Estas características de los coronavirus incluyen (a) una organización genómica altamente

conservada que tiene un gran gen de replicasa en el extremo 5’ que codifica varias proteínas con
actividades enzimáticas, que está aguas arriba de los genes estructurales y accesorios (Figura 1b);
(b) todos ellos de manera eficiente utilizan el cambio de marco ribosómico para expresar sus
proteínas no estructurales (nsps), poliproteínas (Figura 1b), que son esenciales para la replicación
in vivo; (c) como miembro de los nidovirus (nidus significa "nido" en latín), sus genes aguas abajo
se expresan mediante la síntesis de 30 anidados ARNm subgenómicos (Figura 1b).

Ciclo de infección

El virión del coronavirus consta de proteínas estructurales, a saber, espiga (S), envoltura (E),
membrana (M), nucleocápsida (N) y, para algunos betacoronavirus, hemaglutinina-esterasa (no se
muestra). The SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) protein is an abundant RNA-binding protein critical for
viral genome packaging. El genoma de ARN monocatenario de sentido positivo (+ssRNA) está
encapsidado por N, mientras que M y E aseguran su incorporación en la partícula viral durante el
proceso de ensamblaje. Los trímeros S sobresalen de la envoltura viral derivada del huésped y
brindan especificidad para los receptores de entrada celular. segundo | Las partículas de
coronavirus se unen a los factores de unión celular y las interacciones S específicas con los
receptores celulares (como la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2)), junto con los
factores del huésped (como la serina proteasa de la superficie celular TMPRSS2), promueven la
absorción y fusión viral en la membrana celular o endosomal. Después de la entrada, la liberación
y el desprendimiento del ARN genómico entrante lo someten a la traducción inmediata de dos
grandes marcos de lectura abiertos, ORF1a y ORF1b. Las poliproteínas pp1a y pp1ab resultantes se
procesan cotraduccional y postraduccionalmente en las proteínas no estructurales individuales
(nsps) que forman el complejo de replicación y transcripción viral. De acuerdo con la expresión de
nsps, la biogénesis de los orgánulos de replicación viral que consisten en vesículas perinucleares
de doble membrana (DMV), membranas contorneadas (CM) y pequeñas esférulas abiertas de
doble membrana (DMS) crean un microambiente protector para la replicación del ARN genómico
viral y transcripción de ARNm subgenómicos (ARNm sg) que comprende el conjunto anidado
característico de ARNm de coronavirus. Las proteínas estructurales traducidas se trasladan a las
membranas del retículo endoplásmico (RE) y transitan a través del compartimento intermedio del
RE al aparato de Golgi (ERGIC), donde la interacción con el ARN genómico recién producido y
encapsidado en N da como resultado la gemación en la luz de los compartimentos vesiculares
secretores. Finalmente, los viriones son secretados por la célula infectada por exocitosis. Los pasos
clave inhibidos por los compuestos que se están validando actualmente y que representan
objetivos antivirales atractivos están resaltados en rojo. Una secuencia poliA 3'; capuchón,
estructura de capuchón de 5′; dsRNA, RNA de doble cadena; L, secuencia líder; RdRP, ARN
polimerasa dependiente de ARN.

REPLICACIÓN CITOPLÁSMICA

1. La unión de la proteína S viral (quizás también HE si está presente) a los receptores del
huésped media la endocitosis del virus en la célula huésped.
2. Fusión de la membrana del virus con la membrana endosomal (probablemente mediada
por S2), el genoma de ssRNA (+) se libera en el citoplasma.
3. Síntesis y escisión proteolítica de la poliproteína replicasa.
 4. La replicación ocurre en fábricas virales. Un genoma de dsRNA se sintetiza a partir del
ssRNA (+) genómico.
5. El genoma de dsRNA se transcribe/replica proporcionando así mRNAs virales/nuevos
genomas de ssRNA(+).
6. Síntesis de proteínas estructurales codificadas por mRNAs subgenómicos.
7. Ensamblaje y gemación en las membranas del retículo endoplásmico (RE), los
compartimentos intermedios y/o el aparato de Golgi.
8. Liberación de nuevos viriones por exocitosis.

Figura 4. Acoplamiento espacial de los sitios de ensamblaje y replicación del SARS-CoV-2 mediado
por la proximidad de los DMV, el compartimiento vesicular-tubular y el aparato de Golgi (A–F)
Tomografía electrónica y representación 3D de Calu-3 infectado con SARS-CoV-2 células (MOI =
0,5) recolectadas 24 h después de la infección. (A) corte a través del tomograma. (B) Misma región
que en (A) con representación superpuesta de orgánulos celulares y virales que se especifican en
la parte inferior de la figura. (C) Representación 3D de orgánulos visualizados en (A). (D–F) Vista
ampliada del compartimento vesicular-tubular (VTC) (cian) y aparato de Golgi (azul oscuro) con
viriones en ciernes (amarillo) y viriones completamente ensamblados (naranja). Barras de escala,
200 nm.

