestos de selenio no incorporados a protenas. De esta forma, se ha utilizado un preparado comercial, Driselasa, consistente en una mezcla de laminarinasa, lixasa y
127
celulasa, para romper la pared celular de las muestras de levadura enriquecida y liberar las especies de selenio incorporadas en ella2,147. Recientemente, algunos mtodos de extraccin se han basado en procedimientos de extraccin secuencial permitiendo la discriminacin de las fracciones solubles y no solubles en agua de selenio . Moreno y col. distinguieron entre la fraccin soluble en agua y la no soluble, sometiendo posteriormente ambas fracciones a hidrlisis enzimtica. Otros autores distinguen entre la fraccin soluble en tampn Tris-HCl, la fraccin de protenas solubles en SDS (Tris-HCl con dodecil sulfato sdico) y el residuo (HNO3 concentrado), mientras que otros investigadores distinguen entre las especies de selenio solubles en agua (agua caliente), las especies asociadas a la pared celular (Driselasa en tampn TrisHCl), las selenoprotenas insolubles en agua (Tris-HCl con 179dodecil sulfato sdico) y el residuo (hidrxido de tetrametilamonio). Ruiz-Encinar y col. adems de estas fracciones incluyeron la hidrlisis de la fraccin de las selenoprotenas residuales con pronasa y lipasa, obteniendo finalmente recuperaciones prximas al 100%. En la Tabla 10 se muestra una recopilacin de los mtodos de hidrlisis empleados en la determinacin de especies de selenio en muestras biolgicas en los ltimos cinco aos, indicando los porcentajes de extraccin y las formas qumicas identificadas en cada caso.
128
Tabla 10. Mtodos de hidrlisis de protenas empleados en la especiacin de selenio en muestras biolgicas
MUESTRA REACTIVO Proteinasa K H2O 0.5 M HCl Proteinasa K cido metanosulfnico 4M Pronasa E Novozym 234 (-glucosidasa) + Flavourzyme Pronasa E Subtilisina Pronasa E H2O+ Driselasa + SDS + (pronasa+lipasa)+ TMAH Pronasa E + Tripsina Driselasa + SDS cido metanosulfnico 4M Suplementos nutricionales Pronasa E + Lipasa 0.1M HCl 0.1mM HCl H2O H2O H2O + Pepsina + tripsina Pronasa E H2O H2O +Pepsina+ Tripsina Mostaza Ostra HCl (0.5-2M) Pronasa E Subtilisina Pronasa E Subtilisina Subtilisina Pescados Pronasa E Pronasa E + Lipasa MeOH/HCl Digestin gstrica Digestin intestinal 85 87 72-103 38-62 63-80 42 83 78 40 75 37 -74 94 90 30-40 (en forma SeMet) 70 63 5 51 61 % EXTRACCIN (Se total) 83 9 37 21-25 (en forma SeMet) 100 90 95 101 98 -ESPEICES IDENTIFICADAS SeMet SeMet SeMet SeMet SeMet, formacin SeOMet SeMet SeMet, Se-metilselenocistena, SeOMet, -glutamil-Se-metilselenocistena, Seadenosilselenohomocistena Se(VI), Se(IV), SeMet, SeCys SeMet SeMet SeMet, Se(IV) SeMet PROCESO 37C, 20h agitacin oscuridad 165C, 20 min microondas 165C, 20 min microondas 37C, 12h 8h reflujo 37C, 24 h 25C, 3h bao agua + 50C, 2h agitacin magntica 30s, sonda de ultrasonidos T ambiente, 24h 85-90C 1h + 37C, 18h, pH 7.2 + 25C, 1h, pH 7.2 + 37C, 16h, pH 7.5 + 60C, 4h 37C, 15h 8h reflujo 37C, 16h vortex 50C, 2h bao ultrasonido 55C, 1h, pH 5.7 55C, 1h, pH 5.7 + 37C, 2h, pH 7.4 37C, 2h, pH 7.4 37C, 3h, pH 5.7 37C, 3h, pH 5.7 + 37C, 20h, pH 2.1+37C, 20h, pH 7.6 T ambiente, 24h agitacin, 37C, 24h (2 veces) 37C, 24h (2 veces) 37C, 24h (2 veces) 37C, 16 h 37C, 16 h 1,5 h ultrasonidos 37C, 4h 37C, 4h REF 185 163 187 181 17 182
Fruto seco
Levadura enriquecida
100
190 147 187 189 142
SeMet/Se(IV) SeCys2 Se(IV) S-(metilseleno)cistena, SeMet, SeOMet, Se-metilselenocistena, Se(IV), Se(VI), SeMet/TMSe SeMet/TMSe SeMet/TMSe SeMet Se(IV)
143
Champin
144 183 186 184 166 188 191
129
Bacalao cocido
Especiacin de selenio
5. DETERMINACIN DE ESPECIES DE SELENIO En los ltimos aos se ha producido un gran auge en el desarrollo de una nueva generacin de mtodos analticos suficientemente sensibles y selectivos que permiten la identificacin, caracterizacin y determinacin de las distintas especies de selenio a travs del acoplamiento de tcnicas instrumentales de separacin y de deteccin, de manera que las distintas formas qumicas son separadas selectivamente y posteriormente cuantificadas. Entre las tcnicas de separacin, la ms popular para el anlisis de especiacin en muestras biolgicas es la cromatografa lquida, seguida de la cromatografa de gases, y en menor extensin, la electroforesis capilar. Por lo que se refiere a la deteccin, las tcnicas de espectrometra atmica y el ICP-MS son las ms empleadas (figura 7).
DETERMINACIN DE ESPECIES DE SELENIO TCNICAS DETECTORES
CROMATOGRAFA LQUIDOS
INTERCAMBIO INICO PAR INICO FASE REVERSA QUIRAL AFINIDAD EXCLUSIN POR TAMAOS MIXTA
ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN ATMICA (LC-HG-AAS/LC-AAS) FLUORESCENCIA ATMICA (LC-HG-AFS/LC-AFS) ESPECTROMETRA DE MASAS (LC-HG-ICP-MS/LC-ICP-MS) ESPECTROSCOPA DE EMISIN ATMICA (LC-MIP-AES/LC-ICP-AES)
CROMATOGRFICAS CROMATOGRAFA GASES

COLUMNAS EMPAQUETADAS Y CAPILARES (Especies no voltiles requieren una etapa previa de derivatizacin)
ESPECTROMETRA DE MASAS (GC-MS/GC-ICP-MS) FLUORESCENCIA ATMICA (GC-AFS) FOTOMTRICO DE LLAMA (GC-FPD) IONIZACIN DE LLAMA (GC-FID) EMISIN ATMICA ( GC-AED)
NO CROMATOGRFICAS
ELECTROFORESIS CAPILAR
ESPECTROMETRA DE MASAS (CE-ICP-MS)
Figura 7. Resumen de las diferentes tcnicas analticas empleadas para la determinacin de especies de selenio
130
5.1. TCNICAS CROMATOGRFICAS
Cromatografa lquida La cromatografa de lquidos ha sido ampliamente utilizada para especiar selenio en materiales biolgicos y medioambientales debido a que ofrece la posibilidad de separar la mayora de los selenocompuestos de inters (las especies no voltiles) sin necesidad de una etapa previa de derivatizacin. Una de las ventajas ms importantes de la cromatografa lquida es la alta flexibilidad de los mecanismos de separacin mediante el uso de diferentes fases mviles y fases estacionarias, proporcionado prcticamente todo lo necesario para la separacin de las diferentes especies de selenio195. La cromatografa de intercambio inico posee una elevada eficiencia de separacin y una amplia versatilidad, proporcionando soluciones a muchos de los problemas planteados en la especiacin. La retencin relativa de las especies inicas viene definida por tres variables: pH, fuerza inica de la fase mvil y la naturaleza del intercambiador inico . Su empleo para la separacin de selenocompuestos cargados como el selenito, el selenato o el trimetilselenonio resulta muy adecuado196. El intercambio aninico y catinico son mecanismo de separacin complementarios que permiten la resolucin de un gran nmero de selenocompuestos presentes en muestras de inters biolgico y nutricional. La mayora de los selenocompuetos son demasiado hidroflicos parar ser retenidos y separados por fase reversa (Reversed-phase, RP) (tpica fase estacionaria C8 o C18)197. Sin embargo, la RP ha sido empleada para la separacin de selenocompuestos en matrices salinas como la orina198. Adems, la formacin de pares inicos (empleando fundamentalmente cidos carboxlicos fluorados como el cido trifluoractico2,199, el cido heptafluorobutanoico200 o el cido octanosulfnico201) permite extender la aplicacin de RP a compuestos polares de selenio. En este sentido, la cromatografa de pares inicos es, en la actualidad, una de las ms populares para la especiacin de selenio y ha permitido separar hasta 20 compuestos de este elemento . Se caracteriza por proporcionar una elevada resolucin, y la posibilidad de empleo de mltiples fases mviles . Otra posibilidad es utilizar cromatografas mixtas, de manera que el analito y la fase estacionaria interaccionan por varios mecanismos, p.e. simultneamente como de fase reversa y de intercambio inico. Para ello puede modificarse una fase estacionaria C18 con monmeros de bromuro de dodecilamonio (BDDA) dando lugar a lo que se ha denominado cromatografa vesicular202, o bien utilizar columnas comerciales con grupos C18 y cambiadores inicos . Recientemente, se ha empleado la cromatografa de exclusin por tamaos (Size Exclusion Chromatograpy, SEC) caracterizada por su alta tolerancia a la matriz de las
131
muestras. Sin embargo, su poder de resolucin, relativamente bajo, hace que su principal aplicacin sea a escala preparativa o en estudios preliminares (p.e. conocer el tamao molecular de las especies de inters o aislar dichas especies de la matriz para luego separarlas por otra modalidad cromatogrfica). Algunos trabajos han empleado esta tcnica con fines analticos, por ejemplo la separacin de selenoprotenas en tejidos animales149,203, vegetales204,205,206 y leche materna207. Para casos muy concretos se puede recurrir a la cromatografa de afinidad, donde la fase estacionaria interacciona especficamente con un determinado analito. En especiacin de selenio se ha utilizado para analizar las protenas que contienen este elemento en plasma y suero empleando dos columnas de afinidad en serie208 o combinando esta cromatografa en lnea con SEC209. La presencia de carbonos asimtricos en los -selenoamoncidos produce enantimeros quirales con diferentes actividades fisiolgicas . Por ejemplo, la selenometionina es un aminocido pticamente activo, y la bioqumica de los organismos vivos exhibe una fuerte enentioselectividad. Se sabe que la forma L-de los aminocidos es la nica que puede ser utilizada por el hombre, y de ah el inters en determinar en qu forma se encuentra la selenometionina en la muestras de inters nutricional. La separacin enantiomrica mediante HPLC es posible mediante el empleo de fases estacionarias quirales (-ciclodextrinas, teres corona o antibiticos como la teicoplanina) que interaccionan de forma diferente con los dos enantimeros y permite as su separacin210,211. En la Tabla 11 se recogen las principales aplicaciones de HPLC a la especiacin de selenio en muestras biolgicas, llevadas a cabo en los ltimos cinco aos, clasificadas en funcin del mecanismo de interaccin de la fase estacionaria con el analito.
Deteccin En lo que se refiere a los sistemas de deteccin utilizados a la salida de la columna, los acoplamientos en lnea de la cromatografa lquida con un detector atmico como la AAS, la AFS, el ICP-AES, el MIP-MS y el ICP-MS resultan ser muy adecuados por su sensibilidad y selectividad, para llevar a cabo la especiacin de selenio a nivel de trazas. De todos ellos el que mejores lmites de deteccin presenta es el ICP-MS, sin embargo, dicha sensibilidad puede resultar todava insuficiente a la hora de realizar los estudios de especiacin a los niveles de concentracin habituales de las distintas especies de selenio en las muestras reales.
132
Tabla 11. Principales aplicaciones de HPLC para la especiacin de selenio en muestras biolgicas
MECANISMO SEPARACIN
DETECCIN
MUESTRA
ESPECIES Se-metilseleno-N-acetil galactosa amina SeMet Se(IV), Se(VI), Secistationina SeMet, Se(IV), -glutamil-Semetil-selenocistena, Seadenosilselenohomocistena
INFORMACIN ADICIONAL Columna: Luca C18, 250mm x 15mm Fase mvil: 200mM acetato amnico + 5% MeOH Columna: C4, 250mm x 4.6mm Fase mvil: 0.1% TFA H2O:MeOH Columna: C18 Hypersil ODS, 150 mm x 4.6 mm Fase mvil: tampn fosfato 0.025mM, pH 6.8 y CH3CN/CH3OH 70:30 Columna: Symmetry Shield RP8, 150mm x 3.9mm XTerra RP-C18, 150mm x 9.6mm Fase mvil: 0.1% cido trifluoroactico (TFA) / 0.1% cido heptafluorobutanoico (HFBA) Columna: C8 Altima, 150mm x 4.6mm Fase mvil: (5 mM cido ctrico, 5 mM cido hexanosulfnico pH 4.5): metanol 95:5 Columna: C8 Altima, 150mm x 4.6mm Fase mvil: (5 mM cido ctrico, 5 mM cido hexanosulfnico pH 4.5): metanol 95:5 Columna: C8 Altima, 150mm x 4.6mm Fase mvil: (5 mM cido ctrico, 5 mM cido hexanosulfnico pH 4.5): metanol 95:5 Columna: C8 Altima, 150mm x 4.6mm Fase mvil: (5 mM cido ctrico, 5 mM cido hexanosulfnico pH 3.5): metanol 90:10
LD
REF
ICP-MS FASE REVERSA ICP-MS
Orina Levadura Planta (Lecythis ollaria) Levadura y suplemento nutricional
----
212 147 145
ICP-MS
ICP-MS
--
182
ICP-MS PAR INICOFASE REVERSA
Fruto seco
SeMet
--
163
ICP-MS/UV
Fruto seco y levadura
SeMet
--
177
ICP-MS
Cebolla
Se-metilselenocistena, Secys, Secys2, SeMet SeMet
--
156
ICP-MS
Fruto seco
--
185
133
134 MECANISMO SEPARACIN DETECCIN MUESTRA ESPECIES INFORMACIN ADICIONAL Columna: LiChroCART 125-4 Fase mvil: 0.01mM tampn acetato amnico pH 4.0, 0.5% v/v, 10-5 M DDAB 100 mM tampn acetato amnico pH 6.5, 0.5% v/v, 10-5 M DDAB Columna: LiChroCART 125-4 Fase mvil: 0.01mM tampn acetato amnico pH 4.0, 0.5% v/v LD REF HHPN-AFS Champin SeCys2, SeMet, Se(IV) -SeCys2: 18 g l-1, SeMet: 70 g l-1, Se(IV): 16g l-1 -144 HG-AFS PAR INICOFASE REVERSA ICP-MS Brcoli Planta (Brassica juncea) Levadura Ostra, mejilln, gamba, atn, trucha, trbol, levadura, harina trigo Champin SeCys2, Se(IV) 143 ICP-MS ES-MS-MS SeMet, Se(IV), Se(VI), cido metilselennico, Semetilselenocistena, cido selenoico de selenometionina y Se-metilselenocistena Se(IV), Se(VI), SeOMet, Semetilselenocistena, S(metilseleno)cistena, SeMet SeMet Columna: Symmetry Shield RP8, 150mm x 3.9mm Fase mvil: 0.6% HBA Columna: XTerra RP-C18, XTerra MS-C18, Shield RP-C18, Shield RP-C8, Fase mvil: 0.1% HBA, 1% MeOH, 99% H2O Columna: XTerra MS-C18 Fase mvil: 0.01% TEACl, 2% MeOH, pH 4.5 Columna: Hamilton PRP-X100, 250mm x 4.1mm Fase mvil: salicilato pH 6.0, citrato pH 4.8, tartrico pH 2.9 Columna: Hamilton PRP-X200 Fase mvil: 4mM formiato de piridina pH 2.8, MeOH: H2O 97:3 Columna: Hamilton PRP-X200 Fase mvil: 4mM formiato de piridina pH 2.8, MeOH: H2O 97:3 150 -14.8 g l-1 TMSe: 0.2ng, SeCys2: 0.10.15ng, SeMet: 0.70.55ng, Se(IV): 0.20.3ng -183 213 ICP-MS IONICO TMSe, SeMet, Se(IV), SeCys2 166, 184 ICP-MS Levadura SeMet 17
MECANISMO SEPARACIN
DETECCIN
MUESTRA
ESPECIES
INFORMACIN ADICIONAL
LD
REF
HG-AAS IONICO ICP-DRC-MS
Orina, agua grifo Levadura Suplementos dietticos y frmulas infantiles Levadura Leche materna y leche (formula) Msculo pollo, pavo, pato, cordero y cerdo Leche materna y leche (formula) Bacalao y platija
SeMet SeMet, SeOMet
Columna: Hamilton PRP-X100, 250mm x 4.1mm Fase mvil: tampn fosfato pH 7 Columna: Ionosphere-5C, 100mm x 3mm Fase mvil: 0.75-8.0mM formiato de piridina pH 3.0-3.2, MeOH: H2O 97:3 Columnas: Tracer Excel 120 ODSB, 150 mm x 4.0 mm y Hamilton PRP-X100, 150 mm x 4.0 mm Fase mvil: gradiente H2O- tampn fosfato Columnas: Tracer Excel C18, 100 mm x 4.0 mm y SAX, 20 mm x 4.6 mm Fase mvil: H2O- 0.4% acetato sdico Columna: Chirobiotic T, 250 mm x 4.6mm
1.08 ng ml-1 -SeCys: 0.35 ng ml-1, SeMet: 0.54 ng ml-1, Se(IV): 0.40 ng ml-1 -L-SeMet- 3.1 ng ml-1 D-SeMet3.5ng ml-1 --
214 181
HG-AFS FASE REVERSA + IONICO HG-AFS
Se(IV), SeCys, SeMet
215
Se(IV), SeCys, SeMet
157
QUIRAL
ICP-MS
L-SeMet, D-SeMet
187
ICP-MS/UV
Compuestos de selenio solubles en tris-acetato
Columna: Superdex 200 10/30 (10-600 kDa) Fase mvil: tampn Tris-acetato, 3% MeOH (v/v) Columna: Superdex 200 10/30 (10-600 kDa) Fase mvil: 0.1M Tris, pH 7.0 Columna: Superdex 200 10/30 (10-600 kDa) Fase mvil: tampn Tris-acetato, pH 7.5
203
SEC
ICP-MS
Compuestos de selenio solubles Compuestos de selenio solubles en tris-acetato
--
207
ICP-MS/UV 135
0.20g l-1
149
SEPARACIN
136
MECANISMO
DETECCIN
MUESTRA Planta
ESPECIES
INFORMACIN ADICIONAL Columna: Superdex 75R 10/30 (70-3 kDa) y Mono Q 5/50 GL FPLC Fase mvil: 30 mM Tris-HCl, pH 7.5 Columna: Superdex 75R 10/30 (70-3 kDa) y Superdex Peptide HR 10/30 (7-0.1 kDa) Fase mvil: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 Columna: Superdex 200 10/30 (10-600 kDa), Superdex 75R 10/30 (10-600 kDa) y Superdex Peptide (14-0.8 kDa) Fase mvil: 150 mM (NH4)HCO3, pH 7.8; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
LD
REF
ICP-MS
(Brassica juncea)
Compuestos de selenio solubles en tris-HCl Compuestos de selenio solubles en tris-HCl
--
204
ICP-MS
Leguminosa
--
205
SEC
UV-ICP-MS/ CE-ICP-MS
Compuestos de selenio solubles Fruto seco en tris-HCl, HCl, SDS, NaOH y agua Ostra, mejilln,
--
206
Columna: Biosep-SEC-2000 (300-1 kDa) y Compuestos de selenio solubles en H2O y SDS Superdex Peptide HR 10/30 (7-0.1 kDa) Fase mvil: 5 mM fosfato sdico, pH 7.2; 5 mM fosfato sdico, 60 mM NaCl, pH 7.5 -166
ICP-MS/UV
gamba, atn, trucha, trbol, levadura, harina trigo
En el caso del selenio son varias las interferencias poliatmicas que obstaculizan su determinacin utilizando un detector de tipo cuadrupolo. Las principales son la formacin de dmeros en el gas plasmgeno, dos istopos ms abundantes de selenio, producida por
38 78 38
Ar40Ar y
40
Ar2, los cuales solapan con los

80
Se (23.8%) y
Se (49.6%). La interferencia
76
Ar2 tambin dificulta la determinacin de
Se (9.4%) as como la
presencia de impurezas en el argon, tpicamente kripton, que presenta interferencia de superposicin isobrica con tres istopos de selenio: 78Se, 80Se y 82Se. Para superar estos inconvenientes es posible utilizar el ICP-MS provisto de celdas de colisin y reaccin. Estos dispositivos permiten eliminar las interferencias poliatmicas debidas al
40
Ar2 sin que la sensibilidad se resienta. De este modo, se alcanza una mayor
sensibilidad en los anlisis de selenio pues es posible detectar su istopo mayoritario (80Se). En este sentido, en los ltimos tiempos han aparecido un nmero creciente de estudios de especiacin de selenio que emplean equipos ICP-MS con celdas de colisin y reaccin188,189,208. Por otro lado, para incrementar la sensibilidad se ha acoplado en lnea la generacin de hidruros a la salida de una columna cromatogrfica. El empleo de esta tcnica implica la transformacin de todas las especies de selenio eludas en Se(IV), puesto que este es el nico selenocompuesto capaz de genera el hidruro correspondiente de forma eficaz. La generacin de hidruros se emplea mayoritariamente cuando la deteccin se lleva a cabo por AAS o AFS, pero en la bibliografa es posible encontrar tambin ejemplos de utilizacin de la generacin de hidruros combinada con la deteccin por ICP-MS. Tambin se han empleado sistemas ms eficaces para la introduccin de la muestra. As se ha descrito el empleo de nebulizadores ultrasnicos USN216, DIN , microconcntricos217, de capilar oscilante OCN218 y el hidrulico de alta presin HHPN219.
Cromatografa de gases
Es la tcnica ms utilizada para la separacin de especies voltiles como DMSe o DMDSe, que pueden ser separadas con columnas tanto empaquetadas como capilares. De esta forma la cromatografa de gases se ha aplicado al anlisis de compuestos voltiles de selenio en plantas acumuladoras de selenio (ajo220,221, mostaza y altramuz ). La determinacin de especies no voltiles requiere una etapa de derivatizacin previa que puede llevarse a cabo por formacin de piazoselenoles voltiles, tras la reaccin con diaminas222, por formacin de derivados fenilo o por complejacin con acetona o ditiocarbamato223. Por otro lado, el TMSe+ se puede determinar por GC, previa transformacin a DMSe en medio alcalino224. Deteccin
137
Por lo que respecta a los detectores, sin duda los ms utilizados son el Espectrmetro de masas (MS)178,225 y el detector de emisin atmica (AED)178,182,226. Otros detectores de GC utilizados en algunos trabajos son el de ionizacin de llama (FID)227, el de fluorescencia atmica (AFS) y el fotomtrico de llama (FPD) . Otra posibilidad, la ms popular actualmente, es acoplar el cromatgrafo de gases a un ICP-MS159,226,228,229. En este sentido, el acoplamiento de la columna con el ICP-MS presenta ciertas ventajas frente a su anlogo con HPLC, puesto que al pasar directamente la fase gaseosa del cromatgrafo al plasma la eficiencia del transporte del gas al ICP-MS es del 100%.
5.2. TCNICAS NO CROMATOGRFICAS
Electroforesis capilar Esta tcnica, acoplada a un detector UV, se ha empleado en la separacin de las formas inorgnicas de selenio de los aminocidos SeMet y SeCys230 y de los compuestos dialquilados231. El sistema CE-ICP-MS se ha utilizado en la determinacin de las especies inorgnicas de selenio alcanzndose lmites de deteccin de 20 y 30 ng ml-1, para selenito y seleniato, respectivamente232. La sensibilidad puede mejorarse con el acoplamiento CEHG-ICP-MS, obtenindose lmites de deteccin de 10 pg para Se(IV) y 24 pg para Se(VI)233.
138
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1
Cmara C., Prez-Conde C., Toma y tratamiento de muestra, 2002, pp 175-269. Cmara Casiot C., Spuznar J., Lobinski R., Potin-Gautier M., J. Anal. At. Spectrom., 1999, 14, Casiot C., Vacchina V., Chassaigne H., Szpunar J., Potin-Gautier M., Lobinski R., Anal. Johansson M., Bordin G., Rodrguez A.R., Analyst, 2000, 125, 273. Quevauviller P., De la Calle-Guntias M.B., Maier E.A., Cmara C., Mikrochim. Acta, Gmez Ariza J.L., Morales E., Snchez-Rodas D., Girldez I., Trends in Anal. Chem., Lindemann T., Prange A., Dannecker W., Neidhart B., Fresenius J. Anal. Chem., 2000, Uteh J.F., Chou C.L., Sci. Tot. Environ., 1988, 71, 67. Deaker M., Maher W., Anal. Chim. Acta, 1997, 350, 287. Alegra A., Barbera R., Farr R., Moreno A., Die Nahrung, 1994, 6, 382. Bryce W., Izquierdo A., Luque de Castro M.D., Analyst, 1995, 120, 2171. Wu S., Feng X., Wittmeier A., J. Anal. At. Spectrom., 1997, 12, 797. Guang Lan W., Keong Wong M., Min Sin Y., Talanta, 1994, 41(2),195. Guang Lan W., Keong Wong M., Talanta, 1994, 41(1), 53. Yan Zhou C., Keong Wong M., Lin Koh L., Chin Wee Y., Mikrochim. Acta, 1997, 127, 77. Capelo J.L., Ximnez-Embn P., Madrid-Albarrn Y., Cmara C., Anal. Chem., 2004, 76, Sanz-Medel A., Spechtrochim. Acta B, 1998, 53, 197. Sanz-Medel A., Analyst, 1995, 120, 799. Dot A., Namiensnik J., Trends Anal. Chem., 2000, 19, 69. Potin-Gautier M., Analusis, 1997, 25, M22. West G., Anal. Scand., 1966, 20, 2131. West G., Anal. Scand., 1967, 21, 1967. Hempel M., Hintelmann H., Wilken R.D., Analyst, 1992, 117, 669. Tu Q., Qian J., Frech W., J. Anal. At. Spectrom., 2000, 15, 1583. Filipeli M., Anal. Chem., 1987, 59, 116. Storelli M.M., Storelli A., Giacominelli-Stuffler R., Marcotrigiano G.O., Food Chem., 2005, Carro A.M., Rubi W., Bollain M.H., Lorenzo R.A., Cela R., Appl. Organomet.Chem.,
C. (Ed). Sntesis, Madrid.

2
645.
3
Commun., 1999, 36, 77.

4 5
1995, 118, 131.

6
2000, 19(2+3), 200.

7
368, 214.
8 9
10 11 12 13 14 15 16 17
Mason T.J., Ultrasonics Sonochem., 2003, 10, 175.
233.
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
89, 295.
28
1994, 8, 665.
139
29
Lorenzo R.A., Vzquez M.J., Carro A.M., Cela R., Trends in Anal. Chem., 1999, 18(6), Hempel M., Hintelman H., Wilken R.D., Analyst, 1992, 117, 669. Abuin M., Carro A.M., Lorenzo R.A., J. Chromatogr. A, 2000, 889, 185. Thibaud Y., Cossa D., Appl. Organomet. Chem., 1989, 3, 257. Carro A.M., Mejuto M.C., J. Chromatog. A., 2000, 882, 283. Vzquez M.J, Carro A.M., Lorenzo R.A., Cela R., Anal. Chem., 1997, 69, 221. Tseng C.M., De Diego A., Martin F.M., Donard O.F.X., J. Anal. At. Spectrom., 1997, 12, Tseng C.M., De Diego A., Pinaly H., Amouroux D., Donard O.F.X., J. Anal. At. Tseng C.M., De Diego A., Wasserman J.C., Amouroux D., Donard O.F.X., Dietz C., Madrid Y., Cmara C., J. Anal. At. Spectrom., 2001, 16, 1397. Falter R., Hintelmann H., Quevauviller P., Chemsophere, 1999, 39(7), 1039. Boylan H.M., Han Y., Kingston H.M., Link D.D., WTQA2000 Proceedings of the 16th Filippelli M., Chemosphere, 1999, 39(7), 1199. Hammerschmidt C.R., Fitzgerald W.F., Anal. Chem., 2001, 73, 5930. Bloom N.S.J., Can. J. Fish Aquat. Sci., 1989, 46, 1131. Tseng C.M., De Diego A., Martin F.M., Amuroux D., Donard O.F.X., J. Anal. At. Grinberg P., Campos R.C., Mester Z., Sturgeon R.E., Spectrochimica Acta Part B, 2003, Hintelmann H., Falter R., Ilgen G., Evans R.D., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, 58, 363. Jitaru P., Adams F.C., J. Chromatogr. A, 2004, 1055, 197. Cappon C.J., Smith J.C., Anal. Chem., 1977, 49(3), 365. Cappon C.J., Smith J.C., Bulletin Environ. Contaminat. Toxicol., 1978, 19, 600. Quiang T., Qian J., Frech W., J. Anal. At. Spectrom., 2000, 15, 1583. Ramalhosa E., Ro Segade S., Pereira E., Vale C., Duarte A., J. Anal. At. Spectrom., Jitaru P., Goenaga Infante H., Adams F.C., Anal. Chim. Acta, 2003, 489, 45. Bloom N.S., Colman J.A., Barber L., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, 358, 371. Larsens P., Meuleman C., Leermakers M., Baeyens W., Anal. Chim. Acta, 1990, 234, Quevauviller P., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, 358, 419. Ro-Segade S., Bendicho C., J. Anal. Atom. Spectrom., 1999, 14, 163. Emteborg H., Analyst, 1996, 121, 19.
410.
30 31 32 33 34 35
629.
36
Spectrom., 1998, 13, 755.

37
Chemosphere, 1999, 39(7), 1119.

38 39 40
Annual Waste Testing and Quality Assurance Symposium, 2000.

41 42 43 44
Spectrom., 1997, 12, 743.

45
58, 427.
46 47 48 49 50 51
2001, 16, 643.

52 53 54
417.
55 56 57
140
58
Emteborg H., Borklund F., Odman F., Karlsson L., Mthiasson L., Frech W., Baxter D.C., Cai Y., Bayona M.N., J. Chromatogr. A, 1995, 696, 113. Montuori P., Jover E., Alzaga R., Diez S., Bayona J.M., J. Chromatogr. A, 2004, 1025, Yang L., Colombini V., Maxwell P., Mester Z., Sturgeon R.E., J. Chromatogr. A, 2003, Centineo G., Blanco Gonzlez E., Sanz-Medel A., J. Chromatogr. A, 2004, 1034, 191. Diez S., Bayona J.M., J. Chromatogr. A, 2002, 963, 345.
Analyst, 1996, 121,19.

59 60
71.
61
1011,135.
62 63 64
Bravo-Snchez L.R., Ruiz Encinar J., Hidalgo Martnez J.I., Sanz-Medel A., Spectrochim. Bin H., Gui-bin J., Zhe-Ming N., J. Anal. At. Spectrom., 1998, 13, 1141. De Diego A., Tseng C.M., Stoichev T., Amouroux D., Donard O.F.X., J. Anal. At. Stoichev T., Rodrguez Martin-Doimeadios R.C., Tessier E., Amouroux D., Donard Rapsomanikis S., Craig P.J., Anal. Chim. Acta, 1991, 248(2), 563. Snchez Ura J.E., Sanz-Medel A., Talanta, 1998, 47, 509. Alli A., Jaff R., Jones R., J. High Resol. Chromatogr., 1994, 17, 745. OReilly J.E., J. Chromatogr., 1982, 238, 433. Bulska E., Baxter D.C., Frech W., Anal. Chim. Acta, 1991, 249, 545. Sanz J., De Diego A., Raposos J.C., Madariaga J.M., Anal. Chim. Acta, 2003, 486, 255. Emteborg H., Snell J., Qian J., Frech W., Chemosphere, 1999, 39(7), 1137. Gmez-Ariza J.L., Lorenzo F., Garca-Barrera T., Snchez-Rodas D., Anal. Chim. Acta, Muoz J., Gallego M., Valcrcel M., J. Chromatogr. A, 2004, 1055, 185. Bouyssiere B., Baco F., Savary L., Lobinski R., J. Chromatogr. A, 2002, 976, 431. Rosenkraz B., Bettmer J., Anal. Bioanal., Chem., 2002, 373, 461. Carpinteiro Botana J., Rodriguez Rodil R., Cano Daz A.M., Lorenzo Ferreira R.A., Cela Rodrguez I., Mounicou S., Lobisnki R., Sidelnikow V., Patrushev Y., Yumanaka M., Jones R.D., Jacobson M. E., Jaffe R., West-Thomas J., Arfstrom C., Alli A., Water, Air Ebdon L., Foulkes M.E., Le Roux S., Muoz-Olivas R., Analyst, 2002, 127, 1108. Cai Y., Jaff R., Alli A., Jones R., Anal. Chim. Acta, 1996, 334, 251. Cai Y., Jaff R., Jones R., Environmental Science & Technology, 1997, 31(1), 302. Horvat M., Liang L., Bloom N.S., Anal. Chim. Acta, 1993, 281, 135.
Acta Part B, 2004, 59, 59.

65
66
Spectrom., 1998, 13, 623.

67
O.F.X., Talanta , 2004, 62, 433.

68 69 70 71 72 73 74 75
2004, 511, 165.

76 77 78 79
Torrijos R., J. Anal. At. Spectrom., 2002, 17, 904.

80
Anal. Chem., 1999, 71, 4534.

81
and Soil Pollution, 1995, 80, 1285.

82 83 84 85
141
86 87 88 89 90 91
Cai Y., Monsalud S., Jaff R., Jones R.D., J. Chromatogr. A, 2000, 876, 147. Mondral B.C., Das D., Das A.K., Anal. Chim. Acta., 2001, 450, 223. Cela R., Environ. Technol., 1992, 13, 11. Liu R., Environ. Pollut., 2003, 124, 39. Longbottom J.E., Dressman R.C., Chromatogr. Newslett., 1973, 2, 17. Emteborg H., Sinemus H.W., Radziuk B., Baxter D.C., Frech W., Spectrochim. Acta Part Horvat M., Liang L., Bloom N.S., Anal. Chim. Acta, 1993, 282, 153. Fischer R., Rapsomanikis R., Andreae M.O., Anal. Chem., 1993, 65, 763. Armstrong L., Corns W.T., Stockwell P.B., OConnor G., Ebdon L., Evans E.H., Anal. Grossman W.E.L, Eng J., Tong Y.C., Anal. Chim. Acta, 1972, 60, 447. Quimby B.D., Uden P.C., Barnes R.M., Anal. Chem., 1986, 58, 35. Quian J., Fresenius J. Anal. Chem., 2002, 367, 457. Snell J. Quian J., Johansson M., Smit K., Frech W., Analyst, 1998, 123, 905. Quevauviller P., Filippelli M., Horvat M., Trends Anal. Chem., 2000, 19(2+3), 157. Garca Alonso J.I., Ruz Encinar J., Muiz C.S., Gayn J.M.M:, Sanz-Medel A., Plasma
B, 1996, 51(8), 829.

92 93 94
Chim. Acta, 1999, 390, 245.

95 96 97 98 99
100
Source Mass Spectrometry: The New Millenium, 2001, p. 327. Holland G., Tanner D. (Eds.) Cambridge, Reino Unido.
101
Tseng C.M., De Diego A., Martin F.M., Donard O.F.X., J. Anal. At. Spectrom., 1997, 12, Harrington C.F., Trends Anal. Chem., 2000, 19(2+3), 167. Wilken R.D., Hintelmann H., Water, Air and Soil Pollut., 1991, 56, 427. Snchez D.M., Martn R., Morante R., Marn J., Munuera M.L., Talanta, 2000, 52, 671. Eiden R., Falter R., Agustin-Castro B., Shler H.F., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, Ro-Segade S., Bendicho C., Talanta, 1999, 48, 477. Hintelmann H., Wilken R.D., Sci. Total Environ., 1995, 166, 1. Falter R., Ilgen G., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, 358, 401. Hintelmann H., Hempel M., Wilken R.D., Environ. Sci. Technol., 1995, 29, 1845. Bramanti E., Lomonte C., Onor M., Zamboni R., DUlivo A., Raspi G., Talanta, 2005, en Liang L.N., Jiang G.B, Liu J.F., Hu J.T, Anal. Chim. Acta, 2003, 477, 131. Tu W., JohnsonW., Buckley B, J. Anal. At. Spectrom., 2003, 18(7), 696. Chiou C.S., Jiang S.J., Danadurai K.S.K., Spectrochim. Acta Part B, 2001, 56, 1133. Falter R., Ilgen G., Fresenius J. Anal.Chem., 1997, 358, 407. Falter R., Schler H.F., J. Chromatogr. A, 1994, 675, 253. Falter R., Schler H.F., Fresenius J. Anal.Chem., 1995, 35, 34.
629.
102 103 104
105
357, 439.
106 107 108 109 110
prensa.
111 112 113 114 115 116
142
117
Ramalhosa E., Ro-Segade S., Pereira E., Vale C., Duarte A., Anal. Chim. Acta, 2001, Stockwell P.B., Corns W.T., Bryce D.W., 2000, p.1840. Pittcon, Abstracts. Schickling C., Broekaert J.A.C., Appl. Organomet. Chem., 1995, 9, 29. Palmisano F., Zambonin P.G., Cardellicchio, Fresenius J. Anal. Chem., 1993, 346, 648. Gaston Wu J.C., Spectrosc. Lett., 1991, 24, 681. Hintelmann H., Wilken R.D., Appl. Organomet. Chem., 1993, 7, 173. Costa-Fernndez J., Lunzer F., Pereiro-Garca R., Sanz-Medel A., Bordel-Garca N.J., Munaf E., Haraguchi H., Ishii D., Takeuchi T., Goto M., Anal. Chim.Acta, 1990, 235, Bushee D.S., Analyst, 1988, 113, 1167. Shum S.C.K., Pang H.M., Houk R.S., Anal. Chem., 1992, 64, 2444. Martnez R., Tagle M., Snchez J.E., Sanz-Medel A., Anal. Chim. Acta, 2000, 419, 137. Dabek-Zlotorzynska E., Lai E.P.C., Timerbaev A.R., Anal. Chim. Acta, 1998, 359, 1. Carro-Daz A.M., Lorenzo-Ferreira R.A., Cela-Torrijos R., J. Chromatogr. A, 1996, 730, Lee T.H., Jiang S.J., Anal. Chim. Acta., 2000, 413, 197. Silva da Rocha M., Soldado A.B., Blanco-Gnzalez E, Sanz-Medel A, J. Anal. At.
448, 135.
118 119 120 121 122 123
J. Anal. At. Spectrom., 1995, 10, 1019.

124
399.
125 126 127 128 129
345.
130 131
Spectrom., 2000, 15, 513.Silva M., Soldado A.B., Blanco-Gonzlez E., Sanz-Medel J. Anal. At. Spectrom.,
132
Silva da Rocha M., Soldado A.B., Blanco E, Sanz-Medel A, J. Anal. At. Spectrom., Morita H., Sugimoto M., Shimomura S., Anal Sci., 1990, 6, 91. Cossa D., Sanjuan J., Cloud J., Stockwell P.B., Toms W.T., J. Anal. At. Spectrom., Ro-Segade S., Bendicho C, Ecotoxicol. Environ. Safety, 1999, 42, 245. Ro-Segade S., Bendicho C., Spectrochim. Acta Part B, 1999, 54, 1129. Rezende M.C.R., Campos R.C., Curtius A.J., J. Anal. At. Spectrom.,1993, 8, 247. Morabito R., Fresenius Anal. Chem., 1995, 351, 378. Ruiz Encinar J., Ruzik R., Buchmann W., Tortajada J., Lobisnki R., Szpunar J., Analyst, McSheehy S., Yang W., Pannier F., Szpunar J., Lobinski R., Auger J., Potin-Gautier M., McSheehy S., Pohl P., Szpunar J., Potin-Gautier M., Lobinski R., J. Anal. At. Spectrom., Iciolu B., Henden E., Anal. Chim. Acta, 2004, 505, 101. Dernovics M., Stefnka Zs., Fodor P., Anal. Bioanal. Chem., 2002, 372, 473.
2001, 16, 951.

133 134
1995, 10, 287.

135 136 137 138 139
2003, 128, 220.

140
Anal. Chim. Acta, 2000, 421, 147.

141
2001, 16, 68.

142 143
143
144 145
Stefnka Z., Ipolyi I., Dernovics M., Fodor P., Talanta, 2001, 55, 437. Ferri T., Coccioli F., De Luca C., Callegari C.M., Morabito R., Michochem. J., 2004, 78, Lobinski R., Szpunar J., Anal. Chem., 2003, 75, 3765. Polatajko A., liwka-Kaszyska M., Dernovics M., Ruzik R., Ruiz Encinar J., Szpunar J., Slejkovec Z., Elteren J., Woroniecka U.D., Kroon K.J., Falnoga I., Byrne A.R., Biol. nning G., Bergdahl I.A., Analyst, 1999, 124, 1435. Roberge M.T., Borgerding A., Finley J.W., J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 4191. Emteborg H., Bordin G., Rodriguez A.R., Analyst, 1998, 123, 245. Jakubowski N., Thomas C., Klueppel D., Stuewer D., Analusis Magazine, 1998, 26(6), Alsing Pedersen G., Larsen E.H., Fresenius J. Anal. Chem., 1997, 358, 591. Martin J.L., Gerlach M.L., Anal. Biochem., 1969, 29, 257. Potin-Gautier M., Boucharat C., Astruc A., Astruc M., Appl. Organomet. Chem., 1993, 7, Wrbel K., Dannamkumarath S.S., Caruso J.A., Wysocka I.A., Bulska E., witek J., Gmez-Ariza J.L., Caro de la Torre M.A., Girldez I., Morales E., Anal. Chim. Acta, Larsen H.E., Hansen M., Fan T., Vahl M., J. Anal. At. Spectrom, 2001, 16, 1403. Devos C., Sandra K., Sandra P., J. Pharm, Biomed. Anal., 2002, 27, 507. Potin-Gautier M., Gilon N., Astruc M., De Gregori I., Pinochet H., Intern. J. Environ. Michalke B., Witte H., Schramel P., Anal. Bioanal. Chem., 2002, 372, 444. Ge H., Cai X.J., Tyson J.F., Uden P.C., Denoyer E.R., Block E., Anal. Comm., 1996, 33, Kannamkumarath S.S., Wrobel K., Wrobel K., Vonderheide A., Caruso J.A., Anal. Beilstein M.A., Tripp M.J., Whanger P.D., J. Inor. Biochem., 1981, 15, 339. Evenson J.K., Sunde R.A., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1988, 187, 169. Moreno P., Quijano M.A., Gutirrez A.M., Prez-Conde M.C., Cmara C., Anal. Chim. Carvalli S., Cardellicchio N., J. Chromatogr. A, 1995, 706, 429. Hirs C.H.W, Stein W.H., Moore S., J. Biol. Chem., 1954, 211, 941. Moore S., Spackman D.H., Stein W.H., Anal. Chem., 1958, 30, 1185.
195.
146 147
J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 114.

