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Vanguardia: sistema inmunitario innato

Discrimina entre ARN que contiene
Características estructurales bacterianas versus eucarióticas
That Prime para la secreción de IL-12 de alto nivel por
Esta información está actualizada como Células Dendríticas
del 31 de marzo de 2021.
Gary K. Koski, Katalin Karikó, Shuwen Xu, Drew Weissman,
Peter A. Cohen y Brian J. Czerniecki

J Immunol 2004; 172:3989-3993; ;

doi: 10.4049/jimmunol.172.7.3989
http://www.jimmunol.org/content/172/7/3989

Referencias Este artículo cita 14 artículos, 4 de los cuales puede acceder de forma gratuita
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ISSN impreso: 0022-1767 ISSN en línea: 1550-6606.
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LA
DIARIO DE INMUNOLOGÍA

INNOVADOR

Vanguardia: el sistema inmunitario innato discrimina

entre bacterias que contienen ARN versus eucariotas
Características estructurales que preparan para IL-12 de alto nivel
Secreción por células dendríticas1
Gary K. Koski,2 * Katalin Kariko´,† Shuwen Xu,* Drew Weissman,‡ Peter A. Cohen§ y
Brian J. Czerniecki*
ARN derivado de fuentes bacterianas pero no eucarióticas, también tienen colas de 3 -poli (A) ausentes o relativamente cortas (14–60 nt)
en comparación con sus contrapartes eucariotas, que casi siempre tienen colas
cuando se transfecta en células dendríticas derivadas de monocitos humanos
precursores de células, induce la secreción de IL-12 de alto nivel junto largas de 3 -poli(A) (80–200 nt) (5, 6).
con estímulos de maduración de células dendríticas. ARNm transcrito Presumimos que las disparidades estructurales entre el ARN microbiano y el

in vitro que imita la estructura de bacterias huésped habrían ejercido una presión selectiva sobre

El ARNm en ausencia de una cola larga de 3-poli(A) induce igualmente el sistema inmunitario de los mamíferos para desarrollar medios para detectar

la secreción de IL-12, pero esta propiedad se pierde con la eficiente 3- dicho ARN y modificar las respuestas en consecuencia. Para probar esta
hipótesis, transfectamos ARN de varias especies microbianas
poliadenilación enzimática. Entre otros probados
en precursores de células dendríticas (DC) derivadas de monocitos, de modo que
Los ARN, solo el ácido poliuridílico inducían IL-12 p70. Este
el ARN alcanzaría localizaciones intracelulares. Luego suministramos
El fenómeno de la respuesta del ARN parece biológicamente distinto
las células transfectadas con señales de maduración adicionales y
de la respuesta clásicamente definida a dsRNA. Las APC transfectadas
probado para la secreción de IL-12 p70. Nos enfocamos en la IL-12, ya que esta
con ARN también polarizan las células T de una manera dependiente
citoquina juega un papel importante en el control de
de IL-12 hacia el fenotipo Th1 bajo en IL-5 alto en IFN, lo quevínculo
sugiere un
entre
patógenos intracelulares al desviar las respuestas de las células T hacia el
la detección de
Fenotipo IFN -highIL-5low Th1 (7). El IFN- secretado en
ARN apropiadamente estructurado y el sesgo de inmune
a su vez confiere a los macrófagos la capacidad mejorada para matar
respuestas hacia aquellos más adecuados para controlar los microbios
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marzo
2021
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por
de
de
31
de
el intracelulares. El ARN estructurado para emular patrones bacterianos
constituye una nueva estrategia vacunal para generar respuestas
inmunitarias polarizadas de tipo Th1. el diario de
microbios internalizados (8). Encontramos que el ARN de cada uno de
varias especies bacterianas probadas (pero no el ARN eucariótico) fue
capaz de cebar DC para la secreción robusta de IL-12 tras la maduración. En
este estudio, proporcionamos evidencia de que la falta de
Inmunología, 2004, 172: 3989–3993. Las colas de 3 poli(A), características del ARNm bacteriano, son una característica
por el cual el sistema inmunitario innato discrimina entre
El ARN se entrega a ubicaciones intracelulares y pone en marcha respuestas
inmunitarias modificadas para tratar de manera óptima con intracelular.
los tejidos propios de los no propios infecciosos y los mecanismos
patógenos
El sistema han
inmunitario requiere
evolucionado medios
para para estructuras
identificar distinguir exclusivas de patógenos