La alta frecuencia de eventos de gemación observados en el aparato de Golgi y el compartimento

de la membrana vesicular circundante indica que estos orgánulos proporcionan membranas para
el ensamblaje del SARS-CoV-2 (Figuras 4D–4F; Video S5). Dentro de estos compartimentos
celulares, se encontraron cadenas de nucleoproteína viral, correspondientes a gránulos teñidos de
oscuro, en membranas dobladas que, dadas las similitudes en la morfología con los viriones
completamente ensamblados, probablemente correspondan a las primeras etapas de la gemación
del virión (Figura S4A). De acuerdo con informes anteriores, también observamos viriones
completamente ensamblados con un diámetro promedio de 80 ± 9,5 nm (Figura S4B) (Klein et al.,
2020). El panorama global obtenido a partir del gran conjunto de tomogramas y los datos FIB-SEM
revelan que los sitios de ensamblaje, correspondientes al aparato de Golgi y las vesículas
circundantes, y los DMV, los sitios de replicación del ARN, están muy cerca, lo que sugiere una
coordinación espaciotemporal de los diferentes pasos de el ciclo de replicación del SARS-CoV-2
(Figuras 4A–4F y S1; Videos S1 y S5).

En las células no infectadas, el compartimento secretor mostró una morfología bien definida. La
polarización de las pilas de Golg permitió la identificación confiable del área del compartimento
intermedio del RE al Golgi (ERGIC) y la presencia de vesículas recubiertas de clatrina marcó el sitio
de la red trans-Golgi (TGN) (Figura S4C). De manera diferente, se observó fragmentación y
dispersión del aparato de Golgi, con formación de múltiples minipilas de Golgi, en células
infectadas con SARS-CoV-2 apenas 6 horas después de la infección (Figuras 4G, 4H, S4D y S4E).
Aunque se encontraron cisternas de Golgi fragmentadas en las cercanías de los DMV (Figuras 4D–
4F y S1) y podrían constituir sitios de ensamblaje, el área total de Golgi solo se redujo
marginalmente (Figura S4E), lo que sugiere que la infección viral indujo principalmente una
fragmentación y redistribución del aparato de Golgi. cisternas (Figura S1). Debido a la morfología
de Golgi alterada, la identificación inequívoca de los sitios ERGIC y TGN es un desafío en las células
infectadas con SARS-CoV-2 y, por lo tanto, usamos el término más general compartimento
vesicular-tubular (VTC) cuando nos referimos a las membranas en estrecha proximidad. del RE y
las pilas de Golgi. Además del ensamblaje convencional en los sitios VTC y Golgi, también se
observaron eventos de ensamblaje en vesículas densas en electrones que contenían una gran
cantidad de viriones (Figura S4F, i–iii). Además, los viriones ensamblados también estaban
presentes en cuerpos multivesiculares (Figura S4F, iv). Tales estructuras podrían proporcionar una
ruta secretora alternativa o representar productos sin salida del proceso de ensamblaje.

DMV inducidos por coronavirus revelados por crio-ET. (A) Corte tomográfico (7 nm de espesor) de
una crio-laminilla molida a través de una célula infectada por MHV en una etapa intermedia de
infección. (B) Modelo tridimensional (3D) del tomograma, con el contenido segmentado anotado.
Véase también la película S1. ERGIC, compartimento intermedio del RE al aparato de Golgi.

Los corona-virus son virus de ARN (+ARN) de cadena positiva que replican sus genomas
inusualmente grandes en el citoplasma de la célula huésped. como el orgánulo de replicación viral
(RO). Las vesículas de doble membrana (DMV) son el componente más abundante de la RO y los
centros centrales para la síntesis de ARN viral (5). El interior del DMV acumula ARN de doble
cadena (ds), presumiblemente intermediarios de la replicación del genoma viral y la síntesis de
ARNm subgenómico (4,5). Los DMV pueden ofrecer un microambiente favorable para la síntesis de
ARN viral y pueden proteger al ARN viral de los sensores inmunitarios innatos que se activan con el
ARNds.

4. Modelo del tránsito de ARN genómico del coronavirus desde la luz del DMV hasta los sitios de
gemación del virus. Los cortes tomográficos de células infectadas con MHV (arriba) resaltan los
pasos respectivos en el modelo (abajo). (A) El poro molecular exporta ARN viral al citosol, (B)
donde puede ser encapsidado por la proteína N. (C) Los complejos RNP citosólicos pueden luego
viajar a los sitios de ensamblaje del virus para la asociación de membranas y (D) la posterior
gemación de viriones. Las inserciones en los paneles superiores brindan vistas de primer plano de
las áreas delimitadas por corchetes blancos.