148
Trace. Elem. Reserach, 2000, 75, 139.

149 150 151 152
37.
153 154 155
593.
156
Wierzbicka M., Food Chem., 2004, 86(4), 617.

157
2004, 524, 305.

158 159 160
Anal. Chem., 1997, 67, 15.

161 162
279.
163
Bioanal. Chem., 2002, 373, 454.

164 165 166
Acta, 2004, 315.

167 168 169
144
170
Sochaski M.A., Jenkins A.J., Lyons T.J., Thorpe S.R., Baynes J.W., Anal. Chem., 2001, Broderick D.J., Beilstein M.A., Whanger P.D., Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., Palacios M.A., Varga A., Gmez M., Cmara C., Gavilanes F., Qum. Anal., 1999, 18, Hamel C., Kyriakopoulos A., Rsick U., Behne D., Analyst, 1997, 122, 1359. Kroll J., Rawel H., Krock R., Z. Lebensm Unters Forsh A, 1998, 207, 202. Simpson R.J., Neuberger M.R., Liu T.Y., J. Biol. Chem., 1976, 251, 1936. Chiou S.H., Wang K.T., J. Chromatogr. A, 1988, 448, 404. Wrobel K., Kannamkumarath S.S., Wrobel K., Caruso J.A., Anal. Bioanal. Chem., 2003, De la Calle-Guntias M.B., Brunori C., Scerbo R., Chiavarini S., Quevauvillier P., Chassaigne H., Chry C.C., Bordin G., Rodrguez A.R., J. Chromatogr. A, 2002, 409. Bermejo-Barrera P., Fernndez-Nocelo S., Moreda-Pieiro A., Bermejo-Barrera A., J. Larsen E.H., Sloth J., Hansen M., Moesgaard S., J. Anal. At. Spectrom., 2003, 18, 310. Uden P.C., Boakye H.T., Kahakachchi C., Hafezi R., Nolibos P., Block E., Johnson S., Suzuki K.T., Kurasaki K., Okazaki N., Ogra Y., Toxicol. Appl. Pharmacol., 2004, en Quijano M.A., Moreno P., Gutirrez A.M., Prez.Conde M.C., Cmara C., J. Mass Vonderheide A.P., Wrobel K., Kannamkumarath S.S., BHymer C., Montes Bayn M., Moreno P., Gutirrez A.M., Prez.Conde M.C., Cmara C., J. Anal. At. Spectrom., Gmez-Ariza J.L., Bernal-Daza V., Villegas-Portero M.J, Anal. Chim. Acta, 2004, 520, Daz Huerta V., Fernndez Snchez M.L, Sanz-Medel A., J. Anal. At. Spectrom., 2004, Daz Huerta V., Hinojosa Reyes L., Marchante-Gayn J.M, Fernndez Snchez M.L, Ruiz Encinar J., liwka-Kaszyska M., Polatajko A., Vacchina V., Szpunar J., Anal. Crews H.M., Clarke P.A., Lewis D.J., Owen L.M., Strutt P.R., J. Anal. At. Spectrom.,
73, 4662.
171
1985, 44, 1509.

172
163.
173 174 175 176 177
375, 133.
178
Adams F.C., Morabito R., J. Anal. At. Spectrom., 1997, 12, 1041.
179 180
Anal. At. Spectrom.,1999, 14, 1893.

181 182
Tyson J.F., J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 65.

183
prensa.
184
Spectrom., 2000, 35, 878.

185
Ponce de Len C., Caruso J.A., J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 5722.
186
2001, 16, 1044.

187
229.
188
19, 644.
189
Sanz-Medel A., J. Anal. At. Spectrom., 2003, 18, 1243.

190
Chim. Acta, 2003, 500, 171.

191
1999, 11, 1177.
145
192 193
Sutton K., Richard M.C., Sutton M.C., Caruso J.A., J. Cromatogr. A, 1997, 789, 85. Sutton K.L., Ponce de Len C.A., Ackley K., Sutton R.M.C., Stalcup A.M., Caruso J.A., Ponce de Len C.A., Sutton K.L., Caruso J.A., Uden P.C., J. Anal. At. Spectrom., 2000, Michalke B., Ecotoxicol. Environ. Safety, 2003, 56, 122. Li F., Goessler W., Irgolic K.J., J. Chromatogr. A, 1999, 830, 337. Uden P.C., Boakye H.T., Kahajachchi C., Tyson J.F., J. Chromatogr. A, 2004, 1050, 85. Gonzlez La Fuente J.M, Fernndez Snchez M.L., Sanz-Medel A., J. Anal. At. Bird S.M., Ge H., Uden P.C., Tyson J.F., Block E, Denoyer E.J., J. Chromatogr. A, Kotrebai M., Tyson J.F., Block E., Uden P.C., J. Chromatogr. A, 2000, 866, 51. Kajander E.O., Pajula R.L., Harvima R.J., Elorata T.O., Anal. Biochem., 1989, 179, 396. Gnzlez La Fuente J.M., Alaska M., Fernndez Snchez M.L., Sanz-Medel A., J. Anal. Daun C., Lundh T., nnign G., kesson B., J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 129. Mounicou S., Meija J., Caruso J., Analyst, 2004, 129, 116. Koplk R., Bordov M., Mestek O., Komnkov J., Suchnek M., J. Chromatogr. B, Kannamkumarath S.S., Wrobel K., Wuilloud R.G., Talanta, 2005, 66(1), 153. De la Flor St.Remy R., Fernndez Snchez M.L., Lpez Sastre J.B., Sanz-Medel A., J. Hinojosa Reyes L., Marchante-Gayn J.M., Garca Alonso J.I., Sanz-Medel A., J. Anal. Koyama H., Amura A., Ejima A., Kasanuma Y., Watanabe C., Satoh H., Anal. Biochem., Mndez S.P., Gonzlez E.B., Fernndez Snchez M.L, Sanz-Medel A., J. Anal. At. Mndez S.P., Bayon M.M., Gonzlez E.B., Sanz-Medel A., J. Anal. At. Spectrom., Bendahl L., Gammelgaard B., J.Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 950. Dumont E., De Cremer K., Van Hulle M., Chry C.C., Vanhaecke F., Cornelis R., J. Chatterjee A., Shibata Y., Morita M., Michochem. J., 2001, 69, 179. Vias P., Lpez-Garca I., Merino-Meroo B., Campillo N., Hernndez-Crdoba M., Mester Z., Fodor P., Anal. Chim. Acta, 1999, 386, 89.
Analyst, 2000, 125, 281.

194
15, 1103.
195 196 197 198
Spectrom., 1996, 11, 1163.

199
1997, 789, 349.

200 201 202
At. Spectrom., 1998, 13, 423.

203 204 205
2002, 775, 179.

206 207
Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 1104.

208
At. Spectrom., 2003,18, 1210.

209
1999, 267, 84.

210
Spectrom., 1998, 13, 893.

211
2000, 15, 1109.

212 213
Chromatogr. A, 2005, 1071(1-2), 191.

214 215
Anal. Chim. Acta, 2005, 535, 49.

216
146
217
Woller A., Garraud H., Boisson J., Dorthe A.M., Fodor P., Donard O.F.X., J. Anal. At. Wang L., May S.W., Browner R.F., J. Anal. At. Spectrom., 1996, 11, 1137. Jakubowski N., Thomas C., Stuewer D., Dettlaff I., Schram J., J. Anal. At. Spectrom., Cai X., Uden P.C., Sullivan J.J., Quimby B.D., Block E., Anal. Proc., 1994, 31, 325. Dietz C., Sanz Landaluce J., Ximnez-Embn P., Madrid-Albarrn Y., Cmara C., Anal. Johansson K., rnemark U., Olin A., Anal. Chim. Acta, 1993, 274, 129. Harrison R.M., Rap Somaniks S., Environmental Analysis using Chromatographic
Spectrom., 1998, 13, 141.

218 219
1996, 11, 1023.

220 221
Chim, Acta, 2004, 501, 157.

222 223
Interfaced with Atomic Spectrometry, 1989, pp 318-341. Ellis Horwood Limited, Publishers Chichester (Ed). New York.
224
Dauchy X., Potin-Gautier M., Astruc A., Astruc M., Fresenius J. Anal. Chem., 1994, 348, Gmez Ariza J.L., Pozas J.A., Giradlez I., Morales E., J. Chromatogr. A, 1998, 823, Dietz C., Sanz Landaluce J., Ximnez-Embn P., Madrid-Albarrn Y., Cmara C., J. Jank J., Billiet H.A.H. , Fank J., Luyben K., Husek P., J. Chromatogr. A, 1994, 677, Montes-Bayn M., LeDuc D.L., Terry N., Caruso J., J. Anal. At. Spectrom., 2002, 17, Prez Mndez S., Montes Bayn M., Blanco Gonzlez E., Sanz-Medel A., J. Anal. At. Albert M., Demesmay C., Rocca J.L., Fresenius J. Anal. Chem., 1995, 351, 426. Ng C.L., Lee H.K., Li S.F., J. Chromatogr., 1993, 652, 547. Chen W.H., Lin S.Y., Liu C.Y., Anal. Chim. Acta, 2000, 410, 25. Magnuson M.L., Creed J.T., Brockhoff C.A., Analyst, 1997, 122, 1057.
792.
225
259.
226
Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 260.

227
192.
228
872.
229
Spectrom., 1999, 14,1333.

230 231 232 233
147
Parte Experimental
PROCESOS DE TRATAMIENTO DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE Hg, Se Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y NUTRICIONAL
Captulo V
Desarrollo de nuevos mtodos de anlisis
CAPITULO V: PROCESOS DE TRATAMIENTO DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE Hg, Se Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE INTERS BIOLGICO Y NUTRICIONAL
1. EVALUACIN DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE MERCURIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE PESCADO Y POSTERIOR DETECCIN CON FI-CV-AFS Y GC-PYRO-AFS
2. EXTRACCIN DE SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS BIOLGICAS MEDIANTE EL USO DE LA SONDA DE ULTRASONIDOS Y POSTERIOR DETECCIN CON ICP-MS Y HPLC-ICPMS
La elevada toxicidad de las diferentes formas qumicas del mercurio y su baja concentracin en muestras biolgicas hace necesario el desarrollo de mtodos analticos que permitan su separacin, identificacin y cuantificacin en este tipo de matrices. Por otro lado, el inters creciente que suscita la determinacin de las distintas formas qumicas de selenio en muestras biolgicas, y la baja concentracin de las mismas, pone de manifiesto la necesidad de desarrollar mtodos fiables para su determinacin y especiacin. La preparacin de la muestra es una etapa crucial en los estudios de especiacin, ya que idealmente debe extraer cuantitativamente las especies preservando la integridad de las mismas. Por ello, el objetivo de este captulo fue desarrollar procedimientos de tratamiento de muestra para la determinacin de mercurio y selenio total y sus especies en muestras biolgicas. Las metodologas desarrolladas y los resultados obtenidos se recogen en las dos publicaciones que se presentan a continuacin.
153
En el primer trabajo (seccin 1) Evaluation of different sample pre-treatment and extraction procedures for mercury speciation in fish sampes (J. Anal. At. Spectrom., 2002, 17, 1595-1601) se abord la puesta a punto de un procedimiento de tratamiento de muestra reproducible y eficaz que asegure la integridad de las especies de mercurio presentes en muestras de pescado. El procedimiento analtico descrito se basa en el secado previo de la muestra, la extraccin del mercurio y sus especies, y la determinacin de las mismas sin que se altere su concentracin y composicin original. En el trabajo se evaluaron los posibles riesgos asociados a la etapa de secado mediante tres tratamientos distintos (secado en estufa, microondas y liofilizacin) y la extraccin del mercurio empleando cuatro medios de extraccin diferentes (HCl, NaOH, TMAH y SDS). Para minimizar las desventajas de los procedimientos de extraccin convencionales esta se llev a cabo en un bao de ultrasonidos, optimizndose la concentracin y el volumen del agente extractante, as como, el tiempo de exposicin a la sonicacin. La determinacin del contenido total de mercurio se realiz mediante la tcnica CV-AFS. Posteriormente se evalu la estabilidad de los extractos durante una semana a temperatura ambiente y la integridad de las especies extradas. Para ello se aplicaron las tcnicas de CV-AFS y GC-AFS. La posible formacin artificial de la especie dimetilmercurio durante los procesos de extraccin propuestos se evalu tanto en las muestras como con los patrones. La metodologa desarrollada se valid mediante su aplicacin a un material de referencia certificado en MeHg (BCR 463, atn).
En la segunda publicacin (seccin 2) Enzymatic probe sonication extraction of Se in animal-based food samples: a new perspective on sample preparation for total and Se speciation analyis (Anal. Bioanal. Chem., 2005, 381, 373-379) se presenta un mtodo rpido, sencillo y novedoso para la extraccin de selenio total y de sus especies en muestras de inters nutricional, mediante la accin conjunta de una enzima no especfica (Streptomyces Griseus) y la energa de ultrasonidos producida por una sonda. El procedimiento analtico descrito se basa en una hidrlisis enzimtica en la que el tiempo de incubacin y control de temperatura, parmetros crticos en cualquiera de los procesos en los que intervengan enzimas, se modifican sensiblemente si se compara con procedimientos convencionales, como consecuencia de la energa ultrasnica. En el trabajo se estudian distintos medios de extraccin y se optimizan diversos parmetros que afectan a la eficiencia de extraccin del selenio: tiempo de sonicacin, temperatura, relacin de masa sustrato/enzima, amplitud del ultrasonido y cantidad de muestra. El procedimiento se aplic a tres muestras de origen animal (msculo, hgado y rin de pollo) y una vegetal (pienso).
154
La separacin se realiz empleando una columna de intercambio catinico (PRPX200) y formiato de pridina como fase mvil a dos pHs distintos. La identificacin y cuantificacin de las especies de selenio presentes en las muestras se llev a cabo mediante el acoplamiento HPLC-ICP-MS, monitorizando los istopos 82Se y 78Se. Tambin se evalu la estabilidad del contenido de selenio total y de sus especies, en las disoluciones resultantes, durante 48 horas y a temperatura ambiente. La metodologa propuesta se valid mediante comparacin de los resultados obtenidos con los resultados de un mtodo enzimtico previamente desarrollado (debido a la ausencia de material de referencia certificado en especies) como con un material de referencia certificado en Se total (CRM 278, mejilln).
155
1. EVALUACIN DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE MUESTRA PARA LA EXTRACCIN DE MERCURIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS DE PESCADO Y POSTERIOR DETECCIN CON FI-CV-AFS Y GC-PYRO-AFS.
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Evaluation of different sample pre-treatment and extraction procedures for mercury speciation in fish samples. J. Anal. At. Spectrom., 2002, 17, 1595-1601.
El trabajo completo se present como pster y comunicacin oral en la XVIII Reunin Nacional de Espectroscopia, Coimbra, Portugal. 16-21 de Septiembre 2002.
2. EXTRACCIN DE SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN MUESTRAS BIOLGICAS MEDIANTE EL USO DE LA SONDA DE ULTRASONIDOS Y POSTERIOR DETECCIN CON ICP-MS Y HPLC-ICP-MS.
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Enzymatic probe sonication extraction of Se in animal-based food samples: a new perspective on sample preparation for total and Se speciation analysis Anal. Bioanal. Chem., 2005, 381, 373-379.
Estudios preliminares se presentaron en forma de pster en la XIX Reunin Nacional de Espectroscopia, Gran Canaria, 4-9 de Julio 2004.
El trabajo completo se present como comunicacin oral invitada en European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry. Budapest, Hungra. 1-4 Febrero 2005.
Anal Bioanal Chem (2005) 381: 373379 DOI 10.1007/s00216-004-2798-4
O R I GI N A L P A P E R
Ana I. Cabanero Yolanda Madrid Carmen Camara
Enzymatic probe sonication extraction of Se in animal-based food samples: a new perspective on sample preparation for total and Se speciation analysis
Received: 18 May 2004 / Revised: 29 July 2004 / Accepted: 30 July 2004 / Published online: 15 September 2004 Springer-Verlag 2004
Abstract This paper describes a fast, simple and novel extraction method for total selenium and selenium species determination in food samples. Parameters inuencing extraction, such as sonication time, extracting media, temperature, sample mass, ultrasound amplitude and sample/enzyme mass ratio were investigated. The enzymatic hydrolysis proposed, enhanced by probe sonication, allowed the quantitative extraction of selenium in chicken muscle, liver, kidney and feed (97, 93, 95 and 102%, respectively) in 2 min, maintaining the original Se-species integrity. Total Se content of the samples was determined using inductively coupled plasma mass spectrometry. Se-species were identied and quantied using high-performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry. Chromatographic analyses were carried out under two chromatographic conditions and led to the identication of SeMet in all samples. The accuracy of the proposed method was assessed using certied reference materials as well as microwave digestion. Potential advantages of the proposed method over traditional hydrolysis are speed, simplicity and safety of the procedure. Keywords Selenium Extraction Speciation Selenomethionine Food
Introduction
Solid sample pre-treatment has been the Achilles heel of the analytical process, mainly due to time consumption, almost from the era of alchemy to the present time [1, 2,
A. I. Cabanero Y. Madrid (&) C. Camara Departamento de Qu mica Anal tica, Facultad de Ciencias Qu micas, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain E-mail: [email protected]
3, 4, 5]. Therefore, considerable interest has been expressed in shortened and simplied sample preparation procedures for trace element analysis [5, 6]. In this respect, sonochemistry (chemistry enhanced by ultrasound) has emerged as an interesting alternative to traditional sample pre-treatment methods (hot plate and microwave digestion) for total metal and species determination in dierent matrices. Ultrasonic energy has been used infrequently in analytical chemistry, although it is a powerful tool for accelerating various steps, such as dissolution, fusion and leaching in the analytical process [7]. Ultrasound could facilitate the analytical determination of analytes since it diminishes matrix eects as a result of the separation of the analyte from non-extractable and potentially interfering matrix concomitants [8]. Therefore, ultrasound-assisted leaching is a fast, inexpensive and ecient alternative to conventional extraction techniques, as demonstrated by its application to both organic and inorganic analytes in a wide variety of samples [7], and is currently emerging as an alternative to developing more rapid methods [9, 10]. Selenium is an essential micronutrient for humans and is also a constituent of enzymes (such as glutathione peroxidase and 1-iodothyronine 5-deodinase). In addition, it is recognised that Se provides protection against various forms of cancer [11, 12]. However, Se is also considered to be a toxic element at high concentrations. For most people, the most important sources of Se in the diet are cereals, meat and sh. In fact, meat and sh appear to make rather stable contributions of Se, generally around 4050% of the total Se ingested, regardless of the level of total Se consumed [13]. Therefore, the interest in total selenium content and species determination in chicken samples is of special concern because of its high consumption and the selenium accumulation capacity in animals. It is recognised that the toxic or benecial eects from selenium are not governed by their total concentration, instead it comes from the Se species that can interact eciently with sites on biological ligands. For
374
instance, selenium may substitute sulphur in sulphuramino acids to form the Se analogues selenocystine (SeCys2) and selenomethionine (SeMet), which are the main forms of Se found in food [14]. The identication and quantication of elemental species provides information about bioaccumulation, detoxication and toxicological implications [15]. Therefore, the interest in selenium speciation in food and biological samples is currently increasing. Consequently, food safety and nutritional quality depend not only on the determination of total levels but also on the speciation of the trace elements that exist in foodstus. For selenium speciation, dierent approaches such as enzymatic, acid and basic hydrolysis have been proposed, the former being the most widely used. The application of pronase [16, 17, 18, 19, 20, 21, 22], proteinase-K [23, 24], subtilisin [19, 20], pepsin [16, 22, 25], and trypsin [16, 22] for Se speciation has been reported in technical papers. These methods oer certain advantages in terms of the moderate conditions of temperature and pH, preventing elemental losses by volatilisation. However, their main advantage is their selectivity because enzymes act only on certain chemical bonds and it is possible to distinguish among fractions of elements bonded to dierent components of the sample matrix. On the other hand, these processes sometimes require two consecutive steps, each of them lasting up to 24 h at 37 C. This methodology is extremely time-consuming, and therefore the risk of selenium species interconversion could be high. The use of enzymes in conjunction with ultrasonic energy has already been reported, and it seems that ultrasonication enhances the activity of the enzyme. Although it has been used satisfactorily for selenium determination and speciation in yeast (Capelo et al [19]), it has never been used in studies of Se speciation in food samples. The aim of this work was to develop and to optimise a focused ultrasound-assisted enzymatic extraction method which allows the quantitative, simple and rapid extraction of Se in food samples, maintaining the original Se species integrity. The optimisation of parameters aecting the process, such as extraction media, sample/enzyme ratio, and sonication time, is described. Microwave-assisted digestion and enzymatic hydrolysis were used as comparative methods.
Babington nebuliser and a Scott double-pass spray chamber cooled by a Peltier system was used for total selenium determination and selenium detection after chromatographic separation. A PU-2089 HPLC pump (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) tted with a six-port sample injection valve (model 7725i, Rheodyne, Rohner Park, CA, USA) with a 100 ll injection loop was used for the chromatographic experiments. Separations were carried out in a Hamilton PRP-X200 (10 lm, 2504.1 mm i.d.) (Reno, NV, USA) cationic column. Se species quantication was performed in the peak area mode. Data evaluation was carried out with HP ChemStation software. For molecular weight fractionation, 10 kDa cut-o lters (Millipore, Bedford, MA, USA) and an Eppendorf (Hamburg, Germany) Centrifuge 5804, F34-6-38 were used. Reagents and samples All reagents were of analytical grade and were used without further purication. Selenocystine and selenomethionine (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) were dissolved in 3% hydrochloric acid and deionised Milli-Q water, respectively. Trimethylselenonium chloride was synthesised in our laboratory. Inorganic selenium solutions were obtained by dissolving sodium selenite and sodium selenate (Merck, Darmstadt, Germany) in deionised Milli-Q water (Millipore). Stock solutions of 10 mg l1 were stored in the dark at 4 C. Working standard solutions were prepared daily by dilution. For HPLC-ICP-MS studies, the mobile phase was 4 mmol l1 pyridine formate in 3% methanol. The eluent was prepared by diluting commercial pyridine (Merck) with distilled water and adjusting the pH to 2.8 or 4.7 with formic acid (Merck). HPLC-grade methanol was purchased from SDS (Barcelona, Spain). For the enzymatic extraction procedure, TRIS-HCl buer (pH=7.5) and the non-specic protease XIV (Streptomyces griseus) (Merck), were used to prepare the chicken samples. H2O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) were used for acid digestion of samples. Food samples (chicken muscle, kidney and liver) were homogenised and dried at 40 C for 48 h. The resulting samples were ground, homogenised and kept at 18 C until use.
Experimental
Apparatus
Procedures A Sonoplus ultrasonic homogeniser (Bandelin, Germany) tted with a HF generator 2200 was used for selenium extraction. The homogeniser was equipped with a titanium micro-tip of 3 mm diameter and the power was set to 20 W. The frequency was xed at 20 kHz. An inductively-coupled plasma mass spectrometer, (ICP-MS, HP-4500 Plus, Tokyo, Japan), tted with a Total selenium: microwave digestion Chicken muscle (0.2 g of dried sample), chicken liver (0.1 g) and chicken kidney (0.050 g) were digested with 2 ml of nitric acid and 0.5 ml of hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power output. The
375
pressure was hold at 20 psi for 15 min, at 40 psi for 30 min and nally at 85 psi for 1 h. Total selenium: probe sonication extraction Chicken muscle (0.150 g of dried sample), chicken liver (0.1 g) and chicken kidney (0.050 g) were placed in a 10 ml Teon vial. Then 20% of the sample weight of the non-specic protease S. griseus (protease XIV) was added to 3 ml of the extraction media. The mixture was sonicated for 120 s at 20 W power intensity. The resulting suspension was centrifuged at 4,000 rpm for 20 min and aliquots of supernatant were taken for total selenium determination. Total selenium determination The total selenium content of the sample from microwave or sonication treatment was measured by ICP-MS. For this purpose, the isotopes 78Se and 82Se were monitored. The negligible dierences between Se concentrations using both isotopes for Se quantication conrmed the absence of interference. 103Rh was used as an internal standard. Total selenium concentration was determined by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by ICP-MS. Selenium species leaching: traditional enzymatic hydrolysis The extraction of selenium species was performed following the enzymatic procedure used by Moreno et al [20], using the non-specic protease (S. griseus, PronaseE) instead of Subtilisin (incubation at 37 C for 48 h at pH 7.5). Selenium species leaching: enzymatic probe sonication extraction Selenium species extraction was carried out following the same conditions as for total selenium determination. Chicken muscle (0.150 g of dried sample), chicken liver (0.1 g) and chicken kidney (0.050 g) were placed in a 10 ml Teon vial. Then 20% of the sample weight of the non-specic protease S. griseus (protease XIV) was added to 3 ml of the extraction media. The mixture was sonicated for 120 s at 20 W of power intensity. The resulting suspension was centrifuged at 4,000 rpm for 20 min. Selenium species determination In order to enhance the clean-up of the sample after enzymatic hydrolysis, the samples were centrifuged and the supernatants were removed and passed through a 10 KDa cut-o lter (centrifugation at 7,500 g and 20 C). Finally, the ltrates were diluted to 10 ml with Milli-Q-water.
For selenium speciation, subsequent measurement of the extract was carried out by LC-ICP-MS using the operating conditions given in Table 1.
Results and discussion

The total Se contents of the chicken samples were determined in order to evaluate the eciencies of the dierent sonication procedures tested for total Se and Se species extraction. Samples were microwave-digested and the determination of selenium was performed by FIICP-MS. The results obtained are shown in Table 2. The mean selenium concentration in chicken ranged from 0.8 lg g1 in muscle to 3.3 lg g1 in kidney. Probe sonication extraction conditions for total selenium Acid mineralisation is currently the most popular sample pre-treatment for element determination in biological materials, but noting that Se is mostly bonded to proteins in food, we evaluated an enzymatic leaching method. In order to assess the extraction capability of the enzymatic probe sonication, the following variables were optimised: (1) sonication time and extracting media; (2) temperature; (3) sample/enzyme mass ratio, and; (4) ultrasound amplitude and sample mass.
Table 1 Instrumental operating conditions for Se determination by HPLC-ICP-MS HPLC parameters Analytical column Eluent Eluent ow rate Elution programme Injection volume ICP-MS conditions Forward power Plasma gas (Ar) ow rate Auxiliary gas (Ar) ow rate Carrier gas (Ar) ow rate Nebuliser type PRPX-200 4 mM pyridine formiate solution, H20:MeOH (97:3) 1 ml min1 Isocratic 100 ll 1,350 W 15 l min1 1.3 l min1 1.1 l min1 Babington
Table 2 Total selenium concentrations (lg g1) found in chicken samples by FI-ICP-MS after microwave digestion Sample Chicken Chicken Chicken Chicken muscle liver kidney feed Moisture (%) 73 72 75 Total Se (lg g1) 0.880.02 2.340.07 3.310.09 0.750.04
Results based on dried sample; n=4
376
Sonication time (10 s to 5 min) and extracting media (water and Tris-HCl buer pH 7.5) (Fig. 1) have a signicant inuence on the extraction eciency. As was expected, the extraction eciency increased with increasing sonication time. Both extracting media reached and maintained maximum recovery at sonication times of over 2 min. Therefore, an extremely short sonication time (2 min) was suitable for selenium extraction, which is an advantage of this technique compared to other routine extraction methods. The use of Tris-HCl buer results in better recoveries than water (28% higher recovery), so the use of a buffered solution was proposed. This result was expected as enzymes work as a catalysers careful control of the pH is required when the enzymatic process is in progress, otherwise the enzyme activity may be reduced or inhibited [19]. Since careful temperature control is required to optimise the activity of the enzymes, and hot spots are produced as a consequence of acoustic cavitation when ultrasound is applied in a liquid, a study of the inuence of temperature on the recovery of Se was carried out. Selenium recovery did not improve when the temperature was decreased, which could be due to the fact that
100 90 80
70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300
the size of the bubbles generated is very small compared to the total liquid volume, so the heat that they produce is rapidly dissipated with no appreciable change in environmental conditions [7]. For this reason, temperature control is not required. Consequently, room temperature (25 C) was chosen as the working temperature. Dierent amounts of protease were tested in order to evaluate its eect on the extraction eciency. As can be seen in Table 3, a sample/enzyme mass ratio of 5 provided quantitative recovery in the Tris-HCl buer, so this was the ratio chosen for further selenium extractions. Moreover, total Se extraction is only achieved when focused ultrasound is applied in the presence of enzymes. Evidently, a high fraction of the total Se in chicken is bound to protein (selenoproteins or Se-containing proteins). Furthermore, the extremely short time period required for a quantitative extraction may suggest a spectacular nding, because traditional enzymatic procedures usually require a long treatment period. Hence, it can be stated that sonochemistry enhances the activity of the enzyme, maybe because the eciency of mixing and diusing the reaction components is increased, or because ultrasound may also aect intermolecular interactions involving substrates. In addition, the wall cell disruption capability of the ultrasonic probe aids the contact between the enzyme and intracellular components that normally do not come into contact with the enzyme. The variation of sample mass, 25200 mg, did not entail any modications in the recovery of the studied analyte. Furthermore, the variation of ultrasound amplitude by 1030% did not aect the extraction eciency. Analytical gures of merit and application The equation for the linear range of the Se calibration graph was the following: Y = 30304 X + 80357 where Y is the number of counts and X is the Se concentration (lg g1). The regression coecient was 0.999.
Sample/enzyme mass ratio 10 5 Without enzyme 10 5 10 5 10 5 10 5 10 5 Total Se recovery (%) 674 856 423 864 973 433 563 848 936 302 352 814 954
Selenium Recovery (%)
Sonication time (s)

Fig. 1 Eect of sonication time on Se extraction. Conditions: 150 mg of sample, 15 mg of enzyme protease XIV, and 10% ultrasound amplitude. Triangles 3 ml of water, squares 3 ml TrisHCl buer (pH 7.5) Table 3 Eect of sample/ enzyme mass ratio on selenium extraction from chicken samples
Sample Chicken muscle
Extracting media Water Water Tris-HCl Tris-HCl Tris-HCl Water Water Tris-HCl Tris-HCl Water Water Tris-HCl Tris-HCl
buer buer buer buer buer buer buer
Chicken liver
Chicken kidney
n=4
377
The detection and quantication limits, given by LOD = 3(SD/m), and LOQ = 10(SD/m), respectively, where SD is the standard deviation of 11 measurements of a reagent blank and m the slope of the calibration of standard addition graph, were calculated. The LOD and LOQ for Se in the real samples analysed were 2.4 and 8.1 lg kg1, respectively. Both values were calculated taking into account that the Se was extracted from 150 mg of solid material and that it was in a 3 ml volume of Tris-HCl buer. Once it was decided that the optimised enzymatic probe sonication extraction was able to quantitatively extract selenium, it was applied to chicken muscle, liver, kidney and feed. The extraction conditions used in all cases were: 10% ultrasound amplitude; 2 min sonication time; Tris-HCl buer (3 ml volume). The results presented in Table 4 show that the developed method is able to release the selenium content quantitatively in a variety of food samples in an extremely short period of time, drastically reducing the time involved in sample pre-treatment when compared with traditional methods. The proposed method was validated by analysing a standard reference material, CRM 278 (mussel tissue). At the 95% condence level no signicant dierences were detected between the certied value and the experimental one, so the method used was considered accurate for total selenium determination. Evaluation of enzymatic probe sonication: eciency and selenium species stability As stated previously, a focused ultrasound extraction method was optimised in order to carry out studies on Se speciation in food samples. The optimisation of those parameters aecting the process such as extracting media (water or Tris-HCl buer), sample/enzyme ratio and sonication time were evaluated, as was done for total Se extraction. The best recoveries were found when working under optimised conditions for total Se extraction (20% enzyme and Tris-HCl buer). The selenium recoveries, after ultraltration with 10 kDa cut-o lters, for chicken kidney, liver, muscle and feed, were: 50, 62, 70 and 93%, respectively, which means that some selenium may remain in peptide form. This explanation stems from the knowledge that, during the enzymatic hydrolysis of proteins, some peptide
Table 4 Analytical results for Se after the proposed enzymatic probe sonication extraction Sample Chicken muscle Chicken liver Chicken kidney Chicken feed CRM 278II Total Se (lg g1) 0.850.04 2.20.1 3.10.2 0.740.04 1.60.1 Recovery (%) 974 934 956 1025 986
bonds can remain intact, depending on the cleavage specicity of the enzyme [26]. This could be the reason why a selenium fraction with a molecular weight higher than 10 kDa remained after the enzymatic hydrolysis step. To ensure that no selenium compounds lower than 10 kDa were retained in the lters, we determined the total selenium content in the extracts (spiked with the standards) after ltration. The results, with an average recovery of 973% of total selenium, showed that signicant selenium losses did not occur with this sample treatment. In this study, ve standard Se compounds and two mobile phases were tested for Se separation using a cationic exchange column. If a species is identied under two dierent chromatographic conditions, its identity can be stated with more certainty. Because of this, different experiments were carried out to provide good resolution for standard solutions using a mobile phase at two pH values (2.8 and 4.7). Standard chromatograms for both pHs are shown in Fig. 2. Under optimal chromatographic conditions, it is possible to identify these species within 20 min.
Abundance A 1125
1050 975 900 825 750 675 600 525 450 375 300 225 150 75 0
SeCys2
SeMet Se (IV) TMSe+
Se (VI)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0
Time (min) Abundance B 1500

1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Se (IV) SeCys2 TMSe+
SeMet Se (VI)
2.00 4.00 6.00 8.00 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0
Time (min)
Results based on dried sample; n=4 a certied value: (1.660.04)
Fig. 2a,b Chromatograms of 10 lg l1 of Se species obtained using cationic exchange chromatography at two pH values: a 4.7 and b 2.8
378
Chromatographic analyses were performed on four dierent food samples. Figure 3 shows the chromatograms obtained for these samples. Two peaks can be distinguished in each of the evaluated samples. The rst peak was unidentied; it could not be attributed to any of the selenium species tested, so it could correspond to an anionic selenium species that eluted in the dead volume. The second peak was identied as SeMet, the only seleno-amino acid found in all samples. Peak identication was carried out by the spiking procedure. The same chromatographic proles were obtained at both pHs. The results from the speciation analyses of the food samples are shown in Table 5. The amount of SeMet varied depending on the type of sample. Chicken muscle, liver and kidney contain diering amounts of SeMet (51, 13 and 8%, respectively). In animals, SeMet is incorporated into tissue proteins in place of Met, especially in the skeletal muscles, the liver and the testes (SeMet), making the skeletal muscle the largest body pool of Se [14, 27, 28]. This fact may explain why the SeMet concentration found in muscle was higher than in liver or kidney. Furthermore, the feed used for the target chicken was also analysed for Se
Fig. 3ad Chromatograms of Se species found after probe sonication extraction of: a chicken kidney, b muscle c liver at pH 4.7 and d feed at pH 2.8. U=unidentied Se species
Abundance
Table 5 Results from the speciation analyses of chicken samples Sample Chicken Chicken Chicken Chicken n=4 muscle liver kidney feed Total SeMet (lg g1) 0.450.03 0.300.02 0.260.02 0.680.03
species. In this type of sample, 90% of the total Se has been found to be SeMet. According to the literature, Seaccumulators such as cereals and forage crops convert Se predominantly into SeMet [28]. Taking into account that the main components of the feed were: corn, wheat and soybeans, the value found is comparable with other SeMet data found in this type of cereal [28]. Selenium species stability The use of appropriate methods of protein hydrolysis is of key importance irrespective of the method of Se species determination used. Conditions must be carefully chosen to achieve complete protein hydrolysis with minimal concomitant destruction of the Se species. Furthermore, when studying Se speciation, one should not rule out the possibility that the extraction method employed may cause transformation of the Se species
Abundance
A
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
B 320
SeMet
300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
SeMet
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.0 11.0 12.0 13.0
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.0 11.0 12.0
Time (min) Abundance Abundance
Time (min) SeMet
C 400
350 300 250 200 150 100 50 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10 11 12 13 14 15 16
D 750
700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
SeMet
2.00 4.00 6.00 8.00 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 24.0
Time (min)
Time (min)
379
and that the Se species content in the extracts may change. To improve selenium species recovery, longer extraction times (up to 360 s) were applied and speciation analyses were performed. The results shows that no further improvement was achieved by increasing the sonication time, and the SeMet peak did not change. Moreover, no additional species appeared when dierent sonication times were used in both the samples and the SeMet standard solution. These facts support a lack of interconversion between selenium species. In addition to that, an evaluation of SeMet stability in enzymatic extracts was carried out. Results showed that this species was stable for at least 48 h after sonication at room temperature. Therefore, our results may be comparable to other enzymatic hydrolysis that require longer times (2448 h). Finally, due to the lack of CRMs (one of the main problems concerning speciation), the results obtained were compared with the results from an alternative previously developed enzymatic procedure [20]. In order to carry out this comparison, the samples were hydrolysed independently following both methods, and subjected to the same chromatographic conditions. The results showed that the same chromatographic proles, and no additional species, appeared. Furthermore, the same percentage of SeMet was obtained in chicken feed, muscle, liver and kidney (90, 50, 14 and 7%, respectively). Therefore, it can be stated that the duration required for enzymatic incubation has been substantially shortened (by three orders of magnitude) using the ultrasonic probe, and yet this technique still provides results in agreement with those obtained using a validated enzymatic hydrolysis technique.
reduced consumption of reagents, simplicity, and enhanced safety. As a result, the technique described here is expected to be widely used for analytical purposes in the future, owing to the simplicity, speed, safety and performance attributes of this sample preparation technique.
Acknowledgements The authors wish to thank to Ana Serrano for her contribution to this work.One of the authors (A. Cabanero) wishes to thank Complutense University for their support through a predoctoral fellowship.
References
1. Luque de Castro MD, Jimenez-Carmona MM (1998) TrAC Trend Anal Chem 17:441447 2. Nascentesa CC, Kornb M, Arrudaa MAZ (2001) Microchem J 69:3743 3. Brunori C, Ipolyi I, Macaluso L, Morabito R (2004) Anal Chim Acta 510:101107 4. Lima EC, Barbosa F, Krug FJ, Silva MM, Vale MGR (2000) J Anal Atom Spectrom 15:9951000 5. Luque de Castro MD, da Silva MP (1997) TrACTrend Anal Chem 16:1624 6. Ashley K, Andrews RN, Cavazos L, Demange MJ (2001) J Anal Atom Spectrom 16:11471151 7. Luque-Garc a JL, Luque de Castro MD (2003) TrACTrend Anal Chem 22:4147 8. Santos C, Alava-Moreno F, Lavilla I, Bendicho C (2000) J Anal Atom Spectrom 15:987992 9. Perez-Cid B, Lavilla I, Bendicho C (1998) Anal Chim Acta 360:3539 10. Lopez-Gonzalvez A, Probanza A, Galli V, Hevia C, Mar n A, Munoz-Campos F, Barbas C (1999) Chem Ecol 16:297301 11. Combs CF, Gray WP (1998) Pharmacol Ther 79:179192 12. Pyrzynska K (2001) Talanta 55:657667 13. Combs GF, Combs SB (eds) (1986) The role of selenium in nutrition. Academic, New York 14. Daniels LA (1996) Biol Trace Elem Res 54:185199 15. McSheehy S, Mester Z (2003) TrACTrend Anal Chem 22:311326 16. Dernovics M, Stefanka Z, Fodor P (2002) Anal Bioanal Chem 372:473480 17. Gilon N, Potin-Gautier M, Astruc M (1996) J Chromatogr A 750:327334 18. Gilon N, Astruc A, Astruc M, Gautier M (1995) Appl Organomet Chem 9:623628 19. Capelo JL, Ximenez-Embun P, Madrid-Albarran Y, Camara C (2004) Anal Chem 76:233237 20. Moreno P, Quijano MA, Gutierrez AM, Perez-Conde MC, Camara C (2001) J Anal Atom Spectrom 16:10441050 21. Larsen EH, Sloth J, Hansen M, Moesgaard S (2003) J Anal Atom Spectrom 18:310316 22. Stefanka ZS, Ipolyi I, Dernovics M, Fodor P (2001) Talanta 55:437447 23. BHymer C, Caruso JA (2000) J Anal Atom Spectrom 15:1531 1539 24. Vonderheide AP, Wrobel K, Kannamkumarath SS, BHymer C, Montes-Bayon M, Ponce de Leon C, Caruso JA (2002) J Agr Food Chem 50:57225728 25. Ponce de Leon CA, Sutton KL, Caruso JA, Uden PC (2000) J Anal Atom Spectrom 15:11031107 26. Abou-Shakra FR, Rayman MP, Ward NI, Hotton V, Bastina G (1997) J Anal Atom Spectrom 12:429433 27. Schrauzer GN (2000) J Nutr 130:16531656 28. Schrauzer GN (2003) Adv Food Nutr Res 47:73112
Conclusions
An accurate and sensitive method based on the use of enzymatic probe sonication extraction has been found to be a fast and simple extraction method for total selenium and selenium species determination in food samples. Ultrasound energy allowed us to quantitatively extract the Se content in a variety of food samples, maintaining the original Se species integrity, as in the conventional enzymatic procedure. In addition, it allowed us to improve (in kinetic terms) the selenium extraction, substantially reducing the time required for enzymatic hydrolysis from days (required for the traditional method) to only a couple of minutes (for our ultrasound-based method). Therefore, the use of enzymatic hydrolysis in conjunction with focused ultrasound was found to be an ecient method for catalysing the breakdown of Secontaining proteins into selenoamino acids. Furthermore, it provided several benets over other traditional methods of preparing samples for subsequent selenium determination: shortened sample preparation times,
DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO
Captulo VI
Determinacin de mercurio y selenio
CAPITULO VI: DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES EN PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO
1. CUANTIFICACIN Y ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN ESPECIES DE PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO EN ESPAA Y PORTUGAL.
2. DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES BIOACCESIBLES EN MUESTRAS DE PESCADO MEDIANTE UN MTODO DE DIGESTIN IN VITRO.
La principal fuente de mercurio en la alimentacin humana son los pescados, especialmente en pases como Espaa y Portugal donde su consumo es muy elevado. A pesar de las ventajas nutricionales que este alimento aporta, existe cierta precaucin en su consumo por su conocida bioacumulacin de mercurio. Por otra parte, existen evidencias de que el selenio presente en los pescados, aparte de ser un micronutriente esencial, podra contrarrestar la toxicidad derivada del mercurio. Por ello, el objetivo de este captulo es evaluar el riesgo asociado a la exposicin del hombre al mercurio a travs del consumo de pescado. Este estudio implica la determinacin de los contenidos totales de mercurio y selenio y sus formas qumicas presentes en los pescados seleccionados. Las metodologas empleadas y los resultados obtenidos se recogen en las dos publicaciones que a continuacin se resean.
179
Determinacin de mercurio y selenio
En la primera publicacin (seccin 1) Quantification and speciation of mercury and selenium in fish samples of high consumption in Spain and Portugal (Biol. Trace Elem. Research, 2005, 103, 17-35) se aplic la metodologa analtica indicada en el captulo anterior y se evalu la concentracin del mercurio y selenio total y sus especies en pescados comnmente consumidos en Espaa y Portugal (Sardina, atn, etc.). Los contenidos totales de ambos elementos se determinaron mediante los acoplamientos CV-AFS y HG-AFS, previa digestin de las muestras con horno microondas. Los valores obtenidos se compararon con los valores admitidos por la legislacin europea vigente. La especiacin de mercurio en las muestras se llev a cabo mediante el acoplamiento GC-pyro-AFS, previa extraccin de la muestra en medio cido. La extraccin de las especies de selenio se llev a cabo por un sistema secuencial de extraccin en medio acuoso, combinado con procesos de hidrlisis enzimtica de las distintas fracciones obtenidas, con el fin de facilitar la extraccin de sus especies y esclarecer la distribucin de selenio en las muestras. La identificacin y cuantificacin de las especies de selenio se logr mediante el acoplamiento HPLC-ICP-MS. Una vez obtenidos los datos por los procedimientos mencionados se establecireron las reslaciones molares Se:Hg y SeMet:MeHg en cada una de las especies con el fin de seleccionar a quella especie de mayor inters desde el punto de vista toxicolgico.
En la segunda publicacin (seccin 2) Selenium and mercury bioaccesssibility in fish samples: an in vitro digestion method (Anal. Chim. Acta, 2004, 526, 51-61) se presenta la aplicacin de un procedimiento de digestin in vitro para la determinacin del contenido de mercurio y selenio total y sus especies bioaccesibles en pescados. Los estudios se llevaron a cabo sobre muestras de atn, pez espada y sardina y atn cocinado, para evaluar la disponibiliadad del Hg y Se en estas especies distintas especies de pescado de elevado consumo y el efecto que el proceso de cocinado ejerce sobre dicha bioaccesibilidad. Los contenidos bioaccesibles totales de ambos elementos se determinaron mediante los acoplamientos CV-AFS y HG-AFS. Los estudios de especiacin de selenio sobre los extractos gstrico y gastrointestinal se realizaron mediante el acoplamiento HPLC-ICP-MS. La integridad de las especies de mercurio en ambos extractos se logr mediante el acoplamiento CV-AFS, empleando una reduccin selectiva. Con el fin de valorar las especies de mayor inters toxicolgico se determinaron las correlaciones entre las concentraciones molares de selenio y mercurio bioaccesibles.
180
1. CUANTIFICACIN Y ESPECIACIN DE MERCURIO Y SELENIO EN ESPECIES DE PESCADOS DE ELEVADO CONSUMO EN ESPAA Y PORTUGAL.
A.I. Cabaero, C. Carvalho, Y. Madrid, C. Batoru, C. Cmara. Quantification and speciation of mercury and selenium in fish samples of high consumption in Spain and Portugal Biol. Trace Elem. Research, 2005, 103, 17-35.
Estudios preliminares se presentaron en forma de pster en 8th Meeting of the International Neurotoxicology Association, Lisboa, Portugal. 25-26 de Octubre 2001.
El trabajo completo se present como poster en 5th International Symposium on Speciation of Elements in Biological, Environmental and Toxicological Sciences, Almuecar. 12-15 de Septiembre 2003.
Copyright 2005 by Humana Press Inc. All rights of any nature, whatsoever, reserved. 0163-4984/05/103010017 $30.00
Quantification and Speciation of Mercury and Selenium in Fish Samples of High Consumption in Spain and Portugal
ANA I. CABAERO,1 CRISTINA CARVALHO,2 YOLANDA MADRID,1 CAMILA BATORU,2 AND CARMEN CMARA1,*
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain (E-mail: [email protected]); 2 Centro de Ciencias Farmaceuticas. Faculdade de Farmcia, Universidade de Lisboa, Av. Prof. Gama Pinto 1649-003 Lisboa, Portugal.
Received February 13, 2004; Revised April 27, 2004; Accepted May 31, 2004.
1
ABSTRACT
Mercury (Hg) and selenium (Se) determinations were carried out to evaluate human exposure to those elements through fish consumption in Spain and Portugal. Atomic fluorescence spectroscopy (AFS) was applied in a cold vapor mode for total mercury quantification and was also hyphenated to gas chromatography (GC) to achieve the speciation of organomercurial species in fish samples. The results obtained show the highest concentration of Hg in swordfish and tuna (0.47 0.02 and 0.31 0.01 g g1, respectively), and a much lower concentration in sardine, mackerel shad, and octopus (0.048 0.002, 0.033 0.001, and 0.024 0.001 g g1, respectively). The determination of alkyl mercury compounds revealed that 9398% of mercury in the fish the three fish species with higher mercury content. Total selenium concentration was high in sardine, swordfish, and tuna (0.43 0.02, 0.47 0.02, and 0.92 0.01 g g1, respectively), but low in mackerel shad and octopus (0.26 0.01 and 0.13 0.01 g g1, respectively). Speciation of selenium compounds was done by high-performance liquid
* Author to whom all correspondence and reprint requests should be addressed.

