22/01/2019

Las técnicas de PCR

Tema 6

Definición
 La reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una
técnica que permite replicar
entre cientos de miles y
millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in
vitro, una región específica de
ADN Al simular la forma en
como se replica al ADN de
forma natural

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¿Qué ocurre In vivo?

La replicación:
 Es el proceso que permite copiar exactamente las dos hebras de ADN.
 El primer paso es el desenrollamiento de la doble hélice y la separación
de las dos hebras de ADN a través de la helicasa.
 El paso siguiente es la síntesis de las nuevas cadenas de ADN en cada una
de las hebras. La ADN polimerasa es la enzima que permite esta
síntesis

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente

indispensable en laboratorios de investigación médica y
biológica para una gran variedad de aplicaciones.
Entre ellas se incluyen

La clonación de
ADN para la La filogenia basada El análisis funcional
secuenciación, en ADN de genes

La detección y La identificación de huellas

genéticas (usada en técnicas El diagnóstico de
diagnóstico de
forenses y test de trastornos
enfermedades paternidad) hereditarios
infecciosas

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PCR
 Si bien la polimerasa es capaz de fabricar a partir de una molécula
de ADN dos copias iguales…surgen dos problemas que necesitan
solución:

 ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de replicación la técnica

únicamente se copie el fragmento que nos interesa, entre una mezcla
compleja de ADN? CEBADORES
 ¿Como conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN
polimerasa por la temperatura elevada que es necesaria en la fase de
desnaturalización del ADN molde? Taq POLIMERASA

Los cebadores
 Los cebadores (primers) son oligonucleótidos monocatenarios con una
longitud entre 18 y 30 pares de bases cuya secuencia es complementaria
a los extremos del fragmento de ADN que queremos amplificar
 Se diseñan siempre por parejas
 El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´ a
3´se denomina cebador F o forward
 El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´a 3´ se
denomina cebador R o reverse
 Como la polimerasa necesita la cadena de doble hélice para empezar a
trabajar, esa porción la aporta los primers cuando se unen a su secuencia
complementaria
 Un juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de
una molécula de ADN que se amplificará y será la comprendida entre
ambos

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Taq Polimerasa
 Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas
de ADN es necesario que el ADN molde sea monocatenario*.
Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por
una fase de desnaturalización por calor, lo que supone un
problema para las ADN polimerasas convencionales. Esta
dificultad se superaba al principio añadiendo enzima nueva en
cada ciclo, lo que la convertía en una técnica costosa y larga
 El hecho que posibilitó el desarrollo espectacular de la PCR
fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables
aisladas de un grupo de bacterias extremófilas que tenían
actividad polimerasa a altas temperaturas

Desarrollo
 La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en
1983 por el Doctor Kary Mullis. El Dr. Mullis recibió en
1993 el Premio Nobel de Química por este descubrimiento.
Al recibir el premio dijo esto: “Antes del la PCR, el DNA era
largo y fibroso, en absoluto molecular…Yo había resuelto uno de los
principales problemas de la química del DNA en un solo paso:
abundancia y distinción”

 Cabe destacar que, antes de la PCR existían métodos para

aislar fragmentos de DNA basados en la clonación, pero estos
métodos resultaban mucho más costosos en tiempo y en
dinero.

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¿Qué componentes son necesarios

para la PCR?

Otros
elementos

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Proceso de la PCR
 El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir
de la siguiente forma: partiendo de un ADN molde, una
enzima (la ADN Polimerasa) incorpora nucleótidos
complementarios a partir de la zona de doble cadena
originada por la unión de los cebadores al molde. El proceso
se da en tres fases: Desnaturalización, alineamiento
extensión y elongación final.

Desnaturalización
Mediante un calentamiento a 94°C, el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o
desnaturalicen
Se rompen puentes de hidrogeno.
Las bases nitrogenadas quedan expuestas

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Alineamiento
 Es el proceso en el que los primers o cebadores se unen al ADN

 Ocure cuando la mezcla es enfriada hasta 55°C

 En este momento, dentro del tubo de reacción, todo el ADN está en forma de cadena
simple, menos las dos pequeñas regiones en las cuales los primers de 20 pares de bases
se ligarán a los dos lados de la secuencia de ADN

Extensión/Elongación
(polimerización)
 La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y la Taq polimerasa comienza a
sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en
donde cada uno de los primers se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq
polimerasa promueve la síntesis de ADN apenas en la región de doble cadena.
La síntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20 nucleótidos por segundo,
y en un minuto es sintetizada una nueva copia del fragmento que se quiere
analizar.

dNTPs
1 min. Para alargar 1000 nucleótidos

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Elongación final
Es común que al finalizar todos
los ciclos se realice un último
alargamiento por 5 min. a 72ºC,
para asegurarse que todos los
productos de amplificación estén
completamente terminados
y tengan, por ende, exactamente
la misma longitud

Ciclos de una PCR

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Especificidad de la reacción de la PCR

 La especificidad de la PCR depende, fundamentalmente, de
la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la
cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción
(además de depender de la secuencia de los cebadores).

 Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en

la fase de hibridación, más específica es la reacción. Por otra
parte, en un determinado rango, incrementos en la
concentración de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de
la reacción.

¿Cuántos fragmentos se generan durante la

reacción de PCR?
Al final del proceso se obtiene aproximadamente una cantidad de
fragmento igual al producto de la cantidad inicial de ADN
molde por 2n, siendo n el número de ciclos. Como dato para
apreciar la cantidad de copias que se generan, en el ciclo 20 se
ha multiplicado por más de un millón la cantidad inicial de ADN
molde.

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¿Cómo se prepara?

1. Primero se prepara la mezcla de reacción (en cantidad

suficiente para todas las muestras) que contenga todos los
componentes de la PCR, a excepción del ADN molde.
2. Después añadimos ADN a cada tubo que será el unico
elemento diferenciador
3. En un tubo añadiremos agua molecular en vez de ADN que
será nuestro control negativo
4. En otro tubo añadiremos ADN que imite las condicines de
PCR que han funcionado anteriormente que actuará como
control positivo

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Aplicaciones
• Detección de enfermedades hereditarias
• Investigaciones forenses
• Test de paternidad
• Huella genética

Detección de Enfermedades
Hereditarias
 Cada gen en estudio puede ser amplificado fácilmente por PCR,
con los cebadores adecuados, y luego ser secuenciado, para así
determinar si un individuo porta alguna mutación que explica la
presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro, la que
puede ser heredada a sus hijos.

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Huella digital genética

 Es una técnica forense que permite
identificar a una persona comparando
su DNA con el de una muestra
obtenida, por ejemplo, de la escena
de un crimen.
 Como la muestra puede ser muy
escasa, la PCR permite aumentar la
cantidad de DNA amplificando
ciertos segmentos polimórficos
(variables en la población), para
luego poder compararlos

Test de Paternidad
 Amplificando por PCR fragmentos polimórficos de DNA de la madre,
del niño y de él o los presuntos padres, y separándolo mediante
electroforesis, se puede visualizar una serie de segmentos que tiene el
niño, que debe compartir con la madre y padre biológicos.

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Otras aplicaciones
 También, es la identificación de ciertos genes asociados a diferentes
enfermedades familiares como la fibrosis quística, la distrofia muscular
de Duchenne y otras muchas.
 En la serología o el estudio histopatológico de las muestras, la
amplificación de ácidos nucleicos por medio de la PCR aporta grandes
ventajas, como son una gran sensibilidad diagnóstica, así como una
elevada especificidad. Uno de los ejemplos paradigmáticos de la
utilidad clínica de la PCR es el diagnóstico de la encefalitis por el virus
herpes simplex.
 La PCR ha ayudado a establecer el pronóstico de distintas infecciones
por medio de la determinación cuali/cuantitativa del virus de la
hepatitis C o por medio de la determinación de la viremia plasmática
en la infección por el VIH, en la que está reconocida la importancia de
la determinación de la carga vírica en sangre en el pronóstico de la
infección y también en la evaluación del tratamiento.

Ventajas y desventajas de la PCR

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Rapidez y sencillez de uso

 La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando
equipos relativamente poco sofisticados.
 Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de
desnaturalización, síntesis y reasociación.
 Cada ciclo dura típicamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un
VENTAJAS termociclador que lleva un microprocesador para programar
los cambios de temperaturas y el número de ciclos
DEL “PCR” deseado.
 Por supuesto, el diseño y síntesis de los oligonucleótidos
cebadores también lleva tiempo, pero este proceso ha sido
simplificado gracias a la aparición de programas
informáticos para el diseño de los cebadores.
 Una vez que se pone a punto, la reacción puede ser
repetida de forma sencilla.

Sensibilidad

 La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades

ínfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en
una sola célula.
VENTAJAS  La elevada sensibilidad ha permitido:
Desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la
patogénesis molecular
La aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense,
diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc)
donde las muestras pueden contener muy pocas células.
Sin embargo, el hecho de que el método tenga una
sensibilidad tan elevada significa también que se deben
extremar las precauciones para evitar la contaminación de la
muestra con ADN extraño.