Nuestros hallazgos sugieren una vía para el ARN genómico viral recién creado desde el interior del
DMV, a través del canal del poro, hasta los sitios citosólicos de encapsidación. En nuestro modelo,
las subunidades de replicasa específicas pueden asociarse con el complejo del poro para guiar el
ARN recién sintetizado hacia él (Fig. 4A). Como se propone para otras RO virales de ARN + (11),
solo sería necesario exportar los ARN +, mientras que las plantillas de cadena negativa y/o los
intermediarios de ARNbc podrían permanecer dentro de los DMV. En el lado citosólico, todos los
ARNm virales exportados pueden asociarse con la proteína N (Fig. 4B). Alternativamente, la
proteína N acumulada podría servir para seleccionar parte de los genomas recién creados para
empaquetarlos. El resto se usaría luego para la traducción, junto con los ARNm subgenómicos
mucho más pequeños, aunque mucho más abundantes (31). Los complejos RNP que contienen el
genoma viajarían a las membranas donde las proteínas de la envoltura viral se acumulan y
participan en el ensamblaje de los viriones de la progenie (Fig. 4C) (32). Ribonucleoprotein (RNP)
complexes consisting of the nucleocapsid protein (N) and the viral genome, responsible for the
packaging of the RNA genome of the virus, with estimates of 30-35 RNPs per virion. Estos brotan
en compartimentos de una sola membrana (Fig. 4D), normalmente derivados del compartimento
intermedio del RE al aparato de Golgi (8), y viajan a lo largo de la vía secretora para ser liberados
en el espacio extracelular. El poro molecular que abarca la doble membrana revelado aquí puede
constituir la ruta de salida para los productos de ARN coronaviral desde el interior del DMV hacia
el citosol, siendo el nsp3 grande y multifuncional su componente central. Aunque el modo exacto
de función de este poro molecular aún no se ha dilucidado, parece ser una estructura clave en el
ciclo de replicación viral que probablemente se conserva entre los coronavirus y, por lo tanto,
puede ofrecer un objetivo farmacológico específico del coronavirus.

En microbiología , la multiplicidad de infección o MOI es la proporción de agentes (p. ej., fagos o,

más generalmente , virus , bacterias ) a objetivos de infección (p. ej . , células ). Por ejemplo,
cuando se refiere a un grupo de células inoculadas con partículas de virus, la multiplicidad de
infección o MOI es la relación entre el número de partículas de virus y el número de células diana
presentes en un espacio definido.

El genoma codifica para 9860 aminoácidos y 27 proteínas, incluidas las de la ARN polimerasa
dependiente de ARN y cuatro proteínas estructurales.8,16,18 Los ORF1a y ORF1b codifican las
proteínas no estructurales.19 Las cuatro proteínas estructurales del SARS-CoV-2 incluyen la
proteína de superficie (S), la proteína pequeña de la envoltura (E), la proteína de matriz (M) y la
proteína de nucleocápside (N).18 Las proteínas E y M están asociadas con la envoltura viral y la
proteína N está en el interior del virión asociada con el ARN viral.2 La proteína S es una
glicoproteína de fusión trimérica de clase I, que se proyecta de la superficie viral.15,20 Esta
proteína desempeña un papel decisivo en la unión a los receptores en la célula huésped y
determina el tropismo del huésped.

Replicación y brotación del coronavirus. Esta ilustración muestra una sección transversal de una
célula infectada con un coronavirus como el SARS-CoV-2. Muestra un momento en el que el virus
se está replicando activamente y se están creando nuevos virus. Las moléculas de la célula se
muestran en azules y verdes, y las moléculas virales se muestran en rojos y morados. La ilustración
integra el estado actual del conocimiento, pero todavía se están estudiando activamente muchos
aspectos del virus y su ciclo de vida, por lo que partes de la ilustración son especulativas. Tenga en
cuenta que algunas características, como el ARN, debían exagerarse ligeramente en
tamaño/ancho, dado el tamaño mínimo de las características que se podían representar usando
contornos negros de ancho perceptible con el aumento constante de 1,000,000x que se usó para
la pintura de acuarela original. . SARS-CoV-2, síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2.