Biological Trace Element Research
17
Vol. 103, 2005
18
Cabaero et al.
chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS). Selenomethionine (SeMet) was the only selenium compound identified in the fish samples with higher selenium content. Among the fish species studied, sardine had the most favourable Se:Hg and SeMet:MeHg molar ratios; therefore, its consumption seems to be preferable. Index Entries: Mercury, selenium, selenomethionine, speciation, fish.
INTRODUCTION
Mercury pollution has become a global problem because of its occurrence from natural and anthropogenic sources (1), and its detrimental effect on humans, making its detection of special concern among environmental pollutants. Mercury toxicity is well known to be highly dependent on its chemical form (2). Methylmercury is the most important Hg species in terms of bioaccumulation and risk owing to its long biological half-life and accumulation through the food chain. The major source of MeHg for humans is fish, because predatory species may preconcentrate 10,000100,000 times the mercury concentration in water (3). Factors accounting for this magnification can be fish size and/or fat content (4,5), the protein affinity mechanisms (6), and the dissolved oxygen content of fish habitat (7). The exposure to MeHg presents a risk for human health, owing to its teratogenic, immunotoxic, and, especially, neurotoxic effects (3). The lipophilic character of MeHg facilitates its absorption and the passage through hematoencephalic, placentary, and mammary barriers. Selenium is an essential micronutrient for humans being a constituent of enzymes (such as glutathione peroxidase and 1-iodothyronine 5-deiodinase). It is also well known for its potential in disease prevention (8). Among the effects reported in the area of health promotion, its role in decreasing cancer risk (8,9) and several types of diseases, such as cardiovascular, Keshan and KashinBek diseases, as well as liver necrosis (10,11), should be stressed. Selenium is also a well-known antagonist of mercury toxicity (10,12). The way in which selenium interferes with MeHg is still unknown, and several mechanisms have been proposed to explain this interaction; however, none of them is conclusive (13). Among the hypotheses, some are more likely to occur: (1) Se may promote a redistribution of MeHg from more sensitive organs (CNS, kidney) to others less sensitive (muscle); (2) competition of Se for the same receptors; (3) formation of complexes (such as tiemannite) (14); and (4) promotion of MeHg conversion into less toxic forms and prevention of oxidative damage (15). Among the species of Se, selenomethionine is one of the species of Se of most interest for human health because it has the highest rate of absorpBiological Trace Element Research Vol. 103, 2005
Mercury and Selenium in Fish
19
tion and retention in tissues, and the highest level of incorporation into enzymes and proteins (10,16). Furthermore, it represents the major nutritional source of selenium for higher animals and humans (16). Mercury and selenium in foods have mostly been determined at the trace level using spectrophotometric techniques (ETAAS, HGAAS, CVAAS, HGAFS, and CVAFS), which are preferred because of their low detection limits (1719). It is well known that the toxicity, bioavailability, and environmental mobility of metals are strongly dependent on on their chemical forms. Thus, analytical speciation has been gaining increasing importance, especially when organic and inorganic forms of the same element can be present in foods, because different forms of an element can have different toxic or protective effects in living organisms. To the best of our knowledge, never before has speciation of selenium and mercury been carried out on the same sample. Overall, food safety and nutritional quality depend on the determination of total levels as well of speciation of the trace elements that exist in foodstuffs. Risk assessment and prevention of human exposure to MeHg is a strong objective in food safety but unfounded warnings to consumers should be avoided, because of the high nutritional value of fish. Instead, consumers should be provided a clear information, supported by research, about the risk of food consumption. The main goal of this work was to measure the concentration of mercury and selenium, including MeHg and SeMet, in fish commonly consumed in Spain and Portugal.
EXPERIMENTAL PROCEDURE
Instrumentation
An atomic fluorescence spectrometer (AFS, Merlin 10.023, P.S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, UK) was used to determine the total mercury content. Mercury vapor was generated in a flow injection system consisting of a multichannel peristaltic pump, a six-way injection valve, and a gasliquid separator. A gas chromatograph (Perkin Elmer, Ltd. model 8410, England) was hyphenated to the AFS detector for the speciation of organomercury compounds. Separation of organomercury compounds was carried out in a gas chromatograph with an on-column injector. The chromatograph was fitted with a non-polar capillary fused silica column SGL-1 (15 m 0.53 mm id) coated with 1.5 m dimethylpolysiloxane (Sugelabor S.A. Spain). A pyrolyzer unit 10.558 (P.S., Analytical, Kent, UK) was used as the interface between GC and AFS in order to convert the organomercurial compounds to atomic mercury vapor. An atomic fluorescence spectrometer (AFS, Excalibur, P.S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, UK) was used to determine the total selenium content. Selenium hydride was
Biological Trace Element Research Vol. 103, 2005
20
Cabaero et al.
generated in a flow-injection system consisting of a multichannel peristaltic pump, a six-way injection valve, and a gasliquid separator. An inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS, HP-4500 Plus, Tokyo, Japan) fitted with a Babington nebulizer and a Scott double-pass spray chamber was used for selenium detection after chromatographic separation. A CM4000 HPLC pump (Milton Roy, Riviera Beach, FL, USA) fitted with a six-port sample injection valve (model 7725i, Rheodyne) with a 100 L injection loop was used for chromatographic experiments. Separations were carried out in a Hamilton PRP-X200 (10 mm, 250 4.1 mm id) (Reno, NV, USA) for cationic chromatography. For molecular-weight fractionation, 10 kDa cut-off filters (Millipore, Bedford, MA, USA) and an Eppendorf (Hamburg, Germany) Centrifuge 5804, F34-6-38 were used.
Reagents
All reagents were of analytical grade and were used without further purification. Mercury standard solutions were prepared by dilution of a stock mercury(II) solution (1000 mg L1) (Merck) in deionized Milli-Q water (Millipore, Ohio, USA). Standard stock solutions of 1000 mg L1 of methylmercury chloride, dimethylmercury, and ethylmercury chloride (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany) were prepared in methanol (HPLC grade, Scharlau). These solutions were stored in amber vials at 18C and diluted with methylene chloride (HPLC grade, Scharlau) to obtain working standards. Standards were prepared daily to reduce the risk of mercury volatilization. Inorganic selenium solutions were obtained by dissolving sodium selenite and sodium selenate (Merck, Darmstadt, Germany) in deionized Milli-Q water (Millipore). Selenocystine and selenomethionine (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) were dissolved in 3% hydrochloric acid and deionized Milli-Q water, respectively. Trimethylselenonium chloride was synthesized in our laboratory following the procedure of Palmer et al. (20). Stock solutions of 10 mg L1 were stored in the dark at 4C. Working standard solutions were prepared daily by dilution. Stannous chloride 3% (w/v), used as a reducing agent, was prepared by dissolving stannous chloride dehydrate (Merck, Darmstadt, Germany) in concentrated hydrochloric acid and diluted to volume with ultra-pure water to a 3 mol L1 concentration. Reagent solution for the reduction was prepared daily to reduce hydrolysis of stannous chloride and maintain the efficiency of mercury reduction. An acidified solution of potassium bromide [18% (m/v) in 0.5% (v/v) H2SO4 (Scharlau)], 1 mol L1 copper (II) sulfate, and 0.01 mol L1 Na2SO4, were used in sample preparation for mercury speciation. For HG-AFS studies, 1% sodium borohydride solution in 0.3% sodium hydroxide (Merck) was prepared. For LC-ICP-MS studies, the mobile phase was 4 mmol L1 pyridine formate in 3% methanol. The eluBiological Trace Element Research Vol. 103, 2005
21
ent was prepared by diluting commercial pyridine (Merck) with distilled water and adjusting the pH to 2.8 or 4.7 with formic acid (Merck). HPLCgrade methanol was purchased from SDS (Barcelona, Spain). For the enzymatic hydrolysis procedure, TRIS-HCl buffer (pH 7.5) and the nonspecific protease XIV (Streptomyces griseus) (Merck) were used. H2O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) were used for acid digestion of samples. Helium c-50 was used as a carrier gas and argon c-50 was used as a make up gas and sheath gas at the transfer line and the AFS, respectively (Carburos Metlicos, Spain).
SAMPLES
Fish samples: mackerel shad (Trachurus trachurus), octopus (Octopus vulgaris), swordfish (Aphanopus carbo), sardine (Sardina pilchardus), and tuna (Thunnus spp.) were collected on docks (Sesimbra, Portugal) just before delivery to consumers or purchased in a local market following the recommendations of European Commission 2001/22/CE (JO CE, 2001). The skin and bones were removed, then the edible (muscle) portions of fishes were immediately blended and frozen at 70C. Analyses were performed avoiding UV radiation, owing to its detrimental effects on organomercurials. The results were validated using two certified reference materials: tuna tissue CRM-463 certified for methylmercury (2.85 0.16 g g1), from the Community Bureau of Reference of European Commission (BCR), and Antarctic krill Murst-ISS A22, certified for selenium (7.37 0.91 g g1), from Institute for Reference Materials and Measurements.
PROCEDURES
Figure 1 briefly describes an overview of the procedure for total mercury and selenium determination and further speciation.
Total Mercury Quantification

Fish tissues (0.5 g of wet fish or 0.2 g of dry fish) were digested with 25 mL of nitric acid and 0.5 mL of hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power output. The pressure was kept at 20 psi during 15 min, increased to 40 psi during 30 min and kept during 1 h at 85 psi. Total mercury concentration was determined by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by the continuous mercury cold vapor system connected to AFS equipment. A flow rate of 2.5 mL min1 (3 M HCl) and a similar flow rate of the reductant solution (3% SnCl2 in 15% HCl) were used to generate the mercury cold vapor.
22
Cabaero et al.
Fig. 1. Flow chart of the sample treatments used for mercury and selenium speciation in fish samples.
Mercury Speciation Acid Extraction

Five milliliters of 5 mol L1 hydrochloric acid were added to a portion (300 mg) of fish tissue and sonicated for 5 min.
Mercury Speciation
After neutralization, mercury species of the hydrochloric acid extracts were converted into their bromide derivates (RHgBr) by the addition of 3 mL of a solution containing 18% (w/v) potassium bromide, 5%( w/v) sulfuric acid, and 1 mL of 1 mol L1 copper sulphate. Extraction of organomercury species into the organic phase was carried out by adding 5 mL of methylene chloride and shaking the solution for 5 h. A 4 mL aliquot of the organic solvent layer containing the extracted
23
organomercury was transferred to a glass vial, and a 1 mL of 0.01 mol L1 sodium thiosulfate solution was added. The solution was mixed for 20 min and subsequently centrifuged at 1575g. An aqueous layer (800 L) was placed in a 3 mL polyethylene vial and 300 L of KBr/CuSO4 and 300 mL of CH2Cl2 were added. Each vial was manually shaken for 1 min, centrifuged, and 0.10.2 mL of the organic solvent was extracted.
Detection
Speciation of organic mercury was attained on the organic extract with the coupling GC-pyrolyser-AFS. Helium with a flow rate of 10 mL min1 was used as the carrier gas. The temperatures were 250C for the injector and 40C with a ramp of 15C min1 until 200C for the oven. For the AFS detection, argon was used as make-up gas and sheath gas at flows of 60 and 300 mL min1, respectively.
Total Organomercury Determination

After acid extraction total organomercury content in the supernatants was determined by difference between its total mercury content (after digestion with HNO3 and H2O2) and its inorganic mercury content, by using stannous chloride as a selective reductant.
Total Selenium Quantification

The samples for selenium determination followed the same acid digestion as mentioned for total mercury quantification. Se(VI) was reduced to Se (IV) by adding concentrated hydrochloric acid (6 mol L1 final concentration) to the digest and heating at 95C for 1 h. The solutions were then diluted to 25 mL with Milli-Q-water. Total selenium concentration was determined by the continuous selenium hydride system connected to AFS equipment. A flow rate of 1.5 mL min1 (3 M hydrochloric acid) and a similar flow rate of the reductant solution (1% sodium tetrahydroborate w/v) were used to generate the selenium hydride.
Selenium Speciation
Portions (200 mg) of dry fish were enzymatically hydrolyzed following a previously developed method (21) (hydrolysis of water-soluble fraction and its solid residue at pH=7.5), but using the non-specific protease (Streptomyces griseus, Pronase E) instead of Subtilisin. In order to enhance the clean up, the extracts were processed through 10 kDa mass cut-off filters. Finally, the filtrates were diluted to 10 mL and analyzed by cation exchange chromatography coupled to ICP-MS, under the following operating conditions: coolant Ar flow rate: 15.0 L min1;
24
Cabaero et al.
auxiliary Ar flow rate: 1.1 L min1; nebulization Ar flow rate: 1.3 L min1; sample flow rate: 1.0 mL min1; nebulizer type: Babington. For this purpose a Hamilton PRP-X200 cationic exchange column using 4 mM pyridine at pH 2.8 and 4.7 as a mobile phase was evaluated. The analytical peaks were evaluated in terms of peak area by the standard addition method at m/z 82 and 78.
RESULTS AND DISCUSSION

Total Mercury Determination
Total mercury content of the samples was determined by FI-CV-AFS in order to evaluate the mercury exposure through fish consumption. Mercury concentration in marine tissue showed the following gradation: octopus (0.024 g g1) < mackerel shad (0.33 g g1) < sardine (0.048 g g1) < tuna (0.31 g g1) < swordfish (0.47 g g1) (Table 1). Such variability might be explained by the interference of biotic parameters such as age, size, sex, metabolism, and feeding habits (46) that affect the bioaccumulative process of Hg in fish. All these values are within the European Commission Regulations 466/2001 and 221/2002 (22,23), which forms part of EC food hygiene legislation, and sets the maximum limit for mercury in whole fresh fish at 0.5 mg kg1, except mainly for predatory species, which may have higher mercury concentration (1.0 mg kg1). The value for mercury for these three species was comparable with other Hg data found in fish (2426). The accuracy of this method was evaluated by analyzing a marine tissue reference material (CRM 463, tuna fish). Because, at 95% confidence level, no significant differences were detected between the certified value and the experimental one, the method used was considered accurate for total mercury determination.
Mercury Species Analysis

Several procedures based on alkaline digestion have been used for the analysis of mercury speciation, but occasionally have shown overestimation of methylmercury concentration (2728). Therefore, to perform mercury species extraction, acid extraction (hydrochloric acid) combined with an ultrasound bath extraction was selected. Several variables, such as acid concentration (07 M), volume of extractant (07 mL), reagents, and sonication exposure time (015 min), were previously optimized. Once total mercury extraction was carried out, determination of inorganic and total mercury was achieved in the acid extract by CV-AFS. The results obtained showed that organomercury compounds comprised more than 94% from the total mercury occurring in fish samples. This may be explained because of the concurrent MeHg bioamplification phenomena
Table 1 Total Mercury and Selenium Concentrations (g g1) Found in Fish Samples by CV-AFS and HG-AFS
1.28 + 0.02 0.59 + 0.02 2.09 + 0.04 1.81 + 0.02 2.32 + 0.03
2020 13 3 22 8 ---
Certified value: 2.85 0.16 g g1. Certified value: 7.37 0.91 g g1. c Results expressed as mean value standard deviation, n=6.
Vol. 103, 2005
25
10
Cabaero et al.
through the tropic chain and the high specificity of the intestine wall of fishes toward MeHg absorption (29). In order to evaluate the organomercury compounds, after applying the HCl extraction procedure, mercury speciation of the extracts with gas chromatography coupled to pyrolysis with atomic fluorescence detection was carried out. A chromatographic analysis was performed on different fish samples and only MeHg was detected. This fact is in good agreement with the literature, where MeHg is the only organomercury compound found in fish (1). The results of the speciation analysis for swordfish, tuna, and CRM463 were 1.8 0.1 g g1, 0.72 0.05 g g1, and 2.8 0.02 g g1. It can be stated that MeHg was found to be the dominant Hg species in all the samples analyzed. Depending on the fish, the amount of mercury found varies, but the percentage of MeHg is higher than 93% in all the samples. This fact was in agreement with the value provided previously for the total organomercury compound. The proposed HCl extraction GC-AFS method provided a limit of detection for methylmercury of 1.2 pg, calculated as three times the standard deviation of 10 blank measures. The method was validated by the analysis of the standard reference material, CRM 463 tuna fish. No significant differences were found between the certified value and the one provided by the acid leaching method (GC-AFS) at 95% confidence level.
Total Selenium Determination

Total selenium content of the fish samples was determined in order to evaluate the Se exposure of fish consumers. The results obtained are shown in Table 1. Selenium concentration in the muscle tissue did not vary to the same extent as the mercury levels did. Mean selenium concentration in marine tissue ranged from 0.13 g g1 in octopus to 0.92 g g1 in tuna. Swordfish and sardine had a similar Se content; however, tuna doubled this amount. Selenium concentration for these three species was comparable with other Se data found in fish (26,30,31). Even though swordfish and sardine had similar Se content, the molar ratio Se:Hg varies from 3 (swordfish) to 22 (sardine). The accuracy of the method was evaluated by analyzing a marine tissue reference material (Murst-ISS A2). Because, at 95% confidence level, no significant differences were detected between the certified value and the experimental one, the method used was considered accurate for total selenium determination.
Selenium Species Analysis

To date, very few Se speciation studies have been carried out in marine organisms, most of them concerning with oysters (21), cod (30),
11
and tuna (31). However, no data about Sespecies:Hgspecies ratio in fish has been reported to our knowledge. Generally, the use of enzymatic hydrolysis processes has shown better results in the release of selenium species from biological solid samples (21) than basic (tetramethylammonium hydroxide) or acid (hydrochloric acid) hydrolysis that led to selenium species degradation (32,33). Because of this, selenium species extraction was performed following an enzymatic procedure. Se may be present in food sample as inorganic forms (selenite or selenate) or as seleno amino acids (free or forming part of the protein structures). The aqueous extraction may free the weakly bound inorganic Se and soluble seleno amino acids. On the other hand, the enzymatic hydrolysis of biological samples produces free amino acids and peptides of different sizes because of the cleavage of peptide bonds in proteins. After an aqueous extraction, it was found that the percentage of soluble selenium was between 6% and 8% of total concentration, the rest of the selenium was found in the solid fraction. After the enzymatic hydrolysis, total selenium contents were analyzed before and after passing through the 10 kDa cut-off filters in order to evaluate if there were selenium compounds retained in the filters. For swordfish, selenium recoveries ranged from 90% to 97%, which indicates that the molecular weight of most of the selenium species extracted during the hydrolysis are lower than 10 kDa. When tuna and sardine were analyzed, the recovery ranged from 65% to 75%, respectively, which means that the hydrolysis was not as effective in breaking down the peptides or proteins in smaller fractions as it was for swordfish, so some selenium may remain in peptide form. This speculation stems from the knowledge that in the enzymatic hydrolysis of proteins, some peptide bonds can remain intact depending on the cleavage specificity of the enzyme (34). Therefore, in this type of fish, a selenium fraction with a molecular weight higher than 10 kDa remained after the enzymatic hydrolysis step. To ensure that no selenium compounds lower than 10 kDa were retained in the filters, we determined the total selenium content in the extracts (spiked with the standards) after filtration. The results, with an average recovery of 9598% of total selenium, showed that selenium losses did not occur with this sample treatment.
Qualitative Analysis of Selenium Species

Some analytical methods for separation and quantification for organic and inorganic selenium species have been proposed (35). Generally, ionic exchange liquid chromatography is used for the separation of seleno amino acids and inorganic selenium species, owing to a number of potential benefits [minimal preparation of liquid samples, separation at ambient temperatures avoiding the risk of thermal decomposition of labile compounds (36), and remaining of their ionic properties in a wide pH range].
12
Cabaero et al.
Fig. 2. Chromatograms of 10 g L1 of Se species obtained for cationic exchange chromatography at two pH values: (A) 4.7 and (B) 2.8.
In this study, five standard Se compound and two mobile phases were tested for Se separation by a cationic exchange column. If a species is identified under two different chromatographic conditions, its identity can be more certainly stated. Because of this, different experiments were carried out to provide good resolution for standard solutions using two different mobile phases at different pH values. A pH value studied previously (2.8) (19) and a new one (4.7) were used. A standard chromatogram for both pHs is shown in Fig. 2 and the limits of detection (LODs) of the

Table 2 Limits of Detection of the Cation Exchange Chromatographic Methods used for Selenium Speciation Analysis (Injection Volume 100 L)
13
two chromatographic methods are shown in Table 2. Under the optimal chromatographic conditions, it is possible to identify these species within 20 minutes. A chromatographic analysis was performed on three different fish samples. Figures 3 and 4 show the chromatograms obtained for these samples (water-soluble fraction and solid residue) analyzed. Two peaks can be differentiated in each of the evaluated samples. The first peak was unidentified; it could not be attributed to any of the selenium species tested, so it could correspond to any anionic selenium species that elutes in the dead volume. The second peak was identified as SeMet, the only seleno amino acid found in both extracts and the dominant Se-species in the three samples. The identification of the peaks was carried out by the spiking procedure. The same chromatographic profiles were obtained by the two chromatographic methods used (at pH 2.8 and 4.7). According to the literature, SeMet is the main form of Se found in food (16,37,38). Therefore, the majority of Se in plant and animal material consumed by humans will be in the form of SeMet (39). Because SeMet cannot be synthesized by higher animals and humans, it could have beneficial physiologic effects not shared by other selenium compounds and meet the criteria of an essential amino acid (16). Only SeMet is incorporated into body proteins, and this allows Se to be stored in the organism and reversibly released by normal metabolic processes, thus offering an advantage over other Se compounds (37). In addition, organic Se appears to be more bioavailable and maintains higher postsupplementation levels (38).
14
Cabaero et al.
Vol. 101, 2004
Fig. 3. Chromatograms of Se species found in sardine after enzymatic hydrolysis and 10 kDa ultrafiltration in: the solid residue (A) pH 2.8, (C) pH 4.7, and in the water-soluble fraction (B) pH 2.8 and (D) pH 4.7. U= unidentified Se species.
15
Fig. 4. Chromatograms of Se species found after enzymatic hydrolysis and 10 kDa ultrafiltration in the solid residue of: (A) swordfish, (C) tuna and in the water-soluble fraction of (B) swordfish and (D) tuna. U= unidentified Se species. Cationic exchange chromatography at pH 4.7.
Quantitative Analysis of Selenium Species

The results of speciation analysis of fish samples are shown in Table 3. The amount of SeMet varied depending on the type of fish. In the swordfish, 93% of the total Se has been found to be SeMet, on the other hand, tuna and sardine present lower percentage of SeMet (46% and 28%, respectively). The value for SeMet for these species was comparable with other SeMet data found in marine samples [e.g, oyster (47%)(21)] Consequently, the selenium levels found may not only help to achieve the recommended daily amount but provide a rich dietary source of SeMet. In spite of the fact that the highest SeMet content has been found in the swordfish, it can also be seen that the highest value of the SeMet:MeHg ratio (6.3), as well as the Se:Hg ratio (22) is for sardine, and the lowest one for swordfish (3).
16
Cabaero et al.
Table 3 SeMet Concentration Found in Both Soluble and Non-soluble Fractions after Enzymatic Hydrolysis of Fish Samples
Results expressed as mean value standard deviation, n=6.
CONCLUSIONS
The goal of this study was to obtain information about mercury contamination in fish highly consumed in Spain and Portugal to establish future actions on exposure assessment resulting from fish ingestion. The levels of total mercury found in the fish samples analyzed vary to a large extent depending on the species, and are below the maximum level allowed by the European legislation. The results also showed that more than 93% of the total Hg occurring in fish samples was methylmercury. On the other hand, it can therefore be stated that the average concentrations of selenium did not vary to the same extent as the mercury levels did, and that they are important to ensure the recommended daily amount. SeMet was the only selenium compound found in the three fish species (sardine, swordfish, and tuna) after an enzymatic hydrolysis process. Nevertheless, the SeMet:MeHg ratio in the different species of fish differs substantially. The ratio Se:Hg varied from 3 (swordfish) to 22 (sardine) with a more favorable ratio between SeMet and MeHg in the sardines. Sardine consumption thus seem to be preferable over tuna and swordfish.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by Spanish-Portuguese Integrated Actions (HP2000-0049 and 2001/2002 NE-13/01) and by the projects CICYT PB98Biological Trace Element Research Vol. 101, 2004
17
0768 and FCT Sapiens 2001 (POCTI/ESP/41741/2001, Eixo 2, Medida 2.3). The collaboration of P.Margarido and G.Silva from DSHPV (Fisheries Division) in obtaining samples is gratefully acknowledged. One of the authors (A. Cabaero) wishes to thank the Complutense University for support through a predoctoral fellowship.
REFERENCES
1. Y. Cai and J. M. Bayona, Determination of methylmercury in fish and river water samples using in situ sodium tetraethylborate derivatization following by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A 696, 113122 (1995). 2. S. Ro-Segade and C. Bendicho, Ultrasound-assisted extracton for mercury speciation by the flow injection-cold vapor technique, J. Anal. At. Spectrom. 14, 263268 (1998). 3. World Health Organization, Geneva. Environmental Health Criteria, Methylmercury, 101, IPCS (1990). 4. P. Larsens, M. Leermarkers, and W. Baeyens, Determination of methylmercury in fish by headspace-gas chromatography with microwave-induced-plasma detection, Water Air Soil Poll. 56, 103115 (1991). 5. T. M. Grieb, C. T. Briscoll, S. P. Gloss, C. L. Schofield, G. L. Bowie, and D. B. Pordello, Factors affecting Hg accumulation in fish in the upper Michigan Peninsula, Environ. Toxicol. Chem. 9, 919930 (1990). 6. N. S. Bloom, Determination of picogram levels of methylmercury by aqueous phase ethylation, followed by cryogenic gas chromatography with cold vapor atomic fluorescence detection, Can. J. Fish. Aquat. Sci. 49, 10101017 (1992). 7. R. P. Mason and W. F. Fitzgerald, Alkylmercury species in the equatorial Pacific, Nature 347, 457459 (1990). 8. K. Pyrzynska, Analysis of selenium species by capillary electrophoresis, Talanta 55, 657667 (2001). 9. C. F. Combs and W. P. Gray, Chemopreventive agents: selenium, Pharmacol. Ther. 79, 179192 (1998). 10. L. Ebdon, L. Pitts, R. Cornelis, H. Crews, O. F. X Donard, and P. Quevalliller, Trace Element Speciation for Environment and Health, 1st ed., RSC, Cambridge, UK (2001). 11. M. Navarro-Alarcn and M. C. Lpez-Martinez, Essentiality of selenium in the human body: relationship with different diseases, The Sci. Total Environ. 249, 347371 (2000). 12. G. M. Egeland and J. P. Middaugh, Balancing fish consumption benefits with mercury exposure, Science 278, 19041905 (1997). 13. M. A. A. Cuvin-Aralar and R. W. Furness, Mercury and selenium interaction: a review, Ecotoxicol. Environ. Safety. 21, 348364 (1991). 14. K. Das, V. Jacob, and J. M. Bouquegneau, White-sided dolphin metallothioneins: purification, characterisation and potential role, Comparat. Biochem. Physiol. Part C 131, 245251 (2002). 15. D. J. Hoffman and G. H. Heinz, Effects of mercury and selenium on glutathione metabolism and oxidative stress in mallard ducks, Environ. Toxicol. Chem. 17, 161166 (1998). 16. G. N. Schrauzer, The nutritional significance, metabolism and toxicology of selenomethionine, Advanc. Food Nutr. Research 47, 73112 (2003). 17. S. Ro-Segade and C. Bendicho, Selective reduction method for separate determination of inorganic and total mercury in mussel tissue by flow-injection cold vapor technique, Ecotoxicol. Environ. Safety 42, 245255 (1998).
Vol. 101, 2004
18
Cabaero et al.
18. L. Aduna de Paz, A. Alegra, R. Barber, R. Farr, and M. J. Lagarda, Determination of mercury in dry-fish samples by microwave digestion and flow injection analysis system cold vapor atomic absorption spectrometry, Food Chem. 58, 169172 (1997). 19. M. Kotrebai, M. Birringer, J. F. Tyson, E. Block, and P. C. Uden, Selenium speciation in enriched and natural samples by HPLC-ICP-MS and HPLC-ESI-MS with perfluorinated carboxylic acid ion-pairing agents, Analyst 125, 7177 (2000). 20. I. S. Palmer, D. D. Fisher, A. W. Halverson, and O. E. Olson, Identification of a major selenium excretory product in rat urine, Biochem. Biophys. Acta 177, 336342 (1969). 21. P. Moreno, M. A. Quijano, A. M. Gutirrez, M. C. Prez-Conde, and C. Cmara, Fractionation studies of selenium compounds from oysters, and their determination by high-performance liquid chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry, J. Anal. At. Spectrom. 16, 10441050 (2001). 22. Commission Regulation (EC) No 466/2001 of 8 March 2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs (2001). 23. Commission Regulation (EC) No 221/2002 of 6 February 2002 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs (2002). 24. C. R. Joiris, L. Holsbeek, and N. L. Moatemri, Total and methylmercury in sardines Sardinella aurita and Sardina pilchardus from Tunisia, Marine Pollution Bulletin 38, 188192 (1999). 25. A. V. Holden, Mercury in fish and selfish. A review, J. Food Technol. 8, 125 (1973). 26. M. Plessi, D. Bertelli, and A. Monzani, Mercury and selenium content in selected seafood, J. Food Comp. Anal. 14, 461467 (2001). 27. T. Quiang, J. Qian, and W. Frech, Rapid determination of methylmercury in biological materials by GC-MIP-AES or GC-ICP-MS following simultaneous ultrasonic-assisted in situ ethylation and solven extraction, J. Anal. At. Spectrom. 15, 15831588 (2000). 28. H. Hintelmann, R. Falter, G. Ilger, and R. D. Evans, Determination of artifactual formation of monomethylmercury (CH3Hg+) in environmental samples using stable Hg2+ isotopes with ICP MS detection: calculation of contents applying species specific isotope addition, Fresenius J. Anal. Chem. 358, 363370 (1997). 29. F. M. Morel, A. M. L. Kraepiel, and M. Amyot, The chemical cycle and bioaccumulation of mercury, Annu. Rev. Ecol. Syst. 29, 543566 (1998). 30. H. M. Crews, P. A. Clarke, D. J. Lewis, L. M. Owen, and P. R. Strutt, Investigation of selenium speciation in in vitro gastrointestinal extracts of cooked cod by high-performance liquid chromatography-inductively coupled plama mass spcetrometry and electrospray mass spectrometry, J. Anal. At. Spectrom. 11, 11771182 (1996). 31. M. Yoshida, M. Abe, K. Fukunaga, and K. Kkuchi, Bioavailability of selenium in the defatted dark muscle of tuna, Food Additives Contaminants 10, 990995 (2002). 32. M. B. De la Calle-Guntias, C. Brunori, R. Scerbo, et al., Determination of selenomethionine in wheat samples: comparison of gas chromatography-microwave-induced plasma atomic emission spectrometry, gas chromatography-flame photometric detection and gas chromatography-mass spectrometry J. Anal. At. Spectrom. 9, 10411047 (1997). 33. M. A. Palacios, A. Varga, M. Gmez, C. Cmara, and F. Gavilanes, Evaluation of acid hydrolysis of proteins on Se-aminoacids and trimethylselenonium species by liquid chromatography-microwave digestion-hydride generation-atomic absortion spectrometry, Quim. Anal. 18, 163168 (1999). 34. F. R. Abou-Shakra, M. P. Rayman, N. I. Ward, V. Hotton, and G. Bastina, Enzymatic digestion for the determination of trace elements in blood serum by ICP-MS, J. Anal. At. Spectrom. 12, 429433 (1997). 35. M. Kotrebai, S. M. Bird, J. F. Tyson, E. Block, and P. C. Uden, Characterization of selenium species in biological extracts by enhanced ion-pair liquid chromatography with inductively coupled plasma-mass spectrometry and by referenced electrospray ionizaBiological Trace Element Research Vol. 101, 2004
19
tion-mass spectrometry, Spectrochimica Acta Part B 54, 15731591 (1999). 36. T. Guerin and A. Astruc, Speciation of arsenic and selenium compounds by HPLC hyphenated to specific detectors: a review of the main separation techniques, Talanta 50, 124 (1999). 37. G. N. Schrauzer, Selenomethionine: a review of its nutritional significance, metabolism and toxicity, J. Nutrition 130, 16531656 (2000). 38. A. Daniels, Selenium metabolism and bioavailability, Biol. Trace Elem. Res. 18, 185199 (1996). 39. R. A. Sunde, Selenium, in Handbook on Nutritionally Essential Mineral Elements, B. L. ODell and R. A. Sunde, eds., Marcel Dekker, New York, pp. 493556 (1997).
Vol. 101, 2004
2. DETERMINACIN DE MERCURIO Y SELENIO TOTAL Y SUS ESPECIES BIOACCESIBLES EN MUESTRAS DE PESCADO MEDIANTE UN MTODO DE DIGESTIN IN VITRO Y POSTERIOR DETECCIN CON CV-AFS, HG-AFS, GCPYRO-AFS Y HPLC-ICP-MS, RESPECTIVAMENTE.
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Selenium and mercury bioaccesssibility in fish samples: an in vitro digestion method Anal. Chim. Acta, 2004, 526, 51-61.
El trabajo completo se present como poster en 5th Internacional Symposium on Speciation of Elements in Biological, Environmental and Toxicological Sciences, Almuecar. 12-15 de Septiembre 2003.
Analytica Chimica Acta 526 (2004) 5161
Selenium and mercury bioaccessibility in sh samples: an in vitro digestion method

