Integral laboratorio microbiología

 Calor seco
 Laboratorio 1- Medios de cultivo y métodos
a) Horno pasteur: Se aplica aire caliente y seco
de esterilización a 180Cº por 2 horas. Se utiliza para esterilizar
material de vidrio y metales.
 Desinfección: Es la eliminación o destrucción de b) Flameado: Se expone el material a una llama
microorganismos por medio de agentes químicos hasta que se vea incandescencia. Se realiza a
(desinfectantes) con el objetivo de disminuir su altas Tº.
número a niveles mínimos. c) Incineración: Se aplican altas Tº a materiales
 Asepsia: Procedimiento realizados para evitar el que no importa que se destruyan. Ej desechos.
crecimiento de microorganismos en un ambiente
determinado.  Radiación
 Antisépticos: Agentes desinfectantes que se pueden a) Ultravioleta: Se utiliza luz UV para la
utilizar en superficies corporales (sobre la piel) con el preparación de vacunas y esterilización de
objetivo de reducir la microbiota normal y áreas como quirófano
contaminantes microbianos como los patógenos. b) Ionizante: Se utiliza en procesos industriales
 Esterilización: Proceso físico o químico que destruye para esterilizar dispositivos quirúrgicos como
toda forma de vida microbiana incluyendo las guantes o jeringas.
esporas.  Filtración: Se utiliza para esterilizar líquidos,
 Antimicrobianos: Son sustancias químicas donde los microorganismos quedan retenidos en el
sintetizadas por microorganismos o sintéticas, que a filtro. Tamaño del filtro 0,22 um y 0,45 um.
bajas concentraciones, detienen o inhiben el
crecimiento microbiano. Ej permanganato de potasio. II. Químicos
 Antibacterianos: Son sustancias químicas  Óxido de etileno: Gas inflamable que esteriliza
sintetizadas por microorganismos (antibióticos) o sustancias termolábiles como prótesis o catéteres.
sintéticas (agentes quimioterapéuticos), que a bajas El material se expone a 5-10% a óxido de etileno
concentraciones son capaces de inhibir el en anhídrido carbónico a 50-60Cº con humedad
crecimiento microbiano, producir la muerte de las controlada por 4-6 horas.
bacterias o destruir las células “lísis”. Todo esto  Formaldehido: Se utiliza en su forma gaseosa y
ocurre sin dañar al hospedero, por lo que poseen en cámara cerrada, está disuelto en agua al 40%.
toxicidad selectiva, y al mismo tiempo una elevada  Glutaraldehido: Se utiliza en la esterilización de
potencia biológica porque requiere de baja instrumentos ópticos y terapia respiratoria. El
concentración para ejercer su efecto. material se sumerge en una solución al 2%.

 Ejemplos de desinfectantes: Propilenglicol, Medios de cultivo

etilenglicol y alcoholes.
 Ejemplos de antisépticos: Nitrato de plata, Medio de cultivo: Es el material nutritivo donde crece
derivados mercuriales, derivados yodados, el microorganismo.
clorhexidina y fenoles. Cultivo: Es el crecimiento bacteriano en sí mismo.
Métodos de esterilización Para un buen crecimiento se deben tener condiciones
óptimas para el desarrollo del microorganismo.
I. Físicos
 Calor húmedo Factores orgánicos de crecimiento: Son compuestos
a) Autoclave: Horno a presión en el que el aire es orgánicos específicos requeridos en muy pequeñas
sustituido por vapor de agua. Las condiciones cantidades y que NO pueden ser sintetizados por la
son: 121 Cº a 1 atmosfera por 15-20 min. célula.
b) Tindalización: Aquello que se desea esterilizar Suplementos: Son componentes que sin ser esenciales
es sometido a calores intermitentes entre 56-100 para el desarrollo del microorganismo favorecen el
Cº por 30 min, y en los intervalos a 37Cº o Tº crecimiento de este de manera significativa.
ambiente hasta que se repita el ciclo.
Existen diferentes tipos de medios: liquido, semisólido y  Laboratorio 2- Siembra de microorganismos
sólido, donde el agar es utilizado como agente
solidificante. Siembra: Procedimiento donde los microorganismos son
depositados asépticamente en un medio de cultivo.
AGAR: Es un polisacárido complejo que se extrae de un
alga y usualmente se licua sobre 60 Cº. Durante este procedimiento es de gran importante respetar
las medidas de asepsia para evitar contaminaciones y así
 Medio líquido: No utiliza agar obtener cultivos puros. Todos los instrumentos a utilizar
 Medio semisólido: Agar al 0,8% p/v deben estar estériles, como las asas metálicas, las cuales se
 Medio sólido: Agar 1.5-2,0% p/v flamean antes de utilizarlas.
Tipos de medios de cultivo Enriquecimiento y aislamiento
 Medio de mantención: Se encarga de preservar el Las muestras naturales generalmente poseen comunidades
stock de microorganismos vivos. También se utiliza microbianas con diferentes especies de microorganismos.
para aislar microorganismos a partir de una muestra Sin embargo, para estudiar las propiedades propias de un
diversa como orina, heces, etc. microrganismo se requiere de un cultivo puro.

