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ResUMeN aBstRaCt
El tomate de árbol (Solanum betaceum) es un cultivo muy etiOLOGY OF DieBaCK OF tRee tOMatO
importante en Colombia, tanto por su consumo nacional [solanum betaceum (Cav) seNDt.]
como por ser producto de exportación. Las pruebas bio-
químicas y patológicas permitieron identificar a Pseudomonas The tree tomato (Solanum betaceae) is a very important
sp. como el agente causante de la Muerte descendente, una crop in Colombia due to the national consumption and
enfermedad devastadora en huertos comerciales de tomate as well as a product of exportation. The biochemical and
de árbol en la granja Tesorito, de la Universidad de Caldas, pathological tests allowed to identify to Pseudomonas sp. as
ubicada en el municipio de Manizales (Caldas), a una altura the causal agent of the die back, a devastating disease in
de 2.280 msnm, temperatura promedio de 17°C, precipita- commercial plots of tomato tree at the Tesorito farm of
ción promedio anual de 1.800 mm y humedad relativa del the Universidad de Caldas, located in the municipality of
78%. El patógeno produce secamiento de ramas, tallos y Manizales (Caldas), at 2,280 masl, average temperature of
pedúnculos, necrosamiento de botones florales y brotes, 17°C, annual rainfall of 1,800 mm and relative humidity of
manchas café acuosas en hojas y necrosamiento de la 78%. The pathogen produces drying of branches, stems
nervadura central y secundarias. Este es el primer reporte and peduncles, necrosis of bottom flowers and shoots,
en Colombia del ataque de Pseudomonas sp. que ocasione aqueous brown spots on leaves and necrosis of the central
la Muerte descendente del tomate de árbol. and secondary veins. This is the first report in Colombia
of Pseudomonas sp. causing die back in tomate tree.
Palabras clave: Pseudomonas, Phoma, Colletotrichum, Key words: Pseudomonas, Phoma, Colletotrichum, pathogenicity.
patogenicidad.
López-Cardona, N. & Castaño-Zapata, J. 2013. Etiología de la Muerte descendente del tomate de árbol [Solanum betaceum (Cav.)
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8
Nathali López-Cardona y Jairo Castaño-Zapata
MateRiaLes Y MÉtODOs Revelation III con el objetivo 40x (Castaño & Del
Río, 1997). Para la identificación, se utilizó las claves
toma de muestras y procesamiento taxonómicas especializadas de hongos de Hanlin
(1990, 1998), Barnett & Hunter (1998) y Castaño &
Muestras con síntomas característicos de la Salazar (1998).
enfermedad se obtuvieron en la granja Tesorito,
propiedad de la Universidad de Caldas, ubicada en la Para bacterias, se realizaron pruebas culturales
vereda Maltería, municipio de Manizales (Caldas), a [crecimiento en agar Cetrimide, agar MacConkey y
una altura de 2.280 msnm, temperatura promedio de agar semiselectivo Sur África (SMSA), fluorescencia
17°C, precipitación promedio anual de 1.800 mm y en agar King B], morfológicas (tinción de Gram,
humedad relativa del 78%. Los suelos son de origen solubilidad en KOH al 3% y forma) y bioquímicas
volcánico y de textura franca. [oxidasa, catalasa, fermentación de carbohidratos en
agar triple-azúcar-hierro (TSI), prueba de oxidación-
Se recolectaron ramas secundarias con síntomas de fermentación en medio Hugh y Leifson (OF), prueba
Muerte descendente procedentes de un lote comercial de indol, movilidad, ácido sulfhídrico (SIM), licuación
de tomate de árbol variedad Rojo común de 30 de la gelatina, utilización del citrato en el medio citrato
meses de edad. Las muestras se guardaron en bolsas Simmons, ureasa e hidrólisis del almidón en agar
Ziploc debidamente rotuladas con número de fecha, almidón] (Schaad, 2001). Adicionalmente, se realizó la
hospedante, lote y número de planta, y fueron llevadas prueba de DAS-ELISA [Double Antibody Sandwich
al Laboratorio de Fitopatología de la Universidad de - Enzyme Inmunosorbent Assay), utilizando
Caldas. anticuerpos comerciales (Agdia, 2008) para detectar
la especie Ralstonia (= Pseudomonas) solanacearum.
Se cortaron trozos de tejidos afectados de
aproximadamente 3 mm2, se desinfestaron con Producción de inóculo
hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min, se lavaron
en agua destilada estéril y fueron transferidos a cajas Para inducir producción de picnidios, el hongo fue
Petri con PDA (papa, dextrosa y agar 39 g.L-1 de sembrado en agar V8 (200 mL de jugo de verduras
agua) para aislar hongos y agar nutritivo (peptona 5 V8, 3 g CaCO3, 20 g agar-agar, 1 L de agua destilada)
g/L, extracto de carne 4 g/L, agar 15 g/L de agua), acidificado (ácido láctico al 25%) y fue mantenido
para aislar bacterias, los cuales fueron previamente a 20ºC en condiciones de luz negra por periodos
esterilizados en autoclave a 121oC y 15 lb de presión, de 12 horas de luz/12 horas oscuridad hasta el
durante 20 min. Las siembras se incubaron en desarrollo de picnidios y conidios (Boerema et al.,
oscuridad por tres días a una temperatura de 25ºC 2004). A cultivos de 15 días, se procedió a hacerles
en una incubadora marca 1DiES modelo D53VU. macerado y trituración de los picnidios embebidos en
el medio (Gilchrist-Saavedra et al., 2005). El macerado
Para hongos, una vez se obtuvo crecimiento en se realizó con un pistilo estéril. La concentración
PDA, se tomó un trozo de medio con esporulación, de conidios se ajustó a 1,95 x 106 conidios.mL-1
el cual fue transferido a una lámina portaobjetos utilizando un hemacitómetro, marca Neubauer,
conteniendo una o dos gotas de lactofenol al 0,05% American Optical Co.
(20 g de fenol cristalino + 20 cm3 de ácido láctico
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+ 20 cm3 de glicerina + 20 cm3 de agua destilada, y Para producción de acérvulos, el hongo fue cultivado
azul de algodón al 5% en agua), la muestra se cubrió en PDA acidificado con ácido láctico al 25% y fue
con un cubreobjetos y se procedió a observarla en mantenido a 25ºC en incubadora marca 1DiES
un microscopio compuesto marca LW Scientific modelo D53VU, en condiciones de oscuridad. A
cultivos de 4 días, se les realizó un raspado de los y se lavaron dos veces con agua destilada estéril.
conidios con un asa redonda estéril y la concentración Cada tejido inoculado se protegió con una bolsa
de conidios se ajustó a 1,5 x 106 conidios.mL-1 con plástica transparente hasta el desarrollo de síntomas.
la ayuda de un hemacitómetro, marca Neubauer, Una vez se evidenció el desarrollo de síntomas, las
American Optical Co. ramas afectadas fueron llevadas al laboratorio para
comprobar los postulados de Koch.
Cultivos de 24 horas de crecimiento bacteriano fueron
utilizados para ajustar la concentración a 9,0 x 108 Métodos de inoculación
ufc.mL-1 de agua utilizando la escala de McFarland
(Botero, 2001). 1) aspersión: usando un aspersor DeVilbiss No. 15,
con suspensiones de esporas o células bacterianas,
Pruebas de patogenicidad a las concentraciones previamente definidas en
la metodología para producción de inóculo. Se
Se utilizaron plantas sanas de 4 meses de edad inocularon tres plantas, en tres hojas diferentes; el
de la misma variedad de la cual se obtuvieron los testigo fue inoculado de la misma forma, pero con
aislamientos (tomate de árbol, variedad Rojo común). agua destilada estéril (Molina & Castaño, 2003), 2)
Las plantas estaban cultivadas en un sustrato de Heridas: con un par de cuchillas insertadas en un
arena, suelo y materia orgánica en una relación 1:2:2. trozo de madera de 7 x 5 cm, previamente sumergidas
Una vez realizadas las inoculaciones, las plantas en la solución bacteriana o agua destilada estéril
fueron puestas en cámara húmeda y mantenidas (para el control), se hicieron heridas en las hojas. Se
en condiciones de laboratorio a una temperatura utilizaron tres plantas, de las cuales se seleccionaron
promedio de 18,5ºC, con un fotoperiodo de 10 horas- tres hojas diferentes para hacer la inoculación
luz/14 horas-oscuridad. Los tratamientos constaron (Castaño & Del Río, 1997) y 3) inyección: usando
de tres repeticiones y un control (inoculaciones con una jeringa estéril de 5 mL, se hicieron inyecciones
agua destilada estéril). Se realizaron dos ensayos. de inóculo o agua destilada estéril en el ápice de la
En el ensayo uno, en laboratorio, se probó la planta, profundizando con la aguja hacia el tallo
patogenicidad de cada microorganismo mediante principal para llegar a los vasos conductores de
tres métodos de inoculación: aspersión, heridas e xilema y floema (Jiménez et al., 2004; Trandafirescu
inyección al tallo. Después de cada inoculación, las & Botu, 2009). El inóculo estaba ajustado a las
plantas se observaron diariamente hasta la aparición concentraciones previamente establecidas para cada
de síntomas. aislamiento. Una modificación del método se realizó
al final del experimento cuando se descubrió que
El ensayo dos fue igual al descrito previamente, las plantas a las que se les eliminaba el crecimiento
pero se realizó en el campo, mediante selección de apical mediante una poda y luego eran inyectadas,
ramas aparentemente sanas de plantas de tomate de exhibían los síntomas típicos de la enfermedad para
árbol, variedad Rojo común, de 33 meses de edad. el caso del aislamiento bacteriano. Igualmente, tres
Adicionalmente, se inocularon frutos en estado plantas de tomate de árbol fueron inoculadas con una
verde y maduro. Después de cada inoculación, variación del método, así: la aguja de una jeringa de 5
las plantas se observaron cada tres días, hasta la mL se incrustó a través de un tapón de caucho para
aparición de síntomas. Cada rama fue debidamente que al realizar presión sobre el émbolo al momento
rotulada con el nombre del aislamiento y método de de realizar la infiltración en las hojas, el inóculo
inoculación. Previo a cada inoculación, la rama o fruto se distribuyera homogéneamente en el interior de
seleccionado fue asperjado con hipoclorito de sodio la lámina foliar. En este tratamiento se incluyeron
al 2%, contenido en un atomizador marca Vanyplas plantas de fríjol (Phaseolus vulgaris L.).
heteromorpha (Shulter & Sacc.) Noordel. & Boerema en combinación, se obtuvo expresión de enfermedad.
en laurel rosado (Nerium oleander L.) (Álvarez et al., La bacteria también indujo necrosis en hojas de fríjol
2005), Phoma sp. en olivo (Olea europea L.) (Rhouma en los puntos inoculados (Figura 1E), lo que sugiere
et al., 2010), Phoma tracheiphila (Petri) L.A. Kantsch. que el rango de hospedantes no se limita solo al
tomate de árbol y que en condiciones naturales, la para confirmar el verdadero rango de hospedantes
bacteria puede sobrevivir en Solanáceas y Fabáceas, del patógeno.
aunque nuevos estudios deben formularse al respecto
tabla 1. Resultados de las pruebas de patogenicidad realizadas con tres microorganismos aislados de ramas secundarias
de tomate de árbol var. Rojo común en condiciones de laboratorio y de campo
Nº total de plantas
Laboratorio Campo
aislamientos inoculadas
Pi/Ps* infección (%) Pi/Ps infección (%)
Colletotrichum 6/0 0 5/0 0 11
Phoma 6/0 0 5/0 0 11
Phoma + Colletotrichum 5/0 0 5/0 0 10
Pseudomonas 6/6 100 5/3 60 11
Los resultados de las pruebas culturales, morfológicas Comparación de los métodos de inoculación
y bioquímicas para la caracterización de Pseudomonas
sp. se muestran en la Tabla 2. Los métodos de inoculación más efectivos fueron la
inyección al tallo (Figura 1B, C y D) y la infiltración
Resultados de la prueba de eLisa para el en hojas (Figura 1A y E), en las cuales se obtuvo el
aislamiento bacteriano 100% de infección, tanto en tomate de árbol como
en fríjol. Con ningún otro método de inoculación
Los resultados de la prueba de ELISA permitieron se evidenciaron síntomas, tanto bajo condiciones
descartar la posibilidad de que la bacteria del género de laboratorio como de campo. Ningún fruto
Pseudomonas, aislada de plantas de tomate de árbol, inoculado con Pseudomonas sp. desarrolló síntomas
perteneciera a la especie solanacearum. Todas las de la enfermedad.
muestras analizadas resultaron ser negativas para
la presencia de Ralstonia solanacearum, causante del Klement (1977), estudiando el patosistema
marchitamiento vascular. Pseudomonas syringae van Hall.- Cancro bacteriano
y Muerte descendente del albaricoquero (Prunus
Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula ha sido armeniaca Blanco), indica que el floema y cambium
aislada de frutos de tomate de árbol, dónde se del árbol llegan a ser susceptibles justo después de
comporta como un organismo con efecto sinergista, la caída de hojas en invierno; por el contrario, en
por la facultad que posee de promover la formación verano la bacteria se muere en el tejido infectado y el
de apresorios y estimular la germinación de conidios árbol se comporta como resistente en esta época del
de Colletotrichum gloeosporioides, lo que se traduce en año. La predisposición a la enfermedad por la caída
mayor gravedad de la enfermedad de la Antracnosis de las hojas en invierno podría explicar por qué el
de los frutos de tomate de árbol debida a una mayor método de inyección al tallo, después de una poda
virulencia del hongo (Botero, 2001). para eliminar el crecimiento apical, fue el método más
efectivo para inducir la enfermedad en condiciones
de laboratorio.
tabla 2. Resultados de las pruebas culturales, morfológicas y bioquímicas realizadas para la caracterización
de Pseudomonas sp. aislada de tomate de árbol var. Rojo común
PRUeBa ResULtaDO
Características culturales
Crecimiento en agar Cetrimide Colonias cremosas
Colonias mucosas transparentes, lactosa nega-
Crecimiento en agar MacConkey
tiva
Crecimiento en agar semi-selectivo Sur África (SMSA) Colonias rosadas
Fluorescencia en agar King B Positivo
Características morfológicas
Gram -
Reconfirmación del Gram con KOH al 3% +
Forma Bacilo
Características bioquímicas
Oxidasa +
Catalasa +
Agar triple azúcar-hierro (TSI) K/K (alcalino/alcalino)
Crecimiento en oxidación-fermentación O-F (medio Hugh-
Metabolismo oxidativo
Leifson)
Indol -
Movilidad +
Ácido sulfhídrico -
Licuación de la gelatina +
Utilización del citrato (medio citrato Simmons) +
Ureasa +
Hidrólisis del almidón (agar almidón) -
Género Pseudomonas
síntomas de la enfermedad en condiciones necrosar botones florales (Figura 2B) y brotes (Figura
naturales 2E). En hojas, se observan manchas cafés acuosas,
las cuales van creciendo hasta afectar las nervaduras
El síntoma típico producido por Pseudomonas sp. secundarias y la nervadura central de la hoja, donde
es muerte descendente de ramas (Figura 2A) y la muerte descendente toma inicio para infectar
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pedúnculos (Figura 2D), aunque también puede completamente una rama funcional (Figura 2C).
a) Hojas de tomate de árbol mostrando necrosis de nervaduras secundarias en los tres puntos de inoculación. B) Tallos de tomate
de árbol mostrando necrosamiento total, generado a partir del punto de inoculación, C1 y C2: control 1 y 2 respectivamente. C)
Muerte descendente en tallo de tomate de árbol inoculado en condiciones de laboratorio. D) Marchitamiento vascular inducido
en plantas de papa inoculadas con Pseudomonas sp. e) Hoja de fríjol mostrando necrosis en los tres puntos de la infiltración. F)
Muerte descendente en rama de tomate de árbol inoculado en condiciones de campo.
Figura 1. Resultados de las pruebas de patogenicidad en plantas de tomate de árbol, fríjol y papa.
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