Ana I. Caba ero, Yolanda Madrid, Carmen C mara n a
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain Received 25 June 2004; received in revised form 15 September 2004; accepted 15 September 2004 Available online 28 October 2004
Abstract The assessment of hazard from selenium (Se) and mercury (Hg) contaminants in the food chain based on their potential bioaccessibility and on estimate of their actual content in sh is reported under an in vitro model. Atomic uorescence spectroscopy (AFS) was applied for total selenium and mercury quantication. Selenium and mercury bioaccessibility varied depending on the type of sh analyzed. Se solubility in the gastrointestinal supernatants was higher in swordsh and sardine (76 and 83%, respectively) than in tuna (50%). A low Hg bioaccessibility (917%) was found for all the samples. Simulated human gastric and intestinal digestion led to the identication of selenomethionine (SeMet) and organic mercury in the three digested sh. Furthermore, these species were not modied during the digestion. Speciation of selenium compounds was done by liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (LCICP-MS). Sardine had the most favorable Se:Hg, [Se:Hg]bioaccessible and [SeMet:Hg]bioaccessible molar ratios, making it preferable to tuna and swordsh. The effect of cooking was also evaluated. 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Selenium; Mercury; Speciation; Bioaccessibility; Fish sample
1. Introduction The high nutritional value of sh in terms of minerals (P, I, K), unsaturated lipids (oleic acid, linolenic acid and omega 3 series), phospholipids, vitamins (A, D) and proteins of high biological value, makes it an ideal component of a healthy and balanced diet. In addition to the key nutrients mentioned, sh can accumulate substantial concentrations of heavy metals in their tissues and thus can represent a major dietary source of these elements in humans. Fish is therefore a product for which suitable measures should be taken to provide chemical monitoring of the risks deriving from its consumption. With the exception of occupational exposure, sh are acknowledged to be the single largest source of mercury for man
Corresponding author. Tel.: +34 91 3944146. E-mail address: [email protected] (C. C mara). a
[1]. Methylmercury (MeHg) is the organomercury compound most commonly found in sh, and is recognized as a major environmental pollutant and health hazard for humans because of its easy penetration through biological membranes, efcient bioaccumulation, high stability and long-term elimination from tissues [2]. Therefore, the exposure to MeHg poses a risk for human health due to its teratogenic, immunotoxic and, most importantly, neurotoxic effects [35]. One of the natural components of sh that may protect against Hg toxicity is selenium [4,5]. Many reports concerned with Se content in food have shown that the most important sources of Se in the diets of most people are sh, meat and cereals [6,7]. In fact, sh and meat appear to make rather stable contributions of Se, generally around 4050% of the total Se ingested, regardless of the level of total Se ingested [6]. Se appears in food in various forms such as selenite, selenate, selenomethionine and selenocysteine [810] and it is considered as an essential trace element for living organisms,
0003-2670/$ see front matter 2004 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.aca.2004.09.039
52
A.I. Caba ero et al. / Analytica Chimica Acta 526 (2004) 5161 n
including humans, because it forms part of several enzymes such as glutathione peroxidase (GSHPx) and iodothyronine 5 -deiosinase [11]. The evaluation of Hg and Se content in foods has been approached in recent decades from various points of view: estimation of Hg and Se intake, characterization of Hg and Se species, studies of human metabolism, and evaluation of Hg and Se species toxicity in tests with animals and cell cultures. However, to our knowledge, no data on the bioavailability for human beings of Hg and Se presented simultaneously in food have been reported to date. The total concentration of a mineral micronutrient in food does not provide information about its bioavailability, i.e. the percentage of the ingested amount of the element that can be absorbed during digestion and subsequently transformed into metabolically active species. Since the extent of the toxic effects caused by heavy metals is not governed by their total concentration, but rather regulated by the forms of the metals that can efciently interact with sites on the biological ligands [12], bioavailability depends largely on the ability of the ultimate physicochemical forms in which elements reach the absorption site, mainly the duodenum, to cross the intestinal barrier. These forms can exist in food and not be modied during digestion, but in most cases, they result from interactions occurring in the gastrointestinal tract between elements and various functional groups of food components [13]. Consequently, only a proportion (sometimes highly variable depending upon the food matrix processing and storage) of these food components is absorbed and utilized [14]. Speciation of a micronutrient in food and in the gastrointestinal tract is essential to the understanding and prediction of its availability for absorption [13]. The differences in absorption, distribution and toxicity between elemental, inorganic and organic mercury and inorganic selenium and organic selenium are such that detailed dietary studies (speciation of dietary components) may be required to establish a full picture of bioavailable intake [9]. While information on the Hg and Se content of foods is reasonably adequate, knowledge of Hg and Se availability is incomplete. This knowledge gap continues because accurate measurement of Hg and Se availability can be difcult, expensive and time consuming [15]. In vivo studies are both expensive and laborious, and the possibility of measuring certain parameters during the experiments is often limited [16]. In contrast, in vitro experiments can be simple, rapid, low in cost and may provide insights not achievable in whole animal studies [15]. Consequently, in vitro experiments offer an appealing alternative to human and animal studies [16]. Nowadays, there are well-established in vitro methods for estimating element solubility in animals [12]. These methods comprise a two-phase simulation of gastrointestinal physiology, the stomachal and intestinal phases [12]. The results from most in vitro methods are based on the formation of digestion products that are soluble and not precipitated by
precipitating agents, or dialyzable [17]. In this way, the bioaccessible fraction is determined, which is the maximum concentration soluble in simulated gastrointestinal media that is available for subsequent processes of absorption into the intestinal mucosa [18]. Knowledge of the concentration of the element in the bioaccessible fraction is indispensable for evaluating bioavailability. In this work, as part of an ongoing study of Hg and Se bioaccessibility from the human diet, Se and Hg quantication and speciation in sh samples and the subsequent in vitro enzymolysis of the sample to broadly simulate human gastrointestinal digestion were carried out. 2. Experimental 2.1. Instrumentation An atomic uorescence spectrometer (AFS, Excalibur, P.S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, UK) was used to determine the total selenium content. Selenium hydride was generated in a ow injection system. An inductively coupled plasma mass spectrometer (ICPMS, HP-4500 Plus, Tokyo, Japan) tted with a Babington nebulizer and a Scott double-pass spray chamber was used for selenium species quantication after chromatographic separation. A CM4000 HPLC pump (Milton Roy, Riviera Beach, FL, USA) tted with a six-port sample injection valve (model 7725i, Rheodyne) with a 100 L injection loop was used for chromatographic experiments. Separations were carried out in a Hamilton PRP-X200 (10 mm, 250 mm 4.1 mm i.d.) (Reno, NV, USA) for cationic exchange chromatography. For molecular weight fractionation, 10 kDa cut-off lters (Millipore, Bedford, MA, USA) and an Eppendorf (Hamburg, Germany) Centrifuge 5804, F34-6-38 were used. An atomic uorescence spectrometer (Merlin 10.023, P.S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, UK) was used to determine the total mercury content. Mercury vapour was generated in a ow injection system. A gas chromatograph (GC, PerkinElmer, model 8410, England) was hyphenated to the AFS detector for the speciation of organomercury compounds. Separation of organomercury compounds was carried out in a gas chromatograph with an on-column injector. The chromatograph was tted with a non-polar capillary fused silica column SGL-1 (15 m 0.53 mm i.d.) coated with 1.5 m dimethylpolysiloxane (Sugelabor S.A., Spain). A pyrolyzer unit 10.558 (P.S., Analytical, Kent, UK) with a temperature control module was used as the interface between GC and AFS in order to convert the organomercurial compounds to atomic mercury vapour. 2.2. Reagents All reagents were of analytical grade and were used without further purication.
53
Enzymes and bile salts were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA): pepsin (Porcine; catalogue no. P-7000), pancreatin (Porcine; catalogue no. P-1750), and bile salts (catalogue no. B-8756). -Amylase was purchased from Merck (Darmstadt, Germany) (catalogue no. 1329). Inorganic selenium solutions were obtained by dissolving sodium selenite and sodium selenate (Merck) in deionised Milli-Q water (Millipore, Ohio, USA). Selenomethionine (SeMet) and selenocysteine (SeCys2 ) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) were prepared in doubly distilled water. Hydrochloric acid (3%) was added to dissolve SeCys2 . Trimethylselenonium chloride was synthesized in our laboratory following the procedure of Palmer et al. [19]. For HG-AFS studies, sodium borohydride (SigmaAldrich, Steinheim, Germany) was prepared in 0.3% sodium hydroxide (Merck). The 3 M hydrochloric acid solution was prepared by diluting the appropriate volume of concentrated HCl (Merck). For HPLCICP-MS studies, the mobile phase was 4 mM pyridine (Merck) formate in 3% methanol (SDS, Barcelona, Spain). For the enzymatic hydrolysis procedure, TrisHCl and the non-specic protease Streptomyces griseus (Pronase E) (Merck) were used to prepare the sh tissue samples. Mercury standard solutions were prepared by dilution of a stock mercury(II) solution (1000 mg L1 ) (Merck) in deionised Milli-Q water (Millipore, Ohio, USA). Standard stock solution of 1000 mg L1 of methylmercury chloride (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany) was prepared in methanol (HPLC grade, Scharlau, Barcelona, Spain). For CV-AFS stannous chloride (Merck) was prepared in 3 M HCl daily to reduce hydrolysis of stannous chloride and maintain the efciency of mercury reduction. Potassium bromide, copper(II) sulphate and sodium thiosulphate (Merck) were used in sample preparation for mercury speciation. H2 O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) were used for acid digestion of samples. Helium c-50 was used as a carrier gas and argon c-50 was used as a make-up gas and sheath gas at the transfer line and the AFS, respectively (Carburos Met licos, Spain). a 2.3. Samples Fish samples: Swordsh (Aphanopus carbo), sardine (Sardina pilchardus) and tuna (Thunnus spp.) were collected in a Spanish local market. The skin and bones were removed and the edible (muscle) portions of sh immediately blended and frozen at 18 C. These tissues were then oven dried at 40 C for 2 days and stored at 18 C until analysis. Tuna was also analyzed after cooking for consumption in a microwave oven at high power (100%, 650 W) for 4 min. The esh was homogenized in a blender and maintained at 18 C until analysis.
Fig. 1. Flow chart of the experimental protocol of the enzymolysis approach.
2.4. Procedures 2.4.1. In vitro gastrointestinal digestion method The in vitro digestion method used was based on that described by Luten et al. [20], modied and adapted for the sh being studied (Fig. 1). About 25 g of sample were placed in a 250 mL Erlenmeyer ask with 75 mL of gastric juice (6%, w/v pepsin in 0.15 M NaCl, acidied with HCl to pH 1.8) and shaken for 1 min for initial degassing. The mixtures were then held in a thermostatic water bath for 4 h at 37 C, shaking periodically. After 1 h the pH was checked and adjusted to 3 with 6 M hydrochloric acid. After gastric digestion, saturated sodium bicarbonate was added to raise the pH to 6.8. Then 50 mL of intestinal juice (1.5%, w/v pancreatin, 0.5%, w/v amylase and 0.15%, w/v bile salts, in 0.15 M NaCl) were added and the mixture was energetically shaken for 1 min and left in a thermostatic water bath for 4 h at 37 C, shaking periodically. Once gastric/gastrointestinal digestion was completed, a 10 mL aliquot of the suspension was transferred to a polypropylene tube and centrifuged at 1575 g for 1 h. The supernatant was ltered through a 0.45 m Millipore lter, to reduce any effect from microbial activity and both supernatants and precipitates were stored in the dark at 4 C until analysis. Gastric and intestinal digestion blanks were obtained by adding 75 mL of gastric juice to 25 mL of Milli-Q water and 50 mL of intestinal juice respectively, and the above procedure was applied. In addition some blanks were spiked prior to enzymolysis with SeMet and MeHg to determine the recovery of the added Se and Hg at the end of the gastric and gastrointestinal stages.
54
A.I. Caba ero et al. / Analytica Chimica Acta 526 (2004) 5161 n Table 1 Instrument operating conditions for Se determination by LCICP-MS LC parameters Analytical column Eluent Eluent ow rate Elution programme Injection volume ICP-MS conditions Forward power Plasma gas (Ar) ow rate Auxiliary gas (Ar) ow rate Carrier gas (Ar) ow rate Nebulizer type PRPX-200 4 mM pyridine formiate solution, H2 O:MeOH (97:3) 1 mL min1 Isocratic 100 L 1260 W 15 L min1 1.3 L min1 1.1 L min1 Babington
The soluble Se and Hg contents ( g g1 sh) constitute the bioaccessible fraction. The bioaccessibility of these contents for sh is dened as the proportion of Se or Hg in sh available for absorption and it was calculated as Bioaccessibility [Se or Hg in bioaccessible fraction] = 100 [Se or Hg in sh] 2.4.2. Total selenium quantication Fish tissues (0.5 g of wet sh or 0.2 g of dry sh) were digested with 2 mL of nitric acid and 0.5 mL of hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power output. The pressure was hold at 20 psi for 15 min, at 40 psi for 30 min and nally at 85 psi for 1 h. Se(VI) was reduced to Se(IV) by adding concentrated hydrochloric acid (6 M nal concentration) to the digest and heating at 95 C for 1 h. The solutions were then diluted to 25 mL with Milli-Q water. Total selenium concentration was determined by the continuous selenium hydride system connected to AFS equipment. A ow rate of 1.5 mL min1 (3 M hydrochloric acid) and a similar ow rate of the reductant solution (1%, w/v sodium tetrahydroborate) were used to generate the selenium hydride. 2.4.3. Selenium speciation Aqueous leaching. 3 mL of Milli-Q water were added to approximately 200 mg of sample and sonicated for 30 min. Next the solution was centrifuged at 14,000 g for 15 min. The supernatant and the solid residue were enzymatically hydrolyzed separately, to extract seleno-amino acids incorporated into proteins, as described below. Enzymatic hydrolysis. Fish samples were enzymatically hydrolyzed following a previously developed method [11] (hydrolysis of water-soluble fraction and its solid residue at pH 7.5), but using a non-specic protease (S. griseus, Pronase E) instead of Subtilisin. Ultraltration. In order to enhance the clean-up procedure, the supernatants were processed through a 10 kDa cut-off lter. Finally, the ltrates were diluted to 10 mL with Milli-Q water. For selenium speciation, the ultraltered samples were injected into the chromatographic system. Quantication. Selenium species were quantied by LCICP-MS using the operating conditions given in Table 1. For this purpose a cationic exchange column using 4 mM pyridine at pH 2.8 and 4.7 as a mobile phase was used. The analytical peaks were evaluated in terms of peak area by the standard addition method at m/z 82 and 78. 2.4.4. Total mercury quantication The acid digestion procedure used for mercury quantication was the same as that described for total selenium quantication.
Total mercury concentration was determined by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by the continuous mercury cold vapour system connected to AFS equipment. A ow rate of 2.5 mL min1 (3 M HCl) and a similar ow rate of the reductant solution (3% SnCl2 in 15% HCl) were used to generate the mercury cold vapour. 2.4.5. Mercury speciation Mercury species leaching was performed following an acid leaching procedure developed previously [21]. Acid leaching. A 300 mg portion of samples and 5 mL of 5 M hydrochloric acid were placed in a borosilicate glass tube and sonicated for 5 min. Mercury speciation. After neutralization of the HCl extract, mercury species were converted into their bromide derivates (RHgBr). Organomercury species were extracted into an organic phase by adding 5 mL of methylene chloride and shaking the mixture for 5 h. The samples were then centrifuged for 10 min. A 4 mL aliquot of the organic solvent layer containing the extracted organomercury was transferred to a glass vial, and 1 mL of 0.01 M sodium thiosulphate solution was added. The solution was mixed for 20 min and subsequently centrifuged at 1575 g. The aqueous layer (800 L) was placed in a 3 mL polyethylene vial and 300 L of KBr/CuSO4 and 300 L of CH2 Cl2 were added. Each vial was manually shaken for 1 min, centrifuged and 0.10.2 mL of the organic extract was placed in a 2 mL borosilicate glass vial. Detection. Organic mercury speciation was performed with the coupling GC-pyrolyzer-AFS. Helium with a ow rate of 10 mL min1 was used as the carrier gas. The temperatures were 250 C for the injector and 40 C with a ramp of 15 C min1 up to 200 C for the oven. For AFS detection, argon was used as make-up gas and sheath gas at ows of 60 and 300 mL min1 , respectively. Total organomercury determination. After acid leaching the total organomercury content in the supernatants was determined by difference between total mercury content (after
55
digestion with HNO3 and H2 O2 ) and inorganic mercury content, by using stannous chloride as a selective reductant. 2.5. Validation of the results In the present work, two certied reference materials were employed for validation of the methodologies used. Method validation for mercury was performed by using the reference material CRM-463, certied for methylmercury (2.85 0.16 g g1 ), from the Community Bureau of Reference of European Commission (BCR), while for total selenium a marine tissue reference material (Murst-ISS A2), certied for total selenium (7.37 0.91 g g1 ) was used. 2.6. Statistical analysis A one-factor analysis of variance was applied to detect possible differences in total, organic, bioaccessible selenium and mercury content and in bioaccessibility between the three studied sh. A signicance level of P < 0.05 was adopted for all comparisons. Statgraphics Plus version 4.0 (Statistical Graphics) was used for the statistical analysis.
3. Results and discussion 3.1. Total and Se speciation in sh samples Table 2 shows the total Se and SeMet concentrations in uncooked (tuna, swordsh and sardine) and cooked sh (tuna). Total selenium concentration in uncooked sh tissue varied between 0.25 g g1 (swordsh) and 0.51 g g1 (tuna). The value for Se in these three sh species was comparable with other Se data for sh [2224] and agrees with the nding that selenium content in the edible part of shproducts varies within a rather small range from 0.20.9 mg kg1 (Food Standards Agency). For tuna, cooking did not produce a statistically signicant difference (P < 0.05) in the total selenium concentration, as has been reported previously by other authors [25]. According to the data reported here, sh is a good source of selenium and could substantially contribute to meeting the Se requirements for adult humans presented by the World Health Organization (WHO, 1996) (0.39 and 0.42 g kg1 body weight for adult men and women, respectively) [26].
Since selenium bioaccessibility is inuenced by the chemical form of Se, before any conclusions can be drawn about the bioaccessibility of selenium from sh, the chemical species of Se present must be known. After the aqueous leaching, it was found that the percentage of soluble selenium was between 3 and 10% of the total concentration, the rest being found in the solid fraction. For selenium speciation in both, the water-soluble fraction and the solid residue, two-step enzymatic hydrolysis followed by ultraltration with 10 kDa cut-off lters was attempted. For swordsh, selenium recoveries ranged from 91 to 95%, which indicates that the molecular weight of most of the selenium species extracted during the hydrolysis was lower than 10 kDa. When tuna and sardine were analyzed, the recovery ranged from 45 to 65%, respectively, which means that the hydrolysis was not as effective in breaking down the peptides or proteins into smaller fractions as it was for swordsh, so some selenium may have remained in peptide form. This explanation stems from the knowledge that in the enzymatic hydrolysis of proteins, some peptide bonds can remain intact depending on the cleavage specicity of the enzyme [8]. This could be the reason why a selenium fraction with a molecular weight higher than 10 kDa remained after the enzymatic hydrolysis step. In this study, ve standard Se compounds were tested for Se separation in a cationic exchange column at two pH values (2.8 and 4.7) (Fig. 2). A chromatographic analysis was performed on three different sh samples. Fig. 3 shows the chromatograms obtained for these samples (solid residue). Two peaks can be distinguished in each of the sample evaluated. The rst peak was unidentied; it could not be attributed to any of the selenium species tested, so it could correspond to any anionic selenium species that elutes in the dead volume. The second peak was identied as SeMet, the only seleno-amino acid found in both extracts. The identication of the peaks was carried out by the spiking procedure. The chromatographic proles obtained by the two chromatographic methods used (at pH 2.8 and 4.7) were the same in both the water-soluble fraction and the solid residue. The total amount of SeMet varied depending on the type of sh. In swordsh, 85% of the total Se was found to be SeMet, whereas tuna and sardine had lower percentages of SeMet (45 and 25%, respectively). The value for SeMet for these species was comparable with other SeMet contents found in marine tissues (e.g. oyster, 47% [11]).
Table 2 Total selenium and SeMet concentrations ( g g1 ) found in sh samples by HG-AFS and HPLCICP-MS after an enzymatic hydrolysis procedure Sample Tuna Cooked tuna Swordsh Sardine Murst-ISS A2a
a
Moisture (n = 5) (%) 68 43 78 76 2
Total Se fresh sh (n = 5) ( g g1 ) 0.51 0.02 0.50 0.02 0.25 0.02 0.38 0.02
Total Se dry sh (n = 5) ( g g1 ) 1.57 0.06 0.87 0.02 1.13 0.04 1.58 0.02 7.42 0.52
Total SeMet (n = 5) (water-soluble fraction + solid residue) ( g g1 ) 0.70 0.04 0.37 0.03 0.96 0.04 0.40 0.03
Certied value: 7.37 0.91 g g1 .
56
Fig. 2. Chromatograms of 10 g L1 of Se species obtained for cationic exchange chromatography at two pH values: (A) 4.7 and (B) 2.8.
The quality assurance procedures for these analyses included the measurement of a marine tissue reference material (Murst-ISS A2). Since, at the 95% condence level, no signicant differences were detected between the certied value and the experimental one, the method used was considered accurate for total selenium determination. 3.2. Bioaccessibility of Se in sh Table 3 shows total Se contents recovered from the simulated gastric and intestinal digestion of sh. The simulated gastrointestinal digestion residue was also analyzed.
Table 3 Bioaccessible Se contents in dry and cooked sh Sample Bioaccessible Se Gastric digestion (n = 5) ( g kg1 ) Tuna Cooked tuna Swordsh Sardine 761 23 406 8 525 5 1107 33 Gastrointestinal digestion (n = 5) ( g kg1 ) 763 15 477 5 840 25 1331 27 Residue (n = 5) ( g kg1 )
Fig. 3. Chromatograms of Se species found after enzymatic hydrolysis in the solid residue of: (A) swordsh, (B) tuna and (C) sardine. U: unidentied Se species. Cationic exchange chromatography at pH 4.7.
769 33 347 20 214 8 201 7
The recoveries of endogenous Se from uncooked sh in the gastric (pH 2.0) and gastrointestinal (pH 6.8) supernatants varied depending on the type of sh studied. Between 47 and 70% of the selenium in sh were bioaccessible in the simulated stomach digestion, whereas at the neutral pH of intestinal juice, the bioaccessible fractions of selenium were between 50 and 83%. The low bioaccessible values found in some sh may reect either insoluble Se bound to the residue or an equilibrium between the solid and liquid phases. For tuna, the solubility of selenium after gastric digestion did not differ signicantly from that after gastric plus intestinal digestion. Unlike tuna, the Se solubility in the gastrointestinal supernatants of sardine and swordsh was 17 and 60% higher than in the gastric digestion step. Selenium contents of the supernatant intestinal juice are assumed to be a measure of the bioaccessible fraction, as a result of both stomach and intestinal digestion. The Se
57
Fig. 4. Gastric and gastrointestinal Se bioaccessibility in sh.
content in the bioaccessible fraction varied between 480 and 1300 g g1 , with signicant differences (P < 0.05) between the different types of sh, showing the following gradation: sardine > swordsh > tuna. When the results are expressed as percentages, i.e., as bioaccessibility (Fig. 4) it can be seen that the bioaccessibility of Se in swordsh and sardine was higher (76 and 83%, respectively) than in tuna (50%). This might be due to differences in the composition of the sh, since proteins and fat content may affect the solubility of Se, or to a different capability of the enzymes in the in vitro method for releasing the Se existing in each sample. The gastric digestion procedure used (pepsin/HCl) in this study mainly breaks proteins down into lower molecular weight peptides through the action of proteinases and peptidases. The intestinal digestion procedure through the use of pancreatin (a mixture containing mainly lipase and protease) cleaves carbohydrates into monosaccharides and proteins into peptides. Finally, bile salts facilitate digestion of fats due to their emulsion forming properties [27]. The percentages of ultralterable (<10 kDa) selenium (Fig. 4) following simulated gastrointestinal digestion of tuna and sardine showed no decrease in the bioaccessible fraction. Therefore, no signicant differences were found between this value and the one provided above. On the contrary, for swordsh, the ultralterable Se was signicantly lower (P < 0.05) than the Se existing in the bioaccessible fraction ltered with a 0.45 m lter, which means that the in vitro digestion was not as effective in breaking down the peptides or proteins in smaller fractions as it was for tuna or sardine, so some selenium may have remained in peptidic form. This may be why a selenium fraction with a molecular weight higher than 10 kDa remained after the in vitro gastrointestinal digestion. The recoveries obtained from gastric and intestinal digestion for Se are in good agreement with those found in the literature (e.g., cod: 61% [23], mussel: 84% [20], shrimp: 70% [28]).
The value for Se in the cooked tuna was slightly higher (P < 0.05) than in uncooked tuna. In most cases, shery products are processed prior to consumption. Processing might affect the efciency with which the digestive enzymes release Se. During thermal processing, the application of heat hastened loss of water and vitamins, and protein degradation. Chemical contaminants may also be affected by the heat applied. Shen et al. [14] reported that after ripening process, not only the protein pattern and Se distribution from herring changed, but the availability of Se was also increased, which is supposed to be due to protein degradation during the ripening process. The protein degradation can improve protein digestibility, which will facilitate the release of bound Se and therefore increase Se bioaccessibility. Choosing the right way to process shery products could improve their nutritive value. In the three samples, a mass balance was performed after application of the in vitro digestion method. Both the soluble fraction and non-soluble fraction resulting from application of the in vitro digestion method were analyzed. The mass balance results for Se were as follows: tuna = 105 8%, sardine = 92 6% and swordsh = 97 8%. 3.3. Se speciation of the gastrointestinal extracts When studying bioaccessibility, one should not rule out the possibility that the in vitro digestion method employed may bring about some transformation of the selenium species present in the initial product. In order to evaluate this, selenium speciation of the gastrointestinal extracts of sh was carried out. Furthermore, in order to nd out whether cooking made a signicant difference to selenium assimilation potential by humans, both dry and cooked tuna were analyzed. LCICPMS was used to study the possible changes in Se species during cooking and simulated gastrointestinal digestion of sh. A chromatographic analysis was performed on gastric and gastrointestinal extracts ultraltered with 10 kDa cut-off lters. Fig. 5 shows the chromatograms obtained for these samples. SeMet was found to be the dominant Se species in tuna samples, being the only seleno-amino acid found in both extracts. The rst peak was unidentied; it could not be attributed to any of the selenium species tested, so it could correspond to any anionic selenium species that elutes in the dead volume. The swordsh and sardine extracts showed a second unidentied peak, whereas the third one was identied as SeMet. The identication of the peaks was carried out by the spiking procedure. The chromatographic proles obtained by the two chromatographic methods used (at pH 2.8 and 4.7) were the same. In addition, similar chromatograms were obtained for both cooked and uncooked tuna, which shows that cooking did not modify the seleno-amino acid SeMet content. To ensure that no selenium compounds lower than 10 kDa were retained in the lters, we determined the total selenium
58
Fig. 5. Chromatograms of Se species found after in vitro gastrointestinal digestion of: (A) tuna, (B) cooked tuna, (C) swordsh and (D) sardine. U: unidentied Se species. Cationic exchange chromatography at pH 4.7.
content in the extracts (spiked with the standards) after ltration. The result, an average recovery of 95105% of total selenium, showed that selenium losses did not occur with this sample treatment. In order to identify the unknown peaks, possible SeMet modication during digestion was also evaluated. The recovery of Se, as SeMet, added to a digestion blank and to a tuna sample before the start of in vitro enzymolysis was 102 7 and 97 6%, respectively. This was accepted as satisfactory. SeMet was found in these cases, with no signs of modication as predicted by the literature [29]. The results of speciation analysis of the gastrointestinal digestion extracts show that the amount of SeMet varied depending on the type of sh. Tuna and sardine had a higher bioaccessible SeMet concentration (0.290 0.006 and 0.245 0.006 g g1 , respectively) than swordsh (0.147 0.005 g g1 ). However, tuna, swordsh and sardine had similar percentages of bioaccessible SeMet (19, 14 and 16%, respectively) relative to the total Se content. Unlike what happened when Se speciation was performed on sh samples using Pronase, i.e. SeMet content varied within the sh species, in vitro digestion resulted in the same percentage of bioaccessible SeMet regardless of the sample analyzed, although selenium bioaccessibility varied depending on the sh species. Therefore, bioaccessible SeMet may be located in proteins of similar nature and accessibility. By contrast, the SeMet percentage found in uncooked and cooked tuna remained unalterable. According to the literature, SeMet is the main form of Se found in food [7,30,31]. This means that most Se in plant and
animal material consumed by humans will be in the form of SeMet [32]. In addition, various studies have shown that selenomethionine is absorbed and retained more efciently than selenate [810,33], maintaining higher post-supplementation levels [8]. Also, various animal studies found that Se supplemented as sh was more highly retained then when is supplemented as sodium selenite [33,34]. 3.4. Total and Hg speciation in sh samples Table 4 shows total Hg contents in muscle of various species of uncooked and cooked sh. In uncooked sh, the Hg content varied between 0.072 and 0.43 g g1 , with signicant differences (P < 0.05) in concentration depending on the type of sh analyzed (swordsh > tuna sardine). The value for mercury in these three species was comparable with other Hg data for sh [22,35,36]. Such variability is in accordance with the cumulative process of mercury uptake in sh and the interaction of biotic parameters such as age, size, sex, metabolism and feeding habits [3739]. All these values are in compliance with European Commission Regulations 466/2001 and 221/2002 [40,41], which form part of EC food hygiene legislation, and set the maximum limit for mercury in whole fresh sh at 0.5 mg kg1 , except for mainly predatory species, which may have a higher mercury concentration (1.0 mg kg1 ). Even though swordsh, sardine and tuna had similar Se contents, the molar ratio Se:Hg varied from 1.5 (swordsh) to 13 (sardine). As a consequence, sardine seems to be prefer-
A.I. Caba ero et al. / Analytica Chimica Acta 526 (2004) 5161 n Table 4 Total mercury concentrations ( g g1 ) found in sh samples by CV-AFS Sample Tuna Cooked tuna Swordsh Sardine CRM-463a
a
59
Moisture (n = 5) (%) 68 43 78 76 3
Total Hg fresh sh (n = 5) ( g g1 ) 0.43 0.02 0.42 0.02 0.42 0.01 0.072 0.002
Total Hg dry sh (n = 5) ( g g1 ) 1.34 0.06 0.98 0.01 1.91 0.04 0.30 0.01 2.87 0.07
MeHg ( g g1 ) 1.27 0.07 1.85 0.08 0.28 0.03
Certied value: 2.85 0.16 g g1 .
able, due to its low mercury content and considerable selenium content. Since the toxic effect of mercury depends not only on its total concentration, but also on its species, mercury speciation was performed. Mercury species extraction was conducted following acid leaching (hydrochloric acid) combined with ultrasound bath extraction [21]. Once total mercury extraction had been completed, organic and inorganic mercury were determined in the acid extract. The results showed that organomercury compounds comprised more than 92% of the total mercury in sh samples. In order to evaluate the organomercury compounds, the HCl leaching procedure was performed and then, mercury speciation of the extracts with gas chromatography coupled to pyrolysis with atomic uorescence detection was carried out. Chromatographic analysis was performed on different sh samples, but only MeHg was detected. This is in good agreement with the literature, since MeHg is the only organomercury compound found in sh [42]. The amount of mercury found depends on the sh, but the percentage of MeHg (Table 4) in all samples is higher than 94%. No signicant differences were found between this value and the one given above for total organomercury compounds. The method was validated using the CRM-463 tuna sh. No signicant differences were found between the certied value and the one provided by the acid leaching method (GCAFS) at the 95% condence level. 3.5. Bioaccessibility of Hg in sh Table 5 shows total Hg contents recovered from the simulated gastric and intestinal digestion of sh.
Table 5 Bioaccessible Hg contents in sh Sample Bioaccessible Hg Gastric digestion (n = 5) ( g kg1 ) Tuna Swordsh Sardine 264 12 207 7 26 2 Gastrointestinal digestion (n = 5) ( g kg1 ) 106 11 317 20 38 5 Residue (n = 5) ( g kg1 )
The simulated gastrointestinal digestion residue was also analyzed. The recoveries of endogenous Hg from uncooked sh in the gastric (pH 2.0) and gastrointestinal (pH 6.8) supernatants varied depending on the type of sh (Fig. 6). This might be due to differences in the composition of the sh, which might affect the solubility of Hg, or Hg release in each sample. Between 9 and 20% of the mercury in sh was bioaccessible in the simulated stomach digestion, whereas at the neutral pH of intestinal juice, the bioaccessible fractions of mercury were between 9 and 17%. These results are conict with earlier experiments on animals under MeHg administration, in which the high absorption, and therefore bioavailability of MeHg, is addressed. The low Hg recovery obtained in this study could be attributed to the low ability of enzymes in the in vitro method to release the Hg existing in each of the samples, perhaps due to the matrix or to poor access of the enzyme to the substrate, rather than to a lack of bioaccessibility of the MeHg itself. In fact, a recovery of 89% was obtained from in vitro enzymolysis of MeHg. The solubility of mercury after gastric digestion differed signicantly (P < 0.05) from that after gastrointestinal diges-
1152 81 1602 77 251 10
Fig. 6. Gastric and gastrointestinal Hg bioaccessibility in sh.
60
tion for tuna, swordsh and sardine, where the Hg solubility in the gastrointestinal supernatants were 40% lower and 54 and 22% higher, respectively, than in the gastric digestion step. The mercury content of the supernatant intestinal juice is assumed to be a measure of the mercury available for absorption, as a result of both stomach and intestinal digestion. The total Hg content in the bioaccessible fraction varied among the different types of sh, in the following order: swordsh > sardine > tuna. Thus swordsh had the highest bioaccessibility. The very low bioaccessible Hg content in sardine is a further reminder of the benet from this product compared with the two other sh. A mass balance was performed on the three samples after application of the in vitro digestion method. The soluble fraction and precipitate resulting from application of the in vitro digestion method were analyzed. The results of mass balance for Hg were as follows: tuna = 97 9%, sardine = 91 8% and swordsh = 110 7%. 3.6. Hg speciation of the gastrointestinal extracts In order to evaluate possible transformation of mercury species, mainly MeHg, present in the initial product, following the gastrointestinal procedure, the extracts were directly analyzed by selective reduction with 3% (w/v) stannous chloride and measurement by CV-AFS. Total mercury was determined by the same procedure but with previous HNO3 H2 O2 digestion of the extract. Organic mercury was calculated as the difference between the values obtained in the two steps. The results obtained showed that the bioaccessible mercury was not transformed into inorganic forms, so it remained as organomercury after in vitro gastrointestinal digestion. 3.7. Bioaccessible seleniummercury ratios One of our goals in this work was to contribute to assessing the risk represented by toxic metals through the determination of bioaccessible mercury and selenium content, their speciation in sh and the determination of the Se:Hg, [Se:Hg]bioaccessible and [SeMet:Hg]bioaccessible ratios. Even though tuna and sardine had similar Se contents, the Se:Hg molar ratio varies from 1.5 (tuna) to 13 (sardine). As a consequence, taking into account its total Se and Hg content, sardine is the preferred sh species, due to its low mercury content and considerable selenium content. The same behavior was observed (Fig. 7) when simulating in vitro gastrointestinal digestion. The [Se:Hg]bioaccessible ratios varied to the same extent as they did above, showing the following order: sardine > tuna > swordsh (96, 19 and 7, respectively). Furthermore, although the highest SeMetbioaccessible content was found in tuna, the highest values of [SeMet:Hg]bioaccessible ratio (20) and [Se:Hg]bioaccessible ratio were in sardine, and the lowest value in swordsh (2.4).
Fig. 7. Molar Se:Hgbioaccessible and SeMet:Hgbioaccessible ratios found in sh samples after an in vitro gastrointestinal digestion.
Therefore sardine consumption would be preferable to tuna and swordsh.
4. Conclusions Selenium and mercury bioaccessibility was found to be dependent on the type of sh analyzed due to different degradation effectiveness of the food matrix and consequent release of these elements. Simulated human gastric and intestinal digestion led to a high selenium bioaccessibility and the identication of SeMet in the three sh studied. Furthermore, this selenium compound was not modied during digestion. Regardless of the sample, it was found that bioaccessible SeMet accounted for the same percentage of the total Se. Therefore, bioaccessible SeMet may be located in proteins of similar accessibility in all the samples. In addition, cooking did not modify the SeMet found in the sample. By contrast, low Hg bioaccessibility and no modication during digestion was found for all samples. The molar ratios Se:Hg, [Se:Hg]bioaccessible and [SeMet:Hg]bioaccessible showed the same order: sardine > tuna > swordsh. In conclusion, the most favorable sh for human consumption can be predicted by calculating the molar ratio Se:Hg.
Acknowledgements One of the authors (A. Caba ero) wishes to thank the n Complutense University for support through a predoctoral fellowship.
References
[1] G.E. Duke, A.A. Jegers, G. Loff, O.A. Evanson, Biochem. Physiol. 50A (1975) 649. [2] G. Tao, S.N. Willie, R.E. Sturgeon, Analyst 123 (1998) 1215. [3] World Health Organization, Methylmercury, Environmental Health Criteria, WHO, Geneva, 1990, 101 pp. [4] G.M. Egeland, J.P. Middaugh, Science 278 (1997) 1904.
A.I. Caba ero et al. / Analytica Chimica Acta 526 (2004) 5161 n [5] L. Ebdon, L. Pitts, R. Cornelis, H. Crews, O.F.X. Donard, P. Quevalliller, in: RSC (Eds.), Trace Element Speciation for Environment and Health, Cambridge, UK, 2001. [6] G.F. Combs, S.B. Combs, The Role of Selenium in Nutrition, Academic Press, New York, 1986. [7] M. Yoshida, M. Abe, K. Fukunaga, K. Kikuchi, Food Additives and Contaminants 19 (2002) 990. [8] L.A. Danniels, Biological Trace Element Research 54 (1996) 185. [9] S.J. Fairweather-Tait, Eur. J. Clin. Nutr. 51 (1997) 20. [10] J. Ortu o, G. Ros, M.J. Periago, C. Martnez, G. L pez, Food Sci. n o Technol. Int. 2 (1996) 135. [11] P. Moreno, M.A. Quijano, A.M. Guti rrez, M.C. P rez-Conde, C. e e C mara, J. Anal. Atomic Spectrom. 16 (2001) 1044. a [12] A. Asean, M. Vasconcelos, Food Chem. Toxicol. 38 (2000) 899. [13] P. Hocquellet, M. Lhotellier, J. AOAC Int. 80 (1997) 920. [14] L.H. Shen, N.M. Hook-van, J.B. Luten, Seafood from Producer to Consumer, Integrated Approach to Quality, 1997, p. 653. [15] D. Miller, B. Schricker, R. Rasmussen, D. Van Campen, Am. J. Clin. Nutr. 34 (1981) 2248. [16] L.G. Danielsson, A. Zarpen, A.W. Glynn, Analyst 120 (1995) 713. [17] S. Boise, B.O. Eggum, Nutr. Res. Rev. 4 (1999) 141. [18] M.V. Ruby, R. Schoof, W. Brattin, M. Goldade, G. Posst, M. Harnois, D.E. Mosbe, S.W. Casteel, W. Berti, M. Carpenter, D. Edwards, D. Cragin, W. Chappell, Environ. Sci. Technol. 33 (1999) 3697. [19] I.S. Palmer, D.D. Fisher, A.W. Halverson, O.E. Olson, Biochem. Biophys. Acta 177 (1969) 336. [20] J.B. Luten, W. Bouquet, M. Burggraaf, J. Rus, in: P. Bratter, P. Schramel (Eds.), Trace Elements: Analytical Chemistry in Medicine and Biology, Galter de Gruter, New York, 1987, p. 509. [21] A.I. Caba ero, Y. Madrid, C. C mara, J. Anal. Atomic Spectrom. n a 17 (2002) 1595. [22] M. Plessi, D. Bertelli, A. Monzani, J. Food Comp. Anal. 14 (2001) 461.
61
[23] H.M. Crews, P.A. Clarke, D.J. Lewis, L.M. Owen, P.R. Strutt, J. Anal. Atomic Spectrom. 11 (1996) 1177. [24] M. Yoshida, M. Abe, K. Fukunaga, K. Kkuchi, Food Addit. Contam. 10 (2002) 990. [25] D.J. Higgs, V.C. Morris, O.A. Levander, J. Agric. Food Chem. 20 (1972) 678. [26] World Health Organization, Trace Elements in Human Nutrition and Health, WHO, Geneva, 1996, p. 105. [27] M.S. V zquez, A.M. Gutierrez, M.M. G mez, M.A. Palacios, Qum. a o Anal. 13 (1994) 144. [28] S. Hassan, J. Hakkarainen, P.J. Lindberg, Vet. Med. 34 (1987) 353. [29] O.A. Levander, in: W. Mertz (Ed.), Trace Elements in Human and Animal Nutrition, Academic Press, New York, 1989, p. 209. [30] G.N. Schrauzwer, J. Nutr. 130 (2000) 1653. [31] G.N. Schrauzwer, Adv. Food Nutr. Res. 47 (2003) 73. [32] R.A. Sunde, in: B.L. ODell, R.A. Sunde (Eds.), Handbook of Nutritionally Essential Mineral Elements, Marcel Dekker, New York, 1997, p. 493. [33] R. Ornsrud, M. Lorentzen, Br. J. Nutr. 87 (2002) 13. [34] H.Y. Wen, R.L. Davis, B. Shi, J. Chen, M. Boylan, J.E. Spallholz, Biol. Trace Element Res. 58 (1997) 43. [35] C.R. Joiris, L. Holsbeek, N.L. Moatemri, Mar. Pollut. Bull. 38 (1999) 188. [36] A.V. Holden, J. Food Technol. 8 (1973) 1. [37] P. Lansens, M. Leermarkers, W. Baeyens, Water Air Soil Pollut. 56 (1991) 103. [38] T.M. Grieb, C.T. Briscoll, S.P. Gloss, C.L. Schoeld, G.L. Bowie, D.B. Pordello, Environ. Toxicol. Chem. 9 (1990) 919. [39] N.S. Bloom, Can. J. Fish. Aquat. Sci. 49 (1992) 1010. [40] Commission Regulation (EC) No. 466/2001 of 8 March 2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs, 2001. [41] Commission Regulation (EC) No. 221/2002 of 6 February 2002 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs, 2002. [42] Y. Cai, J.M.J. Bayona, J. Chromatogr. A 696 (1995) 113.
ACUMULACIN, DISTRIBUCIN Y TRANSFORMACIN DE MERCURIO EN AVES. EFECTO PROTECTOR DEL SELENIO
Captulo VII
Interaccin Hg-Se en aves
CAPITULO VII: ACUMULACIN, DISTRIBUCIN Y TRANSFORMACIN DE MERCURIO EN AVES. EFECTO PROTECTOR DEL SELENIO.
1. EFECTO DEL ENRIQUECIMIENTO DE PIENSOS CON SELENIO Y ARCILLAS EN LA BIOACUMULACIN DE MERCURIO
2. ESTUDIO DE LA ACUMULACIN DE SELENIO Y SU INTERACCION CON Hg MEDIANTE EL USO DE CV-AFS, ICP-MS Y HPLC-ICP-MS.
3. ESTUDIO DE LA INTERACCIN MERCURIO-SELENIO EN HGADO DE POLLO MEDIANTE EL USO DE CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR ACOPLADA AL ICP-MS
Actualmente la mayora de la poblacin est expuesta principalmente al mercurio a travs de la dieta (pescados). Su carcter lipoflico facilita su absorcin en los tejidos grasos y por tanto su bioacumulcacin a lo largo de la cadena alimentaria, hecho que explica las elevadas concentraciones de este compuesto en alimentos expuestos a bajos niveles de mercurio. Recientemente, la incorporacin de ciertos productos derivados de la pesca, como las harinas de pescado, en piensos de alimentacin animal ha supuesto un aumento de la presencia de mercurio en productos de consumo animal. Como consecuencia, la carne procedente de animales alimentados con estos productos podra favorecer la exposicin del hombre al mercurio. Por ello, el objetivo principal de este captulo es contribuir a la evaluacin del riesgo asociado a la exposicin de aves a mercurio inorgnico y orgnico. Adems de la incorporacin de agentes adsorbentes no nutritivos (arcillas) o antagnico (Se) para poder reducir as la absorcin gastrointestinal de este metal pesado, y consecuentemente sus efectos txicos. Tambin, se intenta clarificar los posibles mecanismos de interaccin entre ellos. Los resultados obtenidos se recogen en las tres publicaciones que se presentan a continuacin.
209
En el primer trabajo (seccin 1) Effect of animal feed enriched with Se and clays on Hg bioaccumulation in chickens: in vivo experimental study (J. Agricultural and Food Chemistry, 2005, ) se recogen los resultados y conclusiones derivadas de los estudios realizados sobre el efecto que ejerce la suplementacin de materiales adsorbentes y antagnicos a travs de la dieta en la bioacumulacin del mercurio en aves. El estudio se realiz con una poblacin de 160 pollos (Hybro-g) y fueron alimentados durante 42 das con una dieta basal (control) o con una dieta suplementada con diferentes compuestos: Hg(II), MeHg, Se(IV), sepiolita o bentonita. Se determinaron la ganancia de peso y eficiencia del alimento a los 0, 21 y 42 das del estudio. Con el fin de evaluar la distribucin del mercurio y selenio, y el efecto que el Se y las arcillas ejercan sobre la distribucin y bioacumulacin del mercurio se evalu la concentracin de ambos elementos en distintas partes del animal: rin, hgado, msculo y piel. La determinacin del contenido de mercurio y selenio total se llev a cabo mediante las tcnicas de CV-AFS y GH-AFS, previa digestin cida en microondas y posterior reduccin con HCl (en el caso del Se).
En el segundo trabajo (seccin 2) Selenium long-term administration and its effect on mercury toxicity se estudi el efecto antagnico de la toxicidad del mercurio que ejerce el selenio y los posibles mecanismos de detoxificacin implicados. Adems se evalu el proceso de acumulacin y transformacin de selenio a travs de la cadena trfica y se desarroll un mtodo in vitro para la determinacin del contenido de selenio total y sus especies bioaccesibles. El estudio se realiz con una poblacin de 72 pollos (Hybro-g) que fueron alimentados durante 42 das con una dieta basal rica en selenio (control) o con una dieta suplementada con: Hg(II), MeHg y Se(IV). Los estudios se realizaron sobre diversas partes del animal: rin, hgado y msculo. Los contenidos totales de ambos elementos se determinaron mediante las tcnicas CV-AFS e ICP-MS, despus de un proceso de digestin de cada muestra. Se identificaron las formas qumicas de Hg y Se y posibles biotransformaciones de estos elementos como resultado de su interaccin. La extraccin de las especies de Se se realiz a travs de un proceso enzimtico desarrollado previamente. La separacin y deteccin de las especies de selenio se logr mediante el acoplamiento HPLC-ICP-MS.
210
Las especies de Hg extradas se estudiaron mediante el acoplamiento CV-AFS, empleando una reduccin selectiva.
En el tercer trabajo (seccin 3) Mercury-Selenium interaction in chicken liver by size exclusion chromatography inductively coupled plasma-mass spectrometry (J. Anal. At. Spectrom., 2005, aceptado) se abord el estudio de la interaccin Hg-Se en hgado de pollo cuando ambos elementos son administrados simultneamente a travs de la dieta. Con el fin de clarificar el metabolismo del Hg y los procesos por los que el Hg y el Se interaccionan se estudi la distribucin de las especies solubles de ambos elementos en funcin del peso molecular. Adems, el estudio se ampli a otros metales, txicos y esenciales, estudindose la distribucin de los compuestos de S, P, Cu, Zn, Mn y Fe en funcin del tamao, y su posible modificacin despus de una exposicin prolongada a Hg y Se. El estudio se realizo sobre hgado de pollos que fueron alimentados durante 42 das con una dieta basal o suplementada con Hg(II), MeHg y Se(IV). En el trabajo se optimizaron diversos parmetros que afectan a la separacin de las biomolculas, tales como el pH, caudal, concentracin y fuerza inica de la fase mvil. El anlisis de la fraccin proteica se llev a cabo por cromatografa de exclusin molecular (SEC) con deteccin por UV e ICP-MS. Los contenidos totales de ambos elementos se determinaron mediante los acoplamientos CV-AFS y HG-AFS, despus de un proceso de digestin de cada muestra.
211
1. EFECTO DEL ENRIQUECIMIENTO DE PIENSOS CON SELENIO Y ARCILLAS EN LA BIOACUMULACIN DE MERCURIO
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Effect of animal feed enriched with Se and clays on Hg bioaccumulation in chickens: in vivo experimental study J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 2125-2132.
Estudios preliminares se presentaron como comunicacin oral invitada en 5th International Symposium on Speciation of Elements in Biological, Environmental and Toxicological Sciences, Almuecar. 12-15 de Septiembre 2003.
El trabajo completo se present como poster en 2nd International IUPAC Symposium on Trace Elements in Food, Bruselas, Blgica. 6-8 Octubre 2004.
J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 21252132
2125
Effect of Animal Feed Enriched with Se and Clays on Hg Bioaccumulation in Chickens: In Vivo Experimental Study
ANA I. CABANERO, YOLANDA MADRID,
AND
CARMEN CAMARA*
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain
An in vivo experiment was conducted to evaluate the effects of sodium selenite, sepiolite, and bentonite on inorganic mercury (Hg) and methylmercury (MeHg) bioaccumulation. For this purpose 160 chickens were fed under different controlled conditions. Chickens were exposed to Hg(II) and MeHg added to feed with or without selenium or clays supplementation. No significant differences were observed in the voluntary intake and feed/gain conversion rates. The target organs of Hg(II) and MeHg in chickens were the liver and kidney, respectively, but the greatest body store was the muscle in both cases. A higher bioaccumulation for MeHg than for Hg(II) was observed. The results showed that addition of sodium selenite, sepiolite, or bentonite induced a decrease of up to 60-100% in the inorganic mercury bioabsorption. Bentonite addition to a MeHg-containing diet also caused a decrease in organic mercury bioaccumulation (29-67%). On the other hand, inorganic selenium and sepiolite did not decrease MeHg accumulation.
KEYWORDS: Selenium; mercury; bioaccumulation; chicken; animal feed; clays
INTRODUCTION
Mercury (Hg) is a widespread and persistent pollutant in the environment and is among the most highly bioconcentrated trace metals in the human food chain. Mercury toxicity, bioavailability, and environmental mobility are well-known to be highly dependent on its chemical form (1). Organic mercury compounds are of special concern because of their easier penetration through biological membranes, more efficient bioaccumulation, higher stability, and slower elimination from tissues (2) compared to inorganic mercury, and methylmercury (MeHg) is one of the most important Hg species in terms of bioaccumulation and risk. Selenium (Se) is an essential micronutrient for humans, a constituent of enzymes, and is also well-known for its potential in disease prevention (3). Several authors consider that selenium can act as a potential antagonist of mercury toxicity (4, 5), but the way in which it interferes with mercury is still uncertain; several mechanisms have been proposed to explain this interaction, although none of them is conclusive (6). Some of the more likely hypotheses are that Se may promote a redistribution of Hg from more sensitive organs (kidney, central nervous system) to less sensitive ones (muscle), that there is competition of Se for the same receptors, that complexes, such as tiemannite (7) or Se-Hg-S species, are formed (8) and that MeHg conversion into less toxic forms is promoted and oxidative damage prevented (9). During the past decade some contamination events of animal feed in Europe, such as a dioxin contamination episode in
* Author to whom correspondence should be addressed (e-mail [email protected]).
Belgium in May 1999, have been detected. Therefore, measures have been introduced by the European Union to protect and improve the quality of human health (10). Nowadays, fish meal is used as a source of protein in feed for poultry and swine (11) in Europe. Poultry, swine, and fish fed these meals could concentrate mercury to undesirable levels if care is not taken (12). Even low levels of fish meals containing mercury fed to swine and poultry can cause mercury accumulation in the flesh exceeding 0.03 mg kg-1, the maximum residue limit (MRL) in most countries for nonfish food stuffs (12). Actually, experiments in feeding fish meal to poultry have shown that tissue mercury accumulation correlates with the mercury concentration of the meal (13). Therefore, meat from animals fed fish meal or other fish products is likely to contribute to the exposure to mercury (11). In fact, such exposure could explain previous findings of unexpectedly high MeHg levels found in individuals with low fish consumption and a possible influence of chicken consumption on the concentration of MeHg in human umbilical cord blood (13). Removing Hg effects from contaminated foodstuffs remains a major problem. One approach could be to use non-nutritive adsorbing materials in the diet in order to bind Hg and reduce its absorption from the gastrointestinal tract or the use of agents that could act as antidotes or antagonize the toxic effect of Hg(II) and MeHg. Non-nutritive adsorbing materials such as cation exchangers (e.g., zeolites) have been previously used in the diet to bind Hg and reduce its absorption from the gastrointestinal tract (14). However, no data about the use of other non-nutritive adsorbing material such as clays has been published. Clays are characterized by their micrometer-sized particles, swelling properties, large surface areas, high cation exchange
10.1021/jf048267v CCC: $30.25 2005 American Chemical Society Published on Web 02/19/2005
2126
J. Agric. Food Chem., Vol. 53, No. 6, 2005
Cabanero et al.
Table 2. Composition of the Basal Diet Used in the Experiments
Table 1. Experimental Setup