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 Esto hace que el método resulte

muy adecuado para estudios de
antropología y paleontología
molecular,
 El método se ha empleado con
Robustez éxito también para la
amplificación de ADN de muestras
 La PCR permite la de tejidos fijadas con formol, lo
amplificación de secuencias cual ha tenido importantes
específicas de material que aplicaciones en patología
VENTAJAS contiene ADN muy molecular.
degradado, o incluido en un
medio que hace
problemática su purificación
convencional.

Necesidad de disponer de
información sobre la
DESVENTAJAS secuencia del ADN diana
DE “PCR”
 Para poder construir oligonucleótidos específicos
que actúen como cebadores para la amplificación
selectiva de una secuencia particular de ADN se
necesita:
 Disponer de alguna información previa sobre la
propia secuencia a amplificar.
 La región de interés ya debió haber sido
parcialmente caracterizada, a menudo mediante la
aplicación de métodos de clonación basados en
sistemas celulares.

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Tamaño Una desventaja clara de la PCR como

método de clonación de ADN ha sido el
corto de los tamaño de las secuencias de ADN que
productos permite clonar.
de la PCR  La información de que se dispone sobre la
mayor parte de secuencias clonadas por PCR
sitúa el tamaño de los fragmentos clonados
sobre 5 Kb.
 Los fragmentos pequeños se amplifican muy
fácilmente, pero conforme aumenta su
tamaño es más difícil obtener una
amplificación eficiente.

 La clonación del ADN en células

pasa por la replicación del ADN in
vivo, proceso asociado a una gran
fidelidad de copiado debido a la
DESVENTAJAS existencia, en la célula, de
mecanismos de lectura y
corrección de errores.
Infidelidad en  Sin embargo, cuando el ADN se
la replicación replica in vitro la tasa de errores
del ADN cometidos durante el copiado
se dispara.

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 La facilidad con que se amplifica el

ADN exige evitar el peligro de
contaminación inherente al poder
multiplicador de la reacción.
DESVENTAJAS
 En un tubo en el que se ha realizado
una reacción de PCR hay tal
cantidad de ADN, que al salir
Peligro de caliente del termociclador y abrir
este, el vapor alcanza el ambiente
contaminación del laboratorio.
 Hay peligro de contaminarse con
otro ADN incluso puede ser del
mismo investigador u otro.

 Necesidad de primers específicos que sean

complementarios al fragmento que se desea
sintetizar obliga a conocer las secuencias de
los extremos

DESVENTAJAS

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PCR Y SUS VARIANTES

 PCR INVERSA
 PCR INTERNA

 PCR ASIMETRICA

 PCR NESTED

 PCR EN TIEMPO REAL

 PCR MULTIPLE

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El molde utilizado es RNA pero el

producto final es ADN
Generación de cDNA
PCR
Enzima retrotranscriptasa reversa INVERSA

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Permite realizar una amplificación de las regiones

flanqueantes de un fragmento de ADN que solo se
conoce su secuencia interna PCR
secuencia conocida
INTERNA

secuencias desconocidas
digerir DNA

ligar extremos

ER

+ER
PCR

30 ciclos de PCR

PCR
•Se monta la PCR con uno de los dos ASIMETRICA
cebadores en cantidades mucho más
elevadas que el otro .

•Se produce ADN de doble cadena en

cantidad exponencial hasta que se agota el
cebador minoritario y luego sólo se produce
la cadena que hibrida con el primer que se
encuentra en exceso, produciéndose a
partir de entonces de forma lineal.

•El producto de PCR contiene 10 a 20 veces

más de ADN monocatenario que de ADN
bicatenario el cual se puede recuperar por
electroforesis

•Al producir ADN monocatenario su

utiliza mucho en la producción de sondas

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Técnica muy sensible de PCR en la que el producto

PCR
de una amplificación es utilizado como molde para NESTED
realizar una segunda amplificación con cebadores
que se ubican dentro de la primera secuencia
amplificada. Este tipo de PCR es muy específica.

PCR EN
Permite cuantificar, la cantidad de
ADN o ARN amplificado en cada
TIEMPO
momento por fluorescencia. REAL
Si en cada en ciclo de amplificación la
cantidad de ADN crece de forma
exponencial, podemos deducir la
cantidad de ADN de partida

También se utiliza para medir los

niveles de expresión de ciertos genes

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PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en

una misma reacción. PCR
MULTIPLE
Emplea dos o más pares de cebadores en único tubo
con el fin de amplificar simultáneamente múltiples
segmentos de DNA.

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