potenciales. Tales estructuras, denominadas asociadas a patógenos Materiales y métodos

patrones moleculares (PAMP)3 (1), incluyen pared celular bacteriana Preparación de ARN
componentes LPS y peptidoglicano, así como no metilados
El ARN total de Streptococcus pyogenes y Enterococcus faecalis fue un amable regalo
Motivos CpG en ADN procariótico.
del Dr. T. Buttaro (Universidad de Temple, Filadelfia, PA) y fue preparado
El ARN también puede formar PAMP. Un intermedio replicatorio para de cultivos de crecimiento logarítmico medio mediante la técnica de fenol caliente. Los parásitos de

algunos virus, el dsRNA provoca una respuesta característica de IFN tipo I (2, 3). la malaria Plasmodium falci parum en etapa sanguínea fueron un amable regalo del Dr. N. Kumar (Johns
Hopkins University, Baltimore, MD), con ARN del parásito preparado usando
El ARN bacteriano también puede contener PAMP, porque su ARN ribosómico
Extracción de TRIzol según protocolo del fabricante (Life Technologies,
difiere del eucariótico en el grado de Gaithersburg, MD). El ARN de Escherichia coli se preparó a partir de un crecimiento logarítmico medio
metilación y contenido de pseudouridina (4). ARNm bacteriano bacterias por digestión con lisozima y posterior extracción con RNAwiz (Ambion,

† 2
*Departamento de Investigación Quirúrgica de Harrison, Departamento de Cirugía, Departamento de Dirija la correspondencia y las solicitudes de reimpresión al Dr. Gary K. Koski, Harrison Department of Surgical

Investigación en neurocirugía, y ‡ Departamento de Medicina, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA Research, Department of Surgery, University of Pennsylvania, 36th and
19104; y § Centro de Investigación de Cirugía, Fundación de la Clínica Cleveland, Hamilton Walk, Filadelfia, PA 19104. Dirección de correo electrónico: [email protected]
Cleveland, OH 44195
3
Abreviaturas utilizadas en este artículo: PAMP, patrón molecular asociado a patógenos; CORRIENTE CONTINUA,
Recibido para publicación el 1 de diciembre de 2003. Aceptado para publicación el 10 de febrero de 2004. célula dendrítica; pU, ácido poliuridílico; pG, ácido poliguanílico; pC, ácido policitidílico; Pensilvania,
ácido poliadenílico; p(I:C), ácido poliinosínico-policitidílico; SOD-1, superóxido dismutasa 1;
Los costos de publicación de este artículo fueron sufragados en parte por el pago de los cargos por página.
MART-1, Ag de melanoma reconocido por células T 1; CD40L, ligando de CD40; CMM, citocina
Por lo tanto, este artículo debe marcarse como publicidad de acuerdo con 18 USC
mezcla de maduración; int, intermedio; pos, positivo; neg, negativo.
Sección 1734 únicamente para indicar este hecho.

1
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-99-029-
04-LIB) (a BJC) y la Fundación Elsa U. Pardee (a GKK).