 Medio selectivo: Favorecen el crecimiento de un Cultivo puro: Cultivo con crecimiento de un solo
determinado microorganismo, se utiliza para aislar un microorganismos.
microorganismo de una muestra mixta. Usualmente Tras aplicar métodos y procedimientos que permitan el
tienen sustancias que inhiben el crecimiento aislamiento de un microorganismo, luego se puede
microbiano de especies distintas a la que se desea cultivar estos, para así estudiar sus características
aislar. Ej: Staphylococcus tolera altas concentraciones morfológicas, fisiológicas y moleculares.
de sales, por lo que un medio con gran cantidad de
NaCl inhibirá el crecimiento de otros Enriquecimiento: Su objetivo es obtener cultivos puros.
microorganismos. Este método se basa en usar medios de cultivo y/o
condiciones de incubación que favorezcan al
 Medio de diagnóstico: Son medios que poseen microorganismo a aislar y sean desfavorables para los
componentes que permiten diferenciar distintos tipos demás.
de microorganismo, en base a sus características
metabólicas. a) Enriquecimiento por métodos físicos: Se utiliza la
temperatura, radiación y presión. Estos factores matan
Los medios de cultivo vienen preparados comercialmente o inhiben el resto de microorganismos, pero conserva
y se disuelven en agua destilada según la proporción a los de interés. Ej: Las bacterias termófilas se ven
indicada por el fabricante. En algunos casos, estos medios favorecidas a altas Tº, pero el resto de
pueden necesitar de calor para disolver completamente los microorganismo muere.
componentes. Una vez disueltos se esterilizan en b) Enriquecimiento por métodos químicos: Se utilizan
autoclave. Si el medio lleva una sustancia termolábil, ésta agentes tóxicos que matan o inhiben el resto de
es esterilizada por filtración y se añade al medio luego de poblaciones microbiana sin afectar al
que el medio de cultivo sea esterilizado en la autoclave. microorganismo de interés, Ej utilizar gran
concentración de NaCl para favorecer el crecimiento
de staphylococcus
c) Enriquecimiento por métodos biológicos: En este
método se utilizan huéspedes específicos que
favorecen el crecimiento de un tipo de
microorganismo, también los microrganismos pueden
tomar ventaja de sus propiedades patógenas. Ej Las
bacterias rhizobium establecen una relación de
simbiosis con las raíces de plantas leguminosas. Aquí
ocurre un enriquecimiento, ya que se ve favorecido el
crecimiento de este tipo de bacteria.