Modelo de maduración cisternal y compartimento intermedio estable (ER)-Golgi (ERGIC). La

proteína en las vesículas COPII (naranja) brota de los sitios de salida del RE al ERGIC, que es un
compartimento estable en las células de los mamíferos, y posteriormente al cis-Golgi a través de
un segundo sistema de transporte vesicular indefinido (gris) [53,61]. Estas vesículas se fusionan
homotípicamente para construir nuevas cis-cisternas, que no son compartimentos estables. Se
mueven y maduran de cis a trans, y luego se descomponen en transportistas en la TGN. El
transporte entre el ER y Golgi está controlado por vesículas COPI (verde) en retrógrado y vesículas
COPIl en anterógrado, transporte.

Las proteínas recién sintetizadas, como las proteínas M, S y E, ingresan al RE donde se pliegan y
empaquetan en vesículas formadas por el complejo de proteína de cubierta II (COPII), que brota
de sitios específicos de salida del RE (Figura 2) [56]. Los CoV brotan y se ensamblan en el ERGIC
entre el ER y el complejo de Golgi. Anteriormente, ERGIC, que se forma por la fusión de vesículas
COPII, se consideraba un compartimento móvil transitorio desde el RE hasta el complejo de Golgi.
Sin embargo, imágenes recientes de células vivas sugieren que el ERGIC es un compartimento
estacionario estable en células de mamíferos [53,61].

En este modelo, el transporte del ER al ERGIC está mediado por vesículas COPII. El transporte
posterior al cis-Golgi está mediado por un segundo sistema de transporte vesicular. Las proteínas
del ERGIC pasan por el complejo de Golgi, que se puede dividir en cuatro compartimentos;
cisternas cis, medial y trans, y la red trans-Golgi (TGN), durante la cual se modifican por
glicosilación. Aunque se ha debatido la ruta de la proteína dentro del complejo de Golgi, gran
parte de los datos respaldan el modelo de maduración cisternal de Golgi [55,56,58]. En este
modelo, la cisterna de Golgi no es una entidad estacionaria de larga vida, sino un compartimento
transitorio. Las vesículas que brotan del ERGIC se fusionan homotípicamente para construir nuevas
cis-cisternas, se mueven y maduran de cis a trans-cisternas y luego se descomponen en
transportadores en el TGN. Las proteínas de Golgi residentes (p. ej., la enzima de glicosilación) o
algunas proteínas pueden regresar al RE o a las cisternas más jóvenes por transporte retrógrado.
Este transporte retrógrado está mediado por vesículas COPI, que funcionan principalmente en el
reciclaje de proteínas del complejo de Golgi al ER (Figura 2) [54–56]. Por lo tanto, el transporte
retrógrado entre el ER y el aparato de Golgi está controlado por vesículas COPI; Las vesículas COPII
median transporte anterógrado. Las proteínas en el TGN se transportan directamente a la
membrana plasmática o indirectamente a través de endosomas de reciclaje.

Dibujo esquemático de la morfogénesis del SARS-CoV-2 (i) Después de la replicación del genoma
viral (verde) dentro del ER derivado (plata) TCEV, complejo de ribonucleoproteína (azul) se
estabiliza (ii) mientras migra a la membrana ERGIC (naranja) (iii). (iv) SARS-CoV-2 adquiere su
envoltura (roja) mientras brota en la luz ERGIC. La cara interna de la bicapa ERGIC muestra las
proteínas S (púrpura), que se incorporan a la partícula viral al brotar. (v) El virus permanece
adherido a la membrana interna del ERGIC antes de que su forma completa llene el lumen de este
compartimento. Este modelo se basa en las presentes observaciones y estudios previos sobre este
tema, especialmente los realizados por Snijder et al. (2020), Wolff et al. (2020) y Klein et al. (2020).

CrioET in situ del proceso de ensamblaje del SARS-CoV-2. (a), (b) Corte tomográfico de lamela
cryoFIB que representa el ensamblaje y la segmentación de la densidad del SARS-CoV-2, que
muestra los portales del DMV (flecha amarilla), virus ensamblados (flecha azul), virus ensamblados
(flecha negra), picos virales en las membranas del SMV (flechas rojas) y transportando vesículas
alrededor del sitio de ensamblaje (flecha rosa). (b) Los cortes tomográficos revelaron que los
complejos de poros estaban presente en DMV fijos inducidos por SARS-CoV-2 (puntas de flecha
blancas) (d) Vesículas de transporte llenas de picos muy cerca de un SMV ( e ) tomograma CryoET y
representación de volumen 3D de la etapa temprana de gemación del virión. S y vRNP se
acumulan en la luz membrana. La representación de volumen 3D se muestra con celular y viral
membranas en verde y magenta, respectivamente, con S (amarillo) y vRNP (cian)

Exposiciones

Calificación sugerida

- Itzia: ¿? – preguntas mal respondidas

- Orlando: 10
- Ricardo:
- Sory: