1-Práctica Pipeteo y Carga Pocillos Alumnos

Biotecnología: Práctica N.º 1.
- Micropipeteo y carga de pocillos 1
PRÁCTICA 1: MICROPIPETEO Y CARGA EN POCILLOS

Lara Fuster
Martina Robalino
Rocío Navarro
FUNDAMENTO
En los laboratorios de Biología Molecular, el manejo del equipo básico es

fundamental. Además, se requiere del conocimiento de las distintas unidades de medición
y su correcta conversión, ya que dichos procedimientos se utilizan a diario en distintas
labores relacionadas con el trabajo.
Las dos medidas más usadas en biología molecular son el microlitro (μL) y el mililitro
(mL), 1 mL = 10-3 L y un 1 μL = 10-6 L.
a) Precauciones en el uso de las micropipetas automáticas:

Nunca rotar el ajustador de volumen más allá del límite superior o inferior de la
pipeta indicados por el fabricante.
Nunca usar la micropipeta sin colocar antes una punta; hacer esto puede dañar el
pistón de precisión que mide el volumen del líquido.
Ensayos Biotecnológicos 2º Laboratorio de Análisis y Control de Calidad 1

Biotecnología: Práctica N.º 1.- Micropipeteo y carga de pocillos 2
Nunca colocar horizontalmente la pipeta con una punta llena con líquido; éste
puede escurrirse hacia el pistón.
Nunca soltar de forma brusca el émbolo después de tomar o vaciar el líquido; esto
puede dañar el pistón.
Nunca sumergir el barril de la pipeta en el líquido.
Nunca flamear la punta de la pipeta (es de plástico).
b) Instrucciones para el pipeteo:
1. Girar el ajustador de volumen hasta alcanzar la cantidad deseada. Notar el cambio
en la longitud del émbolo conforme se cambia el volumen. Asegúrese de localizar la
posición del punto decimal al leer el volumen en la pipeta.
2. Colocar la punta del tamaño adecuado firmemente en el extremo de la pipeta.
3. Al verter o sacar el líquido, sostener el tubo firmemente entre el pulgar y el índice,
a nivel del ojo, para poder ver el cambio en el volumen en la punta de la pipeta.
No pipetear con el tubo descansando en la gradilla o mientras es sostenido por otra
persona.
4. Sujetar el tubo por su cuerpo, no por la orilla ni el tapón, esto permite un mayor
control y evita la contaminación de las manos y de los líquidos que se manipulan.
5. Al llenar la pipeta, sostenerla lo más vertical posible.
6. La mayoría de las micropipetas tiene un pistón de dos posiciones, con un punto de
fricción entre uno y el otro. Prestar atención a este punto y practicar las posiciones
7. Para tomar la muestra del tubo con el reactivo:
Sumergir la punta de la pipeta en el líquido unos 2 o 3 mm, bajar el émbolo hasta

la primera posición y liberar gradualmente el émbolo de la primera posición,
dejando la pipeta unos dos segundos sumergida para permitir la correcta succión
del líquido.
Sacar la punta de la pipeta deslizándola por la pared del tubo, para eliminar
cualquier exceso que se haya adherido a la parte externa de la punta.
Revisar que no haya quedado ninguna burbuja dentro de la punta. Para evitar
futuros errores de pipeteo, aprender a reconocer el nivel aproximado al cual se
llena la punta, con un volumen dado.
8. Para expulsar la muestra en un recipiente:
Bajar la punta de la pipeta hasta que toque el fondo del recipiente formando un
ángulo de 30-45 . Esto crea un efecto capilar que ayuda a liberar el líquido.

Lentamente, bajar el émbolo hasta la primera posición para expulsar la muestra,

manteniendo el émbolo en dicha posición.
A continuación seguir bajando el émbolo hasta la segunda posición, para vaciar
completamente su contenido a la vez que se arrastra la pipeta por las paredes del
recipiente unos 10 mm. Mantener el émbolo en esta posición.
Retirar la pipeta del recipiente. Después, liberar lentamente el émbolo.
Expulsar la punta de la pipeta usando el expulsor de puntas.
MATERIALES (completa indicando el material utilizado en la práctica)
El material utilizado ha sido:
• Micropipeta de volumen graduado de 1-10microlitros.

• Micropipeta de volumen graduado de 10-100 microlitros.
• Micropipeta de volumen graduado de 100-1000microlitros.
PROCEDIMIENTO
Pipeteo de volúmenes pequeños:
1. Rotular tres tubos de 1,5 mL con A, B y C.

2. Usar la siguiente matriz como guía para añadir las distintas soluciones a cada tubo:
Tubo Sol. I Sol. II Sol. III Sol. IV TOTAL:
A 78 μL 120 μL 2 μL Nada 200 μL
B 123 μL 75 μL Nada 2 μL 200 μL
C 146 μL 50 μL 2 μL 2 μL 200 μL
3. Con una misma punta azul, añadir la solución I a cada tubo.

4. Use una punta nueva para añadir la solución II a los tubos.
5. Use una punta nueva para agregar 2 μL de la solución III a los tubos A y C. 6. Use una
punta nueva para agregar 2 μL de la solución IV a los tubos B y C.
7. Tapar los tubos. Mezclar los reactivos ya sea golpeando los tubos contra la mesa
para bajar todas las gotas que haya en la pared del tubo, con vórtex o colocándolos en una
microcentrífuga y aplicando un pulso corto de varios segundos (asegurarse de que los
tubos estén balanceados en el rotor).
8. Un total de 200 μL fue añadido a cada tubo. Para revisar la exactitud de sus
mediciones, fije la pipeta en 200 μL y extraiga cuidadosamente la solución de cada tubo.
Verifique si ocurrió alguna de estas situaciones:
¿La punta se llenó correctamente?
Si. Las tres veces (en los tres tubos)
¿Quedó una pequeña cantidad de la solución en el tubo?
Durante la extracción del segundo tubo sí que observamos algo de líquido en el
extremo del tubo. Todas las demás salieron correctamente.
Después de extraer todo el líquido, ¿quedó un espacio de aire en la punta? Si
ocurre esto, mueva el ajustador de volumen hasta sacar la burbuja de la punta y
lea el volumen final cargado.

Como tuvimos ese pequeño residuo en el segundo tubo, se pudo deber a que se
formó una burbuja de aire, que al regular el ajustador se liberó y pudimos vaciarlo sin
problemas.
Calibración de micropipetas:
Seleccionamos una pipeta y la vamos a calibrar en tres volúmenes diferentes. Para ello de
cada volumen haremos diez pipeteos y mediremos las masas de agua en balanza analítica.
Conversión de masa a volumen

V= ( w + e ) x Z
V= volumen (mL) w=peso (weight)

(mg) e= perdida por evaporación
(mg) z= factor de conversión para
mg/mL
Nota: La pérdida por evaporación puede ser significante con pequeños volúmenes. Para
determinar la pérdida de masa, dispensar agua en el recipiente de pesado, tomar nota de
la lectura y empezar a tomar el tiempo con un cronómetro. Comprobar cuanto decrece la
lectura en 30 segundos. Comparar esto con el tiempo de pipeteo.
Normalmente, la duración de un pipeteo son 10 segundos y las masa perdida 2 μg. Si se
usa una trampa de evaporación o una tapa, no es necesario realizar la corrección de
evaporación.
Exactitud: Error Sistemático

La exactitud es la diferencia entre el volumen dispensado y el seleccionado en una pipeta
A= -VS
A=Exactitud (accuracy)
=Volumen-medio
Vs=volumen-seleccionado
En un certificado de calibración la exactitud se expresa como un valor relativo
ACC%= 100% x A/Vs
La precisión se refiere a la repetitibilidad de los pipeteos. Se expresa como desviación

estándar (s) o coeficiente de variación (cv). Además de por la propia pipeta, la práctica
en el laboratorio, y la experiencia del usuario son también factores importantes que
afectan a la precisión.

CÁLCULOS y RESULTADOS
Pesada Pesada Pesada Media Volumen Volumen sx (μl)

1(g) 2 (g) 3 (g) (g) (ml) (μL)
Volumen 0,095g 0,094g 0,093g 0,094g 0,0943ml 0,0000943μl 0,000001μl
1 (100ml)
Volumen 0,217g 0,215g 0,211g 0,214g 0,2147ml 0,0002147μl 0,00003055μl
2 (200ml)

CONCLUSIONES
En general, la práctica ha salido positivamente, sí que es cierto, que al trabajar con

cantidades tan pequeñas hay que poner más atención y cuidado para asegurarse que
estamos trabajando con las cantidades adecuadas y las que corresponden a los datos
proporcionados; pero con más práctica se acabará perfeccionando.
CUESTIONES
1. ¿Qué ventaja tiene el uso de las pipetas automáticas sobre las de vidrio
tradicionales? ¿y desventaja?
La principal ventaja de las pipetas automáticas volumen variable es su precisión.
Aspirar o dispensar líquidos demasiado rápido, contaminación de muestras y equipos y
la limpieza y calibración inadecuadas, serían las desventajas de las pipetas automáticas.
2. Pon alguna foto indicativa de la práctica.
3. ¿Se puede flamear las puntas de las pipetas para esterilizarlas? ¿por qué? ¿qué
otro medio podríamos utilizar?
No, porque estas son de plástico. Se pueden estropear y deformar. La forma para
esterilizar las puntas de las pipetas es en autoclave.
4. Busca e indica los tipos de micropipetas que hay en el laboratorio.
Las micropipetas fijas, de una sola medida y las micropipetas graduables, entre dos
medidas se podía graduar manualmente girando una pequeña rueda.

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PRÁCTICA 1: MICROPIPETEO Y CARGA EN POCILLOS

En los laboratorios de Biología Molecular, el manejo del equipo básico es

a) Precauciones en el uso de las micropipetas automáticas:

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Sumergir la punta de la pipeta en el líquido unos 2 o 3 mm, bajar el émbolo hasta

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Lentamente, bajar el émbolo hasta la primera posición para expulsar la muestra,

MATERIALES (completa indicando el material utilizado en la práctica)

El material utilizado ha sido:

• Micropipeta de volumen graduado de 1-10microlitros.

Pipeteo de volúmenes pequeños:

1. Rotular tres tubos de 1,5 mL con A, B y C.

3. Con una misma punta azul, añadir la solución I a cada tubo.

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Conversión de masa a volumen

V= volumen (mL) w=peso (weight)

Exactitud: Error Sistemático

La precisión se refiere a la repetitibilidad de los pipeteos. Se expresa como desviación

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Pesada Pesada Pesada Media Volumen Volumen sx (μl)

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En general, la práctica ha salido positivamente, sí que es cierto, que al trabajar con

2. Pon alguna foto indicativa de la práctica.

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