Copyright © 2004 por la Asociación Americana de Inmunólogos, Inc. 0022-1767/04/$02.00

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3990 VANGUARDIA: DC DISCRIMINA ENTRE ARN PROCARIOTICO Y EUCARIOTICO

Austin, TX) según el protocolo del fabricante. Listeria monocytogenes Alosensibilización de células T
fue un amable regalo del Dr. Y. Patterson (Universidad de Pensilvania) con RNA
Se prepararon células T CD4 CD45RO vírgenes a partir de fracciones de elutriación ricas en linfocitos
igualmente preparado usando RNAwiz. Se cuantificó el ARN y se evaluó la calidad.
usando columnas de depleción negativa según las indicaciones del fabricante.
por espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. ARN total de humano
(Sistemas de I+D, Minneapolis, MN). Células T alogénicas purificadas (1 106 /pozo)
La línea de leucemia KG-1 y el corazón de ratón se adquirieron de Ambion. purificado
se cocultivaron como se describió anteriormente con CD (1 105 /pocillo) que se
ARNm poli(A) de corazón y cerebro de ratón, así como ARNt de levadura,
recolectado 12–14 h después del estímulo de maduración (justo antes del pico de secreción de IL-12)
ADN de esperma de salmón trasquilado y los homopolinucleótidos ácido poliuridílico
en placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos. El día 6, las células T se recolectaron y se volvieron a
(pU), ácido poliguanílico (pG), ácido policitidílico (pC), ácido poliadenílico (pA),
estimular en placas recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28 como se describió anteriormente (9). En
y ácido poliinosínico-policitidílico (p(I:C)) se adquirieron de Sigma-Al drich (St. Louis, MO). Todos los
RNA se almacenaron en tubos siliconados a 70°C. algunos experimentos, se realizaron cocultivos en presencia de 10
g/ml mAb neutralizante de IL-12 o control negativo de isotipo coincidente (R&D
Los ARNm transcritos in vitro, capMART-A20 y capSOD-A30, se prepararon a partir de pT7TS-
Sistemas). Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después y se analizaron por ELISA.
SOD-1 linealizado (Dr. K. Mitchell (Instituto Nacional de
Investigación dental y craneofacial, Bethesda, MD)) y pT7T3D-MART-1
(American Type Culture Collection, Manassas, VA) plásmidos que codifican la superperóxido Resultados y discusión
dismutasa 1 de rata (SOD-1) y Ag de melanoma humano reconocido por las células T
El ARN bacteriano y el ARNm transcrito in vitro preparan DC para alto nivel
1 (MART-1), respectivamente. Estas transcripciones, generadas con MessageMachine
secreción de IL-12
Ultra (Ambion), tenía colas cortas de poli(A) de 20 y 30 nt de largo y estructura de tapa como
indicado. Alícuotas seleccionadas de capSOD-A30 y capMART-A20 se poliadelizaron con poli(A)
Presumimos que los agentes del sistema inmunitario innato
polimerasa de E. coli (Ambion) para producir capSOD-A y 150
capMART-A 150 ARNm con una cola poli(A) de un mínimo de 150 nt de longitud. podría distinguir entre el ARN de mamíferos y microbianos
Cuando se indicó, se usaron ARNm de MART de cadena positiva o negativa. Estas origen. Por lo tanto, transfectamos precursores de DC derivados de
Los ARN no estaban tapados, generados por kits MegaScript (Ambion) de monocitos con ARN total (procariota) de S. pyogenes, el agente
pT7T3D-MART-1 utilizando la correspondiente ARN polimerasa T7 o T3. Este
etiológico de la escarlatina, así como ARN total (eucariota).
El kit también se usó para transcribir otro ARNm sin protección (designado como luc)
del plásmido pluc que codifica la luciferasa de luciérnaga (Dr. D. Gallie (Universidad de California,
aislado de la línea de leucemia humana KG-1, corazón de ratón y
Riverside, CA)). Los ARNm transcritos se precipitaron usando LiCl, el parásito de la malaria humana P. falciparum. Entonces las células eran
se lavó con etanol al 70% enfriado con hielo y se resuspendió en agua libre de ARNasa y
madurado o no con CD40L, y los sobrenadantes de cultivo se analizaron
la concentración y la calidad se ensayaron por espectrofotometría y gel de agarosa
electroforesis
24 h más tarde para IL-12. Células tratadas con CD40L o
Para promover la formación de dúplex de ARN complementario positivo y negativo transcrito in El ARN solo produjo poca o ninguna IL-12 (no se muestra). Sin embargo,
vitro, se mezcló 1 g/ml de cada ARN y se incubó a 37 °C durante 3 h, se enfrió a 4 °C durante 1 h y las células transfectadas con ARN de S. pyogenes y luego maduradas
se congeló a temperatura ambiente. 70°C antes de usar.
secretaron niveles muy altos de IL-12 (Fig. 1A). El otro ARN tenía
Se usó un procedimiento similar para la inhibición de polirribonucleótidos sintéticos de
inducción de IL-12 por capMART-A20 usando concentraciones graduadas de pA y no hay tal efecto. Por el contrario, el ARN de E. coli, E. faecalis y L.
p(A,C,U), con la excepción de que estas preparaciones se usaron inmediatamente
sin congelación previa.

Preparación de fracciones de PBMC humanas

Los donantes adultos sanos dieron su consentimiento informado y se sometieron a leucoféresis

según un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. El producto sanguíneo fue entonces
elutriado para obtener fracciones ricas en monocitos (94%) y enriquecidas en linfocitos
que fueron criopreservados como se describió anteriormente (9).

Cultura y transfección de DC

Los esquemas de cultivo de DC se modificaron a partir de métodos rápidos de 2 días descritos

anteriormente usando ligando de CD40 (CD40L) o LPS como principales impulsores de la maduración
(9, 10). Brevemente, las células de las fracciones de elutriación ricas en monocitos se cultivaron
durante la noche a 1,5 × 106 células/ml en medio sin suero de macrófagos (Life
Technologies) suplementado con 50 ng/ml de GM-CSF (para las células a madurar
con CD40L (Amgen, Thousand Oaks, CA)) o GM-CSF más 1000 U/ml IL-4
(para células a madurar con E. coli O26:B6 LPS (Sigma-Aldrich)). El volumen total para las placas
de cultivo de tejidos de 48 pocillos fue de 1 ml, y para las placas de 96 pocillos, de 0,2 ml.
Al día siguiente, se retiraron los sobrenadantes del cultivo y se transfectaron las células.
usando lipofectina (Life Technologies) con concentraciones indicadas de ARN como
descrito anteriormente (11) durante 45 min. Cuando se indique, alícuotas de ácidos nucleicos
se incubaron con Benzonase (Novagen, Madison, WI) o DNase I (Ambion)
antes de la complejación. Después de este período, los sobrenadantes se retiraron y se reemplazaron
con medio fresco y citoquinas. Después de 1-3 h, un estímulo de maduración en
se añadió a los cultivos la forma de 1 g/ml de CD40L (Amgen) o 50 ng/ml de LPS O26:B6 (Sigma-Al
drich). Veinticuatro horas después, se retiraron los sobrenadantes y se analizó la presencia de
citocinas. En algunos experimentos, se usó una mezcla de maduración de citoquinas (CMM) que
constaba de TNF-, PGE2, IL-6 e IL-1 para madurar DC como estándares de comparación no FIGURA 1. El ARN bacteriano se prepara para la secreción de IL-12 de alto nivel por DC. A,
transfectados de acuerdo con
Los cultivos nocturnos de precursores de DC derivados de monocitos se transfectaron con
métodos publicados (12, 13). En general, antes de la maduración, los cultivos DC se
dosis graduadas de ARN total de S. pyrogenes, P. falciparum, leucemia humana
algo heterogéneo (intermedio-negativo) en la expresión de CD14 y
CD83neg, CD80low, CD86low, CD11cpos, HLA-DRint, clase HLA Ipos, línea KG-1, o corazón de ratón, y luego se maduró con 1 g/ml de CD40L. Los sobrenadantes se

y CD33pos. Después de la maduración, las células fueron CD14low-neg, CD83pos, CD80high, recogieron 24 h más tarde y se analizaron para IL-12 p70 mediante ELISA. B, Transfección con ARN

CD86 alto, CD11cpos, HLA-DR alto, Ipos de clase HLA y CD33pos. total de E. coli, E. faecalis o L. monocytogenes a una concentración de 5 g/ml, seguida de maduración
con CD40L o sin tratamiento, con
ELISA Sobrenadantes de 24 h evaluados para IL-12 p70. C, capSOD-1 transcrito in vitro
A30RNA, E. coli RNA total y DNA de plásmido bacteriano que codifica MART-1 Ag
Abs de captura y detección biotinilados y estándares para IFN- humano, IL-5,
fueron digeridos con DNase I o Benzonase, y transfectados en precursores de DC
e IL-12 p70 (BD PharMingen, San Diego, CA), se utilizaron de acuerdo con la
a 5 g/ml en base a la concentración de ARN previa a la digestión. Las células transfectadas fueron
recomendaciones y protocolos del fabricante como se describió anteriormente (9).
El IFN- se midió con un sistema ELISA que detecta los más comunes madurado con CD40L, y los sobrenadantes se evaluaron para IL-12 como en B. Resultados

isoformas de IFN- (Biosource, Camarillo, CA), según el fabricante en A–C son cada uno representativo de tres experimentos con diferentes donantes
las instrucciones de er. SEM.
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El Diario de Inmunología 3991

monocytogenes, el agente etiológico de la listeriosis, cada uno inducido

secreción de alto nivel de IL-12 junto con el tratamiento con CD40L (Fig. 1B).

La maximización de la secreción de IL-12 por la maduración de las CD está estrechamente

regulado y requiere dos señales, incluyendo IFN- (cebado

señal, o señal 1) seguida de CD40L o LPS (señal 2) (14).
Estos resultados muestran que el ARN sustituye al IFN- como el primer
(es decir, cebado) señal. Cabe señalar aquí que el ARN no
alteran apreciablemente el fenotipo de superficie de las CD (es decir, CD83,
CD80 y CD86) según lo evaluado por citometría de flujo, y no
inducir IFN detectable- ni el ,ARN podría servir como el segundo
señal después del cebado con IFN-exógeno (datos no mostrados). Además, la
transfección en lugar de la mera adición de ARN fue
necesarios para observar los efectos de cebado de IL-12 (no mostrados). Este
parece indicar que se requiere la entrega intracelular de ARN,
aunque no se puede descartar un mero efecto estabilizador del complejo
lipofectina. Quizás lo más importante, todas las pruebas bacterianas
ARN preparado para la secreción de IL-12, ya sea derivado de especies
patogénicas o generalmente inofensivas, especies Gram-negativas o Gram-
positivas, o especies que causan enfermedades a través de estilos de vida
FIGURA 2. ARNm con cola 3 -poli(A) corta o ausente y DC cebadoras pU
intracelulares o extracelulares. Así parecía que el
para la secreción de IL-12. A, Se transfectaron cultivos durante la noche de precursores de DC
la discriminación, basada en el conjunto de ARN examinado, se cortó
con ácidos nucleicos de origen natural o sintetizados in vitro indicados a 5 g/ml
exclusivamente a lo largo de los límites eucariotas/procariotas. y luego se maduró con CD40L o LPS bacteriano, con sobrenadantes de cultivo recolectados 24
Para demostrar que los efectos observados en realidad fueron desencadenados por h más tarde y analizados para IL-12 p70. Los resultados son representativos de
ARN en lugar de algún contaminante, se sometió el ARN de E. coli dos experimentos separados. B, ARNm de SOD-1 y MART-1 transcrito in vitro

a la acción enzimática de Benzonase, que digiere tanto fueron sometidos a poliadenilación enzimática que extendieron su cola 3 -poly(A)
por al menos 150 nt como se indica por electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. Estos ARN
ADN y ARN, o ADNasa I libre de ARNasa. El análisis electroforético mostró la
luego se transfectaron en precursores de DC a concentraciones crecientes, y las células
destrucción con Benzonasa del ARN de E. coli , así como en
se maduraron con 1 g/ml de CD40L. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron 24 h
ARN transcrito in vitro (capSOD-1 A30) y ADN MART-1
posteriormente y analizado por ELISA para IL-12 p70. Los resultados son representativos de tres
controles de plásmido (no mostrados). ADNasa I solo destruyó plásmido experimentos
ADN y no tuvo ningún efecto aparente sobre el ARN. Como era de esperar, el
ARN de E. coli tratado con Ben zonasa, pero no el tratado con ADNasa, perdió
la capacidad de cebar las DC para la secreción de IL-12, de acuerdo con el ARN. (capSOD-1 A 150) y el Ag asociado al melanoma humano
siendo el agente activo (Fig. 1C). MART-1 (capMART-1 A 150) (Fig. 2B). Estos ARNm fueron
luego se transfectaron en DC a concentraciones graduadas y se compararon
La poliadenilación de 3 extremos del ARNm transcrito in vitro inhibe la capacidad
con sus transcritos parentales de cola corta (capSOD-1
preparar para la secreción de IL-12
A30 y capMART-1 A20) para cebar la secreción de IL-12. IL-12
Los resultados anteriores también mostraron que el ARNm de cap SOD-1 A30 la secreción disminuyó fuertemente para el ARN poliadenizado enzimáticamente
transcrito in vitro , como el ARN bacteriano natural, tenía la capacidad de cebar en todo el rango de dosis probado. Por lo tanto, poli(A) cola
las CD para la secreción de IL-12 (Fig. 1C). Nosotros por lo tanto longitud parece servir como un medio para distinguir entre
probó una batería de ácidos nucleicos, tanto naturales como sintetizados in ARNm y ARN endógenos que podrían ser de origen microbiano.
vitro, para descubrir si otros ARN cebadores de IL-12 origen patógeno.
existieron y, de ser así, qué similitudes estructurales los unían al ARN
bacteriano. Las CD se transfectaron con transcripciones in vitro La respuesta de DC al ARNm cebador de IL-12 es distinta de la clásica
respuesta a dsRNA
ARNm que codifica luciferasa de luciérnaga, ARNm poli(A) de roedor
de varios tejidos, ARNt de levadura, ADN de esperma de salmón cortado, La respuesta clásica de IFN tipo I es inducida por dsRNA (2, 3).
así como homopolirribonucleótidos pA, pU, pC y pG, y Aunque nuestras construcciones de ARN son nominalmente monocatenarias,
el polímero aleatorio p(A,C,U). A continuación, las células se trataron con la complementariedad limitada de la secuencia interna podría formar regiones
CD40L o LPS bacteriano, y los sobrenadantes de 24 h se analizaron para cortas de doble hebra suficientes para inducir una respuesta de tipo I y una
IL-12 (Fig. 2A). Luc RNA preparado para una secreción robusta de IL-12 posible cosecreción de IL-12. Por lo tanto, probamos
ya sea madurado con CD40L o LPS. Sin embargo, ningún otro la capacidad de p(I:C), el modelo sintético dsRNA, para cebar para
El ARN probado tenía tal actividad excepto pU. El hallazgo con pU secreción tanto de IL-12 como de IFN- en comparación con pU, y
fue inicialmente sorprendente, porque no pudimos ver ninguna conexión p(A,C,U). Solo sobrenadantes de células transfectadas con pU
particular con el ARN bacteriano. En cambio, apreciamos de inmediato mostró altos niveles de IL-12 (Fig. 3A). Por el contrario, p(I:C) fue
que el ARN sintetizado in vitro, como el ARNm bacteriano, tenía el inductor de IFN más potente, con pU y p(A,C,U) estimulando niveles
colas 3 -poli(A) muy cortas o ausentes en comparación con las colas naturales significativos, aunque más modestos.
ARNm de mamíferos (5, 6), que en estos experimentos no En experimentos relacionados, la capacidad de cebado de IL-12 de
inducir IL-12. Esta disparidad en la longitud de la cola de poli(A) podría, por lo Se probó dsRNA, formado a partir de ss RNA complementario sintetizado in
tanto, servir como base de discriminación. vitro. Tanto pU como capMART-1 A20 mRNA (que
Probamos esta hipótesis extendiendo enzimáticamente el 3 - ambos preparados para IL-12) se incubaron individualmente con concentraciones
cola poli(A) de ARNm sintetizado in vitro que codifica SOD-1 crecientes de pA o p(A,C,U) (que no
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3992 VANGUARDIA: DC DISCRIMINA ENTRE ARN PROCARIOTICO Y EUCARIOTICO

ensayo de ción que midió la secreción de citoquinas (9). DC maduradas con

CD40L previamente transfectadas con pU, capSOD-1 A30 o
ARN total de S. pyogenes (todos induciendo la secreción de IL-12) T sensibilizada
células que estaban fuertemente polarizadas hacia el tipo Th1 como se evidencia
por su alta secreción de IFN- con una capacidad correspondientemente menor
para secretar IL-5 (Fig. 4A). Por el contrario, las DC transfectadas
con el ARN que no ceba para la secreción de IL-12 (p(A,C,U),
capSOD-1 A que 150,
y KG-1 ARN humano) células T sensibilizadas
secretaba menos IFN- pero aumentaba la IL-5, característica de
Th2. Este es el mismo perfil general de secreción de citoquinas inducido
por CC estándar inducida por CMM no transfectada (que también
no secretan IL-12 p70) que usamos para la comparación (12, 13).
La polarización Th1 inducida por ARN podría ser bloqueada por mAb neutralizante
de IL 12 (Fig. 4B). Estos resultados muestran que los ARN
que contiene la estructura adecuada puede cebar DC para IL-12
secreción en una magnitud suficiente para polarizar fuertemente las células T
hacia el fenotipo Th1.
Los resultados de estos estudios muestran que los componentes celulares de
FIGURA 3. ssRNA ceba para la secreción de IL-12 a través de una vía distinta el sistema inmunitario innato puede distinguir entre bacterias
de los activados por dsRNA. Los precursores de DC se transfectaron con 5 g/ml y ARN eucariótico a través de un mecanismo que conduce a un alto nivel de
polirribonucleótidos pU, p(A,C,U), o p(I:C) (A), o con 5 g/ml pU o
secreción de IL-12, un habilitador de una fuerte inmunidad de tipo Th1 crítica
ARN de MART-1 que se coincubaron con dosis graduadas de polirribonucleótidos inhibidores
para controlar los patógenos intracelulares. Esta discriminación podría recrearse
(p(A,C,U) o pA) antes de la formación de complejos de lipofectina (B),
usando ARN transcrito in vitro
o con 5 g/ml de ARN de cadena positiva de MART-1, cadena negativa de MART-1, MART-1
hebra negativa más hebra positiva, o MART-1 hebra negativa más SOD-1 más que imitaba transcripciones bacterianas o eucarióticas en virtud de
hebra. A continuación, las células se maduraron con CD40L (A) o LPS (B y C). Después de 24 horas colas cortas o largas de 3 -poli(A), respectivamente. Sin embargo,
incubación, se extrajeron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron para IL-12 p70 y otras características estructurales pueden desempeñar un papel y actualmente están bajo
IFN-. Los resultados de A se promediaron a partir de cuatro experimentos con diferentes donantes, investigación. La acción de pU permanece oscura, porque
y B y C son representativos de tres experimentos, SEM.
no pudo relacionar pU con la estructura del ARNm bacteriano. La UP podría
posiblemente actúe indirectamente, hibridando con las colas 3 -poli(A)
de ARNm celular producido endógenamente, enmascarando la cola y

cebar para IL-12) antes de la formación de complejos de lipofectina. haciéndolo parecer al supuesto aparato de reconocimiento de ARN como

Bajo estas condiciones, se esperaría que pA de origen bacteriano. Alternativamente, un mecanismo directo separado

se hibridan con pU para formar cadenas dobles, debido a la perfecta para identificar pU puede haber evolucionado como un medio para detectar

complementariedad en el apareamiento de bases. Tales interacciones no deben el ARN genómico de algunos virus de ARN de cadena negativa, que

ocurren eficientemente entre p(A,C,U) y pU. En cambio, tampoco

pA ni p(A,C,U) deben formar dúplex significativos con
capMART-1 A20. Cuando estas mezclas se transfectaron en
DC, se encontró que la presencia de pA inhibió fuertemente
Cebado de IL-12 por pU de manera dependiente de la dosis (Fig. 3B).
Cualquier inhibición de p(A,C,U) sobre pU fue leve e incompleta.
Por el contrario, ni pA ni p(A,C,U) inhibieron la capacidad de
capMART-1 A20 para preparar la secreción de IL-12 a las mismas dosis,
lo que sugiere que los efectos supresores en pU fueron específicos en
estas concentraciones, y probablemente como resultado de la formación de
dsRNA inactivo (con respecto al cebado de IL-12). Del mismo modo, cuando
Las cadenas positivas y negativas de MART-1 complementarias transcritas in
vitro se coincubaron antes de la transfección, la IL-12-
Las propiedades de cebado poseídas por cualquiera de las hebras solas fueron
fuertemente inhibido (Fig. 3C). Por el contrario, la coincubación de FIGURA 4. Transfección con ARN que prepara para la secreción de IL-12 de alto nivel permite que
las DC polaricen funcionalmente las células T CD4 vírgenes hacia el fenotipo Th1. A, los precursores
La hebra negativa de MART-1 con la hebra positiva de SOD-1 no disminuyó
de DC se transfectaron con 5 µg/ml de ARN total de pU, p(A,C,U), cap S. pyogenes o ARN total de
apreciablemente el cebado de IL-12, presumiblemente debido a la falta de
SOD A30, capSOD A luego 150, KG-1. Células
secuencias complementarias entre las dos cadenas. Estos datos se maduraron con CD40L y se cosecharon 14 h más tarde, antes de su pico
son consistentes con la noción de que la respuesta de cebado de IL-12 secreción de IL-12. Las DC se cocultivaron con columna purificada
inducida por ssRNA es fenomenológicamente distinta de la CD4 CD45RO linfocitos T alogénicos vírgenes. A modo de comparación, también se utilizaron

respuesta de IFN de tipo I inducida por dsRNA y, por lo tanto, representa un cocultivos con DC derivadas de monocitos sin transfectar preparadas con un CMM estándar.
iniciado. Después de 6 días, las células T se recogieron y se reestimularon en placas recubiertas
sistema de reconocimiento de PAMP distinto y probablemente novedoso.
previamente con Abs anti-CD3 y anti-CD28. Después de una incubación de 24 h, los sobrenadantes

del cultivo se recogieron y se analizaron para determinar IFN- e IL-5 mediante ELISA. B, ELISA
Las CD transfectadas con ARNm que ceban para la secreción de IL-12 se polarizan
análisis de sobrenadantes de células T reestimuladas sensibilizadas en presencia de
Células T CD4 alogénicas ingenuas hacia Th1
mAb de control neutralizante de IL-12 o de isotipo coincidente por DC transfectadas con S.
Finalmente, probamos la capacidad de las DC transfectadas con ARN para ARN de pyogenes . Los resultados en A y B son representativos de tres experimentos con
polarizar las células T CD4 hacia el fenotipo Th1 en una alosensibilización. diferentes donantes SEM.
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El Diario de Inmunología 3993

codifican las colas poli(A) de su ARNm a través de tramos largos 5. Sarkar, N. 1997. Polyadenylation of mRNA in prokaryotes. año Rev. Bioquímica. 66:
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por el sistema inmunitario innato. Estos PAMP pueden tener ratones: la sustitución de IL-12 por macrófagos para estimular la producción de IFN- es dependiente de
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