Aislamiento: Los métodos de aislamiento tienen como

objetivo separar espacialmente las células microbianas
unas de otras. Tras el aislamiento estas pueden ser II. Observación microscópica
resembradas para así obtener un cultivo puro. Ej:
aislamiento por agotamiento por estría en placa. Los microorganismos se pueden observar por medio de un
microscopio. Si el objetivo es ver microorganismos vivos
Diluciones seriadas y recuento de microorganismos para analizar movilidad o reacción frente a una sustancia,
por siembra homogénea se observa SIN TEÑIR. Mientras que, si se busca ver la
forma, estructura o agrupación se requiere de una tinción.
UFC: unidades formadoras de colonias
1. Observación de microorganismo sin tinción: Se
Un buen número de UFC es de 30-300. utiliza la preparación húmeda, la que consiste en
 Laboratorio 3-Observación macro y suspender una cantidad pequeña de inoculado en
suero fisiológico estéril 0,5-0,8%. Luego se deposita
microscópica de cultivos
una gota de esta suspensión en un portaobjeto, se
cubre con un cubreobjeto y se observa.
I. Observación macroscópica
2. Tinciones:
Cultivos sólidos: Al sembrar en un cultivo las células
microbianas, estas se desarrollan y multiplican formando Paso 1-preparación de la muestra: Se deposita una
colonias. cantidad pequeña de muestra sobre un portaobjetos, si es
sólido se emulsiona con suero fisiológico estéril. Luego, la
Colonia: Es el desarrollo aislado de una cepa microbiana muestra se extiende con el asa, dejando una capa o película
que crece hasta un tamaño que se pueda medir en mm. Lo fina sobre el portaobjetos conocida como “frotis”.
conforma app 108 células microbianas (células clones de
la original). Su aspecto dependerá del tipo de Fijación: Procedimiento en que se seca y se fija el frotis
microorganismo y bajo las condiciones que se incube. para poder teñirlo, puede ser por medio de calor o agentes
químicos. Usualmente se fija por calor, lo que consiste en
Caracterización de colonias pasar el portaobjetos con el frotis varias veces por el
 Forma: punteada, circular, irregular, fusiforme, mechero, lo que deshidrata y mata células.
rizoide Paso 2 -Coloración de la muestra: Tras la fijación del
 Elevación: plana, cóncava, convexa, elevada, frotis se aplican colorantes, los que dependerán del tipo de
unbilicada tinción.
 Borde: entero, ondulado, lobulado, dentado, rizoide
 Opacidad: transparente, trans-lucido, opaco Colorante: Compuesto químicos, generalmente sales, que
 Tamaño: Grande, mediano, pequeño, puntiforme tienen afinidad a ciertas estructuras celulares.
 Consistencia: blanda, firme, mucosa a viscosa
TIPOS DE TINCIONES
(bacterias encapsuladas)
 Olor: aromático, desagradable, ausente 1) Simple: Se utiliza un colorante, permite ver forma y
 Color: Ausente o presente. Endopigmento-> color de tamaño.
la colonia; Exopigmento->pigmento que difunde al
medio 2) Diferencial: Separa las bacterias en grupos de
acuerdo a su reacción diferencial frente a dos
Cultivos líquidos: Usualmente el desarrollo de bacterias colorantes. Ej: tinción de gram y de ziehl-neelsen.
en medios líquidos se observa como una turbidez en el
caldo, pero en otros microorganismos el medio permanece 3) Especial: Se utiliza para observar estructuras
transparente y el crecimiento se observa como migajas en celulares como capsulas, esporas o flagelos, o para
suspensión. Específicamente en las bacterias aerobias microorganismo difíciles de teñir como rickettsias y
estrictas se genera un velo en suspensión o anillo cuando micoplasma.
están encapsuladas. Pueden presentar slime (cápsula laxa
 Tinción de Gram
poco organizada).
Permite dividir a las bacterias en grampositivas y
En cultivos líquidos también se puede observar
gramnegativas. En las gram+ la decoloración con alcohol
características como olor y cambio de color si la bacteria
contrae poros del peptidoglicano, por lo que el complejo
produce exopigmentos.
cristal violeta-lugol queda retenido en la célula. Las gram-
al tener un peptidoglicano más fino no puede retenerlo.
Las bacterias gram+ poseen un color morado y las gram-
un color rosado.
Lugol: es un mordiente que aumenta la afinidad del los microporos se cierran quedando fijo el colorante. Las
colorante violeta de crista por las estructuras celulares a esporas se ven verdes y las células vegetativas se ven rojas.
las que se une.
1. Realizar frotis y fijación
1. Realizar frotis y fijación de la muestra
2. Cubrir el frotis con papel
2. Teñir con cristal de violeta 1 min
3. Teñir con verde malaquita a emisión de vaportes 10-
3. Lavar con agua y aplicar lugol 1 min 15 min

4. Lavar con agua y decolorar con alcohol 30 seg 4. Dejar enfriar el porta objeto y lavar con agua

5. Lavar con agua y teñir con fucsina básica 5. Teñir con safranina 1 min

6. Lavar con agua y dejar secar el aire 6. Lavar con agua y dejar secar

7. Observar al microscopio 7. Observar al microscopio con aceite de inmersión

 Laboratorio 4-Pruebas bioquímicas

 Tinción diferencial de ziehl neelsen
Al existir una gran cantidad de bacterias, las tinciones NO
La pared celular de las micobacterias tiene alto contenido
son suficientes para identificar especies bacterianas, por lo
de lípidos, por lo que colorantes hidrofilicos no serán
que es importante la detección de propiedades fisiológicas
afines. En esta tinción se utiliza carbol fuscina como
y bioquímicas de cada microorganismo. La
colorante, el que ablanda y permeabiliza la pared celular.
caracterización bioquímica de un microorganismo se
En su forma de vapor este colorante penetra de mejor
realiza por diversas técnicas que en conjunto se les llama
manera tiñendo ácidos micolicos, luego se utiliza como
pruebas bioquímicas.
decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico que
deshidrata y cierra la célula conservando el colorante en I. Prueba bioquímica de respiración celular
su interior. A las micobacterias también se les conoce
como bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR), estos El O2 es un aceptor de electrones y un agente oxidante. Los
microorganismos se observan con un color rojo en la ROS se forman como subproductos de la respiración
tinción(postivos), mientras que microorganismos celular aeróbica. Aquellos organismos que realicen
diferentes a micobacterias se tiñen de azul por el azul de respiración requieren de enzimas como peroxidasa,
metileno(negativo). catalasa y superoxido dismutasa que las protejan contra las
especies reactivas de oxígeno.
1. Agregar 10-15 gotas de carbol de fuscina sobre el
frotis O2-Superóxido, H2O2 peróxido, radical hidroxilo OH-

2. Calentar hasta emitir vapores y repetir procedimiento Prueba de catalasa: Para esta prueba se requiere de un
1-4 veces cultivo en un medio sólido, de entre18-24 horas de
incubación, al que se le agrega gotas de peróxido de
3. Decolorar con HCl-etanol hidrogeno. Si se observan burbujas indica que hay
liberación de oxígeno por acción de la enzima catalasa
4. Lava con agua
(resultado positivo), si no hay burbujas no hay catalasa.
5. Teñir con azul de metileno 1 min
II. Prueba bioquímica de fuentes de carbono
6. Lavar con agua y dejar secar
Prueba del Agar hierro kliger: El medio diferencial
7. Examinar al microscopio con aceite de inmersión “Kliger” permite determinar si el microorganismo es
capaz de utilizar como fuente de carbono glucosa y
lactosa, glucosa, o ninguno. Además, se observa que
algunas bacterias son capaces de producir ácido
 Tinción especial de esporas
sulfhídrico y gas. El agar hierro-kliger tiene tiosulfato de
Las endoesporas son estructuras de resistencia que poseen sodio y sulfato férrico de amonio, que permiten determinar
muchas capas. El colorante se aplica para ablandar sus la producción de H2S por medio de un precipitado negro
capas y el vapor penetra sus microporos, al lavar y enfriar en el tubo.
 Los microorganismos que utilizan azúcar lo pueden hacer agregan unas gotas de rojo metilo. Si el indicador
con o sin liberación de gases, ya sea anaeróbico o aeróbico. detecta ácidos, mantiene su color rojo, lo cual indica
El medio kliger lleva lactosa al 1% y glucosa al 0.1%, un resultado positivo. Por el contrario, si el indicador
además posee rojo fenol como indicador de pH. vira a amarillo, significa un resultado rojo metilo (-).

Resultados de las pruebas Medio: caldo suplementado con glucosa.

 K/A: Superficie alcalina(fucsia) sobre fondo  Prueba de vogues proskauer: Esta prueba detecta si
ácido(amarillo). El microorganismo solo utiliza el microorganismo es capaz de realizar la
glucosa, pasada 24 horas la glucosa se agotó y el fermentación butanodiolica de la glucosa. Esta
organismo utiliza peptonas, por lo que el medio se fermentación genera como producto final bitanodiol.
alcaliniza (fucsia) y los ácidos estables tras la La acetoina reacciona con alfa naftol + KOH(40%),
fermentación se van al fondo (amarillo). se produce una coloración rojiza indicando un color
 A/A:Superficie ácida (amarilla)sobre fondo ácido positivo.
(amarillo).El microorganismo utiliza glucosa y
lactosa. Luego de 24 horas se consume la glucosa y el Medio: caldo suplementado con glucosa.
microorganismo utiliza la lactosa, como esta última  Prueba del citrato: Esta prueba determina si el
NO se consume se observa un color amarillo. microorganismo es capaz de usar el citrato como
 K/K:Superficie alcalina (fucsia)sobre fondo alcalino única fuente de carbono. Para esta prueba se usan los
(fucsia):El microorganismo NO utiliza ni glucosa y medios Koser citrato (líquido) o Simón citrato
lactosa, utiliza peptonas. Si el microorganismo es (sólido). Este medio posee citrato como única fuente
aeróbico y anaeróbico es K/K, si usa peptonas de carbono, sales de amonio como única fuente de
aeróbicamente el resultado es K/ rojo. nitrógeno, sales minerales y azul de bromotimol como
indicador de pH.
III. Prueba bioquímica de compuestos nitrogenados
El medio es verde, pero se va alcalinizando, dando lugar a
Prueba de ureasa: Determina la presencia de la enzima un color azul (+), si permanece verde es negativo.
ureasa, la cual cataliza la hidrolisis de urea formando como
productos 2 amonio. El medio de cultivo posee una
solución de urea al 40% y rojo fenol como indicador.
Tipos de medios de cultivo utilizados en el laboratorio
Si la prueba es positiva el medio se alcaliniza, dando un
1. Agar citrato
color fucsia.
Medio utilizado para la diferenciación de
enterobacterias en base a la capacidad de usar citrato
IV. Pruebas de IMVic como única fuente de carbono y energía.

Resultados
La prueba de IMVic consta de 4 pruebas bioquimicas: -Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso
Indol, rojo de metilo, vogues proskauer y citrato. Estas color azul.
se utilizan para diferenciar bacterias entéricas, pueden ser -Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia
indicadores biológicos. del color verde del medio de cultivo.
 Prueba del indol: Detecta la capacidad del
microorganismo de producir indol a partir del 2. Agar sangre
aminoácido triptófano, esto lo hace por la enzima Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de
triptofanasa. El microorganismo se siembra en un numerosos microorganismos. Al ser suplementado
caldo peptonado y luego de 24 se agrega el reactivo con sangre ovina, permite el crecimiento de
de kovacs, que reacciona con el indol dando un color microorganismos nutricionalmente exigentes y la
rosado intenso, es negativo cuando NO hay color o clara visualización de reacciones de hemólisis.
posee un color amarillo. El medio de cultivo preparado posee un color ámbar
 Prueba de rojo de metilo: Detecta la capacidad del y cuando está suplementado con sangre tiene un color
microorganismo de producir y mantener estables los rojo cereza (rojo intenso).
derivados ácidos de la fermentación ácido mixta de la
glucosa. Son positivas cuando hay ácidos estables. El Resultados
microorganismo se siembra y se incuba en -Hemólisis alfa: lisis parcial de los glóbulos rojos. Se
condiciones apropiadas. Después de 24 a 48 h, se observa un halo de color verdoso alrededor de la
 colonia en estudio. Esto se debe a la oxidación de la
hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de
color verdoso) por el peróxido de hidrógeno generado
por los microorganismos.
-Hemólisis beta: lisis total de los glóbulos rojos. Se
observa un halo claro brillante alrededor de la colonia
en estudio.

-Hemólisis gamma: Ausencia de lisis de los glóbulos

rojos. El medio de cultivo no presenta modificaciones
de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio.

3. Agar mac conkey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos
Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos a partir de muestras clínicas,
aguas y alimentos.
El medio de cultivo preparado posee un color rojizo
Sistemas API
púrpura.
Los sistemas miniaturizados API son métodos rápidos que
Resultados permiten la identificación de microorganismos a través de
-Microorganismos fermentadores de lactosa: la realización de diferentes pruebas bioquímicas.
colonias rosadas rojizas. Puede observarse halo de
precipitación biliar. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico con
-Microorganismos no fermentadores de lactosa: varios microtubos (espacios) que contienen diferentes
colonias del color del medio, incoloras. medios de cultivo deshidratados o diferentes sustratos de
enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere
4. Agar medio MIO montar. Entre algunas de las pruebas bioquímicas que
Medio utilizado en la identificación de miembros de pueden realizarse con estos sistemas están las pruebas de
la familia Enterobacteriaceae en base a la movilidad, fermentación de carbohidratos, la determinación de la
producción de indol y actividad enzimática ornitina producción de H2S, la determinación de la hidrólisis de la
decarboxilasa. gelatina, entre otras.
La tripteína aporta gran cantidad de triptofano,
1) API 20E
sustrato de la enzima triptofanasa a partir del cual se
forma indol que puede ser revelado con el reactivo de Permite la identificación de microorganismos
Ehrlich o de Kovac´s por la formación de un pertenecientes al grupo de las enterobacterias y de otros
compuesto de color rojo. bacilos gram negativos. Es una galería conformada por
El medio de cultivo preparado posee un color púrpura 20 microtubos.
ligeramente opalescente(vino).

Resultados
-Movilidad Resultado positivo: presencia de
turbidez o crecimiento más allá de la línea de siembra.
-Movilidad Resultado negativo: crecimiento
solamente en la línea de siembra.
-Ornitina decarboxilasa resultado positivo: color
púrpura.
-Ornitina descarboxilasa resultado negativo: color
amarillo. A veces se puede desarrollar un color Resultados de prueba
violáceo en la superficie del medio.
-Resultado positivo prueba indol: color rojo. 1. ONPG: indica la presencia de la enzima beta-
-Resultado negativo prueba indol: el color del galactosidasa. Neg= incoloro; Pos=amarillo claro
reactivo revelador permanece incoloro-amarillento. 2. ADH: Arginina dihidrolasa. Neg=Amarillo;
Pos=rojo/naranjo-rosado
3. LDC: Enzima lisina descarboxilasa. Neg=amarillo 2) API 20NE
;Pos= rojo/naranjo
4. ODC: Ornitina descarboxilasa. Permite la identificación de bacilos gram negativos NO
Neg=amarillo;Pos=rojo/naranja pertenecientes al grupo de las enterobacterias como por
5. CIT: Indica la capacidad de la bacteria para fermentar ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,
el citrato. Neg= amararillo-verde pálido; Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Es una galería
Pos=verde-azul/azul conformada por 20 microtubos.
6. H2S: Producción de dióxido de azufre H2S.
Neg=incoloro/grisáceo; Pos=depostio negro/línea
delgada
7. URE: Muestra la capacidad de la bacteria para
fermentar la urea. Neg=amarillo;Pos=Rojo/naranja
8. TDA: triptófano desaminasa.
Neg=amarillo Pos=marrón rojizo
*Se utiliza reactivo TDA inmediatamente
9. IND: Positiva para la producción de indol.
Neg=incoloro/verde pálido o amarillo; Pos=
Resultados de prueba
Rosado
*Se utiliza reactivo de James inmediatamente 1. NO3: Prueba de reducción de nitrato.
10. VP: Reacción de producción de acetoina(Vogues 1)Nitrato-> nitrito.Neg=incoloro; Pos=rosado-rojo
proskauser). *Se utiliza reactivo NIT 1 y NIT2 de 2-5min.
Neg=incoloro; Pos=rosado/rojo 2)Nitrato->nitrógeno. Neg=rosado;incoloro
*Se utiliza reactivo VP 1 y VP 2 por 10 min. *Se utiliza zinc y se deja por 5min
2DA MITAD DE API 2. TRP: Producción de indol a partir de triptofano.
11. GEL: Indica la capacidad de la bacteria para Neg=incoloro/verde pálido o amarrillo;
hidrolizar la gelatina. Neg=sin difusión; Pos=rosado-rojo
Pos=difusión del pigmento negro * Se utiliza reactivo de james inmediatamente
12. GLU: Indica la capacidad de la bacteria para 3. GLU: Fermentación de glucosa. Neg= Azul a verde;
fermentar glucosa. Neg=azul/azul-verde; Pos= Pos=amarillo
amarillo/amarillo grisáceo 4. ADH: Arginina dihidrolasa. Neg=Amarillo;
13. MAN: Muestra la capacidad de la bacteria para Pos=rojo/naranjo/rosado
fermentar el manitol. Neg=azul/azul-verde; Pos= 5. URE: Muestra la capacidad de la bacteria para
amarillo fermentar la urea. Neg=amarillo;Pos=Rojo/naranja
14. INO: Fermentación de inositol Neg=azul/azul- 6. ESC: Capacidad de un microorganismo de hidrolizar
verde; Pos= amarillo el glucósido esculina a esculetina y glucosa.
15. SOR: Indica la capacidad de la bacteria para Neg=amarillo;Pos=gris/café/negro
fermentar el sorbitol. Neg=azul/azul-verde; Pos= 7. GEL: Indica la capacidad de la bacteria para
amarillo hidrolizar la gelatina. Neg=sin difusión;
16. RHA: Indica la capacidad de la bacteria para Pos=Difusion de pigmento negro
fermentar el rafinosa. Neg=azul/azul-verde; Pos= 8. PNPG: Capacidad de hidrolizar el aminoácido
amarillo fenilalanina a fenilpiruvato y piruvato.
17. SAC: Fermentación de sacarosa. Neg=azul/azul- Neg=incoloro; Pos= Amarillo
verde; Pos= amarillo 9. GLU(otro): Capacidad de un microorganismo para
18. MEL: Indica la capacidad de la bacteria para absorber y utilizar glucosa como fuente de
fermentar el melibiosa. Neg=azul/azul-verde; Pos= energía.Neg=Transparente; Pos=Opaco
amarillo 10. ARA: Capacidad de utilizar arabinosa.
19. AMY: Hidrólisis de amigdalina. Neg=azul/azul- Neg=Transparente; Pos=Opaco
verde; Pos= amarillo 2DA MITAD DEL API
20. ARA: Indica la capacidad de la bacteria para 11. MNE: Capacidad de utilizar manosa Transparente;
hidrolizar el arabinosa. Neg=azul/azul-verde; Pos= Pos=Opaco
amarillo 12. MAN: Capacidad de utilizar manitol Transparente;
Pos=Opaco
13. NAG: Capacidad de utilizar N-acetilglucosamina
Transparente; Pos=Opaco
14. MAL: Capacidad de utilizar maltosa Transparente; que por difusión simple avanzará, por lo que no se tendrá
Pos=Opaco la misma concentración de antibiótico en la zona más
15. GNT: Capacidad de utilizar gluconato de potasio cercana al disco que en la más alejada (menor M). Sin
Transparente; Pos=Opaco embargo, este método no permite establecer la
16. CAP: Capacidad de utilizar ácido caprico concentración mínima inhibitorio (CIM).
Transparente; Pos=Opaco
17. ADI: Capacidad de utilizar ácido adipico Si se observan bacterias en el halo de inhibición, significa
Transparente; Pos=Opaco que estas son resistentes al antibiótico.
18. MLT: Capacidad de utilizar ácido malico Técnica:
Transparente; Pos=Opaco
19. CIT: Capacidad de utilizar citrato de trisodio 1. Desde un cultivo líquido de la cepa de interés inocular
Transparente; Pos=Opaco 100 µL sobre una placa de agar.
20. PAC: Capacidad de utilizar acido fenilacetico
2. Homogeneizar con la asa de Drigalski.
Transparente; Pos=Opaco
21. *OX: Citrocromo oxidasa. 3. Colocar los discos de antibióticos sobre la placa de agar.
4. Incubar la cepa en condiciones óptimas. Luego observar
el halo de inhibición de crecimiento y medirlo.
 Laboratorio 5-Prueba de sensibilidad a
2) Determinación de la concentración mínima
antimicrobianos inhibitoria
Resistencia a los antimicrobianos Se utiliza para determinar la concentración mínima de un
La resistencia es la capacidad de un microrganismo de antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano. Se puede
crecer en presencia de este tipo de compuesto. Esta puede realizar por método de dilución en medio líquido o
ser intrínseca o adquirida a través de diversos procesos de mediante E-test en medio sólido.
variabilidad genética como mutación, recombinación y En este caso se toma una concentración madre del
flujo horizontal de genes. antibiótico, la cual se va diluyendo con el objetivo de
La variabilidad genética ocurre de manera natural y observar el crecimiento microbiano en un gradiente de
aleatoria. Sin embargo, el uso indiscriminado de concentración.
antibióticos ha favorecido la SELECCIÓN de Para realizar el ensayo de la CIM se debe tener un control
microorganismos resistentes. Adicionalmente, la sin antibiótico, que indicará como crece el
evaluación de la sensibilidad de los patógenos a los microorganismo en condiciones normales y uno donde no
antibióticos es esencial para favorecer una terapia exitosa. haya bacterias en el medio cultivo. Se debe tener un
En este contexto, la sensibilidad a los antimicrobianos control positivo y uno negativo.
puede evaluarse mediante diferentes estrategias como:
Método de difusión en agar y la Concentración mínima  Control positivo: Es una muestra que contiene
inhibitoria. condiciones óptimas para el crecimiento microbiano.
 Control negativo: Es una muestra que no contiene
1) Prueba de agar en difusión-Antibiograma microorganismos viables o que ha sido tratada de
En el método de difusión por disco, la siembra se realiza manera que inhiba el crecimiento microbiano.
en toda la placa como un “césped” a modo de tapete en la La CIM es la primera concentración en la que NO se
placa y luego se aplican discos que tienen cantidades observ turbidez. Esto se determina al ojo.
conocidas de antibiótico. Posteriormente, la placa es
llevada a incubación en donde se recrean las condiciones Técnica de CMI por microdilución en placa:
óptimas del microorganismo y se evalúa su crecimiento
por medio de la medición del halo de inhibición. Según el 1. De un cultivo líquido de la cepa de interés preparar un
dato obtenido, se compara con bases de datos como inóculo en NaCl 0,9 % que permita inocular 103
EUCAST que permitirán determinar si el microorganismo UFC/pocillo. Considere que el preinóculo contiene 109
estudiado es sensible(S), sensibilidad intermedia(I) o UFC/ml y el volumen de inóculo por pocillo es de 10 µl.
resistente(R) al antimicrobiano. 2. Preparar la solución stock (la de mayor concentración)
A medida que aumentan las concentraciones de los discos del antibiótico en medio de cultivo.
se observa que aumenta el halo de inhibición (zona 3. Hacer diluciones seriada (0.5 X concentración) en la
blanca). En la placa existe una cantidad de antibacteriano, placa de 96 pocillos a del antibiótico.
4. Inocular 103 UFC/pocillo Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci,
enterococci, mycobacteria and fungi.
5. Control positivo: Medio de cultivo libre de antibióticos
+ inóculo Tinción de la película biológica
6. Control negativo: Medio de cultivo 1) Después de la incubación, tire las células girando
la placa y sacudiendo el líquido.
2) Sumerja suavemente la placa en una pequeña tina
de agua (es decir, use los fondos de las cajas de
punta de pipeta para pipetas P1000 como la
bañera). Sacude el agua. Este paso ayuda a
eliminar las celdas no acopladas y los
componentes multimedia que se pueden teñir en
el siguiente paso, y reduce significativamente la
tinción de fondo(este paso lo hicimos en el lab en
 Laboratorio 6- Ensayo de formación de otra sala).
biofilm de plato de microtítulo 3) Añadir 125 μL de una solución al 0,1% de cristal
violeta a cada pocillo de la placa de
Los biofilms se definen como comunidades de
microtitulación.
microorganismos que crecen embebidos en una
4) Incubar la placa de microtitulación a temperatura
matriz de exopolisacáridos y adheridos a una
ambiente durante 10-15 min.
superficie inerte o un tejido vivo. El biofilm está
5) Enjuague la placa 3-4 veces con agua
compuesto por microorganismos, azúcares y
sumergiendo en una tina de agua como se
proteínas, y cuando se forma es muy difícil
describe anteriormente, agite y seque
eliminarlo, ya que se vuelve impermeable y no es
vigorosamente en una pila de toallas de papel
posible tratarlo con antibióticos ni desinfectantes.
para liberar la placa de todas las células y tintes
Los microbios que crecen en un biofilm poseen una en exceso.
estructura característica generalmente compuesta de 6) Ponga la placa de microtitulación boca abajo y
macrocolonias rodeadas por canales llenos de fluido. séquela durante unas horas o toda la noche.
En otras palabras, el biofilm es el resultado de la 7) Para los ensayos cualitativos, los pozos se
comunicación bacteriana, esta particularidad le pueden fotografiar cuando están secos.
permite a los microorganismos crear una estructura
Resultados
compleja y resistente.
Las infecciones que producen biofilm son
persistentes, un ejemplo de esto sería la fibrosis
quística, la cual está asociada a la bacteria
Pseudomona aeruginosa, la cual es un patógeno
A. Vista lateral de biofilm 8 horas a 37ºC
oportunista que va a infectar solo a las personas que
P.aeruginosa.
están inmunocomprometidas.
B. Vista lateral de P.fluorescens por 6 horas a
El ensayo de microtitulación permite la formación de 30ºC.
una biopelícula en la pared y/o en el fondo de un C. Vista hacia arriba del pozo de S.aureus 24 horas
plato de microtitulación. Esta técnica es útil para las por 37ºC.
pantallas genéticas, así como para probar la
Algunos microorganismos como A y B son móviles
formación de biopelículas por múltiples cepas en
y forman biopeliculas en la interfaz aire-liquido,
diversas condiciones de crecimiento. Las variantes
mientras que otras como la C no es móvil y forma
de este ensayo se han utilizado para evaluar la
biofilm en el fondo.
formación temprana del biofilm para una amplia
variedad de microbios, incluyendo a pseudomonas, Las condiciones óptimas para la formación de
biofilm como el medio de crecimiento, temperatura o
tiempo de incubación se deben determinar para cada
microorganismo.
 El biofilm se puede cuantificar por medio de un
espectrofotómetro midiendo las absorbancias a
una longitud de onda a 550 nm.