treatment basal diet control + selenium (0.2 mg kg-1 in feed) + bentonite (2 g kg-1 in feed) + sepiolite (2 g kg-1 in feed) basal diet + Hg(II) [0.2 mg kg-1 in feed] control + selenium (0.2 mg kg-1 in feed) + bentonite (2 g kg-1 in feed) + sepiolite (2 g kg-1 in feed) basal diet + MeHg [0.2 mg kg-1 in feed] control + selenium (0.2 mg kg-1 in feed) + bentonite (2 g kg-1 in feed) + sepiolite (2 g kg-1 in feed) total no. of pens 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 20 total no. of chickens 8 8 8 8 16 16 16 16 16 16 16 16 160
ingredient barley wheat maize soyabean soja oil calcium carbonate dicalcium phosphate sodium chloride sodium carbonate DL-methionine Avizyme 1300 SV-5211-MxMa total analysis true metabolizable energy (kcal/kg) dry matter PB EE FB ash carbohydrates sugars calcium phosphorus available phosphorus Cl sodium lysine methionine methionine + cystine Thr Trp lysine av methionine + cystine av Thr av Trp av LI-C18:2 Na + KCl unsaturated saturated
042 days (%) 5.000 30.000 18.568 35.903 6.453 0.564 2.267 0.299 0.186 0.159 0.100 0.500 100.000 3075 88.55 22.18 8.50 2.63 6.28 32.57 4.64 0.91 0.75 0.45 0.22 0.18 1.23 0.55 0.93 0.84 0.28 1.07 0.82 0.69 0.24 4.60 260 6.95 1.20
capacity, chemical stability, and charge distribution. On the basis of their physical and chemical properties, these products are widely employed as additives (binders, anticaking agents, coagulants, lubricants, or agglomerate) in foodstuffs, although they are generally present as a minor component depending on the established regulation of each country (1-2% w w-1) (10). Recently a role as enhancer of the nutritive value of diets in ruminants and monogastric animals has been also proposed (15). The special characteristics of sepiolite make it ideal for use as an adsorbent for toxins, bacteria, and even viruses in the intestine (16), as pharmaceutical excipients, or as active ingredients (17), as well as lubricants of ground diets and as a pelleting agent during feed processing procedures. With these characteristics, it might promote significant modifications in the physical and chemical properties of digesta contents (15). Bentonite is used as an animal feed supplement and as a pelletizing aid in the production of the animal feed pellets, as well as a flowability aid for unconsolidated feed ingredients such as soy meal. It is also used in the removal of impurities in oils and as a clarification agent in drinks such as beer, wine, and mineral water. It also has been shown to reduce the toxic effect of aflatoxins contained in fish food (18). In this work several studies have been performed to evaluate, on the one hand, the mercury distribution and possible modifications in naturally occurring levels of Se and, on the other, the effect of Se, bentonite, and sepiolite administration on mercury distribution and bioaccumulation in broiler chickens.
EXPERIMENTAL PROCEDURES Animals, Diets, and Experimental Setup. One hundred and sixty 1-day-old Hybro-G female broiler chickens were used in this study. The birds were randomly assigned into 20 pens for treatment, each of 8 birds. All pens were bedded with a wood-shavings litter and equipped with feeders and waterers in an environmental chamber with 37.5 cm2 per bird. The chickens (during a study period of 42 days) were fed either with a common basal diet (control), formulated to contain all nutrients required, or with a diet supplemented with different compounds [Hg(II), MeHg, Se(IV), sepiolite, or bentonite] specified in Table 1. Ingredients and chemical composition of the basal diet are shown in Table 2. The diets and fresh water were offered ad libitum. Lights were on for 24 h during the first 3 days, after which a lighting schedule was applied consisting of 20 h of light and 4 h of darkness. The light intensity was reduced gradually during the experiment.
The chickens were weighed at 0, 21, and 42 days of age to determine gains in body weight and feed efficiency. Mortality was recorded as it occurred (Table 3). During the experiment, temperature and humidity were registered. These conditions were in accordance with animal welfare. The experimental design consisted of 12 different dietary treatments (Table 1), to evaluate the effect of selenium, sepiolite, and bentonite on mercury bioaccumulation. At the end of day 42, the experiment was finished. For evaluation of mercury bioaccumulation in the indicated cases, all birds were slaughtered. The carcasses were manually eviscerated, and the liver, skin, kidney, and muscle of each chicken were collected and stored individually at -18 C. The frozen organs from six animals/group were individually blended and oven-dried at 40 C for 2 days and stored at -18 C until analysis. Instrumentation. An atomic fluorescence spectrometer (AFS, Merlin 10.023, P. S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, U.K.) was used to determine the total mercury content. Mercury vapor was generated in a flow injection system using a multichannel peristaltic pump (Gilson, Villiers-le-be, France), a six-way injection valve (Omnifit, Cambridge, U.K.), and a gas-liquid separator. The separator was coupled to a commercial dryer membrane (Perma Pure Products, Farmingdale, NJ) to eliminate the moisture, and both together were used as an interface for CV-AFS. An atomic fluorescence spectrometer (AFS, Excalibur, P. S. Analytical Ltd.) was used to determine the total selenium content. Selenium hydride was generated in a flow injection system using a peristaltic pump (Gilson) and a gas-liquid separator. The separator was coupled to a commercial dryer membrane (Perma Pure Products) to eliminate the moisture, and both together were used as an interface for HG-AFS.
Hg Bioaccumulation in Chickens
2127
Table 3. Effect of Hg, MeHg, Se, Bentonite, and Sepiolite on Body Weight Gain and Food Conversiona
bird body wt (g), day 0 43 2 42 1 42 2 41 3 43 2 42 2 41 3 42 2 41 3 42 2 42 3 41 2 bird body wt gain (g), day 21 733 30 726 41 752 32 769 45 795 29 769 42 775 27 758 27 749 32 798 41 802 38 774 33 bird body wt gain (g), day 42 2426 98 2389 95 2405 78 2415 89 2451 85 2359 101 2464 90 2357 100 2472 91 2462 98 2452 96 2281 93 food conversion ratio [g of food (g of gain-1)], day 21 1.56 0.05 1.68 0.06 1.59 0.06 1.67 0.07 1.54 0.05 1.50 0.06 1.59 0.07 1.55 0.06 1.52 0.05 1.52 0.05 1.54 0.07 1.55 0.07 food conversion ratio [g of food (g of gain-1)], day 42 1.72 0.08 1.69 0.07 1.77 0.07 1.77 0.09 1.76 0.08 1.72 0.08 1.78 0.09 1.75 0.10 1.70 0.06 1.74 0.08 1.74 0.07 1.76 0.09 mortality (%) 12 12 0 12 6 0 0 0 6 6 0 6
treatment basal diet control + selenium + bentonite + sepiolite basal diet + CH3ClHg control + selenium + bentonite + sepiolite basal diet + HgCl2 control + selenium + bentonite + sepiolite
a
Results expressed as mean value SD.
For total Hg and Se determination, samples were microwave digested in double-walled advanced composite vessels using an oven with a power of up to 1000 W (MSP, CEM, Matthews, NC). Reagents. Mercury standards solutions were prepared by appropriate dilution of a stock mercury chloride solution [1000 mg Hg(II) L-1] (Merck, Darmstadt, Germany) and methylmercury chloride [1000 mg MeHg L-1] (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany) in deionized Milli-Q water (Millipore, Bedford, MA). These solutions were stored in amber vials at -18 C. Standards were prepared daily to reduce mercury losses by volatilization. Inorganic selenium solution was obtained by dissolving sodium selenite (Merck) in deionized Milli-Q water. Stock solutions of 10 mg Se(IV) L-1 were stored in the dark at 4 C. Working standard solutions were prepared daily by dilution. Sepiolite (Exal UE-562, Tolsa, S.A., Madrid, Spain) and bentonite (Toxisorb, Lohmann Animal Health GmbH & Co., Cuxhaven, Germany) were added to the basal diet. Stannous chloride (3% w v-1), used as a reducing agent for Hg(II) in CV-AFS, was prepared by dissolving the appropriate mass of stannous chloride, anhydrous (Merck), in 3 M hydrochloric acid that had been prepared by diluting 12 M hydrochloric acid (Merck) with ultrapure water. Sodium tetrahydroborate 0.5% (w v-1), used as a reducing agent for Se(IV) in HG-AFS, was prepared by dissolving NaBH4 powder (Merck, Steinheim, Germany) in deionized Milli-Q water, stabilized in 0.15% (w v-1) NaOH, and filtered to eliminate turbidity. H2O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) were used for acid digestion of samples. Argon (purity ) 99.999%, Carburos Metalicos, Barcelona, Spain) was used as a makeup gas, sheath gas at the transfer line, and carrier gas with AFS, respectively. Measurements. Total Mercury Quantification. To determine the total mercury content, the dry samples (50-200 mg) were digested with 1-2 mL of concentrated nitric acid and 0.5 mL of 35% hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power output. The pressure was held at 20 psi for 15 min, at 40 psi for 30 min, and finally at 85 psi for 1 h. Total mercury concentration was determined by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by the continuous mercury cold vapor system connected to AFS equipment. A flow rate of 2.5 mL min-1 (3 M hydrochloric acid) and a similar flow rate of the reductant solution (3% stannous chloride in 3 M hydrochloric acid) were used to generate the mercury cold vapor. Total Selenium Quantification. The samples followed the same acid digestion as mentioned for total mercury quantification. Se(VI) was reduced to Se(IV) by adding concentrated hydrochloric acid (6 M final concentration) to the digest and heating at 95 C for 1 h. The solutions were then diluted to 25 mL with Milli-Q water.
Total selenium concentration was determined by the continuous selenium hydride system connected to AFS equipment. A flow rate of 1.5 mL min-1 (3 M hydrochloric acid) and a similar flow rate of the reductant solution (1% sodium tetrahydroborate w v-1) were used to generate the selenium hydride. Validation of the Results. In the present work, two certified reference materials were employed for validation of the methodologies used. Method validation for mercury was performed by using the reference material CRM-463 (tuna fish), certified for methylmercury (2.85 ( 0.16 g g-1), from the Community Bureau of Reference of European Commission (BCR), whereas for total selenium a marine tissue reference material (Murst-ISS A2), certified for total selenium (7.37 ( 0.91 g g-1) from Institute for Reference Materials and Measurements, was used. Because, at the 95% confidence level, no significant differences were detected between the certified value and the experimental one [(2.86 ( 0.10 g of Hg g-1) and (7.41 ( 0.6 g of Se g-1)], the method used was considered to be accurate for total mercury and selenium determination. Statistical Analysis. A one-factor analysis of variance was applied to detect possible differences in total mercury and selenium between the different treatments studied. A significance level of P < 0.05 was adopted for all comparisons. Statgraphics Plus version 4.0 (Statistical Graphics) was used for the statistical analysis. RESULTS AND DISCUSSION
Feed Intake and Growth. Data presented in Table 3 show the effect of the 12 dietary treatments on body weight gain and feed conversion ratios of broilers at 0, 21, and 42 days of age. Neither selenium nor clays (sepiolite and bentonite) added to the basal diet had a significant effect on feed conversion. These data agree with the findings of other authors, who reported similar results for sepiolite and bentonite (15, 19-20). Furthermore, the results show that chickens fed with a mercury concentration of 0.2 mg kg-1 with or without Se and clays had similar weight gains up to 42 days. No differences were found in feed conversion among treatments and between groups on the 12 treatments (P < 0.05). Therefore, the inclusion of Hg(II), MeHg, Se(IV), bentonite, and sepiolite did not affect food conversion. Evaluation of Hg(II) and MeHg Bioaccumulation. To evaluate mercury bioaccumulation, total mercury content of the chickens fed Hg(II) and MeHg supplementation was determined (Table 4).
2128
Cabanero et al.
Table 4. Total Mercury Concentrations and Distribution Found in Fresh Weight Chicken Tissues after Hg(II) and MeHg Supplementation
treatment basal diet + Hg(II) (0.2 mg kg-1 in feed) chicken tissue kidney liver muscle skin total Hga (g kg-1) 85 24 22 4 63 1.1 0.5 distribution (%) 15 12 72 1 basal diet + MeHg (0.2 mg kg-1 in feed) total Hga (g kg-1) 190 70 304 36 113 27 33 9 distribution (%) 2 10 85 3
a Results of six independent chickens for each group. Three replicates for each measurement (mean value SD).
The total Hg contents in the chicken tissues were compared for the two groups to ascertain whether there was any difference in the accumulation process depending on tissue and Hg species exposure. Hg accumulation and distribution pattern were differentially affected by the species (P > 0.05), even though the diets had the same total Hg content (Table 4). Total mercury concentrations in the kidney and liver of the chicken treated with Hg(II) were 1 order of magnitude higher than those in muscle or skin. A similar situation was observed for MeHg except for the muscle. Assuming that 55.6% of carcass weight is muscle, 2.3% is liver, 0.7% is kidney, and 6% is skin and that Hg is evenly distributed throughout these tissues, 11.3 g of total Hg(II) and 180.4 g of total MeHg were bioaccumulated in the chickens analyzed. Therefore, this experimental animal study showed a higher MeHg bioavailability (20.7%) compared to Hg(II) bioavailability (1.3%). It was also noted that the greatest body store of Hg(II) and MeHg in chicken was the muscle, kidney being the target organ when Hg(II) was added to the diet and liver when MeHg was added. Therefore, we can conclude that Hg(II) is not highly bioaccumulated in chicken, kidney being the tissue most sensitive to inorganic mercury poisoning, as previously reported (6, 14, 21-23). This is due to its low gastrointestinal absorption and the fact that inorganic mercury accumulates in the proximal convoluted tubules of the kidney (24, 25), because the urinary route is one of the main pathways for its elimination (26). Meanwhile, methylmercury is almost completely absorbed from the gastrointestinal tract (24) and excreted to only a very limited extent (27), and as a result of MeHg attachment to sulfhydryl groups and binding to proteins on membranes and to enzymes (26, 28), a higher accumulation in the chicken is observed. All of the control groups showed no evidence of Hg contamination. Hg(II) and MeHg Bioavailability. A. Selenium Treatment. The protective effect of sodium selenite against the toxicity of mercuric chloride, when both compounds are co-administered, in mammals has been known for three decades. The first report on this subject was published by Parizek et al. (29), who reported on the alleviation of Hg(II) toxicity by sodium selenite simultaneously administered to rats, showing a protective effect against the renal necrosis and mortality caused by mercuric chloride. Since then, many studies dealing with this phenomenon have been published (6, 21, 23, 25, 30-35). To clarify the interaction between Se and Hg(II) and MeHg and to elucidate its significance, an experimental in vivo study has been carried out. In this particular case we tested Se as a possible antagonist of Hg in broiler chicken. The Hg levels bioaccumulated in liver, kidney, and muscle of chickens fed with Hg(II) and Se(IV) are shown in Figure 1.
Figure 1. Mercury bioaccumulation in chicken tissues after Hg(II), Hg(II)bentonite, Hg(II)sepiolite, and Hg(II)Se(IV) treatments: *, significant differences between Hg(II)-exposed chickens and [Hg(II) + bentonite]-, [Hg(II) + sepiolite]-, or [Hg(II) + Se]-exposed chickens (P < 0.05).
As can be seen, the addition of Se to the Hg(II)-containing diet significantly (P < 0.05) alleviated the adverse accumulation of Hg in chicken. The whole-body retention of mercury was drastically decreased, Hg concentration in all tissues being highly affected by Se administration, but the kidney remained the target organ. A drastic reduction in total Hg content between 60 (muscle) and 100% (skin) was observed, the highest concentrations in the kidney being 6 and 85 g kg-1 (wet weight) for chicken with and without Se treatment, respectively. Hence, not only Hg accumulation but distribution pattern (muscle, 89%; liver, 8%; and kidney 3%) compared to the previous distribution results from Table 4 was affected by the addition of sodium selenite. This fact is in agreement with other authors who assume that selenium protection must involve a change in the distribution of mercury on a subcellular level (6, 21).
Hg Bioaccumulation in Chickens
2129
Figure 2. Selenium bioaccumulation in chicken tissues after Hg(II), Hg(II)bentonite, Hg(II)sepiolite, and Hg(II)Se(IV) treatments: *, significant differences between control chickens and [Hg(II)]-, [Hg(II) + bentonite]-, [Hg(II) + sepiolite]-, or [Hg(II) + Se]-exposed chickens (P < 0.05).
As a consequence, selenium addition reduced mercury accumulation and promoted a redistribution of Hg from more sensitive organs (kidney, liver) to a less sensitive one (muscle). Therefore, Se influences tissue accumulation through tissuespecific mechanisms. Several studies on mice, rats, and pigs have shown that Se markedly reduced the mercury content in the kidneys but, in contrast, most of them showed a general trend toward increasing mercury levels in the liver (21, 23, 25). The addition of selenite to inorganic mercury diets also caused a shift in the tissue mercury distribution. The presence of Hg(II) did not cause a relevant effect on naturally occurring levels of Se bioaccumulation in liver, muscle, and skin (Figure 2). However, it did affect Se accumulation in kidney, but bioaccumulation order (kidney > liver > muscle > skin) remained unaltered.
On the other hand, the addition of Se to the Hg(II)-containing diet affected the Se bioaccumulation in all tissues. Taking into account that 90% of the total Se has been found to be selenomethionine (SeMet) in the feed used for the target chicken, a possible interaction among SeMet, Hg, and Se(IV) may explain the differences found in Se bioaccumulation under the two different treatments previously described. In fact, the response of animals (rats, chicks) to inorganic mercury after the administration of selenite has been found to be more immediate than that with selenate or selenomethionine (31, 33), but no studies on selenite, selenomethionine, and inorganic mercury presented simultaneously in food have been reported to date. Furthermore, unlike what happened with Hg accumulation, the Se distribution pattern remained unchanged (muscle, 8284%; liver, 7-10%; and kidney, 8-9%) in the control group, Hg(II) group, and Hg(II) + Se group. Therefore, mercury inhibited selenium absorption without altering the whole-body distribution of selenium. Although the mechanism of this finding is not clear, the results are similar to earlier papers showing that dietary exposure to other toxic metal significantly reduces the absorption of selenite in chicks (31, 36, 37). The protective effect of sodium selenite used in this study against the toxic accumulation of Hg(II) was as great as had been predicted. Therefore, these improvements should contribute to a solution of a possible inorganic mercury problem in poultry. In addition, the antagonism by Se of the toxicity of inorganic mercury and its detoxifying effect on MeHg attracted the attention of many scientists in heavy metal toxicology (32). Ganther et al. were the first to report the interaction of MeHg and Se. Their results clearly showed the alleviating effects of Se on MeHg-induced mortality and the suppression of weight gain in rats. The results of several studies also suggest that when Se is co-administered with MeHg, the fetotoxicity, neurotoxicity, or developmental toxicity of MeHg is alleviated (38). Although many studies on the fate of MeHg in animals have been performed, the mechanisms regulating distribution in tissues and excretion have not yet been examined in detail. Thus, as outlined above, the interactions between Se and MeHg in broiler chickens has been evaluated in this study. In Figure 3 the mean values of MeHg expressed as total mercury concentration found in the liver, kidney, and muscle are presented. As can be seen, the addition of Se to the MeHgcontaining diet did not affect the mercury accumulation in kidney (P < 0.05), but Hg concentration in liver and muscle was highly affected by Se administration (as selenite), with the liver remaining as the target organ. Under selenite administration, organic Hg concentration in muscle reached kidney levels and 2.8-fold higher bioaccumulation was found in the liver. Despite this, selenium did not significantly change the relative mercury distribution (muscle, 83-84%; liver, 15-16%; and kidney, 1%) in the MeHg and MeHg + Se groups, respectively. The effect of Se on MeHg accumulation was different from that expected, with an increase in its accumulation especially in liver. It is known that Se reduces the biliary secretion of MeHg. Urano et al. (40) suggested that the decrease in biliary secretion of MeHg induced by Se may result from inhibition of the pathway for secretion of MeHg from liver to bile, rather than the formation of a complex between methylmercury and selenium. Se may specifically inhibit the activity of the canalicular transporter(s) involved in active transport of GSH from liver to bile (40). As a result, a slow biliary excretory
2130
Cabanero et al.
Figure 4. Selenium bioaccumulation in chicken tissues after MeHg, MeHg Figure 3. Mercury bioaccumulation in chicken tissues after MeHg, MeHg
bentonite, MeHgsepiolite, and MeHgSe(IV) treatments: *, significant differences between MeHg-exposed chickens and [MeHg + bentonite]-, [MeHg + sepiolite]-, or [MeHg + Se]-exposed chickens (P < 0.05).
bentonite, MeHgsepiolite, and MeHgSe(IV) treatments: *, significant differences between control chickens and [MeHg]-, [MeHg + bentonite]-, [MeHg + sepiolite]-, or [MeHg + Se]-exposed chickens (P < 0.05).
process would retard whole-body elimination of the metal and favor, thus, its accumulation (41). Therefore, this inhibitory effect of selenium could be due to a MeHg detoxification pathway involving the liver. Similar results have been previously reported (40, 42-47) in which the hepatic Hg level in rats, quails, hens, and mice also increased by the presence of Se. The presence of MeHg did not cause a relevant effect on naturally occurring levels of Se bioaccumulation (Figure 4). In contrast, the addition of Se to the MeHg-containing diet (Figure 4) did not affect the Se accumulation in kidney, muscle, and skin, but Se concentration in liver, was increased, with the kidney as the target organ. Furthermore, unlike what happened with inorganic mercury, the Se accumulation pattern was affected when MeHg (muscle, 78%; liver, 11%; and kidney,
10%) or MeHg + Se (muscle, 77%; liver, 14%; and kidney, 9%) was added to chicken feed, in comparison to the control group (muscle, 84%; liver, 7%; and kidney, 9%). Hence, MeHg promoted Se redistribution from muscle to the liver, suggesting that a mercury-selenium interaction occurred in this organ. This fact also indicates a possible correlation of MeHg and Se, when both are co-administered. The data presented here emphasize that the relationship between Se and Hg, whereby Hg metabolism by animals is modified, is quite complex and not well understood. B. Clays Treatment. In this study the evaluation of the capacity to reduce Hg(II) and MeHg accumulation of two different clays (bentonite and sepiolite) was performed. Results for inorganic mercury are detailed in Figure 1. Sepiolite and bentonite incorporation at 2 g kg-1 of feed significantly reduces the concentration of Hg in all chicken
Hg Bioaccumulation in Chickens tissues [between 64 (muscle) and 100% (skin)], the best results being for bentonite (81-100%). Results similar to those reported in the present study were found in a study where 5% clipnoptilolite dietary supplement was added to feed enriched with Hg (14). However, the presence of clays in the diet considerably decreases the natural Se content found in the different tissues tested (Figure 2), but the bioaccumulation order remained unaltered, kidney > liver > muscle > skin. Consequently, we concluded that sepiolite and bentonite supplementation may greatly diminish Hg(II) bioaccumulation on broiler chicken. Therefore, these clays could act as promising mercury protectors at low cost. With regard to MeHg, the results of this experiment are summarized in Figure 3. Sepiolite and bentonite have remarkably different behaviors on MeHg bioaccumulation in broiler chickens. A significant interaction (P < 0.05) between bentonite and MeHg is observed in the kidney and muscle, where MeHg expressed as total Hg content was reduced 67 and 29%, respectively, whereas the mercury found in the liver remained unaltered. On the other hand, the addition of sepiolite to the MeHgcontaining diet did not affect Hg accumulation in kidney, but Hg concentration in liver, muscle, and skin was highly affected, the liver being the target organ. Hg concentration in muscle exceeds in this case the levels found in liver without clay addition, leading to 2.6-fold higher bioaccumulation. As a consequence, sepiolite addition seems to cause an effect on MeHg accumulation similar to that Se addition had on MeHg accumulation. On the other hand, Se bioaccumulation was not reduced (Figure 4), in contrast to what happened when clay and Hg(II) were added to the diet. In conclusion, this study shows that the addition of bentonite to the diet can be beneficial to chickens consuming MeHgcontaminated food. In addition, further studies targeted on Hg are proposed to clarify whether sepiolite enhances MeHg accumulation or MeHg conversion into less toxic forms affects their further accumulation.
ACKNOWLEDGMENT
2131
We thank Almudena Anton and Angel Fernandez for their contribution to this work (obtaining, identifying, and collecting of the samples).
LITERATURE CITED (1) Ro-Segade, S.; Bendicho, C. Ultrasound-assisted extraction for mercury speciation by the flow injection-cold vapor technique. J. Anal. At. Spectrom. 1998, 14, 263-268. (2) Tao, G.; Willie, S. N.; Sturgeon, R. E. Determination of total mercury in biological tissues by flow injection cold vapor generation atomic absorption spectrometry following tetramethylammonium hydroxide digestion. Analyst 1998, 123, 1215-1218. (3) Pyrzynska, K. Analysis of selenium species by capillary electrophoresis. Talanta 2001, 55, 657-667. (4) Egeland, G. M.; Middaugh, J. P. Balancing fish consumption benefits with mercury exposure. Science 1997, 278, 1904-1905. (5) Ebdon, L.; Pitts, L.; Cornelis, R.; Crews, H.; Donard, O. F. X.; Quevalliller, P. Trace Element Speciation for EnVironment and Health, 1st ed.; Royal Society of Chemistry: Cambridge, U.K., 2001. (6) Cuvin-Aralar, M. A. A.; Furness, R. W. Mercury and selenium interaction: a review. Ecotoxicol. EnViron. Saf. 1991, 21, 348364.
(7) Das, K.; Jacob, V.; Bouquegneau, J. M. White-sided dolphin metallothioneins: purification, characterisation and potential role. Comp. Biochem. Physiol. Part C 2002, 131, 245-251. (8) Gailer, J.; George, G. N.; Pickering, I. J.; Madden, S.; Prince, R. C.; Yu, E. Y.; Denton, H. S.; Younis, H. S.; Aposhian, H. V. Structural basis of the antagonism between inorganic mercury and selenium in mammals. Chem. Res. Toxicol. 2000, 13, 11351142. (9) Hoffman, D. J.; Heinz, G. H. Effects of mercury and selenium on glutathione metabolism and oxidative stress in mallard ducks. EnViron. Toxicol. Chem. 1998, 17, 161-166. (10) Abad, E.; Llerena, J. J.; Saulo, J.; Caixach, J.; Rivera, J. Comprehensive study on dioxin contents in binder and ant-caking agent feed additives. Chemosphere 2002, 46, 1417-1421. (11) Lindberg, A.; Ask Bjornberg, K.; Vahter, M.; Berglund, M. Exposure to methylmercury in non-fish-eating people in Sweden. EnViron. Res. 2004, 96, 28-33. (12) Savage, G. P. Mercury in fish and fishmeals. Trace Elements: Roles and Risks. Proceedings of the New Zealand Trace Elements Group Conference; 1992; pp 11-22. (13) Ask Bjornberg, K.; Vahter, M.; Petersson-Grawe, K.; Glynn, A.; Cnattingius, S.; Darnerud, P. O.; Atuma, S.; Aune, M.; Becker, W.; Berglund, M. Methylmercury and inorganic mercury in Swedish pregnant women and in cord blood: influence of fish consumption. EnViron. Med. 2003, 111, 637-641. (14) Lysenco, M. Prevention of mercury accumulation in broiler organs. Poult. Int. 2000, 38-39. (15) Ouhida, I.; Perez, J. F.; Piedrafita, J.; Gasa, J. The effects of sepiolite on broiler chicken diets of high, medium and low viscosity. Productive performance and nutritive value. Anim. Feed Sci. Technol. 2000, 85, 183-194. (16) Martindale, W. The Extra Pharmacopoeia, 28th ed.; Pharmaceutical Press: London, U.K., 1982; p 2025. (17) Viseras, C.; Lopez-Galindo, A. Pharmaceutical application of some Spanish clays (sepiolite, palygorskite, bentonite): some preformulation studies. Appl. Clay Sci. 1999, 14, 69-82. (18) Kececi, T.; Oguz, H.; Kurtoglu, V.; Demet, O. Effects of polyvinylpolypyrrolidone, synthetic zeolite and bentonite on serum biochemical and haematological characters of broiler chickens during aflatoxicosis. Br. Poult. Sci. 1998, 39, 452458. (19) Ouhida, I.; Perez, J. F.; Gasa, J. Sepiolite (exal) decreases microbial colonization in the gastrointestinal tract of young broilers fed barley-wheat based diets. Arch. Zootec. 2000, 49, 501-504. (20) Santurio, J. M.; Mallmann, C. A.; Rosa, A. P.; Appel, G.; Heer, A.; Dageforde, S.; Bottcher, M. Effect of sodium bentonite on the performance and blood variables of broiler chickens intoxicated with aflatoxins. Br. Poult. Sci. 1999, 40, 115-119. (21) Potter, S.; Matrone, G. Effect of selenite on the toxicity of dietary methylmercury and mercuric chloride in the rat. J. Nutr. 1974, 104, 638-647. (22) Pribilncova, J.; Marettova, E.; Kosucky, J.; Maretta, M. The effect of phenyl mercury on reproductive performance in laying hens. Acta Vet. Hung. 1996, 44, 377-387. (23) Hansen, J. C.; Kristensen, P.; Al-Masri, S. N. Mercury/selenium interaction. Nord. Vet-Med. 1981, 33, 57-64. (24) Morel, F. M. M.; Kraepiel, A. M. L.; Amyot, M. The chemical cycle and bioaccumulation of mercury. Annu. ReV. Ecol. Syst. 1998, 29, 543-566. (25) Frisk, P. Expressions of mercury-selenium interaction in vitro. Comprehensive summaries of Uppsala dissertations from the faculty of medicine, Uppsala, Sweden. Acta UniV. Uppsaliensis 2001, 988. (26) Clarkson, T. W. The toxicology of mercury. Crit. ReV. Clin. Lab. Sci. 1997, 34, 369-403. (27) Rahman, L.; Corns, W. T.; Bryce, D. W.; Stockwell, P. B. Determination of mercury, selenium, bismuth, arsenic and antimony in human hair by microwave digestion atomic fluorescence spectrometry. Talanta 2000, 52, 833-843.
2132
Cabanero et al.
methylmercury added to diets containing tuna. Science 1972, 175, 1122-1124. Urano, T.; Imura, N.; Naganuma, A. Inhibitory effect of selenium on biliary secretion of methylmercury in rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 239, 862-867. Storelli, M. M.; Marcotrigian, G. O. Mercury speciation and relationship between mercury and selenium in liver of Galeus melastomus from the Mediterranean Sea. Bull. EnViron. Contam. Toxicol. 2002, 69, 516-522. El-Begearmi, M. M.; Sunde, M. L.; Ganther, H. E. A mutual protective effect of mercury and selenium in Japanese quail. Poult. Sci. 1977, 56, 313-322. Sell, J. L.; Gorani, F. G. Influence of selenium on toxicity and metabolism of methylmercury in chicks and quail. Nutr. Rep. Int. 1976, 14, 439-447. Heinz, G. H.; Hoffman, D. J. Methylmercury chloride and selenomethionine interactions on health and reproduction in mallards. EnViron. Toxicol. Chem. 1998, 17, 139-145. Johnson, S.; Pond, W. G. Inorganic vs organic Hg toxicity in growing rats: Protection by dietary Se but not Zn. Nutr. Rep. Int. 1974, 9, 135-147. Emerick, R. J.; Palmer, I. S.; Carlson, C. W.; Nelson, R. A. Mercury-selenium interrelationships in laying hens. Fed. Prot. 1976, 35, 577. Nielsen, J. B.; Andersen, O. The toxicokinetics of mercury in mice offspring after maternal exposure to methylmercuryseffect of selenomethionine. Toxicology 1992, 74, 233-241.
(28) Graeme, K. A.; Pollack, C. V. Heavy Metal Toxicity, Part I: Arsenic and Mercury. J. Emerg. Med. 1998, 16, 45-56. (29) Parizek, J.; Ostadalova, I. The portective effect of small amounts of selenite in sublimate intoxication. Experientia 1967, 23, 142143. (30) Watanabe, C. Modification of mercury toxicity by selenium: practical importance? Tohoku J. Exp. Med. 2002, 196, 71-77. (31) Mykkanen, H. M.; Metsaniitty, L. Selenium-mercury interaction during intestinal absorption of 75Se compound in chicks. J. Nutr. 1987, 117, 1453-1458. (32) Imura, N.; Naganuma, A. Possible mechanism of detoxifying effect of selenium on the toxicity of mercury compounds. In AdVances in Mercury Toxicology; Suzuki, T., Ed.; Plenum Press: New York, 1991; pp 275-288. (33) Parizek, J.; Benes, I.; Ostadalov, I.; Babicky, A.; Benes, J.; Lener, J. Metabolic interrelations of trace elements the effect of some inorganic and organic compouds of selenium on the metabolism of cadmium and mercury in the rat. Physiol. BohemosloV. 1969, 18, 95-103. (34) Kossakowski, S.; Grosicki, A. Interaction between mercury and macro- and microelements in animals. Pol. J. EnViron. Stud. 1996, 5, 5-9. (35) Grosicki, A.; Kowalski, B. Lead, cadmium and mercury influence on selenium fate in rats. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2002, 46, 337343. (36) Mykkanen, H. M.; Humaltoja, T. Effect of lead on the intestinal absorption of sodium selenite and selenomethionine in chicks. Biol. Trace Elem. Res. 1984, 6, 11-17. (37) Jensen, L. S. Modification of selenium toxicity in chicks by dietary silver and copper. J. Nutr. 1975, 105, 769-775. (38) Naganuma, A.; Ishii, Y.; Imura, N. Effect of administration sequence of mercury chloride and sodium selenite on their fates and toxicities in mice. Ecotoxicol. EnViron. Saf. 1984, 8, 572580. (39) Ganther, H.; Goudie, C.; Sunde, M.; Kopecky, M.; Wagner, S.; Hoekstra, W. Selenium: relation to decreased toxicity of
(40)
(41)
(42)
(43)
(44)
(45)
(46)
(47)
Received for review October 19, 2004. Revised manuscript received December 22, 2004. Accepted December 23, 2004. We gratefully acknowledge financial support from FUNDISA. We thank Complutense University for its support through a predoctoral fellowship of A.C.
JF048267V
2. ESTUDIO DE LA ACUMULACIN DE SELENIO Y SU INTERACCION CON Hg MEDIANTE EL USO DE CV-AFS, ICP-MS Y HPLC-ICP-MS
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Selenium long-term administration and its effect of mercury toxicity
SELENIUM LONG-TERM ADMINISTRATION AND ITS EFFECT ON MERCURY TOXICITY
INTRODUCTION
Nowadays selenium (Se) is recognised as an essential micronutrient for animals and humans. To date, the major biological functions of selenium are attributed it its antioxidative properties, its role in the regulation of thyroid hormone metabolism and cell growth1. Although a variety of benefits of Se to human health have been reported2, Se is also considered to be a toxic element at high concentrations. The most important sources of selenium for human beings in the diet are cereals, meat and fish. In fact, meat and fish appear to make rather stable contributions of selenium, generally around 40-50% of the total Se ingested3. It has been established that Se in food occurs in diverse chemical forms with different bioavailability. Therefore, the interest in total selenium and species content in meat samples of high consumption, as well as its bioavailability, is of special concerned. The absorption, distribution and elimination of selenium in animals and humans can be markedly affected by nutritional and environmental factors4. In fact, there is abundant evidence for protective effect of selenium against heavy metal action in the body, which, consequently, can cause a change in its metabolism. Therefore, in vivo interaction between dietary Se compounds (or their metabolites) and toxic metals are particularly important from a toxicological point of view. Interaction of Se with mercury (Hg), one of the most hazardous environmental pollutants in the environment, has long been investigated, yet it is still incompletely understood5. As reported by Parizek and Ostadalova6, and subsequently confirmed by many other researchers, simultaneous administration of selenite counteracts the negative impacts of exposure to mercury, particularly in regard to neurotoxicity, fetotoxicity and developmental toxicity7. In addition to the antagonism by selenium of the toxicity of inorganic mercury, its detoxifying effect on methylmercury (MeHg) has attracted attention of many scientists in heavy metal toxicology8. Several researchers discussed a few possibilities of the protective role of Se against Hg toxicity, including the redistribution of Hg in the tissues9,10,11, the competition for binding sites12, and the formation of Hg-Se complexes13,14. However, there are controversial results on Se involvement in Hg detoxification, which is of prime concern to humans and animals for toxicological reasons. Most studies have been conducted on the interactions between Hg and Se in mammals and fish systems. In marine mammals and seabirds, mercury is taken up from their diet
mainly as methylmercury is then transformed into a less toxic form, inorganic mercury, in their bodies. Hence, the large fraction of mercury stored at high concentration in the liver is inorganic Hg15. It has been suggested that selenium is involved in the protection of the organism against Hg intoxication16 detoxifying MeHg by forming complexes containing the two elements at an equimolar ratio. In fact, mercuric selenide (HgSe) has been found in the liver of some species of marine mammals and seabirds . This compound is assumed to be an inert end product of the detoxification process in these marine animals . In this work, as part of an ongoing study of Se bioaccumulation and bioaccesibility through the plant-animal-human food chain, Se quantification and speciation of feed and chicken samples and the subsequent in vitro enzymolyis of the sample was carried out. In addition, in order to evaluate the possible antagonistic effect of selenium on mercury toxicity and to obtain insights into the detoxification mechanism of mercury by selenium, some experiments have been conducted in presence of inorganic mercury and MeHg.
EXPERIMENTAL
ANIMALS, DIETS AND EXPERIMENTAL SETUP Seventy two, 1-day-old Hybro-G female broiler chickens were used in this study. The birds were randomly assigned, into 20 pens for treatment, each of 8 birds. All pens were bedded with a wood-shavings litter and equipped with feeders and waterers in an environmental chamber with 37.5 cm2 per bird. The chickens (during a study period of 42 days) were fed either with a common basal diet (control), formulated to contain all nutrients required, or with a diet supplemented with different compounds (Hg(II), MeHg, Se(IV)) specified in Table 1. The diets and fresh water were offered ad libitum. The average drinking water consumption was 8.6 l and the food intake was approximately 4.3 kg of feed. The chickens were weighed at 0, 21 and 42 days of age to determine gains in body weight and feed efficiency. During the experiment, temperature and humidity were registered. These conditions were in accordance with animal welfare. The experimental design consisted of 6 different dietary treatments, in order to evaluate the effect of selenium on mercury bioaccumulation. For evaluation of mercury, selenium and other metals bioaccumulation in the indicated cases, all birds were slaughtered after 42 days. The carcasses were manually eviscerated and the liver and kidney of each chicken were collected and stored individually at 18 C.
INSTRUMENTATION An atomic fluorescence spectrometer (AFS, Merlin 10.023, P.S. Analytical Ltd., Orpington, Kent, UK) was used to determine the total mercury content. Mercury vapour was generated in a flow injection system using a multi-channel peristaltic pump (Gilson, Villiers-le-be, France), a six-way injection valve (Omnifit, Cambridge, UK) and a U-tube-gas-liquid separator. The separator was coupled to a dryer membrane (Perma Pure Products, Farmingdale, NJ, USA) to eliminate the moisture, and both together were used as an interface for CV-AFS. An inductively coupled plasma mass spectrometer, (ICP-MS, HP-4500 Plus, Tokyo, Japan) fitted with a Babington nebulizer and a Scott double-pass spray chamber cooled by a Peltier system was used for total selenium determination and selenium detection after chromatographic separation. Before coupling the chromatographic system, the ICP-MS working conditions were optimised, using a standard solution containing elements spanning the mass range from beryllium to uranium, at a 10 g l-1 level. The chromatographic system used consisted of a PU-2089 HPLC pump (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) fitted with a six-port sample injection valve (model 7725i, Rheodyne, Rohner Park, CA, USA) with a 100 X200 (10 L injection loop was used for chromatographic experiments. Selenium speciation was performed in a Hamilton PRPm, 250 mm x 4.1 mm i.d.) (Reno, NV, USA) cation exchange column. The chromatographic system was coupled to the ICP-MS by a 5 cm polytetrafluoroethylene capillary tubing (0.5 mm i.d.) running from the column outlet to the Babington nebuliser inlet. 10 kDa cut-off filters (Millipore, MA) and an Eppendorf (Hamburg, Germany) Centrifuge 5804, F34-6-38 were used as a clean-up method. For total Hg and Se determination, samples were microwave digested in double-walled advanced composite vessels using a 1000 W Microwave Sample Preparation System (MSP) microwave oven (CEM, Mattheus, NC, USA).
REAGENTS Inorganic selenium solutions were obtained by dissolving sodium selenite and sodium selenate (Merck, Darmstadt, Germany) in deionised Milli-Q water (18.2 M cm) obtained from a Millipore Milli-Q water purification system (Millipore, Ohio, USA). Selenoaminoacids (SeCys2 and SeMet) were purchased from Sigma and dissolved in 3% (v/v) HCl and deionised Milli-Q water (Millipore), respectively. Stock solutions of 10 mg l1 were stored in the dark at 4C and working standard solutions were prepared daily by dilution.
For HPLCICP-MS studies, the mobile phase was 4mM pyridine (Merck) formate in 3% methanol (SDS, Barcelona, Spain). For the enzymatic hydrolysis procedure, TrisHCl and the non-specific protease Streptomyces griseus (Pronase E) (Merck) were used to prepare the chicken tissue samples. Enzymes and bile salts were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA): pepsin (Porcine; catalogue no. P-7000), pancreatin (Porcine; catalogue no. P-1750), and bile salts (catalogue no. B-8756). Germany) (catalogue no.1329). Mercury standards solutions were prepared by appropriate dilution of a stock mercury chloride solution (1000 mg Hg(II) L-1) (Merck, Darmstadt, Germany) and methylmercury chloride (1000 mg MeHg L-1) (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany) in deionised Milli-Q water (Millipore, Ohio, USA). These solutions were stored in amber vials at 18 C. Standards were prepared daily to reduce mercury losses by volatilization. Stannous chloride (3% w v-1), used as a reducing agent for Hg(II) in CV-AFS, was prepared by dissolving the appropriate mass of stannous chloride, anhydrous, (Merck, Darmstadt, Germany) in 3M hydrochloric acid that had been prepared by diluting 12 M hydrochloric acid (Merck, Darmstadt, Germany) with ultrapure water. H2O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) were used for acid digestion of samples. Argon (purity 99.999 %, Carburos Metlicos, Spain) was used as a make up gas, sheath gas at the transfer line and as carrier gas with AFS, respectively. -Amylase was purchased from Merck (Darmstadt,
MEASUREMENTS
Total selenium quantification To determine the total selenium content, the dry samples (50-200 mg) were digested with 1-2 mL of concentrated nitric acid and 0.5 mL of 35% hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power output. The pressure was held at 20 psi for 15 min, at 40 psi for 30 min and finally at 85 psi for 1 hour. The total selenium concentration was determined by ICP-MS. For this purpose, the isotopes
78
Se and
82
Se were monitored.
103
Rh was used as an internal standard. Total
selenium concentration was determined by both, external and standard addition calibrations of the signal obtained by ICP-MS.
Selenium speciation Portions of 150 mg of the dry samples were enzymatically hydrolyzed following a previously developed method17. The extracts obtained were processed through 10 kDa mass cut-off filters, diluted to 10 mL and analysed by cation exchange chromatography coupled to ICPMS, under the operating conditions given in Table 2. The analytical peaks were evaluated in terms of peak area by a standard addition calibration method at m/z 78 and 82.
In vitro gastrointestinal digestion method The in vitro digestion method used was based on that described by Luten et al.18, modified and adapted for the chicken being studied. About 50 g of sample were placed in a 250 mL Erlenmeyer flask with 150 mL of gastric juice (6% w v-1 pepsin in 0.15M NaCl, acidified with HCl to pH 1.8) and shaken for 1 min for initial degassing. The mixtures were then held in a thermostatic water bath for 4 h at 37 C, shaking periodically. After 1 h the pH was checked and adjusted to 3 with 6M hydrochloric acid. After gastric digestion, saturated sodium bicarbonate was added to raise the pH to 6.8. Then 100 mL of intestinal juice (1.5%, w v-1 pancreatin, 0.5%, w v-1 amylase and 0.15%, w v-1 bile salts, in 0.15M NaCl) were added and the mixture was energetically shaken for 1 min and left in a thermostatic water bath for 4 h at 37 C, shaking periodically. Once gastric/ gastrointestinal digestion was completed, a 10 mL aliquot of the suspension was transferred to a polypropylene tube and centrifuged at 1575g for 1 h. The supernatant was filtered through a 0.45 m Millipore filter, to reduce any effect from microbial activity and both supernatants and precipitates were stored in the dark at 4 C until analysis. Gastric and intestinal digestion blanks were obtained by adding 150 mL of gastric juice to 50 mL of Milli-Q water and 100 mL of intestinal juice respectively, and the above procedure was applied.
Total mercury quantification The samples followed the same acid digestion as mentioned for total selenium quantification. Total mercury concentration was determined by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by the continuous mercury cold vapour system connected to AFS equipment. A flow rate of 2.5 mL min-1 (3M hydrochloric acid) and a
similar flow rate of the reductant solution (3% stannous chloride in 3M hydrochloric acid) were used to generate the mercury cold vapour.
Mercury speciation Mercury leaching was performed following an acid leaching procedure developed previously19. Afterwards, the total organomercury content in the supernatants was determined by difference between total mercury content (after digestion with HNO3) and inorganic mercury content by using stannous chloride as a selective redundant.
Validation of the results In the present work, two certified reference materials were employed for validation of the methodologies used. Method validation for mercury was performed by using the reference material CRM-463 (tuna fish), certified for methylmercury (2.85 + 0.16 g g-1), from the Community Bureau of Reference of European Commission (BCR), while for total selenium a marine tissue reference material (Murst-ISS A2), certified for total selenium (7.37 + 0.91 g g-1) from Institute for Reference Materials and Measurements was used.
RESULTS AND DISCUSION
EVALUATION ON Se BIOACCUMULATION In an attempt to improve our understanding of the transfer process of selenium along the trophic chain, the uptake of selenium in chickens from feed was evaluated. During the assays chickens were fed animal feed of vegetal origin. In order to asses selenium uptake, total selenium content of the chickens feed and chicken tissues (liver, kidney and muscle) as well as its speciation was carried out by ICP-MS and LC-ICP-MS, respectively. The mean selenium concentration in chicken ranged from 0.23 mg g-1 in muscle to 1.6 mg g-1 in kidney, being the skeletal muscle the largest body pool of Se (Table 3).
The enzymatic digestion specified in the procedure section followed by ultrafiltration with 10 kDa cut-off filters was applied to the chicken feed and chicken samples in order to identify and quantify the seleno-amino acids and inorganic Se species. For chicken feed no selenium losses were detected in this step (Se recoveries 93-97%), which indicates that the molecular weigh of most of the selenium species extracted during the hydrolysis was lower than 10 kDa. On the other hand, selenium recoveries for chicken tissues were not quantitative, so during the enzymatic hydrolysis of proteins, some selenium remained in peptide form. The analysis was carried out by cation exchange chromatography. The identification and quantification were performed by the standard addition method using two different chromatographic conditions. A standard chromatogram at each pH value and the chromatogram obtained after enzymatic hydrolysis are shown in Fig 1 and 2. Two peaks could be differentiated in all the samples. The first peak was unidentified, it could not be attributed to any of the selenium species tested. The second peak was identified as SeMet, the only seleno-amino acid found in all samples. The identification of the peaks was carried out by the spiking procedure. The same chromatographic profiles were obtained by the two chromatographic method used (at pH 2.8 and 4.7). The results from the speciation analyses of the samples are shown in Table 3. The amount of SeMet varied depending on the type of sample. In the chicken feed the main selenium-species found was SeMet (90% of total Se). Therefore we can conclude that the chemical form of Se consumed by the animals used in this study was mostly SeMet. According to the literature, plants such as cereals and forage crops convert Se predominantly into SeMet20 and incorporate it into protein in place of methionine21. Therefore, in nature animals receive Se mainly in the form of selenomethionine. Taking into account that the main components of the feed were: corn, wheat and soybeans, the value found is comparable with other SeMet data found in this type of cereal . Intake of dietary SeMet is reflected in the SeMet content of the chicken. SeMet is incorporated into tissue proteins especially in the skeletal muscles (96%) and the liver, according to yet published data20,21,22. Each chicken consumed approximately 4.3 kg of feed throughout the feeding period. Therefore, 3.24 g of total Se and 2.94 g of SeMet were ingested. Assuming that 55.6% of carcass weight is muscle, 2.3% is liver and 0.7% is kidney and Se is evenly distributed throughout these tissues, 365 g of total Se and 168 g of total SeMet were bioaccumulated in the chickens analyzed. Therefore, this experimental animal study showed that 12% and 5.6% of the ingested Se was accumulated in the evaluated tissues as total Se and as SeMet, respectively. It was also noted that the greatest body store of Se
and SeMet in chicken was the muscle, being kidney and the liver the target organ of total Se and SeMet, respectively. Since higher animals are unable to synthesise SeMet, any detectable amount in the organs and tissues must arise only from dietary sources. As a result, SeMet is incorporated into chicken tissue proteins in place of Met. This allows Se to be stored in the organism and reversibly released by normal metabolic processes, thus offering an advantage over other se compounds. Any SeMet that is not immediately metabolised is incorporated into organs with high rates of protein synthesis such as the skeletal muscles, liver, kidney.
SELENIUM BIOACCESSIBILITY The role of Se in human nutrition is an important topic of recent research and it is well recognised that adequate dietary Se is an important determinant of human health23. In some countries (e.g. the USA) 50% of the total Se in the typical diet is provided by beef, white bread, pork, chicken and eggs. This means that poultry products are among the major Se sources for humans24. Se status relies on the dietary selenium intake and the element bioavailability. Therefore, total selenium and species determination in chicken meat (muscle) is of special concern because of its high consumption and its important contribution to the Se status of humans. Unfortunately the total concentration of Se in food does not provide information about its bioavailability. The extent of the toxic or beneficial effects caused by Se is not governed by their total concentration, but rather regulated by the forms of the metal that can efficiently interact with sites on the biological ligands25. Consequently, total determination and speciation of Se in the gastrointestinal tract is essential to understand and predict its availability for absorption26. In order to study Se bioaccessibility from human diet an in vitro enzymolysis simulating the human gastrointestinal digestion was carried out. The recoveries of endogenous Se from chicken muscle in the gastric supernatant (pH 2.0) did not differ significantly (P<0.05) from the gastrointestinal supernatant (pH 6.8). 43 + 3% and 40 + 5% of total Se was found bioaccessible in the simulated stomach and intestinal digestion, respectively. The percentage of ultrafilterable (<10 kDa) selenium (23% of total Se) following simulated gastrointestinal digestion of chicken muscle showed an important decrease in the bioaccessible fraction, which means that the in vitro digestion was not completely effective in breaking down the peptides or proteins in smaller fractions, so some selenium may have remained in peptide form.
A mass balance was performed after application of the in vitro digestion method. Both the soluble fraction and non-soluble fraction resulting from application of the in vitro digestion method were analysed. The mass balance result for se was 96 + 8%. In order to evaluate whether the in vitro digestion method employed keeps the integrity of the selenium species present in the initial product, or brings some transformation, selenium speciation of the gastrointestinal extracts was carried out. The identification of the peaks was carried out by the spiking procedure. The first peak was unidentified and could no be attributed to any anionic selenium species tested. SeMet was found (second peak) to be the dominant Se species, being the only seleno-amino acid found in both extracts (gastric and gastrointestinal). The chromatographic profiles obtained by the two chromatographic methods used were the same. The results of speciation analysis of the gastrointestinal digestion extract shows that 21% of the bioaccessible Se was found as SeMet. Although chickens have no efficient mechanism for Met synthesis, and consequently are unable to synthesise SeMet, are a source of SeMet due to its diet and the plant-animal food chain.
EFFECT OF MERCURY LONG-TERM ADMINISTRATION ON SELENIUM SPECIATION We have previously reported the effect of Hg on natural occurring levels of Se27, however no speciation studies have been reported. In order to evaluate the effect of Hg (inorganic and organic) on selenium metabolism the speciation of several chicken tissues (kidney, liver and muscle) has been carried out. Se speciation of the chicken tissues revealed the same chromatographic profiles. The first peak was unidentified and the second one was identified as SeMet. Furthermore, the addition of Hg(II) or MeHg to the control diet did not change the SeMet distribution (Fig. 3). Therefore, Hg exposure did not significantly altered SeMet uptake.
EFFECT OF SELENIUM LONG-TERM ADMINISTRATION ON MERCURY TOXICITY In order to understand the molecular basis of the Hg-Se antagonistic mechanism involved in the accumulation process of mercury in chicken, we designed a feeding experiment to test the effect of dietary selenite on dietary mercury poisoning. Since we were also interested in the molecular specificity of the mercury-selenium interaction, mercury was fed in two forms, mercuric chloride and methylmercury chloride.
In order to assess mercury uptake, total mercury content of the chicken tissues (liver, kidney and muscle) as well as its speciation was carried out by CV-AFS. The mean mercury concentration in chicken ranged from 0.006 g g-1 in muscle to 0.304 g g-1 in liver (Table 4), being the muscle the largest body pool of mercury. As it has been previously reported the addition of Se to a Hg(II) containing diet significantly alleviated the adverse accumulation of Hg in chicken. However, the addition of Se to the MeHg containing diet did not affect the mercury accumulation in kidney, but Hg concentration liver and muscle was highly affected by se administration. As a consequence mercury speciation has been carried out to clarify whether Se enhances MeHg accumulation or MeHg conversion into less toxic forms. The determination of inorganic and total mercury determination was achieved by selective reduction with SnCl2 and later measurement by CV-AFS. The results (Table 4) show that inorganic mercury does not undergo a biotransformation process because it remains unalterable as inorganic mercury. However, some of the MeHg which enters the body is partly demethylated to inorganic mercury (a less toxic form). It seems likely that most of this demethylation process takes place in the liver, with subsequent accumulation of Hg(II) in the kidneys28. In fact, according to the literature a large fraction of mercury stored at high concentration in the liver of some animals (marine mammals and seabirds) is found as Hg(II) despite the fact that mercury is take up from their diet mainly as methylmercury performing a toxicologically less damaging alternative to the accumulation of MeHg. On the other hand, some authors suggest that Se is directly involved in the demethylation process. In our case, the addition of Se to the MeHg-containing diet meant promotion of MeHg conversion into a less toxic form (inorganic Hg), because an increase up to 145-280% of MeHg demethylation in chicken liver and kidneys was observed. It has been previously suggested that the process of demethylation of MeHg and inorganic mercury transformation by reaction with selenium to form mercuric selenide would be an effective mechanism for counteracting the potentially damaging action of mercury29. Se, in addition to its role as micronutrient, exerts an antidotal action on the toxic effects of mercury, through the formation of highly insoluble complexes, consisting of mercury selenide HgSe . This compound is assumed to be an inert and product of the detoxification process in marine animals30. In conclusion, liver is the main site of MeHg biotransformation in chickens. Furthermore, an antagonic effect of Se favouring MeHg detoxification pathway involving the liver is proposed.
10
REFERENCES
1 2
Patching S.G., Gardiner P.H.E., J. Trace Elem Med. Biol., 1999, 13, 193-197. Daz Huerta V., Szpnar J., Lobinski R., Fernndez Snchez M.L., Sanz-Medel A., J. Anal. Combs G.F. The role of selenium in nutrition, 1986. Combs S.B. (eds). Academic, New Grosicki A., Kowalski B., Bull. Vet. Inst. Pulawy, 2002, 46, 337. Watanabe C., Tohoku J. Exp. Med., 2002, 196, 71. Parizek J., Ostadalova I., Experientia, 1967, 23, 142. Raymond L.J., Ralston N.V.C., Seychelles Medical and Dental Journal, 2004, 7, 1. Imura N., Naganuma A., Advances in Mercury Toxicology, 1991, pp. 275-288. Suzuki T. Fang S.C., Chem. Biol. Interact., 1977, 17, 25. Sheline J., Schimdt-Nielsen B., Physiological Responses of Marine Biota to Pollutants:
At. Spectrom., 2003, 18, 1471.

3
York.
4 5 6 7 8
(Ed) Plenum Press, New York.

9 10
Methilmercury-selenium Interaction in killifish, Fundulus heteroclitus, 1975, pp 119-130. Vernberg F. (Ed). Symposium, Milford, CN.
11 12 13 14 15
Chen R.W., Whanger P.D., Fang S.C., Pharmacol. Res. Commun., 1974, 6, 571. Leonzio C., Focardi S., Bacci E., Sci. Total. Environ., 1982, 24, 249. Yoneda S., Suzuki K.T., Toxicol. Appl. Pharmacol., 1997, 143, 274. Naganuma A., Imura N., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1980, 27, 163. Ikemoto T., Kunito T., Tanaka H., Baba N., Miyazaki N., Tanabe S., Arch. Environ. Koeman J.H., Peeters W.H.M., Koudstaal-Hol C.H.M., Tjioe P.S., Degoeij J.J.M., Nature, Cabaero A.I., Madrid Y., Cmara C., Anal. Bioanal. Chem., 2005, 381, 373. Luten J.B., Bouquet W., Burggraaf M., Rus J., Trace Elements: Analytical Chemistry in
Contam. Toxicol., 2004, 47, 402.

16
1973, 245, 385.

17 18
Medicine and Biology, 1987 p. 509., Bratter P., Schramel P. (Eds.). Galter de Gruter, New York.
19 20 21 22 23 24 25 26 27
Cabaero A.I., Madrid Y., Cmara C., J. Anal. At. Spectrom., 2002, 17, 1595. Schrauzer G.N., Adv. Food. Nutr. Res., 2003, 47, 73. Schrauzer G.N., J. Nutr., 2000, 130,1653. Daniels L.A., Biol, Trace Elem. Res., 1996, 54, 185. Rayman M.P. Lancet, 2000, 356, 233. Surai P.F., Worlds Poultry Sci. J., 2002, 58, 431. Asean A., Vasconcelos M., Food Chem. Toxicol., 2000, 38, 899. Hocquellet P., Lhotellier M., J. AOAC Int., 1997, 80, 920. Cabaero A.I., Madrid Y., Cmara C., J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 2125.
11
28
Frisk, P. Expressions of mercury-selenium interaction in vitro.Comprehensive summaries
of Uppsala dissertations from the faculty of medicine, Uppsala, Sweden. Acta UniV. Uppsaliensis. 2001, 988.
29 30
Storelli M.M., Marcotrigiano G.O., Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2002, 69, 516. Martoja R., Berry J.P., Vie Milieu Paris, 1980, 30, 7.
12
3. ESTUDIO DE LA INTERACCIN MERCURIO-SELENIO EN HGADO DE POLLO MEDIANTE EL USO DE CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR ACOPLADA AL ICP-MS
A.I. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara. Study of mercury-selenium interaction in chicken liver by size exclusion chromatography inductively coupled plasma-mass spectrometry J. Anal. At. Spectrom., (aceptado)
El trabajo completo se present como poster en European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry. Budapest, Hungra. 1-4 Febrero 2005.
STUDY OF MERCURY-SELENIUM INTERACTION IN CHICKEN LIVER BY SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS
SPECTROMETRY
Ana I. Cabaero, Yolanda Madrid and Carmen Cmara*
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040 Madrid, Spain. * E-mail: [email protected]
ABSTRACT In order to estimate metal distribution patterns in biomolecules of different sizes and their possible modification after long-term Hg and Se exposition, multi-elemental distribution of the cytosols of chicken livers were evaluated. For this purpose 72 chickens were fed under different controlled conditions. Chickens were exposed to Hg(II) and MeHg added to feed with or without selenium supplementation. Size-exclusion chromatography with ICP-MS detection was developed for multielemental (S, P, Cu, Zn, Se, Mn, Fe and Hg) speciation in chicken liver cytosol and optimisation of the separation parameters (25 mM Tris-HCl buffer, 50 mM KCl, pH 6.8, 1ml min-1) was carried out. The liver extracts were injected into the column four times each and the variation between the runs was small (RSD<10%). The recovery of the chromatographic step varied between 82-102%, indicating some interaction between the liver extracts and the column material. S, Cu, Zn, Fe, Se and Hg appeared mainly associated to high and medium-molecular weight species (>300-45 kDa), whereas Mn is mainly associated to high (116 kDa) and (0.03kDa) low molecular weight species and P is mainly associated to low molecular weight species (5.5 kDa). Changes in the subcellular distribution and distribution patters caused by long-term Hg-Se administration have been discussed.
INTRODUCTION
Mercury is a widely distributed and persistent pollutant in the environment and is among the most highly bioconcentrated trace metals in the human food chain. Mercury toxicity, bioavailability and environmental mobility are well known to be highly dependent on its chemical form1, being methylmercury one of the most toxic species. Therefore, risk assessment and risk prevention of human exposure to mercury is a milestone in food safety. Selenium is known to be both an essential and toxic micronutrient for living organisms, whose biological functions are believed to be carried out by selenoproteins, in which Se is specifically incorporated as the amino acid selenocysteine. In addition, Se also occurs as selenomethionine, which can be non-specifically incorporated into proteins instead of methionine2. Nowadays, the major functions of this element are attributed to its antioxidant properties and its role in the regulation of thyroid hormone metabolism and cell growth2. Moreover, several authors reported a protective function of Se against toxic effects caused by mercury, but the way in which it interferes with mercury has not yet been fully elucidated3-7. Negative and positive effects of these elements on organisms are significantly dependent on the speciation, concentration, metabolism and path of exposure. In addition to that, the general trace element status of an exposed organism has also to be considered because interactions between absorbed elements species and already present metal complexes may modify its metabolism, multiplying or reducing the biochemical effects8. In fact, the imbalances of essential elements caused by heavy metals could often induce dysfunction damage to organs and tissues9. Trace elements play very important roles in living organisms10. More than a third of cellular proteins have a functional requirement for at least one catalytic or structural metal ion cofactor11-12. In addition to proteins that employ the metals there are a variety of metalbinding proteins that import, export, and transport metals within the cell, assemble metallocenters, detoxify the cytoplasm, and regulate expressions of the various protein factors12-16. The characterisation of trace element species in solid biomatrices like liver is necessary to obtain a more detailed knowledge of the complex function and interactions of these compounds in the organism8. Therefore, to elucidate the mechanisms that control the uptake of mercury and selenium by an organism exposed to these metals as well as metal transport, metabolism and detoxification processes, reliable information is needed not only about these elements but also about trace-element speciation of biomolecules with specific
functions in the cell. Consequently, multielement detection is necessary to study those effects in complex biomatrices. Metal-protein interactions sometimes are labile under standard analytical conditions employed for chromatography or mass spectrometry, thus investigation of metal-containing proteins requires particular attention to assure that their native composition is retained17. Size-exclusion chromatography (SEC) is especially suitable for separation of element species of limited stability being frequently encountered in protein-rich matrices. The main advantages of SEC are simplicity of application, compatibility of mobile phase composition with specific demands of certain biological sample and possibility of estimation of molecular mass of element species18. Therefore SEC is often applied as the method of choice for separation of the fraction containing metallobiomolecules of interest. SEC with element-specific detection like ICPMS allows the estimation of the molecular weight of biomolecues in non-denaturing condition19, and was successfully applied, to element species fractionation in animal tissues8, 20-23, food24-26, plants18, 27-31, and human cells32. The aim of this work is the application of SEC-UV and SEC-ICP-MS to investigate the binding patters of many trace elements in chicken liver estimating the molecular weight of the water-soluble compounds. The distribution of metalloproteins and their element binding patter obtained in this way are also compared with those obtained from chicken supplemented with Hg(II), MeHg and Se in an attempt to investigate the mercury-seleniumtrace elements interaction. To elucidate the complexities of mercury and selenium the changes in the element binding patter are also evaluated. The investigation on the differences of the distribution of Hg, Se and essential elements might be helpful to the understanding of the mechanism of mercury toxicity.
EXPERIMENTAL
Instrumentation
An inductively coupled plasma mass spectrometer, (ICP-MS, HP-4500 Plus, Tokyo, Japan) fitted with a Babington nebuliser and a Scott double-pass spray chamber cooled by a Peltier element system was used for total metal determination and metal detection after chromatographic separation. Before coupling the chromatographic system, the ICP-MS working conditions were optimised, using a calibrant, byspanning the mass range from beryllium to uranium, at a 10 g l-1 level.
A spectrometer 5000 photodiode array detector (LDC Analytical Thermo Separation Product, Uxbridge, Middlesex, UK) was used for total protein determination and protein detection after chromatographic separation. A PU-2089 HPLC pump (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) fitted with a six-port sample injection valve (model 7725i, Rheodyne, Rohner Park, CA, USA) with a 200 L injection loop was used for chromatographic experiments. Protein separations were carried out in a Biosep-SEC-2000 (10 m, 300 x 7.8 mm i.d.) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) size exclusion column, with an effective separation range of 300-1 kDa. The chromatographic system was coupled to the spectrometer or ICP-MS by a 5 cm polytetrafluoroethylene capillary tubing (0.5 mm i.d.) running from the column outlet to the spectrometer or Babington nebuliser inlet for online measurements. An Eppendorf (Hamburg, Germany) Centrifuge 5804, F34-6-38 was used for the separation of the supernatant after protein extraction from liver tissues. For total trace element determination, samples were microwave digested in double-walled advanced composite vessels using a 1000W MSP (Microwave Sample Preparation system) microwave oven (CEM, Mattheus, NC, USA). 0.22 m Millipore nylon filters were used to filter the HPLC solutions and 0.22 m Millipore Millex-HV filters were used to filter the samples before the injection into the SEC column.
Reagents All reagents were of analytical-reagent grade and were used without further purification. Inorganic selenium solutions were obtained by dissolving sodium selenite (Merck, Darmstadt, Germany) in ultrapure water (18.2 M cm) obtained from a Millipore Milli-Q water purification system (Millipore, Ohio, USA). Selenoaminoacid (selenomethionine) was purchased from Sigma and dissolved in 3% (v/v) HCl and deionised Milli-Q water (Millipore). Stock standard solutions of 10 mg l1 were stored in the dark at 4C and working standard solutions were prepared daily by dilution. Mercury standards solutions were prepared by appropriate dilution of a stock mercury chloride solution (1000 mg Hg(II) l-1) (Merck, Darmstadt, Germany) and methylmercury chloride (1000 mg MeHg l-1) (Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany) in deionised Milli-Q water (Millipore, Ohio, USA). These solutions were stored in amber vials at 18 C. Standards were prepared daily to reduce mercury losses by volatilization. Standard metal solutions of 1000 mg l-1 from Merck (Darmstadt, Germany) were used. All working solutions were prepared daily with deionised Milli-Q water (Millipore). Proteins (blue dextran 2000; alcohol dehydrogenase; cytochrome C and aprotinin) and metal-binding proteins (carbonic anhydrase; albumin from bovine serum and coenzyme
B12) for calibrating the size exclusion chromatographic column were purchased from Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). A protease inhibitor cocktail (104mM AEBSF, 0.08 mM Aprotinin, 2 mM Leupepetin, 4 mM Bestatin, 1.5 mM Pepstatin A and 1.4 mM E-65) to improve the yield of intact proteins, was obtained from Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Tris [Tris(hydroxymethyl)-aminomethane], KCl and HCl, used in the preparation of the mobile phase (pH: 6.8 25 mM Tris-50 mM KCl), the extraction buffer (pH: 6.8 25 mM Tris50 mM KCl) and the protein standards (pH: 7.5 100 mM Tris-50 mM KCl), were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Coomassie Brilliant Blue G-250 was used for total protein determination. H2O2 (35%) from Panreac and HNO3 (65%) pro analysis grade (distilled in our laboratory in a distillation system for acids, model BSB 939IR from Berghof (Eningen Germany) were used to digest the samples.
PROCEDURES
Animals, diets and experimental setup Seventy two, 1-day-old Hybro-G female broiler chickens were used in this study. The birds were randomly assigned, into 10 pens for treatment, each of 8 birds. All pens were bedded with a wood-shavings litter and equipped with feeders and waterers in an environmental chamber with 37.5 cm2 per bird. The chickens (during a study period of 42 days) were fed either with a common basal diet (control), formulated to contain all nutrients required, or with a diet supplemented with different compounds (Hg(II), MeHg, Se(IV)) specified in Table 1. The experimental design consisted of 6 different dietary treatments, in order to evaluate the effect of selenium on mercury bioaccumulation. For evaluation of mercury, selenium and other metals bioaccumulation in the indicated cases, all birds were slaughtered after 42 days. The carcasses were manually eviscerated and the liver of each chicken was collected and stored individually at 20 C.
MEASUREMENTS
Total element quantification To determine the total content, the fresh samples (1 g) were digested with 4 mL of nitric acid and 1 mL of 35% hydrogen peroxide in an analytical microwave oven at 43% power
output. The pressure was held at 137,895 Pa for 15 min, at 275,790 Pa for 30 min and finally at 586,053 Pa for 1 hour. The element recovery obtained after Tris-HCl extraction was calculated on the basis of the total element concentration found in the digested liver (using HNO3). The insoluble pellet was then digested using concentrated HNO3 for a complete recovery. The total contents as well as the extractable amounts of elements and pellets were analysed by ICP-MS. All metals were quantified by both external and standard addition calibrations of the signal obtained by the ICP-MS using the operating conditions given in Table 2.
Metal compounds determination
Size exclusion chromatography (SEC) As previously detailed, the chromatographic separation was performed with a Biosep-SEC2000 column. The following peptides and proteins of molecular weights from 0.198 to 150 kDa were used for determination of molecular weights: blue dextran (2000 kDa); alcohol dehydrogenase (150 kDa); albumin from bovine serum (66 kDa); carbonic anhydrase (29 kDa); cytochrome C (12.4 kDa); aprotinin (6.5kDa); coenzyme B12 (1.579 kDa) and selemethionine (0.198 kDa). Approximately 1000 mg l-1 solutions of each protein standard were prepared in 50 mM Tris-HCl/100 mM KCl at pH=7.5. Diluted solutions of 20-100 mg l-1 were prepared daily in deionised water. The calibration curve for the size exclusion column was determined both by UV (at 250 and 280 nm) and ICP-MS (monitoring
59
Co,
63
Cu,
65
Cu,
64
Zn,
66
Zn,
78
Se and
82
Se isotopes), by
plotting log (molecular weight) versus the retention time. The column was regularly washed according to the recommendations of the manufacturer to remove adsorbed material.
Speciation analysis of protein-bound elements in cytosol samples Liver tissue was homogenised in a Tris buffer (25 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 7.5) and 50 l of the protease inhibitor cocktail to yield a 20% (m/v) homogenate, using a Potter homogeniser. Cell disruption was performed at a cold temperature (4C) by keeping the sample on ice.
The soluble components were thereafter separated by centrifugation for 30 min at 15000 g at 4C, to minimise the risk of species degradation or transformation. After centrifugation the supernatant was decanted and filtered through a 0.22 mm filter and stored at -20C until analysis. The metallocompounds in the supernatant were fractionated with sizeexclusion chromatography-ICP-MS. Prior to SEC-ICP-MS analysis, the supernatant was diluted 5-fold. The pellet was mineralised and then also measured for its total content in Cr, Co, Cu, Zn, As, Se, Cd, Fe, Mn and Hg by ICP-MS.
Determination of proteins analysis The protein content in soluble fractions was determined spectrophotometrically (=595nm) by the Bradford method with Coomassie Brilliant Blue G-250. Bovine serum albumin was used as the calibration standard.
Validation of the results In the present work, two certified reference materials were employed for validation of total metal content and species. Method validation for mercury was performed by using the reference material CRM-463 (tuna fish), certified for methylmercury (2.85 + 0.16 g g-1), from the Community Bureau of Reference of European Commission (BCR) whereas for total Cr, Mn, Co, Cu, Cd, Zn, Se a certified marine tissue reference material, CRM 278R (mussel tissue), currently available as a European Reference Material ERM CE278, was used.
Statistical analysis
A one-factor analysis of variance was applied to detect possible differences in total elements between the different treatments studied. A significance level of p<0.05 was adopted for all comparisons. Statgraphics Plus version 4.0 (Statistical Graphics) was used for the statistical analysis.
RESULTS AND DISCUSSION a) Total element concentration and distribution
Total element content of the chicken liver was determined by ICP-MS after a microwave digestion (Table 3). The results were obtained using external calibration and the accuracy of the method was evaluated by analysing different certified biological reference materials. Since no significant differences were observed (p<0.05) between the certified values and the experimental ones, the method used was adequate for total determinations in the sample analysed. In addition, the quantitative distribution of metals between the Tris-HCl-soluble and nonsoluble fractions of liver was investigated in order to evaluate the element distributions and the element extraction efficiency of the proposed method. The results for 10 elements are given in Table 3, from which it can be seen that the major elements are Fe, Zn, Cu and Cr (essential elements). The minor elements are Co, As and Cd, being the latter toxic elements. For Hg the concentration was below the detection limit of the procedure used, therefore, the basal diet control group did not show evidence of Hg contamination. The calculated extraction efficiency expressed as per cent of soluble metal relative to total metal in the liver is also given in Table 3. With a Tris-HCl buffer 32 to 70% of the metal content was extracted. The results showed some differences in extraction efficiency, depending on the element, being higher (>65%) for Co, Zn and As. Mn, Cu, Cd and Fe were nearly equally distributed between the cytosolic fraction and the pellet, whereas the major amount of Cr and Se was probably not located in the cytosol but for example bound to membranes or nuclei and therefore, not extracted with the applied procedure.
b) Optimization of SEC separation Several parameters that could influence the efficiency of the SEC protein separation such as mobile phase pH, salt concentration and flow rate were optimised for the SEC column using UV detection. Phosphate and Tris-HCl buffer solutions within the 10 to 50 mM concentration range were tested. The use of 25 mM Tris-HCl buffer results in better resolution, hence the use of this buffered solution was proposed. The effect of salt concentration on protein separation efficiency was evaluated for the SEC column by the addition of 25 to 100 mM KCl to the Tris-HCl buffer. The highest resolution was achieved using 50 mM. Therefore, the separations were carried out with 50 mM KCl. The pH range was slightly modified close to pH=7 (6.5-7.5), and the best results were obtained at pH=6.8.
The effect of the mobile phase flow rate was evaluated from 0.6 to 1.0 ml min-1 to enable subsequent hyphenation of the SEC column to the ICP-MS. As no significant changes in resolution were observed, the highest flow rate (1.0 ml min-1) was chosen for further experiments. After optimising the chromatographic parameters, the columns were calibrated with proteins of different molecular weight. Relative standard deviations (n=5) for the elution volumes measured were lower than 2%. The equation obtained for the calibration was: log (MW) = -0.4773 tr + 5.5112 and the correlation coefficient (r) was 0.998, which was considered suitable for column calibration.
c) Element binding pattern in control liver cytosol In order to estimate metal distribution patterns in biomolecules of different sizes, the cytosol isolated from the control liver homogenate was injected into the SEC column. Soluble proteins and multi-elemental distributions were assessed by comparing the chromatograms obtained by both UV (at 280 and 250 nm) and ICP-MS. Each sample was injected 4 times and the variations between runs were small (RSD: 37%). The recovery of the metals in the chromatographic step varied between 82-102% depending on the element. Thus, there seems to be some interaction between some elements (Cu and Mn) and the column material.
UV profiles The protein profiles are shown in Fig. 1. There were 10 UV peaks easily distinguishable. Approximately 60% of proteins extracted from chicken liver were found in the high-medium molecular weight region (>300-45 kDa), while the remaining proteins were detected in the low molecular weight region. The first peak corresponded to high-molecular weight proteins (>300 kDa). The second one (200 kDa) was accompanied by one small shoulder whose apparent relative molecular weight was 100 kDa. The third peak (major peak) corresponded to medium-molecular weight species (45 kDa). The following two peaks corresponded to low molecular weight (4, 1 kDa) species. UV peaks at retention times above 12 min represent compounds with a molecular weight estimated out of optimum fractionation range given by the manufacturer and may be separated by mechanisms other than size-exclusions (e.g. adsorption)31.
ICP-MS profiles Chromatograms obtained with ICP-MS detection are shown for S, P, Cu, Zn, Mn, Fe and Se in Figures 2 and 3. These chromatograms show clearly that each element has its own species pattern of various level of complexity. Retention times, estimated apparent molecular masses of eluted species and element quantities corresponding to individual peaks are summarised in Table 4. Since quantitative S and P determination by ICP-MS is not feasible because (monoisotopic) and
32 31
S (95% abundance) are strongly interfered by NO+, NOH+ and COH+,
we have only attempted to perform qualitative experiments to ascertain whether or not these analytes are present. Although these polyatomic interferences affect the background of all chromatograms, the analytical peaks of the chromatograms clearly indicate the presence of both P and S. Sulphur detection is an indicator of the whole protein (sulphur containing aminoacids) content. The sulphur elution curve (Fig. 2) resembled the UV280 chromatogram to a large extent for retention times lower than 10 min. In fact, S coeluted with the first four high UV signals. Sulphur appeared (Table 4) mainly distributed in high-medium molecular weight species (>300-45 kDa) (64% of the recovered S), while the remaining proteins were detected in the low molecular weight region (5 and 2 kDa). ICP-MS signals of sulphur obtained in this experiment also shows that the distribution of S among the five peaks varied considerably. Peak 1 and 4 accounted for 7% of the recovered S, whereas peaks 2, 3 and 5 accounted for 28-29% each one, respectively. The pattern obtained for phosphorus (Fig. 2) turned out to be quite different. Phosphorous elution profile shows a dominant phosphorus peak in the low-molecular mass region at the elution time of 9.9 min preceded by a very small peak at the elution time of 6 min. This first signal accounts for more than 99% of total P. The estimated molecular mass of the major phosphorus species is approximately 5.5 kDa, whereas those of the minor phosphorus species are >300 kDa. Data in Table 4 and Fig. 2 indicate that main species of copper and zinc were detected in the high-medium molecular mass region. About 89% of total Cu and 98% of total Zn are distributed between high and medium molecular weight proteins eluted from 6 min to 8 min with molecular weights ranging from 45 kDa up to >300 kDa. The prevailing species in this fraction (67% of total Cu and Zn, respectively) corresponds to proteins with a molecular weight of about 45 kDa. About 11% of Cu and 2% of Zn was bound to low molecular weight proteins with the maximum peaks, corresponding to molecular weights of about 5, 2 and 1 kDa (10 to 11.5 min elution time).
10
Mn elution profiles of control liver cytosol (Table 4 and Fig. 2) shows that it appears both associated to high molecular weight proteins from >300 to 116 kDa (44% of total Mn), along with low molecular weight species (<1kDa) in a very broad zone (56% of total Mn). The Fe elution profile (Table 4 and Fig. 2) clearly shows that it is mainly eluted in the region of high and medium molecular weight proteins. It shows the presence of two major peaks corresponded to high molecular mass region (>300 kDa; 60% of total Fe) and medium molecular mass region (45 kDa; 39% of total Fe). Selenium (Table 4 and Fig. 3) is spread among several binding fractions, from high to low molecular weights (>300- 2 kDa). According to the elution time of the calibrating proteins, the separated species correspond to compounds with the following molecular weights: 190 kDa, 45 kDa, 17 kDa, 3.8 kDa and 2.3 kDa. However, about 77% of total Se is eluted in 10 min. Therefore, Se appears mainly associated to high and medium molecular weight proteins. The main forms of selenium are either selenomethionine unspecifically incorporated into proteins, or specific selenoproteins containing selenocysteine. The chromatographic profiles for selenium as protein-bound selenomethionine would be expected to mainly follow the total protein concentration, i.e. total methionine concentration. Peaks 1, 2 and 4 in liver cytosol were related to major UV peaks (Fig. 3). However, for several other highmolecular weight UV peaks there was very low selenium content, which suggests that only a low fraction of the soluble selenium in this liver extract was protein-bound selenomethionine. Se peaks 3 and 5 coincided with very low UV absorbance indicating that most of it constituted specific selenoproteins.
d) Mercury-selenium-trace elements interaction
Mercury In order to evaluate mercury distribution and accumulation, total mercury content in the liver of the chickens fed Hg(II) and MeHg supplementation was determined (Table 5). Total mercury concentration varied between 22 and 304 g kg-1 depending on the Hg species exposure, being one order of magnitude lower when feed was enriched with inorganic mercury than when it was enriched with MeHg. This data is in good agreement with those previously reported were liver was found to be one of the most sensitive tissues to MeHg poisoning. Furthermore, the extraction efficiency of mercury using Tris-HCl buffer was very high for inorganic mercury (90%), whereas MeHg was nearly equally distributed between the
11
cytosolic fraction (57%) and the pellet. Therefore, Hg(II) and MeHg had a different distribution on a subcelullar level. Long-term Se supplementation did not change the subcelullar distribution of inorganic mercury, but it did modify the subcelullar MeHg distribution. Concurrent administration of MeHg and sodium selenite caused a decrease in the percentage of Hg found in the cytosol (48%). Therefore, the mercury content increases in the pellet (nuclear/mitochondria fraction) when Se was supplemented as a result of a selenium-mercury interaction. Similar results have been previously reported in rat and mice brains33-34, where the percentage of Hg in the nuclear fraction of neurones was increased, suggesting that the subcellular distribution of Hg in brain of MeHg exposed animals had been markedly influenced by Se treatment. In addition, the formation of stable and non-diffusible Hg-Se complexes of Hg and Se in liver has been previously suggested35. Mercury in liver of the chickens fed Hg(II) was spread among several binding fractions (Fig. 4). Mercury appeared mainly associated to high and medium molecular weight proteins from >300 to 45 kDa (80% of total Hg), along with low molecular weight species (<10 kDa). The mercury chromatogram resembled the UV280 and S chromatogram to a relatively large extent, suggesting that Hg attaches to thiol-groups and binds to proteins. Tissue accumulation of mercury is, according to several previous reports, due to mercury binding to SH, carboxylic, and amino groups36-37. Both inorganic Hg and MeHg have been found to exhibit a high affinity for SH groups38-39, favouring the synthesis of metalloproteids forming less or more stable mercury compounds with proteins38-39. Thus, mercury is invariably found in cells and tissues attached to thiol-containting molecules such as protein or small molecular weight with thiols such as cysteine and glutathione. It is believed that the formation of mercury thiol bonds underlies both the toxicity and mobility of mercury in the body39. Figure 4 shows how the intensity of
202
Hg signal varied considerably among the different
treatments, however the speciation patterns obtained were quite similar for Hg(II) and MeHg treatments. Hg elution profiles of all mentioned samples showed a dominant Hg peak in the medium-molecular-mass region (45 kDa, accounting approximately 50% of the recovered Hg). Hg distribution in inorganic Hg treatment was not affected by Se addition, however a noticeably lower signal was observed. This can be explained by findings of a previous work, where a drastic reduction on total Hg content in liver (78%) was observed after Hg(II)sodium selenite co-administration40. On the other hand, Se supplementation in MeHg treatment caused important changes in the Hg distribution pattern. Se supplementation favoured the formation of new low molecular weight species (1 kDa) and a small peak shift towards higher molecular weight. Therefore, the distribution of Hg among the 5 peaks varied considerably.
12
This effect was only observed when MeHg and Se(IV) were co-administered, indicating that a mercury-selenium interaction occurred in this organ as previously mentioned above.
Selenium To study the differences in Se distribution and accumulation, total Se content in the liver of the control chicken and chickens fed Hg(II) and MeHg supplementation was evaluated (Table 5). As it can be seen, the presence of Hg did not cause a relevant effect on natural occurring levels of Se bioaccumulation, as well as on the extraction efficiency. Efficiencies around 30% were obtained for all the samples. Se distribution patterns for the following treatments were recorded (Fig 5): Hg(II), Hg(II)+Se(IV), MeHg, MeHg+Se(IV) and some important differences were found between treatments. The distribution of selenium among the peaks slightly varied when Hg(II) or Hg(II)+Se(IV) were added to the feed. However, we can observe that MeHg and MeHg + Se(IV) supplementation extensively modified the selenium chromatogram of the control liver (Fig. 3) Presence of MeHg favoured the formation of high molecular weight selenium species. In addition, when Se was added to the MeHg treatment not only high molecular weight selenium species formation was favoured, but a new peak (accounting for almost 30% of selenium recovered) appeared at retention time of 10.9 min ( 2kDa). Cikrt and Becko suggested that Se affects the binding of Hg to proteins41; it has also been reported to direct the binding of Hg from LMW to HMW42. Previous studies have shown the formation of high molecular weight complexes (containing Hg and Se) after 24h of Hg and Se coadministration35, 43. The Se distribution changes observed when MeHg and Se were added to the feed was similar to the one found for MeHg, since the formation of high and low molecular weight species was observed, which corroborates the mercury-selenium interaction in the liver at subcellular level suggested previously. Thus, this study provides new information about the distribution of Hg and Se in chicken liver after different treatments, emphasizing the relationship between mercury and selenium. But further studies are needed for additional identification of the different mercury and seleno compounds in the peaks using complementary techniques such as ESI-MS/MS in order to understand their metabolism.
13
Zinc Since the status of micro-nutritional elements and its species after Hg exposure is not well documented, the investigation on the differences of essential elements distribution after Hg exposition has been carried out. The concentration and distribution patterns of trace elements were found to be stable when Hg(II) and Hg(II)+Se were added to the feed in comparison with the control group. Therefore, our data in this research indicated that there was no obvious adverse impact of Hg(II) on the concentration of trace elements in the liver, as well as in the species distribution. On the other hand, a notorious effect on Zn distribution pattern was observed in MeHg exposed animals. Fig. 6 depicts the SEC elution profiles of Zn obtained for the different treatments. As shown in this figure, the MeHg or MeHg+Se exposition alters the binding of the essential element Zn, diverting the binding of Zn from medium-molecular weight to high-molecular weight species. Zn associated to high-molecular weight species varies from 36% (control liver) to 48% (MeHg) and 56% (MeHg+Se) of the recovered Zn. At this MeHg exposure concentration, mercury redistributes Zn in different molecular weight species. In fact, a peak of 100 kDa molecular weight disappeared and a new peak at 80kDa can be observed in the chromatograms. Interaction of Zn with Cd has been previously reported44. Ferrarello et al. observed a change in the Zn distribution pattern when Cd and Se were co-administered to mussels. However, interactions of Hg with essential metals like Zn, Cu or Fe are not well documented. Flora et al.42 suggested that Zn could play a significant role in detoxification mechanisms for Hg, but further studies targeted on Hg, Se and Zn are proposed in order to clarify their interaction.
CONCLUSIONS This paper provides information about the concentration of several trace element species in chicken liver and its molecular weight distribution. Total element concentration and distribution varied depending on the element according to its essentiality and biological functions, having each element its own distribution between the cytosolic fraction and the pellet, as well as its own species pattern. The most important metal-binding biocompartment was found to be in the high and medium molecular weight pool, with a strong signal containing S, Cu, Zn, Fe, Se and Hg, suggesting the presence of proteins with various metals associated to its structure.
14
Long-term Hg or Hg+Se did not affect the multielemental concentration or distribution, whereas MeHg or MeHg+Se treatment did modify mercury, selenium and zinc distribution patterns. MeHg and Hg presented different subcellular distribution, but quite similar pattern; however when Se was added to the MeHg treatment a change in the subcellular distribution and distribution pattern was observed. Se was also modified when MeHg or MeHg+Se was added to the diet. Thus, the MeHg+Se supplementation favours the formation of high and low molecular weight selenium and mercury-containing proteins, while high molecular weight Zn containing proteins are preferentially formed. These results support a significant interaction between Hg, Se and Zn when MeHg and Se are co-administered.
ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by the CICYT project BQU2002-01348. One of the authors (A. Cabaero) wishes to thank the Complutense University for support through a predoctoral fellowship.
15
REFERENCES 1. S. Ro-Segade, C. Bendicho, J. Anal. At. Spectrom., 1998, 14, 263-268. 2. S. G. Patching and P. H. E. Gardiner, J. Trace Elem Med. Biol., 1999, 13, 193-197. 3. J. Parizek and I. Ostadalova, Experientia, 1967, 23, 142-143. 4. M. A. A Cuvin-Aralar and R. W. Furness, Ecotoxicol. Environ. Safety, 1991, 21, 348-364. 5. S. Potter and G. Matrone, J. Nutr., 1974, 104, 638-647. 6. J. C. Hansen, P. Kristensen and S. N. Al-Masri, Nord. Vet-Med., 1981, 33, 57-64. 7. C. Watanabe, Tohoku J. Exp. Med., 2002, 196, 71-77. 8. V. Nishwitz, B. Michalke and A. Kettrup, J. Anal. At. Spectrom., 2003, 18, 444-451. 9. W. Feng, M. Wang, B.Li, J. Liu, A. Chai, J. Zhao, and G. Deng, Toxicol. Lett., 1994, 152, 223-234. 10. A. Sanz-Medel, M Montes-Bayn and M. L Fernndez Snchez, Anal. Bioanal. Chem., 2003, 377, 236-247. 11. R. H. Holm, P. Kennepohl and E. I. Solomon, Chem. Rev., 1996, 96, 2239-2314. 12. A. C. Rosensweig, Chem. Biol., 2002, 9, 673-677. 13. S. J. Lippard, J. M. Berg, in Principles of Bioinorganic Chemistry, eds, University Science Books, Mill Valley, California, 1994. 14. F. W. Outten, C. E. Outten and T. V. OHalloran in Metalloregulatory systems at the interface between bacterial metal homeostsis and resistance, eds, G. Storz, R. Hengge-Aronis, Bacterial Stress Response, ASM Press, Washington DC, 2000, p 145-157. 15. L. S. Busenlehner, M. A. Pennella and D. P.Giedroc, Microbiol. Rev., 2003, 27, 131-143. 16. J. Kuchar and R. P. Hausinger, Chem. Rev., 2004, 104, 509-525. 17. M. Wind and W. D. Lehmann, J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 20-25. 18. R. Koplk, M. Borkov, O. Mestek, J. Komnkov and M. Suchnek, J. Chromatogr., B, 2002, 775, 179-187. 19. N. Jakubowski, R. Lobinski and L. Moens, J. Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 1-4, 20. C. Daun, T. Lundh, G nning, B.kesson, J.Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 129134. 21. J. Wnag, D. Dreessen, D. R. Wiederin, R. S. Houk, Anal. Biochem., 2001, 288, 8996 22. G. nning and I. A. Bergdahl, Analyst, 1999, 124, 1435-1438. 23. H. Goenaga Infante, K. V. Campenhout, D. Schaumloffel, R. Blust and F. C. Adams, Analyst, 2003, 128, 651-657. 24. B. Michalke, P. Schramel, J.Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 121-138.
16
25. R. R. de la Flor St.Remy, M. L. Fernndez Snchez, J. B. Lpez Sastre and A. Sanz-Medel. J.Anal. At. Spectrom., 2004, 19, 1104-1110. 26. J. Szpunar, P. Pellerin, A. Makarow, T. Doco, P. Williams, B. Medina and R. Lobinski, J.Anal. At. Spectrom., 1998, 13, 749-754. 27. S. Mounicou, J. Meija and J. Caruso, Analyst, 2004, 129, 116-123. 28. V. Vacchina, D. Polec and J. Szpunar, J.Anal. At. Spectrom., 1999, 14, 1557-1566. 29. O. Mestek, J. Komnkov, R. Koplk, M. Borkov and M. Suchnek, Talanta, 2002, 57, 1133-1142. 30. B. A. Lesniewska, J. Messerschmidt, N. Jakuboswski and A. Hulanicki, Sci. Total Environ., 2004, 322, 95-108. 31. K. degrd and W. Lund, J. Anal. At. Spectrom., 1997, 12, 403-408. 32. A. Richarz, C. Wolf and P. Brtter,. Analyst, 2003, 128, 640-645. 33. B. Mller-Madsen and G. Dansher, Toxicol. Appl. Pharmacol., 1991, 108, 457-473. 34. A. Wicklund Glynn and Y. Lind, Pharmacol. Toxicol., 1995, 77, 41-47. 35. N. Imura and A. Naganuma in Possible mechanism of detoxifying effect of selenium on the toxicity of mercury compounds: Advances in Mercury Toxicology, eds. T. Zuxuki et al. Plenum Press, New York, 1991, p. 275-288. 36. F. Iverson, R. H Downie, G. L. Trenholm and C. Paul, Toxicol. Appl. Pharmacol., 1974, 27, 60-69. 37. G. L Diamond and R. K Zalups, Toxicol. Pathol., 1998, 26, 1, 92-103. 38. W. L. A. Hughes, Ann. New York Acad. Sci., 1956-7, 65, 454-459. 39. T. W. Clarkson, Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 1997, 34(3), 369-403. 40. A. Cabaero, Y. Madrid, C. Cmara, J. Agric. Food Chem., 2005, in press. 41. M. Cikrt and V. Bencko, Toxicol. Lett., 1989, 48, 159-164. 42. G. J. S. Flora, R. Mathur, N. Sandhu and K. K. Dua, Indian J. Pharmacol., 1994, 26, 209-212. 43. A. Naganuma and N. Imva, Pharmacol. Biochem. Behav., 1981, 15, 449-452. 44. C. N. Ferrarrello, M. Fernndez de la Campa, J. F. Carrasco and A. Sanz-Medel, Spectrochim. Acta, Part B, 2002, 57, 439-449.
17
Table 1. Experimental set-up
no. of Treatment pens
Total no. of chickens
Basal diet Control Basal diet + Hg(II) [0.2 mg kg-1 in feed] Control + Selenium (0.2 mg kg-1 in feed) Basal diet + MeHg [0.2 mg kg-1 in feed] Control + Selenium (0.2 mg kg-1 in feed) 2 2 16 16 2 2 16 16 1 8
Total
72
18
Table 2. Operating conditions for element determination by ICP-MS and SEC-ICP-MS
ICP-MS Operating Conditions Forward Power Plasma gas (Ar) Auxiliary gas (Ar) Nebuliser gas (Ar) Spray chamber Nebuliser Skimmer cone Sampling cone Acquisition mode Points per peak Integration time Isotopes monitored 1300 W 15 l min-1 1.26 l min-1 1.11 l min-1 Double pass (Scott type) Babington Nickel, 0.4 mm orifice Nickel, 1.0 mm orifice TRA 3 0.7 s
31 65
P,
34
S,
52
Cr,
66
53
Cr,
75
55
Mn,
78
56
Fe,
82
57
Fe,
59
Co,
63 200
Cu, Hg,
Cu, Hg,
64
Zn, Hg
Zn,
As,
Se,
Se,
111
Cd,
201
202
SEC Analytical column Mobile phase Injection volume Flow rate Biosep-SEC-2000 25 mM Tris-HCl buffer- 50 mM KCl (pH=6.8) 200 l 1.0 ml min-1
19
Table 3. Total metal contents in the fresh liver from control group and the percentage amount of these contents in a buffered extract (25 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 7.5).
Element
Total content in liver (g g )

-1
Extraction efficiency (%)
Reference material (certified value) 0.80 0.08 0.35b 9.60 0.16 76 2 5.9 0.2 7.37 0.91 0.34 0.02 -7.3 0.2 2.84 0.09
Reference materialc (experimental value) 0.9 0.1 0.34 0.01 9.2 0.7 72 5 5.7 0.2 7.45 0.78 0.37 0.04 -7.4 0.5 2.85 0.16
Cr Co Cu Zn As Se Cd Fe Mn Hg
a b c
2.69 0.09 0.041 0.001 3.70 0.06 14.9 0.6 0.112 0.004 0.45 0.08 0.019 0.001 114.9 5.1 1.12 0.03 nd
33 1 67 3 53 1 69 3 70 4 32 2 55 4 57 2 51 3 nd
Results expressed as mean value + SD for 4 determinations Recommended value Reference material: CRM 278R
20
Table 4. Element distribution by molecular weight of associated molecules in aqueous extracts of chicken liver
Element Retention time tr (min) 6.03 S 6.85 8.00 9.84 10.73 P 5.99 9.32 Cu 5.92 7.06 8.09 10.14 10.81 11.54 Zn 5.99 6.74 7.35 8.05 10.08 10.79 11.52 Se Broad zone 7.01 8.04 8.97 10.31 10.79 Mn 6.44 7.23 14.64 Fe 5.99 8.05 9.9
a
Molecular weight MW >300 170 50 5.7 2.2 >300 5.5 >300 135 45 4.7 2.2 1.1 >300 205 100 46 4.7 2.2 1.1 >300 190 45 17 3.8 2.3 >300 116 0.03 47 6
b
Peak area (%)a 7 29 29 7 28 1 99 4 18 67 8 3 7 13 11 67 2
28 20 30 8 13 7 37 56 60 39 1
>300
Percentage of total amount of the element present in injected volume of liver extract. (Element peak Estimation is out of optimum fractionation range of the column (1-300 kDa) given by the producer.
area)/ element peak areas)

b
21
Table 5. Total mercury and selenium concentrations in fresh chicken livers after Hg(II) and MeHg supplementation.
TREATMENT Basal diet Total Hg (g kg )

-1 a
Basal diet + Hg(II) (0.2 mg kg in feed)

-1
Basal diet + MeHg (0.2 mg kg-1 in feed)
nd
22 4
304 36
Total Se (g kg-1)a 450 83 385 69 465 118
Results of six independent chickens for each group. Three replicates for each
measurement (mean value + SD)
22
FIGURES CAPTION Fig 1. SEC-UV chromatogram of chicken liver. The black line shows the UV absorbance (280 nm) and the dotted line the UV absorbance (250 nm). Fig 2. Chromatograms obtained by SEC(300-1 kDa)-ICP-MS for chicken liver extract. Fig 3. Chromatograms obtained by SEC-ICP-MS: Selenium distribution profile. Fig 4. Mercury distribution profile after: Hg(II); Hg(II)+Se(IV); MeHg; treatment. Fig 5. Selenium distribution profile after: (A) Hg(II); (B) Hg(II)+Se(IV); (C) MeHg; (D) MeHg+ Se(IV) treatment. Fig 6. Zinc distribution profile after: (A) control; (B) Hg(II); (C) Hg(II)+Se(IV); (D) MeHg; (E) MeHg+ Se(IV) treatment. MeHg+ Se(IV)
23
Figure 1.
24
Figure 2
25
Figure 3
26
Figure 4
27
Figure 5
28
Figure 6
29
Discusin Integradora
DISCUSIN INTEGRADORA
El trabajo de investigacin desarrollado en esta memoria presenta una doble finalidad. Por un lado se ha abordado de forma global la resolucin de los problemas analticos que se presentan en la determinacin del contenido total de mercurio y selenio y sus especies en muestras de inters biolgico y nutricional. Para ello fue imprescindible desarrollar nuevos mtodos de tratamiento de muestra que mejorasen las prestaciones de los ya existentes, en cuanto a reduccin del tiempo empleado, simplicidad en el procedimiento y aumento de las recuperaciones; preservando en todo momento las especies originalmente presentes en la muestra. Por otra parte, una vez desarrollada y validada la nueva metodologa analtica, se aplic a la determinacin del contenido total de mercurio y selenio y sus especies e interaccin con protenas en alimentos de elevado consumo (principal va de entrada de mercurio y selenio en el organismo). Paralelamente los resultados obtenidos se han utilizado como herramienta para conocer los mecanismos de acumulacin, distribucin, transformacin e interaccin del mercurio y selenio en animales.
Desarrollo del trabajo realizado de forma globalizada
El trabajo desarrollado a lo largo de la presente memoria queda resumido en los siguientes puntos.
Extraccin de mercurio y sus especies
Desde que el inicio de la era industrial supusiera un aumento considerable en los niveles de mercurio en el medioambiente se han realizado numerosos esfuerzos para el desarrollo de una metodologa analtica fiable con el fin de llevar a cabo la elucidacin de las especies de mercurio presentes en los distintos compartimentos medioambientales. De hecho, la validacin de los mtodos analticos de especiacin de mercurio en alimentos y materiales biolgicos constituye todava un reto analtico debido a los riesgos asociados al proceso: pre-tratamiento de la muestra, volatilizacin, contaminacin, transformacin de especies durante el proceso de extraccin, derivatizacin, etc. En nuestro caso, en primer lugar se abord el desarrollo de procedimientos de pretratamiento de muestra reproducibles y eficaces que asegurasen tanto la integridad de las distintas formas qumicas presentes como la de sus concentraciones. Puesto que las muestras no siempre pueden ser analizadas inmediatamente despus de la toma de muestra, y teniendo en cuenta que la homogeneizacin as como la
277
extraccin de los analitos y su conservacin se ve favorecida en muestras desecadas, es importante evaluar los posibles riesgos asociados a la etapa de secado. Por tanto, con fines analticos habr que seleccionar las mejores condiciones de pre-tratamiento para llevar a cabo el anlisis del mercurio sin que se altere su concentracin original. En este sentido se evaluaron los riesgos asociados de prdida de mercurio en tres procedimientos de secado: secado en estufa, microondas y liofilizacin. Los tratamientos se aplicaron principalmente a muestras de atn y pez espada por tener un contenido en mercurio medio y alto. El empleo de una estufa convencional durante 48 h a una temperatura de 40C permiti el secado de las muestras sin que se detectasen prdidas debidas a la posible volatilizacin del mercurio. Sin embargo, el empleo del horno microondas y el proceso de liofilizacin condujeron a prdidas del 13% y 65%, respectivamente. Estos resultados experimentales ponen de manifiesto el hecho de que ambos procesos pueden constituir una fuente de error en la determinacin del mercurio total y sus especies en muestras de tejidos animales. Adems, el proceso de liofilizacin no slo puede provocar prdidas de especies voltiles, sino que algunas especies de inters pueden verse modificadas debido a la degradacin del enlace metal-protena que algunas muestras pueden experimentar. El hecho de que la bibliografa en este sentido no sea concordante puede deberse a la naturaleza de las especies presentes en la muestra. Por lo tanto, estos resultados se debern tener en cuenta para prevenir la prdida de analitos de inters, y consecuentemente, los errores que se pueden derivar, y debern ser considerados muy especialmente cuando se aborde la preparacin de materiales de referencia, puesto que la mayora emplean la liofilizacin en su preparacin. A continuacin se evalu la extraccin del mercurio en medio cido (HCl), bsico fuerte (KOH/MeOH) y dbil (TMAH/MeOH) y con el tensoactivo dodecilsulfato sdico (SDS). La extraccin cida es la opcin ms utilizada para extraer mercurio, aunque la capacidad de la extraccin alcalina de romper enlaces protena-Hg o lpido-Hg no debe olvidarse cuando se analizan especies de mercurio en tejidos biolgicos. Debido a la afinidad del mercurio con el azufre, y el hecho de que el SDS se haya empleado en la extraccin de otros metales, nos hizo pensar en un primer momento en su posible capacidad extractante. Para minimizar las desventajas de los procedimientos de extraccin
convencionales en trminos de tiempo, eficiencia y consumo de reactivos, estos se llevaron a cabo en un bao de ultrasonidos, acelerndose de esta forma el proceso de extraccin. Las variables optimizadas fueron: la concentracin, el volumen de extraccin de los reactivos, y el tiempo de sonicacin. Los resultados obtenidos mostraron que el nico
procedimiento que permita la extraccin cuantitativa de mercurio fue la extraccin cida, empleando 5 ml de HCl 5 M durante cinco minutos. La determinacin del contenido total de mercurio y sus especies en muestras slidas requiere de la obtencin de extractos lquidos en los que las especies de inters sean estables. Sin embargo, en muchas ocasiones la estabilidad de las especies vara en funcin del procedimiento de extraccin llevado a cabo y el tipo de muestra. El conocimiento de este dato en muestras reales, es de gran importancia, ya que permite su almacenamiento sin prdidas del analito de inters, evitndose el anlisis inmediato. La evaluacin de la estabilidad del mercurio en los extractos cidos demostr que estos eran estables a temperatura ambiente por lo menos durante una semana. Asimismo se estudi la recuperacin, mediante el empleo de disoluciones patrn de las especies sometidas a un tratamiento equivalente a la muestra, observndose su estabilidad durante todo el proceso. La extraccin de las especies de mercurio en muestras complejas constituye una etapa crucial ya que las especies deben extraerse cuantitativamente, preservando en todo momento su forma qumica. Para poder evaluar la integridad de las especies extradas, los extractos procedentes de las extracciones alcalina y cida fueron sometidos a un anlisis selectivo (reduccin con cloruro de estao y deteccin con CV-AFS) y a un anlisis de especiacin mediante el acoplamiento GC-pyro-AFS despus de la extraccin directa en un disolvente orgnico (diclorometano) y una etapa de limpieza. El empleo del anlisis selectivo permite la determinacin del mercurio inorgnico de forma directa y del mercurio total mediante el mismo procedimiento, pero con una etapa previa de digestin de los extractos con cido ntrico y perxido de hidrgeno. El mercurio orgnico se calcula por diferencia de los valores obtenidos en estas dos etapas. En lo que respecta a GC-pyro-AFS, este acoplamiento permite la determinacin individual de las especies en tiempo real. En las muestras tratadas con cido clorhdrico o con KOH/MeOH slo se detect una especie orgnica, el metilmercurio, sin embargo, cuando se emple TMAH/MeOH se detectaron dos especies orgnicas de mercurio, metilmercurio y dimetilmercurio. Por lo tanto, el tratamiento en medio bsico dbil supone la formacin artificial de la especie dimetilmercurio durante la extraccin. Asimismo se evalu la posible formacin artificial de dimeltilmercurio en disoluciones patrn de metilmercurio sometidas a las mismas condiciones que la muestra, obtenindose el mismo resultado, lo que corroboraba el hecho de que el tratamiento de la muestra con TMAH puede ocasionar la metilacin del metilmercurio en un 5%, constituyendo una fuente de error en la identificacin y cuantificacin de las especies de mercurio.
279
De los datos expuestos se puede concluir que el proceso de secado de las muestras de pescado en estufa (40C) y la extraccin con HCl de las especies de mercurio son dos tratamientos adecuados ya que se minimizan los riesgos de prdidas en el proceso de pre-tratamiento, siendo su extraccin cuantitativa y preservndose las especies. As pues, la metodologa propuesta permite llevar a cabo la determinacin de las especies de metilmercurio, dimetilmercurio y etilmercurio en muestras biolgicas mediante el acoplamiento GC-pyro-AFS sin la necesidad de emplear procedimientos de derivatizacin por etilacin. Por otra parte, la cuantificacin del metilmercurio y mercurio inorgnico en el extracto cido por ambos mtodos (CV-AFS y GC-pyro-AFS) pusieron de relieve que el anlisis selectivo permite discernir entre mercurio inorgnico y mercurio orgnico de forma rpida, y con posibilidad de limitar los posibles errores debido al bajo nmero de etapas implicadas en el proceso, la mnima preparacin de la muestra y al corto perodo de anlisis, si se compara con mtodos cromatogrficos.
Extraccin de selenio y sus especies
El descubrimiento de nuevas especies de Se y el importante papel que juega este elemento en los procesos vitales, ha originado un gran inters en el desarrollo de metodologas analticas fiables para la deteccin, elucidacin y cuantificacin de selenocompuestos en muestras de inters clnico y nutricional. En la actualidad existen numerosos procedimientos de extraccin del selenio total y sus especies en muestras biolgicas. Dado que en los tejidos animales el selenio se encuentra mayoritariamente incorporado a las protenas, formando parte de las selenoprotenas, la mayora de estos procedimientos estn basados en hidrlisis cidas, bsicas o enzimticas. Las hidrlisis cidas y bsicas provocan en algunos casos la degradacin de especies de selenio. Sin embargo, la hidrlisis enzimtica proporciona resultados ms prometedores, aunque este tratamiento se caracteriza por los elevados tiempos de incubacin requeridos. Por ello, se propuso realizar una hidrlisis enzimtica empleando una enzima no especfica (Streptomyces Griseus), que permitiera la extraccin de las especies de selenio de forma reproducible. Con el fin de disminuir los tiempos de extraccin, la hidrlisis se realiz con la ayuda de una sonda de ultrasonidos. La metodologa se aplic a muestras de msculo, rin e hgado de pollo y muestras de pienso.
Con el fin de optimizar los parmetros involucrados en el proceso de hidrlisis se estudiaron las siguientes variables: tiempo de sonicacin, naturaleza del extractante, temperatura, cantidad de enzima, amplitud del ultrasonidos y cantidad de muestra. En primer lugar se evalu el efecto del tiempo de sonicacin (10s-5min) y del medio extractante (H2O y tampn Tris-HCl) sobre la eficiencia de extraccin. Los resultados experimentales mostraron que la eficiencia de extraccin aumenta conforme se aumenta el tiempo de sonicacin alcanzndose la mxima recuperacin a los dos minutos. Por otro lado, el empleo de la disolucin reguladora Tris-HCl condujo a una recuperacin superior si se compara con el medio acuoso, tal y como cabra de esperar, puesto que las enzimas requieren un control de pH, de otro modo, la actividad enzimtica puede verse reducida o incluso inhibida. Puesto que la temperatura es otro factor que ha de controlarse para asegurar la ptima actividad enzimtica, y teniendo en cuenta que esta se incrementa como consecuencia de la cavitacin acstica, se estudi la influencia de la temperatura externa del vial (0-25C) en la recuperacin del selenio. El control de la temperatura no mejor la eficiencia de extraccin, por lo que se seleccion la temperatura ambiente como temperatura de trabajo ptima. Por otra parte, se evalu el efecto de la cantidad de enzima sobre la eficiencia de extraccin. Los resultados obtenidos mostraron que la concentracin de selenio total extrada aumenta con la cantidad de enzima, obtenindose recuperaciones cuantitativas con 20% (m/m) de enzima. La extraccin de Se slo fue cuantitativa cuando la energa de ultrasonidos se aplic en presencia de la enzima, hecho que corrobor la suposicin inicial de que una elevada fraccin del selenio total en los tejidos del pollo se encuentra enlazado a protenas. El perodo de tiempo extremadamente corto necesario para extraer las especies (2 minutos con ultrasonidos frente a 48 horas en ausencia de ultrasonidos) sugiri que la sonda de ultrasonidos facilita la ruptura de la pared celular de los tejidos estudiados, lo que favorece el contacto entre la enzima y los componentes intracelulares, que normalmente no pueden entrar en contacto con la enzima, o slo lo consiguen despus de elevados tiempos de incubacin. Finalmente, se investig el efecto que ejerce la cantidad de muestra y la amplitud del ultrasonido en la extraccin del selenio. El aumento de la cantidad de muestra (25-200 mg) as como la variacin de la amplitud del ultrasonidos en el intervalo estudiado (1030%) no influyeron en la recuperacin del Se. El mtodo de tratamiento de muestra desarrollado permite extraer
cuantitativamente el selenio en muestras de origen animal y vegetal en un periodo de tiempo extremadamente corto, reduciendo as drsticamente el tiempo involucrado con el empleo de los mtodos tradicionales.
281
Una vez desarrollada la metodologa para la extraccin de selenio total se abord el mismo estudio pero para la extraccin de especies. Las mejores recuperaciones se obtuvieron trabajando bajo las condiciones ptimas comentadas con anterioridad (20% enzima, tampn Tris-HCl, 2 min). Tras la hidrlisis enzimtica en Tris-HCl los compuestos de selenio extrados se procesaron por ultrafiltracin a travs de filtros de corte molecular de 10 kDa. Los resultados obtenidos, tras medida por ICP-MS, mostraron que el 50, 62, 70 y 93% del selenio extrado en muestras de rin, hgado, msculo y pienso, respectivamente, mostraba un peso molecular inferior a este tamao, lo que implica que parte del selenio permaneca an en forma peptdica. Este hecho se debe a que durante la hidrlisis enzimtica de protenas algunos de los enlaces peptdicos pueden permanecer inalterados, dependiendo de la especificidad de la enzima utilizada. Con el fin de asegurar que los compuestos de tamao molecular inferior a los 10 kDa no eran retenidos en los filtros, se determin el contenido total en disoluciones patrn sometidas a las mismas condiciones experimentales de tratamiento de muestra, despus de su filtracin. El mtodo propuesto supuso la recuperacin cuantitativa del selenio, lo que implicaba la ausencia de errores ocasionados por prdidas con este tratamiento de muestra. Para determinar la naturaleza de las especies de selenio presentes se emple el acoplamiento HPLC-ICP-MS, con cromatografa de intercambio inico, debido a la naturaleza de las especies estudiadas (selenoaminocidos, TMSe+ y especies
inorgnicas). La separacin de las especies tuvo lugar empleando una columna de intercambio catinico (Hamilton PRP-X200) bajo dos condiciones cromatogrficas diferentes (pH, 2.8 y 4.7), con el fin de una identificacin inequvoca de las especies de selenio. La fase mvil seleccionada fue formiato de piridina 4mM. Se observ que el orden de elucin estaba relacionado con el pH, siendo posible la identificacin de estas especies en menos de 20 minutos. Los resultados obtenidos muestran que los mecanismos de interaccin no obedecen, nicamente, a interacciones de tipo inico, dado que la especie Se(VI) es la especie ms retenida a los dos pHs de trabajo. Como consecuencia, deben existir mecanismos secundarios de interaccin, como son los de naturaleza hidrofbica entre la muestra y las regiones no inicas de la fase estacionaria polimrica. El anlisis cromatogrfico de los extractos de los hidrolizados de las muestras mostr la presencia de dos picos. El primer pico corresponde a un compuesto de Se no identificado, y podra deberse a una especie aninica de selenio que eluyese en el volumen muerto. Por el contrario, el segundo pico se identific por comparacin de los tiempos de retencin y adicin estndar, como selenometionina.
Por lo tanto, el mtodo propuesto permiti la identificacin de un selenoaminocido y su cuantificacin en las cuatro muestras analizadas. El porcentaje de SeMet con respecto al selenio total vara con el tipo de muestra. En el caso del pienso el 90% del selenio total se encontraba en forma de SeMet. Puesto que muchas plantas transforman predominantemente el selenio a SeMet, y teniendo en cuenta que los principales componentes del pienso son: maz, trigo y soja, el valor encontrado es comparable con el que aparece en la bibliografa para este tipo de cereales. Por el contrario, en los tejidos animales el porcentaje de SeMet encontrado fue inferior: 51, 13 y 8% del selenio total en el msculo, hgado y rin de pollo, respectivamente. Los animales no son capaces de sintetizar SeMet, por lo que esta proviene de su dieta. Adems, la SeMet se incorpora en las protenas de tejidos en el lugar de la metionina, especialmente en los msculos esquelticos y el hgado, lo que hace del msculo esqueltico la mayor reserva de Se. Por ello, la concentracin encontrada en el msculo es superior a la encontrada en los otros rganos. Una vez realizada la deteccin y cuantificacin de las especies, se evalu la estabilidad de las mismas durante el proceso de tratamiento de muestra propuesto. Las condiciones de extraccin deben ser cuidadosamente seleccionadas para conseguir la hidrlisis completa de las protenas con una mnima destruccin de las especies de selenio. Adems, no se debe olvidar la posibilidad de que el mtodo empleado de extraccin pueda suponer la transformacin de las especies de selenio, y por lo tanto que su contenido en los extractos pueda cambiar con respecto a la muestra en estado slido. Con el fin de mejorar la eficiencia del proceso en trminos de recuperacin de especies, preservando la integridad de las mismas, se aument el tiempo de sonicacin hasta 6 minutos. Los resultados mostraron que el hecho de incrementar esta variable no modificaba el rendimiento de la extraccin ni los cromatogramas obtenidos, es decir, que no apareci ninguna especie adicional. Este hecho ratifica la ausencia de interconversin entre las especies de selenio presentes en las muestras. Anlogamente al estudio realizado para el mercurio, se evalu la estabilidad de las especies de selenio en los extractos tras 48 h a temperatura ambiente. Se demostr que las especies permanecan estables y por lo tanto, nuestros resultados son comparables con los proporcionados por otros proceso enzimticos que requieren perodos de incubacin elevados (24-48h). Finalmente, y debido a la ausencia de materiales de referencia (uno de los mayores limitaciones de la especiacin), los resultados derivados de la especiacin fueron comparados con los obtenidos por un mtodo enzimtico previamente desarrollado en nuestro grupo de investigacin. Se obtuvieron los mismos perfiles cromatogrficos, y los mismos porcentajes de SeMet que los anteriormente comentados. Por lo tanto, el empleo de la hidrlisis enzimtica asistida por sonda de ultrasonidos (EPS) proporciona resultados
283
comparables a los obtenidos por otros procesos enzimticos que requieren un tratamiento de muestra mucho ms largo. De los datos expuestos se puede concluir que el mtodo propuesto (hidrlisis enzimtica + sonda de ultrasonidos) ofrece la posibilidad de extraer el selenio total de muestras biolgicas en un tiempo muy inferior al requerido por otros procedimientos, adems de tratarse de un mtodo caracterizado por el bajo consumo de reactivos, la simplicidad y seguridad del procedimiento. Paralelamente, este mtodo ha permitido disminuir drsticamente (tres rdenes de magnitud) el tiempo involucrado en la hidrlisis enzimtica de las muestras, si se compara con los mtodos establecidos hasta el momento, sin que se originen prdidas ni transformaciones de las especies qumicas estudiadas. Al mismo tiempo, la accin conjunta de la energa de ultrasonidos y la de la enzima permite la extraccin cuantitativa del selenio en un solo paso y sin necesidad de controlar la temperatura, a diferencia de lo que ocurre en otros mtodos.
Consecuentemente, las expectativas y perspectivas de aplicacin derivadas del empleo conjunto de enzimas y el ultrasonidos son bastante elevadas.
Validacin de la metodologa
El aseguramiento de la calidad de los resultados analticos implica el empleo de materiales de referencia certificados con los que contrastar los resultados obtenidos. Idealmente, el material de referencia seleccionado debe ser muy similar en matriz y composicin a la muestra objeto de estudio. Para establecer el rendimiento de la extraccin de mercurio en las muestras de pescado, el procedimiento de hidrlisis cida se aplic sobre el BCR-463 (atn certificado en MeHg). Los valores obtenidos pusieron de manifiesto la no existencia de diferencias significativas (nivel de probabilidad 95%) entre los resultados y el valor certificado. En el caso del procedimiento desarrollado para la extraccin cuantitativa de selenio en muestras biolgicas mediante la combinacin de la sonda de ultrasonidos y la hidrlisis enizimticas ste se valid empleando el CRM 278 (mejilln certificado en Se). En todos los casos las diferencias encontradas entre el valor certificado y el obtenido mediante el mtodo no fueron significativas al nivel de probabilidad del 95%.
Determinacin de mercurio y selenio y sus especies en pescados de elevado consumo
La exposicin al mercurio presenta notables riesgos para la salud humana, debido a sus efectos tetarognicos, inmunotxicos y especialmente neurotxicos. Su carcter
lipoflico facilita su absorcin en los tejidos grasos y por tanto su bioacumulacin a lo largo de la cadena alimentaria, hecho que explica la elevada concentracin de este compuesto en alimentos expuestos a bajos niveles de mercurio. Por ello, la continua monitorizacin de sus compuestos en alimentos se ha convertido en un aspecto de elevado inters en la comunidad cientfica actual. La principal fuente de mercurio en la alimentacin humana son los pescados, especialmente en pases como Espaa y Portugal, dnde su consumo es muy elevado. Este hecho ha puesto de manifiesto la necesidad de valorar y controlar el riesgo de exposicin humana a alimentos contaminados para poder cumplir con la legislacin vigente en materia de seguridad alimentaria. A pesar de las ventajas nutricionales que aporta el consumo de pescados, este puede constituir un riesgo por su conocida bioacumulacin y transformacion de especies de Hg. Por otra parte existen evidencias de que el Se presente en los pescados, aparte de ser un micronutriente esencial, podra contrarrestar el efecto txico del Hg. De hecho, en la bibliografa se han descrito mamferos marinos y aves con valores de selenio y mercurio extremadamente altos, y a pesar de esto, no mostraron ningn signo de intoxicacin. Esto sugiere que la presencia de ambos elementos puede proporcionar un efecto protector mutuo. Aunque la evaluacin del riesgo asociado a la exposicin del hombre al mercurio es de elevada importancia, se deben evitar las alarmas infundadas a los consumidores, puesto que los pescados presentan un elevado valor nutricional y son necesarios para una dieta equilibrada. Por esto, se debe proporcionar una informacin clara, basada en la investigacin, sobre las especies que presentan una relacin riesgo-beneficio ms favorable. De acuerdo con la metodologa y el plan de trabajo consignados en la memoria, el trabajo experimental ha tenido por objeto la evaluacin de la exposicin de las poblaciones espaolas y portuguesas a estos compuestos en el marco de dos acciones integrada entre ambos pases (HP2000-0049 y HP03-127). Para evaluar la exposicin de la poblacin espaola y portuguesa al mercurio a travs del consumo de pescado, se seleccionaron las especies ms comnmente consumidas, y se determin la correlacin Hg-Se. De esta forma puede valorarse no slo el riesgo que supone su consumo, sino las especies de mayor inters desde un punto de vista toxicolgico. Una vez seleccionadas las variedades de inters, se aplic la metodologa analtica desarrollada para la separacin, identificacin y cuantificacin de las especies de mercurio y selenio en los pescados. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que todos los pescados analizados cumplen la legislacin comunitaria (European Commission Decision 466/2001 y
285
222/2002) en cuanto a los valores de mercurio total. Pero cabe destacar que el contenido total de mercurio en el pulpo (0.024 g g-1), caballa (0.033 g g-1) y sardina (0.046 g g-1) se encuentra muy por debajo de los contenidos del pez espada y el atn (0.31-0.43 y 0.420.47 g g-1, respectivamente). Tal variabilidad se puede explicar por la interferencia de parmetros biticos como la edad, tamao, sexo, metabolismo y hbitos de alimentacin que afectan al proceso de bioacumulacin en los seres vivos. De hecho, el mercurio se biomagnifica en la cadena alimentaria acutica, por lo que los peces situados en un nivel trfico superior suelen tener niveles superiores de mercurio. Anlogamente se evalu la concentracin de selenio en las mismas muestras, aunque en este caso no se observ una variabilidad tan grande (0.13-0.92 g g-1). Por lo tanto, el pescado puede considerase una buena fuente de selenio que podra contribuir substancialmente a proporcionar la cantidad diaria recomendada por la Organizacin Mundial de la Salud. El conocimiento sobre las formas qumicas en que se encuentra el mercurio y el selenio en los alimentos tiene gran inters, puesto que su toxicidad depender de las especies encontradas y de su concentracin. Los estudios de especiacin de mercurio de las muestras de pescado, mediante el acoplamiento GC-pyro-AFS, previa extraccin cida, pusieron de manifiesto que ms del 92% del mercurio total aparece en forma de MeHg, la nica especie orgnica detectada, permaneciendo el resto en forma de mercurio inorgnico. Teniendo en cuenta estos resultados y los contenidos de mercurio total comentados con anterioridad, el consumo del atn y el pez espada se encontrara fuertemente restringido segn recomendaciones de la USEPA (Agencia de Proteccin Medioambiental de los Estados Unidos). Por otro lado, con el fin de evaluar la naturaleza de los selenocompuestos presentes, las muestras se sometieron a una extraccin acuosa y se observ que slo una fraccin muy pequea, entre un 3-10% del selenio total era soluble en agua. Posteriormente, tanto a la fraccin soluble como al residuo slido se aplic un tratamiento de hidrlisis enzimtico en dos etapas desarrollado previamente en el grupo de investigacin, pero modificando la enzima utilizada. A continuacin ambos extractos fueron procesados a travs de filtros de corte de 10 kDa. De esta forma se pudo estudiar como la distribucin de los compuestos de selenio variaba en funcin de la muestra analizada. En el caso del pez espada, se obtuvieron recuperaciones entre el 90-97%, lo que indica que el peso molecular de la mayora de las especies de selenio es inferior a 10 kDa. Sin embargo, cuando se analizaron el atn y la sardina las recuperaciones fueron notablemente inferiores (45-75%), lo que implica que la enzima no result tan efectiva para
la ruptura de los pptidos o protenas en fracciones de menor tamao como ocurra con el pez espada, por lo tanto el selenio debe permanecer en parte en forma peptdica. El anlisis de ambas fracciones por HPLC-ICP-MS, bajo dos condiciones cromatogrficas distintas permiti la identificacin de una nica especie de selenio, la SeMet. La SeMet es una de las especies que junto con la SeCys posee mayor importancia para la salud humana, puesto que presenta una elevada velocidad de absorcin, mayor retencin en tejidos y una mxima incorporacin a enzimas y protenas. La concentracin de SeMet vari dependiendo del tipo de pescado. El pez espada contena un porcentaje de SeMet de 85 a 93% del selenio total se encontraba en forma de SeMet, sin embargo el atn y la sardina presentaron porcentajes inferiores (45-46% y 2528% respectivamente). La relacin Se:Hg vari entre 3 (pez espada) y 22 (sardina). Adems, la relacin favorable encontrada entre MeHg y SeMet en la sardina (6.3), comparndola con la obtenida en el atn (3.8) o pez espada (2.7), pone de manifiesto su importancia nutricional desde el punto de vista toxicolgico. Por ello, su consumo sera preferible frente al de los otros dos pescados estudiados.
Para establecer el balance correcto de mercurio y selenio, tanto en el hombre como en los animales, es necesario estimar la eficacia del aporte de estos elementos a travs de la dieta. Para ello, no basta con determinar el contenido total, sino que es preciso conocer su biodisponibilidad, cantidad absorbida y utilizada por el organismo, ya que en la mayora de los alimentos, slo una parte es disponible. La biodisponibilidad de estos elementos implica no slo su absorcin en el intestino, sino tambin su conversin en una forma biolgicamente activa. La extensin de los efectos txicos causados por metales pesados no se debe exclusivamente a su concentracin total, sino que viene regulado por la forma en que el metal interacciona eficientemente con ligandos biolgicos. Por lo tanto, la biodisponibilidad depender de la posibilidad de las especies qumicas de llegar a los lugares de absorcin, principalmente el duodeno, para as cruzar la barrera intestinal. Estas formas qumicas pueden existir originalmente en los alimentos o modificarse durante el proceso de digestin. Consecuentemente, slo se absorbe y utiliza una proporcin de estos alimentos. La forma fsico-qumica del elemento ingerido determinar por lo tanto la fraccin absorbida del mismo, su grado de biodisponibilidad y sus vas metablicas en el organismo. El mercurio y el selenio son ejemplos de elementos consumidos en diferentes formas qumicas, por lo que resulta necesario conocer tanto la biodisponibilidad como el metabolismo de estas formas. Por lo tanto, la especiacin de los micronutrientes es
287
esencial tanto en los alimentos como en el tracto gastrointestinal para as entender y predecir la disponibilidad de absorcin. Con el fin de evaluar el porcentaje del nutriente transformado a una forma absorbible en el intestino se realizaron estudios de bioaccesibilidad in vitro, mediante la simulacin de una digestin gastrointestinal. Los estudios se llevaron a cabo sobre muestras de atn, pez espada y sardina y atn cocinado, para evaluar as el comportamiento de distintas especies de pescados de elevado consumo y el efecto que el proceso de cocinado ejerce sobre la bioaccesibilidad del mercurio y selenio. El contenido de mercurio y selenio de los extractos resultantes de la digestin estomacal e intestinal proporciona una medida de la fraccin de Hg y Se bioaccesible. Las recuperaciones obtenidas despus de someter los alimentos a una digestin gstrica (pH=2.0) y gastrointestinal (pH=6.8) simulada permitieron concluir que la bioaccesibilidad del selenio depende del tipo de alimento. Entre un 47 y un 70% del selenio presente en los pescados fue bioaccesible en la digestin estomacal, mientras que a un pH neutro (jugo intestinal), la fraccin bioaccesible oscil entre un 50 y un 83%. En el caso del atn la solubilidad del selenio despus de la digestin gstrica no difiri significativamente de la digestin gastrointestinal, sin embargo, la solubilidad del selenio en los sobrenadantes gastrointestinales en el caso de la sardina y pez espada fue un 17 y 60% superior respectivamente a los obtenidos en la digestin gstrica. Si se comparan los distintos pescados se observa que la bioaccesibilidad del selenio es superior en el caso del pez espada y sardina (76 y 83% respectivamente) que en el atn (50%). Esto puede ser consecuencia o de la diferente composicin de los pescados, puesto que tanto las protenas como el contenido en grasas puede afectar a la solubilidad del selenio, o de la diferente capacidad de las enzimas del mtodo in vitro desarrollado para liberar el selenio existente en cada muestra. En este caso la digestin gstrica empleada (pepsina /HCl) rompe las protenas fundamentalmente en pptidos de menor peso molecular a travs de la accin de proteinasas y peptidasas. La digestin intestinal a travs de la pancreatinina favorece la ruptura de los carbohidratos en monosacridos y protenas en pptidos. Finalmente, las sales biliares facilitan la digestin de las grasas debido a la formacin de emulsiones. En el caso del atn cocinado se observ que el selenio bioaccesible era ligeramente superior si se compara con el atn seco. Este hecho pone de manifiesto que el procesamiento de la muestra puede alterar la eficiencia con la que las enzimas digestivas liberan al selenio durante la digestin de los alimentos. Los procesos que involucran la aplicacin de calor favorecen la prdida de agua y vitaminas, adems de la degradacin de protenas. De esta forma se puede favorecer la digestin de esas protenas, lo que
facilitara la liberacin del selenio unido a protenas, y consecuentemente, se incrementara la bioaccesibilidad del mismo. Cuando se realizan estudios de bioaccesibilidad no debe olvidarse la posibilidad de transformacin que los procesos de digestin pueden ocasionar en las especies de selenio presentes en los alimentos. Para evaluar esta posibilidad se realiz la especiacin de Se en los extractos gastrointestinales. Adems, para poder dilucidar si el efecto del cocinado produce alguna diferencia potencial en la asimilacin de selenio en los humanos se analizaron igualmente el atn seco y el cocinado. Los estudios de especiacin sobre los extractos gstrico y gastrointestinal pusieron de manifiesto que la SeMet fue la especie predominante de selenio encontrada en el atn en ambos extractos. El cromatograma obtenido era anlogo al que se obtuvo cuando se aplic un proceso de hidrlisis enzimtica con la enzima Streptomyces griseus. Sin embargo, los extractos del pez espada y la sardina presentaron un pico mayoritario adicional adems del pico correspondiente a la SeMet. Asimismo se obtuvieron cromatogramas similares para los dos tipos de atn analizados, por lo que se puede concluir que el proceso de cocinado no modifica ni la integridad ni el contenido del selenoaminocido SeMet. Los resultados derivados de la cuantificacin de la SeMet permiten concluir que la cantidad de SeMet vara dependiendo de la especie de pescado analizado. El atn y la sardina mostraron una mayor concentracin de SeMet bioaccesible (0.245-0.290 g g-1) que el pez espada (0.147 g g-1), a pesar de que este ltimo mostr un mayor contenido en SeMet cuando se realizaba la hidrlisis enzimtica. A diferencia de lo que ocurra con el empleo de la enzima Pronasa (contenido de SeMet vari en funcin del pescado), en la digestin in vitro todos los pescados analizados proporcionaron el mismo porcentaje de SeMet bioaccesible, a pesar de que la bioaccesibilidad del selenio total vari en funcin de la especie animal. Por lo tanto, cabe concluir que la SeMet biodisponible debe estar localizada en protenas de naturaleza y accesibilidad similar. Paralelamente se evalu la bioaccesibilidad del mercurio. Las recuperaciones del mercurio endgeno en los sobrenadantes gstrico y gastrointestinal nuevamente variaron en funcin del tipo de muestra, como consecuencia de la diferencia de composicin de los pescados estudiados. Los resultados obtenidos mostraron que entre un 9 y un 20% del mercurio total se converta en bioaccesible despus de una digestin estomacal, y entre un 9 y un 17% despus de simular la digestin intestinal, siendo en el pez espada donde el mercurio se mostr ms bioaccesible. Estos resultados resultan contradictorios si se compara con los derivados de experimentos con animales suplementados con MeHg, en donde se observa una elevaba absorcin. Las bajas recuperaciones obtenidas pueden atribuirse a la poca capacidad de las enzimas del mtodo in vitro desarrollado para liberar
289
el Hg existente, ms que a la baja bioaccesibilidad del MeHg. De hecho, se obtuvo una recuperacin del 89% cuando se aplic el mismo tratamiento a un patrn de MeHg. La solubilidad del mercurio en la digestin gstrica difiri significativamente de la digestin gastrointestinal, puesto que la solubilidad gastrointestinal fue 40% inferior para el atn y 54% y 22% superior para el pez espada y la sardina. Para evaluar las posibles transformaciones de las especies de mercurio, principalmente MeHg, presente en el producto inicial, una vez simulada la digestin gastrointestinal se procedi a la especiacin en los extractos. Los resultados mostraron que el mercurio bioaccesible no se transform a mercurio inorgnico, sino que permaneci en forma de mercurio orgnico. Una vez determinado el contenido de mercurio y selenio bioaccesible, y su especiacin se determinaron las relaciones molares Se:Hg, [Se:Hg]bioaccesible, y
[SeMet:MeHg]bioaccesible. stas mostraron el mismo orden: sardina>atn>pez espada. Como consecuencia el pescado ms favorable para el consumo puede predecirse calculando la relacin molar Se:Hg. En este caso se prefiere el consumo de la sardina frente al consumo de las otras dos especies.
Efecto del enriquecimiento de piensos con selenio y arcillas en la acumulacin, distribucin y transformacin del mercurio
En la actualidad se ha de tener en cuenta que adems del consumo directo de pescado en la alimentacin animal se emplean productos derivados de la pesca debido a su elevado contenido en minerales y a que proporcionan una fuente rica de protenas. De hecho, la utilizacin de harinas de pescado en la crianza de aves ha supuesto una serie de ventajas entre las que destacan un rpido crecimiento, una mejor conversin del alimento, incremento de la inmunidad y mejor desarrollo del sistema nervioso y estructura sea. El empleo de piensos que contengan harinas de pescado puede originar niveles de mercurio no deseados, puesto que incluso bajos niveles de mercurio pueden causar su acumulacin por encima del lmite permitido en la mayora de los pases para alimentos no derivados de la pesca. Por lo tanto, la carne procedente de animales alimentados con productos derivados de la pesca podra contribuir a la exposicin del hombre al mercurio. Como consecuencia del aumento considerable de la presencia de mercurio que estn experimentando los productos de consumo animal se nos propuso formar parte de un proyecto de investigacin en colaboracin con la empresa Nanta. El proyecto consisti en establecer posibles formas de reducir la toxicidad del mercurio. Para ello se suplementaron en la dieta materiales adsorbentes no nutritivos capaces de unirse al
mercurio y reducir as su absorcin en el tracto gastrointestinal o agentes antagnicos del efecto txico del mercurio, como es el selenio. Las arcillas seleccionadas en este estudio (bentonita y sepiolita) presentan unas caractersticas fsico-qumicas especiales como elevada rea superficial, elevada capacidad de intercambio catinico y estabilidad qumica. Adems, se ha demostrado que su administracin a animales de experimentacin reduce el efecto txico de algunos compuestos como las aflatoxinas. Por otro lado, el selenio ha sido considerado como un antagonista potencial de la toxicidad del mercurio, por lo que conjuntamente con las arcillas se propuso su utilizacin para paliar los efectos negativos del mercurio y clarificar los posibles mecanismos de interaccin entre el mercurio y el selenio. El estudio se realiz con una poblacin de 160 pollos (Hybro-G) de un da de edad, y fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de 8 individuos para su posterior tratamiento. Durante los 42 das que dur el estudio los pollos fueron alimentados con una dieta basal (control) o con una dieta suplementada con diferentes compuestos: Hg(II), MeHg, Se(IV), sepiolita o bentonita (12 tratamientos diferentes). De esta forma se podra evaluar, por una parte la distribucin del mercurio y posible modificacin de los niveles basales de Se, y por el otro, el efecto que el Se, la bentonita y la sepiolita ejercan sobre la distribucin y bioacumulacin del mercurio. En la figura 8, se esquematiza los tratamientos utilizados en el estudio. Durante los 3 primeros das se les administr luz de forma continuada, despus fue programado un intervalo de 20 h de luz y 4 h de oscuridad al da. La dieta y el agua fueron administrados ad libitum. Para determinar la ganancia de peso y la eficiencia del alimento, los animales se pesaron a los 0, 21 y 42 das de estudio. No se observaron diferencias significativas en la ingesta del pienso, ni en la ganancia de peso en ninguno de los tratamientos experimentales. Por lo tanto, la adicin de Hg(II), MeHg, Se, benotita y sepiolita no afectaron a la ingesta y conversin del alimento. A los 42 das los animales fueron sacrificados y se seleccionaron sus hgados, riones, msculo y piel, los cuales se almacenaron individualmente a 18C. Con el fin de evaluar las posibles diferencias en el proceso de acumulacin del mercurio y selenio dependiendo del tejido y de la especie de mercurio administradas se determin el contenido de mercurio y selenio total de los pollos control y de los pollos alimentados con Hg(II) y MeHg mediante las tcnicas de CV-AFS y HG-AFS.
291
292
CONTROL
Hg(II)
Agua + Pienso
Agua + Pienso
enriquecido con Hg(II)
MeHg
Agua + Pienso
enriquecido con MeHg
Agua + Pienso enriquecido con sepiolita (2%)
CONTROL
Agua + Pienso enriquecido con bentonita (2%)
Hg Inorgnico Hg(II)
Hg Orgnico MeHg
Agua + Pienso enriquecido en Se
Agua + Pienso enriquecido con Se(IV)
Agua + Pienso enriquecido con Se(IV)
Figura 8. Esquema de los tratamientos experimentales utilizados
Los resultados mostraron que tanto su acumulacin como su distribucin dependi de la forma qumica administrada, a pesar de que ambas dietas tenan el mismo contenido de mercurio total (0.2 mg kg-1). La administracin de mercurio inorgnico y orgnico condujo a valores de acumulacin de 11.3 g y 180.4 g, respectivamente. Por lo tanto, el MeHg mostr una mayor biodisponibilidad (21%) que el mercurio inorgnico (1.3%). Adems, se observ que en ambos casos el msculo fue el rgano dnde se concentr la mayor cantidad de mercurio, pasando a ser este rgano una gran reserva del elemento, a pesar de ser el rin y el hgado los rganos diana bajo los tratamientos de Hg(II) y MeHg, respectivamente. El grupo control al que no se le adicion mercurio no mostr ninguna evidencia de contaminacin. La administracin de Se a travs del pienso condujo a valores de acumulacin de 365 g de selenio total y 168 g de Semet, bioacumulndose un 12% de Se total y un 5.6% de SeMet. Adems, se observ que el msculo fue el rgano donde mayor cantidad de selenio se concentr, constituyendo una gran reserva del elemento, aunque el rin y el hgado fueron los rganos diana para el Se total y la SeMet respectivamente. La administracin conjunta de Se(IV) y Hg(II) supuso la disminucin de la acumulacin del mercurio en todos los rganos del pollo estudiados (entre un 60 y un 100%), pero el rin permaneci como el rgano diana. Adems, se observ una variacin en su distribucin, lo que hace suponer que la proteccin ejercida por parte del selenio debe involucrar algn tipo de cambio en la distribucin del mercurio a un nivel subcelular. Consecuentemente, la adicin de selenio produjo una reduccin en la acumulacin del mercurio y promovi la redistribucin del mercurio desde rganos ms sensibles (rin e hgado) a menos sensibles (msculo). Por lo tanto, el selenio influye en la acumulacin del mercurio en los tejidos a travs de mecanismos especficos en cada tejido. As mismo, la presencia de mercurio inorgnico no modific significativamente los niveles endgenos de selenio en el hgado, msculo y piel, sin embargo s afect a su acumulacin en el rin. Por otra parte, la adicin del selenio a la dieta que contena Hg(II) s disminuy la bioacumulacin del primero en todos los tejidos. Como se ha comentado anteriormente el pienso suministrado a los pollos contiene aproximadamente un 90% del contenido de selenio en forma de SeMet. Una posible interaccin entre la SeMet del pienso y el Hg(II) y el Se(IV) adicionados puede explicar las diferencias encontradas en la bioacumulacin del selenio entre los dos tratamientos (Hg y Hg + Se). A diferencia de lo observado en el caso del mercurio, la distribucin del selenio permanece inalterada tanto en el grupo control, como en el grupo de Hg(II) y el grupo (Hg(II)+ Se). Por lo tanto, el mercurio inorgnico inhibi la absorcin del selenio sin alterar su distribucin.
293
Los resultados obtenidos cuando se co-administraron Se(IV) y MeHg mostraron que la acumulacin del metilmercurio no experimentaba las mismas variaciones que con el mercurio inorgnico. La acumulacin del mercurio orgnico en el rin no se vio modificada, pero s su acumulacin en el hgado, msculo y piel, alcanzando as el msculo los niveles de mercurio total que se encontraban en el rin en ausencia de selenio, y triplicando su concentracin el hgado. A pesar del aumento del mercurio total en el hgado, sin embargo se observ, una vez realizados los estudios de especiacin, que la proporcin de MeHg haba disminuido. Esto implica que la presencia de Se favorece la demetilacin del mercurio en un 145280%. Aunque se han llevado a cabo un gran nmero de estudios, los mecanismos de interaccin MeHg-Se an no estn muy establecidos. Se sabe que el Se reduce la secrecin biliar del MeHg. Como consecuencia, un proceso de excrecin biliar lento retrasara la eliminacin del metal del cuerpo del animal y se favorecera as su acumulacin y detoxificacin en el hgado. La presencia del MeHg no modific significativamente los niveles basales de Se en el pollo. Sin embargo la co-administracin de Se(IV) en la dieta no afect a la acumulacin del mismo en el msculo, el rin y la piel, pero s increment su nivel en el hgado. A diferencia de lo que ocurra con el mercurio inorgnico la distribucin del selenio s se vio afectada cuando se adicionaron al pienso MeHg o MeHg y Se. De hecho, el MeHg favoreci la redistribucin del Se del msculo al hgado, corroborando que en este rgano interaccionan ambos elementos cuando se administran simultneamente. Estos resultados enfatizan la relacin entre el Se y Hg, aunque el mecanismo por el cual el metabolismo del Hg en animales es modificado es bastante complejo y no se comprende en su totalidad. El empleo de las arcillas (bentonita y sepiolita) disminuy la bioacumulacin de mercurio inorgnico en todos los tejidos (64-100%), obtenindose mejores resultados con el empleo de la bentonita. Sin embargo, la presencia de estas arcillas en la dieta tambin disminuye considerablemente el contenido basal de Se en los cuatro tejidos estudiados, aunque el orden de acumulacin permanece inalterado. Consecuentemente, se puede concluir que ambas arcillas pueden disminuir en gran medida la acumulacin del mercurio inorgnico en pollos, por lo que podran emplearse en la dieta de animales como protectores del efecto txico del mercurio. Con respecto al MeHg, los resultados muestran una interaccin significativa entre la bentonita y el MeHg en el rin y el msculo, donde el contenido de mercurio se redujo un 67 y un 29% respectivamente, mientras que el mercurio en el hgado permaneci inalterado.
Por otra parte, la adicin de sepiolita no afect a la acumulacin de mercurio orgnico en los riones, pero s en el hgado, msculo y piel, permaneciendo el hgado como rgano diana. La concentracin de mercurio total en estos tejidos super la encontrada en ausencia de sepiolita. Consecuentemente, la inclusin de sepiolita parece causar un efecto similar en la acumulacin del MeHg al indicado previamente para el selenio. Con vista de estos resultados, el empleo de bentonita en la dieta de las aves puede ser beneficioso en el caso de que los animales consuman alimentos contaminados indistintamente con MeHg o Hg(II).
En un intento por clarificar el metabolismo del mercurio en aves y elucidar el mecanismo de interaccin entre el mercurio y el selenio se estudi la distribucin de las especies solubles de ambos elementos presentes en la fraccin proteica de los hgados de pollo. El estudio se realiz mediante la aplicacin de cromatografa de exclusin molecular (SEC) con deteccin UV e ICP-MS. El mercurio y el selenio pueden modificar su metabolismo, magnificando o reduciendo sus efectos debido a las interacciones entre estas especies y otros elementos presentes en el individuo. De hecho, los desequilibrios de los elementos esenciales causados por los metales pesados a menudo inducen a una disfuncin de rganos y tejidos. Por ello, para poder dilucidar los mecanismos que controlan la asimilacin del mercurio y selenio y los procesos de transporte, metabolismo y detoxificacin, se requiere informacin no slo de estos elementos, sino de otros elementos traza con funciones especficas en la clula. Consecuentemente, para estudiar estos efectos se realiz una deteccin multielemental. La extraccin de las protenas se llev a cabo en un medio regulado (25 mM TrisHCl, 50 mM KCl, pH=7.5) y con la ayuda de un Potter para favorecer as la ruptura de las clulas y la extraccin de las protenas. Para la separacin de las mismas se seleccion una columna de exclusin molecular con el intervalo de separacin comprendido entre 300-1 kDa y se evalu el efecto de distintas variables, tales como: pH, fuerza inica, concentracin de la fase mvil y caudal, sobre la separacin de protenas de peso molecular conocido. La mejor resolucin cromatogrfica se consigui utilizando como fase mvil Tris-HCl 25 mM (KCl 50 mM, pH=6.8, 1 ml min-1). La deteccin se realiz mediante el acoplamiento de SEC a UV e ICP-MS. Los elementos estudiados fueron Hg, Se, S, P, Cr, Co, As, Cd, Cu, Zn, Mn y Fe. Los resultados obtenidos mostraron contenidos totales y porcentajes de extraccin (3270%) dependientes del metal estudiado. En el citosol se encontraron los mismos porcentajes (>65%) de Co, Zn y As. En el caso del Mn, Cu, Cd y Fe estos aparecen distribuidos entre la fraccin citoslica y el residuo (51-57%), mientras que el Cr y Se (33-
295
32%) no aparecen mayoritariamente en el citosol, sino que probablemente estn enlazados a las membranas celulares o al ncleo, y por lo tanto, no pudieron ser extrados con este procedimiento. El azufre se distribuy fundamentalmente asociado a compuestos de alto y medio peso molecular (>300-45 kDa) y bajo peso molecular (2.2 kDa). La deteccin de este elemento es un indicador de las protenas (aminocidos que contienen azufre), por lo que su perfil cromatogrfico fue muy similar al obtenido por UV. La monitorizacin del fsforo condujo a un pico mayoritario en la zona de bajos pesos moleculares (5.5 kDa), precedido por un pico muy pequeo correspondiente a compuestos de peso molecular superiores a 300 kDa. El Cu, Zn y Fe se encontraron asociados fundamentalmente a especies de alto y medio peso molecular (>300-45 kDa). En este sentido, la existencia de fracciones de un mismo tamao con distintos metales indica la presencia de protenas con varios metales asociados a su estructura. Los compuestos de selenio aparecen asociados a compuestos con un peso molecular comprendido entre 190 y 2.3 kDa. El estudio de la distribucin de los compuestos de selenio en la fraccin soluble de los hgados de pollos control sugiere que las principales formas en las que se encuentra el selenio es constituyendo selenoprotenas especficas, y slo una fraccin muy pequea del selenio soluble se encuentra en forma de selenometionina. Una vez establecidas las caractersticas de los hgados de pollo del grupo control se llev a cabo el mismo estudio en hgados de los pollos que haban sido sometidos a los tratamientos anteriormente mencionados: Hg(II), Hg(II)+ Se, MeHg y MeHg + Se. Los porcentajes de recuperacin del mercurio fueron del 57-90% en funcin de la especie de mercurio empleada. El mercurio inorgnico mostr una elevada eficiencia de extraccin (90%) mientras que el MeHg se distribuy equitativamente entre el citosol y el residuo, por lo que ambas especies mostraron una distribucin subcelular diferente. La exposicin prolongada a Se(IV) no modific la distribucin subcelular del mercurio inorgnico, pero s la del mercurio orgnico. La co-administracin de MeHg y selenito sdico caus una disminucin en el porcentaje de Hg encontrada en el citosol, lo que implica que la interaccin mercurio orgnico-selenio favorece un incremento del primero en la fraccin nuclear/mitocondrial. Los cromatogramas obtenidos se asemejaron a los cromatogramas obtenidos en UV y los cromatogramas del azufre, lo que sugiere que el Hg se une a grupos sulfhidrilo y se enlaza as a protenas. El mercurio aparece fundamentalmente asociado a protenas de peso molecular alto y medio, con un pico mayoritario en la regin de los 45 kDa que constituye aproximadamente el 50% del mercurio extrado.
La adicin de selenio a la dieta que contena mercurio inorgnico no afect a los perfiles cromatogrficos del mercurio, aunque s vari la intensidad de los picos. Por otro lado, la adicin de Se a la dieta que contena MeHg origin importantes cambios en la distribucin del mercurio. La adicin conjunta de Se(IV) y MeHg favoreci la formacin de nuevas especies moleculares de mercurio de 1 kDa de peso molecular y adems un desplazamiento hacia las masas de mayor peso molecular. Este efecto slo se observ cuando se administraron conjuntamente MeHg y selenito, lo que corrobora, como se ha comentado anteriormente, la interaccin mercurio-selenio que ocurre en este rgano. Con respecto a los porcentajes de recuperacin de selenio obtenidos en todos los casos la presencia del mercurio no caus ningn efecto relevante. En todas las muestras analizadas se recuper el 30% del selenio total. La distribucin del selenio apenas se vio modificada con la adicin a la dieta de Hg(II) o Hg(II)+ Se(IV), sin embargo, la presencia de MeHg favoreci la formacin de especies de selenio de elevado peso molecular. Adems, cuando se co-administraron conjuntamente Se y MeHg no slo se vio favorecida la formacin de especies de selenio de alto peso molecular, sino que apareci un nuevo pico (30% del Se) con un tamao aproximado 2 kDa. Esto corrobora la interaccin mercurio-selenio en el hgado a nivel subcelular sugerida con anterioridad. Por lo tanto, este estudio proporciona informacin sobre la distribucin del Hg y Se en hgado de pollo despus de ser sometidos a diferentes tratamientos, enfatizando la relacin entre el mercurio y el selenio. Pero an se requieren estudios que involucren el empleo de tcnicas complementarias para as intentar identificar estas especies y comprender as su metabolismo. Los tratamientos que involucraron el mercurio inorgnico no afectaron a la concentracin y distribucin multielemental estudiada, indicando que la adicin de Hg(II) no supuso ningn efecto adverso en la concentracin de los elementos traza al igual que en la distribucin de sus especies. Mientras, los tratamientos con el mercurio orgnico si modificaron la distribucin del zinc. Las especies de Zn asociadas a altos pesos moleculares (>300-45 kDa) varan del 36% (hgado control) al 48% (MeHg) y 56% (MeHg + Se). El MeHg redistribuye el Zn apareciendo nuevas especies de elevado peso molecular. De hecho, un pico desaparece (100 kDa) y aparece un nuevo pico a 80 kDa. Los resultados experimentales derivados de este estudio constituyen una importante aportacin dado el estado actual del conocimiento, puesto que se inicia el camino hacia la identificacin y caracterizacin de las biomolculas de mercurio y selenio. Adems, constituye el comienzo de una investigacin que requiere procesos previos de purificacin con el fin de llevar a cabo su elucidacin estructural y el establecimiento de su funcin biolgica.
297
Conclusiones
Conclusiones
CONCLUSIONES
A lo largo de la investigacin recogida en esta memoria, se han cubierto los objetivos propuestos al inicio del trabajo. Las conclusiones ms relevantes de esta Tesis Doctoral se resumen a continuacin:
El mtodo analtico desarrollado basado en el secado previo de la muestra en estufa y el empleo posterior de HCl como medio extractante permite la extraccin de las especies de mercurio presentes en muestras biolgicas de forma cuantitativa, manteniendo su integridad durante todo el proceso de extraccin. Adems, se ha demostrado que los extractos cidos son estables durante una semana, no producindose variaciones en la concentracin de mercurio total. Como consecuencia, es posible el almacenamiento de los extractos durante el periodo mencionado, evitndose la necesidad del anlisis inmediato. El mtodo ha sido aplicado satisfactoriamente para la determinacin de las especies de mercurio en pescados, y validado mediante su aplicacin a un material de referencia. La metodologa desarrollada permite la determinacin de las especies de mercurio sin necesidad de emplear procedimientos ms laboriosos como derivatizacin por etilacin.
El empleo del microondas o liofilizacin como procedimientos alternativos de secado de muestra, y el extractante TMAH puede conducir a errores en la determinacin de las especies de Hg por prdidas de las especies voltiles o formacin artificial de dimetilmercurio, respectivamente.
El mtodo desarrollado basado en la combinacin de la energa procedente de una sonda de ultrasonidos y un tratamiento enzimtico permite la extraccin del contenido total de selenio y sus especies en muestras biolgicas en un tiempo muy inferior al requerido por otros procedimientos, sin que se originen prdidas ni transformaciones de las especies qumicas estudiadas. Este mtodo de extraccin ha sido aplicado satisfactoriamente a muestras de origen vegetal y animal y se caracteriza por el bajo consumo de reactivos, la simplicidad y seguridad del procedimiento.
La determinacin de Hg total y sus especies en pescados de elevado consumo en Espaa y Portugal pone de manifiesto que los pescados seleccionados tienen la habilidad de acumular elevadas concentraciones de Hg, fundamentalmente MeHg. Este hecho merece especial atencin debido al elevado valor nutricional de este alimento, necesario en una dieta equilibrada. Por ello, se establece la necesidad de monitorizar los
301
Conclusiones
compuestos de Hg en alimentos para evitar as posibles riesgos para la salud. Por otra parte, la determinacin de las especies de Se en dichas muestras, mediante HPLC-ICPMS puso de manifiesto que la SeMet es la especie mayoritaria en todas las fracciones analizadas, variando su contenido segn el tipo de pescado.
Estudios de bioaccesibilidad de Hg y Se llevados a cabo mediante la simulacin de una digestin gastrointestinal in vitro demostraron que sta depende del tipo de muestra analizada, excepto en el caso de la SeMet, lo que implica que esta especie se encuentra presente en los pescados en protenas de la misma naturaleza. Las especies de Hg y Se permanecen inalteradas durante todo el proceso de digestin, resultando ms disponible las especies de Se.
El pescado ms recomendable para el consumo humano puede predecirse calculando la relacin molar Se:Hg. De todos los pescados estudiados la sardina ha resultado ser la especie ms idnea.
El enriquecimiento de piensos con un agente antagnico del efecto txico del Hg (Se) y con materiales adsorbentes (bentonita y sepiolita) ha resultado ser adecuado para reducir la toxicidad del Hg inorgnico en aves. Adems, el empleo de bentonita en la dieta puede ser beneficioso en caso de que los animales consuman alimentos contaminados con MeHg, ya que disminuye su acumulacin.
La cuantificacin, especiacin y distribucin de los compuestos de Hg y Se, pone de manifiesto la biotransformacin de ambos elementos, as como el antagonismo ejercido por el Se como resultado de su interaccin con el Hg cuando se administran simultneamente en aves.
Se ha demostrado, asimismo, que la interaccin Hg-Se depende son slo de la forma qumica en la que est presentes, sino del rgano implicado. Entre todos los rganos estudiados el hgado est implicado directamente en los procesos de detoxificacin.
302
Anexo
Glosario de trminos
GLOSARIO DE TRMINOS
AAS ADN AES AFS ARN ASE BDDA CAR CE CRM CT CV Cys DESe DIN DMDSe DMSe DOC DVB ECD ESMS ETAAS EtHg FAAS FI FID FTIR GC Gly GPX GPX1 GPX2 GPX3 GPX4 GSSeSG, GSSeH
Espectroscopa de absorcin atmica cido desoxirribonucleico Espectroscopa de emisin atmica Espectroscopa de fluorescencia atmica cido ribonucleico Extraccin con disolventes acelerada Bromuro de didodecildimetilamonio Carboxeno Electroforesis capilar Material de referencia certificado Atrapamiento criognico Vapor fro Cistena Dietilselenio Nebulizador de inyeccin directa Dimetildiselenio Dimetilselenio Materia orgnica disuelta Divinil-benceno Captura electrnica Espectrometra de masas con electrospray Espectroscopa de absorcin atmica con cmara de grafito Etilmercurio Espectroscopa de absorcin atmica con llama Inyeccin en flujo Detector de ionizacin en llama Transformada de Fourier Cromatografa de gases Glicina Glutadiona peroxidasa Glutadiona peroxidasa celular, clsica o citoslica Glutadiona peroxidasa gastrointestinal Glutadiona peroxidasa plasmtica Fosfolpido hidroperoxidasa Intermedios metablicos del selenio ingerido con la glutadiona peroxidasa
305
Glosario de trminos
HG HHPN HPLC HS ICP ICP-AES Generacin de hidruros Nebulizador hidrulico de alta presin Cromatografa lquida de alta eficacia Espacio de cabeza Plasma de acoplamiento inductivo Espectroscopa de emisin atmica con plasma de acoplamiento inductivo ICP-MS L. D. LC Lys Me2Hg MeHg MeOH MIP MIP-AES MS MW NaBEt4 OCN PDMS PrSeCys2 Rfd RP SBM SDS SEC SeCys SeCys2 SeEt SeMet SeOMet SeUr SNC SPME tARN TMAH TMSe
+
Espectrometra de masas con plasma de acoplamiento inductivo Lmite de deteccin Cromatografa de lquidos Lisina Dimetilmercurio Metilmercurio Metanol Plasma inducido por microondas Plasma inducido por microondas-Espectroscopa de emisin atmica Espectrometra de masas Microondas Tetraeltilborato de sodio Nebulizador de capilar oscilante Polidimetilsiloxano Propil-selenocistina Dosis de referencia Fase reversa Seleniuro bis(metilmercrico) Dodecil sulfato sdico Cromatografa de exclusin molecular Selenocistena Selenocistina Selenoetionina Selenometionina xido de la selenometionina Selenourea Sistema nervioso central Microextraccin fase slida cido desoxirribonucleico translacional o de transporte Hidrxido de tetrametilamonio Ion trimetilselenonio
306
Glosario de trminos
TRIS UGA US-EPA USN UV Uv-Vis VIH Tris-(hidroximetil)-aminometano Triplete de bases uracilo-guanosima-adenina Agencia Americana para la proteccin del Medio Ambiente Nebulizacin ultrasnica Ultravioleta Ultravioleta-visible Virus de inmunodeficiencia humana
307

Ucm t28514

Cargado por

Información del documentohacer clic para expandir la información del documento

Información del documentohacer clic para expandir la información del documento

Copyright:

Formatos disponibles

Ucm t28514

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Ucm t28514

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Departamento de Qumica Analtica

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

ANA ISABEL CABAERO ORTIZ Madrid, 2005

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Directoras: Dra. Carmen Cmara Rica Dra. Yolanda Madrid Albarrn

ANA ISABEL CABAERO ORTIZ Madrid, 2005

Ciudad Universitaria 28040 Madrid (Espaa) Telef. 913944331 Fax. 913944329

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,

Madrid, 12 de mayo de 2005

Fdo. Carmen Cmara Rica

Fdo. Yolanda Madrid Albarrn

A mis apoyos incondicionales, mis padres, mi hermanos y mis abuelos

2. IMPORTANCIA TOXICOLGICA DEL MERCURIO Y SUS DERIVADOS.

3. FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO...

CAPTULO II. SELENIO: ELEMENTO ESENCIAL PARA LOS SERES VIVOS

2. RELEVANCIA BIOLGICA DEL SELENIO..

3. FUENTES DE SELENIO EN LA DIETA Y SU BIODISPONIBILIDAD..

CAPTULO III. INTERACCIN MERCURIO-SELENIO

3. DETERMINACIN DE ESPECIES DE MERCURIO.... 111

4. EXTRACCIN DE ESPECIES DE SELENIO...

5. DETERMINACIN DE ESPECIES DE SELENIO...

D. DISCUSIN INTEGRADORA.. 275 E. CONCLUSIONES... 299 F. ANEXO: GLOSARIO DE TRMINOS. 303

OBJETIVOS DEL TRABAJO

IMPORTANCIA TOXICOLGICA DEL MERCURIO Y SUS DERIVADOS

FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO

MERCURIO: ELEMENTO TXICO PARA LOS SERES VIVOS

Mercurio en el medio ambiente

MERCURIO: ELEMENTO TXICO PARA LOS SERES VIVOS

1. MERCURIO EN EL MEDIO AMBIENTE

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

Toneladas 58.6 49.8 48.5 28.5 8.7 6.5 16.2

* Hg0= vapor mercurio elemental, Hgp=mercurio asociado a partculas

Mercurio en el medio ambiente

. Las emisiones naturales de mercurio estn fuera de nuestro control y

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

1.2. ESPECIES PRESENTES EN EL MEDIO NATURAL

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

Tabla 2. Concentraciones medias de mercurio total en diferentes muestras medioambientales

Mercurio en el medio ambiente

Figura 1. Distribucin del Hg en los diferentes compartimentos medioambientales

Mercurio en el medio ambiente

Mercurio en el medio ambiente

3. FUENTES DE EXPOSICIN DEL HOMBRE AL MERCURIO

ACCIDENTES El mercurio se conoce desde hace ms de 3500 aos, pero su uso se ha

Tabla 3. Biomagnificacin de mercurio inorgnico y metilmercurio en la cadena alimentaria85

Nivel trfico Agua Fitoplancton Zooplancton Pescados

Fuente de exposicin Aire Alimentos Pescado Otros

Mercurio elemental vapor 0.030 (0.024) 0 0 0 3.8-21 (3-17) 3.9-21 (3-17)

Metilmercurio 0.008 (0.0064) 2.4 (2.3) 0 0 0 2.41 (2.31)

Agua potable Amalgamas dentales Total

Expert panel on Mercury Atmospheric Processes, 1994, Mercury atmospheric processes: