Cromatografía de líquidos

de alta eficiencia
Diana Vélez
 HPLC (high-performance liquid
chromatography), rivaliza la eficiencia con
la cromatografía de gases y permite hacer
mediciones y separaciones en minutos.
Es el análogo de la GC en fase líquida, las
partículas son pequeñas y uniformes.
• La cromatografía de líquidos convencional se hacía
en columnas grandes, con partículas grandes y con
alimentación por gravedad.
• Las fracciones de eluyentes se recolectaban
manualmente para su medición en el
espectrofotómetro.
• El primer equipo de HPLC fue construido por Csaba
Horvath y S. R. Lipsky.
• En los primeros años de 1970 fue posible usar
columnas de volumen pequeño y mayor longitud que
permitieron un funcionamiento con alta resolución.
Principios
• La rapidez de distribución de solutos entre la
fase estacionaria y la fase móvil, en la
cromatografía de líquidos tradicional, está
controlada por difusión principalmente. La
difusión en los líquidos es en extremo lenta.
• Para minimizar la difusión y el tiempo para el
movimiento de los componentes de la
muestra debe cumplirse que: el material de
empaque esté finamente dividido y ser
regular, y que la fase estacionaria sea una
película delgada y uniforme sin lugar para
estancamiento.
Fases estacionarias
• Las micropartículas en la HPLC original eran de gel de sílice
o de alúmina, irregulares y porosas, de 10 𝜇𝑚 o menos.
• Actualmente las partículas son de sílice de alta pureza, con
un diámetro típico de 5-10 𝜇𝑚. Las partículas de 3 𝜇𝑚 se
emplean cada vez más para cromatografía de alta
velocidad.
• Los tamaños de los poros son de 60-100 Å, se usan tamaños
hasta de 300 Å para biomoléculas más grandes.
• La mayor parte de las separaciones con HPLC se lleva a
cabo en el modo líquido-líquido.
Fases estacionarias
Usadas con mayor frecuencia, permeables al disolvente.
La fase móvil se mueve en torno a las partículas y el
Partículas soluto se difunde entrando a la fase móvil estancada
dentro de los poros, e interactúa con la fase
microporosas o
estacionaria. Se difunde saliendo del poro y entra a la
difusivas fase móvil. El uso de partículas pequeñas reduce al
mínimo la longitud de la trayectoria de difusión

Están formados por una mezcla de poros grandes y

pequeños (pasantes y difusivos, respectivamente). Los
poros pasantes permiten que la fase móvil atraviese en
Empaques de forma directa el empaque y con ello aumente la rapidez
de transferencia de masa en la fase móvil. El soluto pasa
perfusión menos tiempo intercambiando masa, los máximos son
más angostos. El proceso es una combinación de
difusión y convección. Estos empaques son de 12 𝜇𝑚 de
diámetro. Alcanzan mayor eficiencia para moléculas
grandes, como proteínas.
Fases estacionarias
De sílice o resina, con tamaños menores de 1.5-2.5 𝜇𝑚
de diámetro, tienen una capa porosa delgada. Eliminan
la existencia de una fase móvil estancada, permitiendo
Empaque no una mayor rapidez de transferencia de masa. Las
porosos moléculas grandes o pequeñas pueden separarse en
pocos minutos. La capa delgada se limita a capacidades
de carga muy pequeñas y la contrapresión es mayor.

Otro método para tener bajas caídas de presión y

mayores velocidades de transferencia de masa. Son
columnas sólidas continuas de fase estacionaria de
Columnas sílice porosa y no de partículas empacadas. Los
macroporos tienen 2 𝜇𝑚 de diámetro. El esqueleto de
monolíticas sílice contiene mesoporos con 13 nm de diámetro. Su
superficie se puede modificar con la fase estacionaria.
Sobre el cilindro se encoge PEEK para evitar que haya
efecto de pared. Son cortas y las cantidades de platos
son muy pequeñas.
Fases estacionarias
• Las partículas de sílice se limitan a pH de 8.
• Se desarrolló una partícula híbrida de sílice/polímero
denominada Xterra, que se derivan de dos monómeros: uno
que forma unidades de 𝑆𝑖𝑂2 y otro que forma unidades de
𝑅𝑆𝑖𝑂1.5
• Los grupos organosilano se incorporan en toda la
estructura y se enlazan en forma superficial con diversos
grupos no polares.
• Se desarrollaron partículas de circonio poroso
químicamente estables en pH de 1-14 y térmicamente
estables a 200°C.
Equipo para HPLC
Se requieren presiones de hasta 1000-3000 libras por pulgada cuadrada para
tener rapidez de flujo de 1 a 2 𝑚𝑙Τ𝑚𝑖𝑛, en columnas de 3-5 mm de diámetro y de
10-30 cm de longitud.
Un aparato de cromatografía de líquidos de alta eficiencia se compone de cuatro
partes principales:
• Sistema de suministro de fase móvil: Tiene una bomba para llegar a las altas
presiones que se requieren, suele contener algún medio para producir un
gradiente de elución. Los depósitos de disolvente se pueden llenar con
disolventes de distintas polaridades (miscibles), deben ser puros y estar
desgasificados para evitar la formación de burbujas. Se da un problema
cuando se mezclan solventes porque pueden liberar burbujas por la distinta
solubilidad de aire. Las formas comunes de desgasificar son burbujear con
helio o con vacío. La bomba más utilizada es la reciprocante que tiene una
pequeña cámara cilíndrica de pistón que se llena con fase móvil y se vacía en
forma alternativa, con un movimiento de ida y vuelta del pistón. Las bombas
reciprocantes tienen varias ventajas. Cuentan con pequeño vo lumen
interno, son capaces de producir altas presiones y se pueden usar con
facilidad para un gradiente de elución. Otras bombas que también se usan
son las de jeringa motorizadas y las neumáticas (de presión constante).
Equipo para HPLC
• Sistema de inyección de muestra: Se compone de un anillo de acero
inoxidable con seis conexiones diferentes, una de las cuales va a la columna.
Dentro del anillo hay un cono móvil de teflón que tiene tres segmentos
abiertos, y cada uno de ellos conecta un par de las conexiones externas. Dos
de las conexiones se unen con un circuito externo de muestra, de volumen
conocido o fijo. El cono permite el flujo directo del efluente a la columna, y
así el circuito se puede llenar con la muestra. El cono se gira 30° para que el
circuito de la muestra sea parte de la corriente en movimiento, la cual barre
la muestra y la lleva a la columna. Las muestras se pueden introducir en
forma manual a la válvula con una jeringa que llena el circuito de la muestra.
La principal limitante de los inyectores de válvula es que el tamaño de la
muestra es fijo, y se debe cambiar el circuito para variar la cantidad de
muestra inyectada. Hay jeringas ajustables motorizadas que producen la
presión suficiente para inyectar la muestra a través de una válvula de
retención, que evita el flujo de retorno.
Equipo para HPLC
• Columna: Son de varios diámetros y longitudes, los cuales dependen de la
aplicación. En general, el diámetro interno tiene 3.9 o 4.6 mm. Una columna
de 4.6 mm de diámetro, bien empacada con partículas de 5 𝜇𝑚 debe tener un
número de platos del orden de 60000-90000 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎𝑠ൗ𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜, a flujos de 1 𝑚𝑙Τ𝑚𝑖𝑛 .
Una columna convencional de 15 cm de longitud con 4.6 mm de diámetro
interior tiene 15000 platos. Las partículas menores se limitan a longitudes de
25 cm o menos, por las grandes caídas de presión. Puede hacerse
cromatografía rápida con columnas de mayor diámetro y cortas, pero las
columnas delgadas producen mayor resolución. No es necesario controlar la
temperatura en la cromatografía líquido-sólido, a menos que deba trabajarse
a temperaturas elevadas; pero en general sí se requiere para otras formas de
cromatografía de líquidos. Algunos detectores son muy sensibles a los
cambios de temperatura. Entre el inyector y la columna analítica se instala
un guardacolumna o precolumna pequeño, de 3-10 cm, que contiene en
general el mismo empaque que la columna analítica. Se instala porque
retiene basura y materia sólida provenientes de la muestra que ensuciarían la
columna y retienen compuestos que quedarían atrapados en la columna sin
eluirse. Prolonga la duración de la columna analítica, debe ser sustituido o
regenerado periódicamente.
Equipo para HPLC
• Detector: Se requieren detectores con gran sensibilidad, en general para
cantidades de microgramos a nanogramos. Los detectores que más se usan
son refractómetros y detectores de ultravioleta (UV). El detector de
refractómetro diferencial, llamado con frecuencia “detector universal”, mide
cambios en el índice de refracción del eluyente causados por la presencia de
solutos al salir de la columna. Es muy sensible a los cambios de temperatura.
Este detector es robusto, y detecta concentraciones aproximadas de
10−5 a 10−5 𝑔Τ𝑚𝑙 (10 -1 ppm). El detector ultravioleta tiene mucho mejor
selectividad, alrededor de 10−8 𝑔Τ𝑚𝑙 (0.01 ppm). No es sensible a la
temperatura, cuesta relativamente poco y se puede usar con gradiente de
elución. Con el detector UV se hacen el 80% de las mediciones. Muchos
detectores de UV son sencillos filtros de interferencia que pueden medir la
absorbancia sólo a unas cuantas longitudes de onda predeterminadas. El
detector más popular en HPLC es el de longitud de onda variable UV-Vis.
Puede medir nanogramos de analitos absorbentes de UV o los que tengan
cromóforos adecuados que absorban en la región visible. Las columnas
analíticas pueden manejar muestras de 100 𝜇𝑙, por lo que estos detectores
pueden medir, en casos favorables, concentraciones de 10 ppb
Equipo para HPLC
• Detector: Un detector de serie de diodos proporciona poder adicional de
resolución e incluso identificación a nivel de huellas digitales. La fuente de
radiación focal pasa a través de la celda de detector de flujo y es dispersada
por una rejilla a una serie de fotodiodos para su detección. Los detectores de
fluorescencia pueden tener mejor selectividad que los de absorción
ultravioleta porque son menos los compuestos que fluorescen que los que
absorben. El detector amperométrico es adecuado para detectar sustancias
electroactivas, y ha encontrado muchos usos en aplicaciones biológicas. Al
configurar el aparato, debe haber un “volumen muerto” mínimo entre la
conexión de inyección y la columna, y entre la columna y el detector, para
minimizar el ensancha miento de los máximos y para obtener la máxima
eficiencia. En general, se puede usar un capilar de 20 cm de acero inoxidable
para conectar la columna con el detector sin afectar mucho la eficiencia de
ésta. También el volumen del detector debe ser pequeño.
Desarrollo del método HPLC
• La cromatografía de líquidos de alta eficiencia se usa en el modo de
cromatografía de adsorción líquido-sólido, o en el de cromatografía de
partición líquido-líquido. El más común es el modo de partición. Los
procesos de partición líquido-líquido son bastante sensibles a pequeñas
diferencias en el peso molecular, por lo que se prefieren para separar
miembros de series homólogas. Por otra parte, los procesos de adsorción
son sensibles a los efectos estéricos, y se prefieren para separar isómeros
con distintas configuraciones estéricas. Los materiales muy polares se
separan mejor con cromatografía de partición, en tanto que los que son
mucho menos polares se separan con cromatografía de adsorción.
• En la cromatografía de fase normal (NPC, normal-phase chromatography) la
fase estacionaria es polar. Se usa una fase móvil no polar, la fase
estacionaria es un siloxano unido con un grupo funcional polar, las fases
retienen compuestos polares preferentemente a compuestos no polares.
• En la cromatografía de fase inversa (RPC, reversed-phase chromatography)
se usa una fase estacionaria relativamente no polar, y la fase móvil polar. El
disolvente orgánico se llama modificador, y el más común es acetonitrilo. El
contenido de agua se hace variar para ajustar la polaridad. Con los
compuestos ácidos se usa metanol, y para los básicos se usa acetonitrilo.
Desarrollo del método HPLC
• Selección del disolvente: En la cromatografía de partición líquido-
líquido se puede variar la fase móvil, esto es, la “fuerza del
disolvente”. Con un disolvente puro no se obtendrá la separación
eficiente de una serie de compuestos, y deberá usarse una
formulación con dos o más disolventes. El disolvente débil se llama
disolvente A, y el fuerte se llama disolvente B. El factor de
retención k, que es un término de polaridad, y el factor de
separación , que es un término de selectividad se trata de ajustar la
concentración del disolvente para colocar todas las bandas de
soluto dentro de un intervalo de k de aproximadamente 0.5-20. El
ajuste a una polaridad aceptable permitirá que la resolución sea
adecuada para muchos compuestos. Si la separación es
incompleta, un cambio en % B, por ejemplo de 35-45% causará con
frecuencia un cambio importante en el espaciamiento de las
bandas, y producirá una mejor resolución.
Desarrollo del método HPLC

• Diferencias entre columnas: Los fabricantes de columnas

proporcionan información como el número de platos, selectividad
única, reproducibilidad, caída de presión, etc. Se ha tratado de
clasificar las columnas. Una de estas formas consiste en usar un
solo compuesto para caracterizar una serie de columnas con un
analito de polaridad fija para determinar el tiempo relativo en el
que éste se eluye. Otra es usar un método quimiométrico
(estadístico) para agrupar las columnas de acuerdo con la
eficiencia, simetría del máximo, formación de colas en el máximo y
silano libre. La mejor manera de seleccionar la columna adecuada
es la evaluación empírica
Desarrollo del método HPLC
• Gradiente de elución: Un método más viable que no está disponible en la
cromatografía de gases es emplear elución con gradiente de fase móvil. La
cromatografía de líquidos con gradiente de elusión es una de las formas más
efectivas para separar varios analitos que tienen tiempos relativos de
retención diferentes. En la elución isocrática (con la misma polaridad) en
general hay mala resolución de máximos al iniciar el cromatograma y
ensanchamiento de máximos con tiempos de retención más grandes. En la
cromatografía de fase inversa el gradiente se consigue aumentando la
fracción de disolvente orgánico modificador permitiendo eluir compuestos
débilmente retenidos, y los que se retienen más se eluirán más rápido. El
gradiente puede elevarse de manera escalonada o continua. Las bombas se
programan para mantener constante el flujo total. El disolvente inicial debe
tener una polaridad que eluya rápido y resuelva los primeros componentes;
la concentración (polaridad) del disolvente se eleva hasta un valor que
resuelva los últimos máximos en un tiempo razonable. Uno de los problemas
que se encuentran en el gradiente de elución en cromatografía de fase
inversa es que la columna se debe reequilibrar con el disolvente inicial entre
corridas. Para eso se requiere lavar con 15 a 20 volúmenes de columna con la
fase móvil inicial.
Cromatografía líquida rápida
• Se obtienen separaciones más rápidas usando partículas más pequeñas y
columnas más cortas.
• Si las columnas se acortan y se empacan con partículas más pequeñas,
pueden hacerse separaciones en la décima parte del tiempo que se requiere
en HPLC convencional.
• Las columnas rápidas de cromatografía de líquidos (LC, liquid
chromatography) tienen el mismo diámetro que las columnas
convencionales, 4.6 mm, pero sólo tienen 1 a 3 cm de longitud, y se empacan
con partículas de 3 𝜇𝑚 trabajando dentro de 1-3 𝑚𝑙Τ𝑚𝑖𝑛
• Las columnas son cortas debido a la mayor contrapresión con las partículas
más pequeñas. Si bien no tienen gran resolución, estas separaciones
resuelven muchos de los problemas analíticos en la industria farmacéutica.
• Al usar cromatografía de líquidos rápida se usa 50-80% menos disolvente, la
sensibilidad aumenta de 3-5 veces.
• Si se debe aumentar la resolución al usar esas columnas cortas, se puede
ajustar la fase móvil para que todos los analitos se eluyan en un intervalo de k
de 1 a 10 con una elución más lenta.
• Se requieren detectores y circuitos electrónicos de respuesta rápida para
medir los máximos de elución angostos (de 0.5 s o 3 𝜇𝑙) y rápidos.
Columnas de pequeño calibre
• Con columnas angostas mejora la sensibilidad.
• Si se hacen columnas más angostas, el resultado es una mayor detección
debido a que los máximos son más angostos y altos.
• La rapidez de flujo es proporcional al cuadrado del diámetro de la columna, y
el flujo óptimo para tener la misma resolución es unas cinco veces menor
para la columna más angosta, se puede alcanzar la misma sensibilidad en las
columnas convencionales si se inyecta una muestra cinco veces mayor.
• Los volúmenes de muestra inyectados en las columnas de 2.1 mm no deben
ser mayores a 5 𝜇𝑙 para minimizar la influencia de la inyección sobre los
volúmenes de los máximos. Y el volumen de la celda de flujo debe ser de 3-5
𝜇𝑙.
• En líquidos-masas se usan ampliamente capilares de sílice fusionada, de
0.25 o 0.32 mm de diámetro interno, empacados con partículas de 3 o 5 𝜇𝑚.
Estas columnas requieren muestras pequeñas, del orden de un microlitro o
menos.
 Temperatura
• Las partículas se circonio son
estables a altas temperaturas.
Las de circonio poroso
recubiertas con poliestireno se
han usado hasta los 200°C.
• La eficiencia de la columna de
alta velocidad mejora a mayores
temperaturas, en especial para
solutos que se retienen
fuertemente.
Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
• Es más difícil conectar un cromatógrafo de líquidos con un espectrómetro de
masas debido a la necesidad de eliminar el disolvente. Además, los analitos
son no volátiles y pueden ser térmicamente lábiles.
• Las interconexiones de uso común son la fuente de ionización por
electroaspersión (ESI, electrospray ionization), ionización por
termoaspersión (TSI, thermospray ioniza tion), ionización química a presión
atmosférica (APCI, atmospheric pressure chemical ionization) y la ionización
con haz de partículas.
• La elección depende de la polaridad y estabilidad térmica del analito.
• La ionización por electroaspersión es la interconexión HPLC masas de uso
más común. Se prefiere para moléculas polares, iónicas o muy grandes,
como proteínas y péptidos.
• La ionización química a presión atmosférica también es adecuada para
moléculas grandes y para compuestos no polares.
• La termoaspersión se usa para compuestos polares y no polares.
• La ionización por haz de partículas es adecuada para moléculas
relativamente volátiles y pequeñas, polares y no polares.
Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
• En una interfase con haz de partículas el eluyente viene de la columna de
HPLC y se nebuliza con gas helio formando un aerosol en una cámara a
presión reducida, calentada a 70°C.
• En el extremo de la cámara hay un cono con un orificio pequeño que conduce
a una zona con menor presión.
• La diferencia de presiones causa una expansión supersónica del aerosol. El
helio y las moléculas de disolvente son más ligeros que las moléculas del
analito, tienden a difundirse fuera de la corriente y se bombean para
removerlas.
• Después el vapor de analito entra a la fuente de iones. La interfase del haz de
partículas produce espectros de ionización electrónica
• En la interfase de termoaspersión, la muestra de la columna atraviesa por un
tubo calentado y se expande rápidamente en forma de chorro de aspersión
en una cámara al vacío calentada.
• El disolvente se aparta rápido de las gotitas por bombeo y se imparte a las
partículas una carga estática, las cuales entran al espectrómetro de masas.
La termoaspersión produce “ionización suave” con poca o ninguna
fragmentación, y permite la ionización suave de compuestos orgánicos no
volátiles y termolábiles.
Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas
• La interfase de ionización por electroaspersión es la más
difundida. También es un método de ionización suave. La solución
de la muestra se rocía a través de una aguja hacia un orificio en la
interfase.
• El flujo de calor y del gas desolvatan las gotitas cargadas y
producen moléculas del analito cargado que entran al
espectrómetro de masas.
• En la ionización química a presión atmosférica se usa una interfase
de ionización a presión atmosférica, se utiliza una descarga de
corona para ionizar al analito en una región a presión atmosférica.
 Gracias!
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