Capitulo 5

5. FRACCIÓN ORGÁNICA DEL SUELO. HUMUS.
ORIGEN. COMPOSICIÓN Y DINÁMICA
INTRODUCCIÓN
La materia orgánica (MO) del suelo es uno de los recursos naturales más
importantes, reconocido desde la antigüedad como un agente primordial en
la fertilidad del suelo.
Uno de los aspectos más importantes de la materia orgánica en el suelo
son las transformaciones que por acción de los microorganismos sufre en el
suelo, y que básicamente se pueden resumir como:
Mineralización t; Inmovilización
El proceso de mineralización supone la transformación de los materiales
orgánicos en inorgánicos. Por tanto, se trata de un proceso básico en la diná-
mica de elementos considerados como nutrientes, donde el N, P, S, Cu, Fe,
Mn y Zn orgánicos se transforman en formas inorgánicas (NH4+, H2PO42~,
SO42~,...) asimilables por las plantas superiores y los microorganismos. Una
parte del carbono es transformado a CO2 que pasa a la atmósfera, otra parte
se incorpora a los tejidos microbianos, pasando a formar parte de la Biomasa
del suelo, y el resto se convierte en humus estable.
Un proceso importante en la síntesis de la materia orgánica del suelo
(MOS) es la fotosíntesis. Las plantas superiores, gracias a la absorción de
energía solar y nutrientes del suelo, son capaces de sintetizar compuestos
tales como lignina, materia prima en la síntesis de la MOS.
El carácter dinámico de la fracción orgánica contribuye a un amplio nú-
mero de procesos esenciales del suelo como: ciclos biogeoquímicos, forma-
ción de agregados del suelo y solubilización de nutrientes. La sola presencia
de la fracción orgánica en el suelo afecta a propiedades básicas del mismo
tales como intercambio catiónico y capacidad tampón.
146 M. Juárez Sanz, J. Sánchez Andreuy A. Sánchez Sánchez
Fig. 5.1. Distintas fracciones orgánicas del suelo.
Estudios realizados con 14C en residuos vegetales en suelos de zonas

templadas, han permitido obtener datos acerca del tiempo de permanencia
de la materia orgánica en el suelo: Una parte del C que llega al suelo deja de
formar parte de la materia orgánica del suelo a lo largo del primer año. El
resto puede permanecer por más tiempo incorporado a: la Biomasa (semanas
o años) o a compuestos húmicos (hasta siglos).
Debido a las distintas formas y grados de transformación, en que la ma-
teria orgánica se puede encontrar en los suelos, se utilizan distintos términos
para diferenciarla (Fig. 5.1):
1. Materia orgánica del suelo: De acuerdo con Stevenson, 1994, es la can-
tidad total de sustancias orgánicas presentes en el suelo, incluyendo los
restos de tejidos vegetales y animales inalterados, sus productos de des-
composición parcial, la biomasa microbiana, la fracción orgánica soluble
en agua y el humus.
2. Residuos orgánicos: Tejidos de plantas y animales, no transformados, y
sus productos de descomposición parcial.
3. Biomasa del suelo: Aquella materia orgánica viva incluida en los tejidos
microbianos.
4. Humus: No hay, hasta el momento, una definición específica y concre-
ta para él. Mientras que para algunos autores este término significa lo
mismo que materia orgánica del suelo, incluyendo sustancias húmicas,
materiales orgánicos identificables de elevado peso molecular, como po-
lisacáridos y proteínas, y sustancias simples como azúcares, aminoáci-
dos y otras moléculas, pero excluyendo los tejidos de plantas y animales
Química del suelo y medio ambiente 147
no descompuestos, los productos de descomposición parcial y la bioma-

sa del suelo (Stevenson, 1994, MacCarthy et al., 1990). Otros autores
utilizan el termino humus para referirse sólo a las sustancias húmicas
(MacCarthy et al., 1990).
El humus incluye un amplio espectro de constituyentes orgánicos, mu-
chos de los cuales proceden de tejidos biológicos. Podemos distinguir dos
grandes grupos, las sustancias no húmicas y las sustancias húmicas.
5. Sustancias no húmicas: Comprenden aquellos compuestos de compo-
sición definida como: Hidratos de carbono, proteínas, aminas, alcoholes,
sulfuro de hidrógeno, polisacáridos, ceras, ácidos grasos, lignina, resi-
nas, pigmentos, ácidos nucleicos, hormonas, ácidos orgánicos; y cuya
presencia no es exclusiva del suelo.
6. Sustancias húmicas: Aquellas que no tienen una composición defini-
da y que son sintetizadas en el suelo. Presentan carácter coloidal y re-
sistencia al ataque microbiano. Resultan de la degradación de restos de
animales y plantas, y no pueden ser clasificados dentro de la categoría
de compuestos discretos como sucede con las sustancias no húmicas.
Las sustancias húmicas son omnipresentes, y se encuentran en todos los
suelos, sedimentos y aguas.
El origen de las sustancias húmicas ha mostrado ser una factor deter-
minante de atributos moleculares como la acidez y el tamaño (Senesi et al.,
1989). Las sustancias húmicas de origen acuático son más pequeñas que las
aisladas del suelo. Un caso especial son las sustancias húmicas de leonardita
que presentan una estructura más condensada (Thorn et al., 1989).
Dentro de estas sustancias heterogéneas de naturaleza coloidal que he-
mos llamado sustancias húmicas, encontramos dos grupos de compuestos
conocidos como ácidos húmicos y ácidos fulvicos que podríamos definir
como:
7. Ácidos húmicos: Material orgánico de color oscuro que puede ser ex-
traído del suelo por álcalis y otros reactivos y que es insoluble en ácido
diluido (Stevenson, 1994).
8. Ácidos fulvicos: Fracción de la materia orgánica del suelo que es soluble
en álcali y ácido (Stevenson, 1994).
9. Humifícación: Procesos de formación del humus.
La materia orgánica del suelo puede contener cantidades muy diferentes
de sustancias húmicas y no húmicas. Así, la cantidad de carbohidratos osci-
la entre un 5-25%, las proteínas entre un 15-45%, los lípidos de un 2% en
suelos forestales a un 20% en suelos turbosos, y las sustancias húmicas del
33-75% del total de materia orgánica del suelo. Una composición global me-
148 M. Juárez Sanz, J. Sánchez Andreu y A. Sánchez Sánchez
Fig. 5.2. Composición global media para la materia orgánica del suelo.
dia para la MOS puede ser la reflejada en la Fig. 5.2. Se trata de porcentajes
medios, muy influenciados por las condiciones ambientales.
ORIGEN DE LA MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO

El mayor aporte de materiales orgánicos al suelo proviene de los restos vege-
tales y desechos animales. Por tanto, se puede afirmar que la fuente última de
toda la materia orgánica es el C fijado a través de la fotosíntesis, como CO2,
y con un pequeño aporte procedente de las bacterias autótrofas del suelo,
residuos animales y combustión de productos fósiles (Fig. 5.3).
Con el incremento de la fabricación de compuestos orgánicos sintéticos,
se ha producido un aumento considerable de estos compuestos en el suelo,
destacando los plaguicidas. Otros son los hidrocarburos policíclicos aromá-
ticos, producidos en cantidades considerables en la combustión de materiales
fósiles y, compuestos xenobióticos (plásticos) como resultado del desarrollo
industrial.
Los compuestos orgánicos antropogénicos inciden de forma poco im-
portante en la masa total de la materia orgánica del suelo, aunque a veces se
producen efectos apreciables y dramáticos en zonas delimitadas.
Un compuesto orgánico al incorporarse al suelo, puede seguir tres rutas
básicas:
1. Incluirse en el humus del suelo.
2. Ser totalmente mineralizado y pasar a CO2.
3. Incorporarse a la masa microbiana.
Fig. 5.3. Origen de la materia orgánica del suelo.
La velocidad de estas conversiones depende de:

- Las interacciones de microorganismos, nematodos y comunidades de
microartrópodos del suelo.
- La amplia variedad de reacciones bioquímicas.
- Parámetros físicos y químicos del suelo considerado.
CONTENIDO EN MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO

El contenido en materia orgánica depende del tipo de suelo que se trate. Así,
es menor del 1% en suelos áridos, mientras en los orgánicos puede llegar
hasta el 100%.
En suelos con altos contenidos en materia orgánica: Mollisol (suelos de
pradera), su contenido en materia orgánica oscila entre 5 y 6%. Los suelos
calizos poseen un contenido en materia orgánica menor del 1%.
En la Tabla 5.1, se muestra el nivel de C en distintos reservónos de la su-
perficie terrestre; y a una profundidad de unos 16 Km. Podemos observar que
la masa de C en el suelo es la más importante de los reservónos superficiales.
FACTORES QUE REGULAN EL CONTENIDO EN MATERIA ORGÁNICA DE LOS

SUELOS
El contenido en materia orgánica de los suelos (C, N) depende de diversos
factores: clima, relieve, presencia de organismos, tiempo, material primario,
prácticas agrícolas,...
150 M Juárez Sanz, J. Sánchez Andreu y A. Sánchez Sánchez
Tabla 5.1
CANTIDAD DE C EN DISTINTOS RESERVORIOS (Stevenson, 1994).
Reservorio Cantidad de C, 1014 Kg
En la superficie terrestre:
CO2 atmosférico 7
Biomasa 4,8
Aguas superficiales 2,5
Mares 5-8
Materia orgánica del suelo 30-50
A una profundidad de 16 Km
Detritus orgánicos marinos 30
Carbón y petróleo 100
Carbono soluble en la profundidad del mar 345
Sedimentos 200.000
Factor tiempo
A lo largo del proceso de formación del suelo, la materia orgánica se acumu-
lará en los inicios para con posterioridad alcanzar un nivel de equilibrio, que
vendrá determinado por la acción conjunta de los distintos factores formado-
res del suelo. De acuerdo con Stevenson (1994) la velocidad de acumulación
de la materia orgánica en el suelo es muy rápida durante los primeros años,
a continuación disminuye lentamente, y alcanza el equilibrio en un período
que varía desde como poco 110 años para materiales originarios de textura
fina, hasta 1500 años para áreas arenosas (Fig. 5.4). En los suelos cultivados
este equilibrio se rompe y desciende considerablemente el contenido en ma-
teria orgánica.
Las razones por las cuales se piensa que se alcanza el equilibrio son:
- Los coloides orgánicos adquieren resistencia al ataque por microorganis-
mos.
Fig. 5.4. Evolución de la materia orgánica del suelo con el tiempo.

- La asociación de humus, elementos metálicos y materiales de la arcilla

supone una protección del humus, impidiendo así su destrucción.
- La limitación de uno o varios nutrientes (N, P, S) crea un techo sobre la
cantidad de humus estable que puede sintetizarse.
Factor clima
Es, tal vez, el factor más importante en la incidencia sobre los niveles de
materia orgánica del suelo, al regular:
- El establecimiento de las especies vegetales.
- La cantidad de material vegetal producido.
- La intensidad de la actividad microbiana en el suelo.
Esto es válido para todo tipo de suelos excepto para aquellos de drena-
je impedido o restringido (Histosoles o Inceptisoles), ya que al ser baja la
cantidad de oxígeno presente, evitan la completa destrucción de los restos
vegetales por microorganismos, para un amplio margen de temperaturas, y
por tanto, la incidencia del clima se atenúa.
En general, al aumentar la temperatura disminuye la cantidad de materia
orgánica del suelo (Stevenson, 1994). En cuanto a la humedad, a mayor hu-
medad mayor crecimiento vegetal y de microorganismos y, por tanto, mayor
cantidad de humus.
Factor vegetación
Que determina tanto la cantidad como la composición de los materiales que
aportan.
Es un hecho conocido que la cantidad de materia orgánica en los suelos
de pradera (carbono) es mayor que en los suelos forestales. Ello se debe a:
- En los suelos de pradera se produce un aporte mayor de materia vegetal
para la síntesis del humus.
- El proceso de nitrificación de los suelos de pradera suele inhibirse:
Por ello los suelos de pradera presentan un mayor contenido de N orgánico

yC.
- La síntesis de humus se realiza básicamente en la rizosfera. Esta zona es
más extensa en los suelos de pradera que en el bosque.
- Los suelos de pradera se encuentran en condiciones más básicas, que
favorecen la unión NH4-lignina, conservando así ese N .
Material primario
Este material afecta al contenido en C de un suelo a través de su influencia en
propiedades del suelo como, la textura que determina la aireación, humedad,
reactividad y disponibilidad de nutrientes del suelo (Tema 2). Así, para una
zona climática dada, y considerando vegetación y topografía constante, los
niveles de carbono y nitrógeno dependen de las características texturales del
suelo. La fijación de las sustancias húmicas como complejos organominera-
les preserva de la descomposición de la materia orgánica. Así, suelos arcillo-
sos suelen tener mayor contenido en materia orgánica que los arenosos.
Además del tamaño, también influye el tipo de material primario, en
el contenido de materia orgánica en un suelo. Así, la montmorillonita, por
ejemplo, tienen alta capacidad de retención de materia orgánica, protegién-
dola de manera muy efectiva de su descomposición por microorganismos.
Topografía
La topografía influye en el nivel de materia orgánica a través de los factores
que determina: clima, evaporación, transpiración y escorrentía (microlima).
Así, suelos en depresiones, con clima «localmente húmedo», poseen mayor
contenido en C que los climas localmente áridos.
Como resumen de la relación existente entre clima, vegetación y suelo
podemos observar como en países tropicales y subtropicales, el contenido de
C es escaso aunque con perfil de distribución homogéneo a causa de la alta
actividad biológica.
En las estepas rusas, praderas y pampas americanas se mantiene la ho-
mogeneidad aunque los suelos están más enriquecidos en materia orgánica.
Al pasar al bosque caducifolio templado se observa una brusca disminución
al profundizar unos pocos centímetros en el suelo, pero se mantiene la ri-
queza superficial en C. En los bosques de coniferas rusos y canadienses (la
Taiga), se observa un segundo máximo en profundidad por la emigración de
la materia orgánica (podsolización).
Influencia de algunas prácticas agrícolas en el nivel de materia orgánica

Normalmente, siempre que se realiza una práctica agrícola, es decir, cuando
se cultiva un suelo, se produce una disminución en la cantidad de materia
orgánica.
La historia demuestra que cuando los nutrientes, especialmente el N, no
son reemplazados por aportes orgánicos o inorgánicos, el suelo no «mantie-
ne» los rendimientos.
A lo largo de los años de cultivo, en un suelo se habrán efectuado distin-

tas prácticas agrícolas que pueden favorecer la descomposición y la minera-
lización del humus.
a) Arado, el arado de un suelo aumenta su aireación y disponibilidad de agua.
Como consecuencia de ello, se produce un aumento en la actividad de los mi-
croorganismos capaces de destruir la materia orgánica. Este aumento implica
una mayor liberación de compuestos orgánicos solubles al suelo.
b) Riego. Al proporcionar humedad al suelo, favorece la actividad de los
microorganismos y, por tanto, la descomposición de la materia orgánica.
c) Encalado. Es la adición de calcita o dolomita a los suelos para subir el
pH (Tema 11). Esta práctica favorece la actividad de lombrices y otros or-
ganismos como actinomicetos (que pueden ser más eficaces que bacterias y
hongos en la descomposición), con lo cual, la descomposición de la materia
orgánica se ve favorecida; por otra parte, un aumento del pH implica la pre-
cipitación de iones metálicos como el Fe. Puesto que estos iones son agentes
estabilizadores de la materia orgánica, al precipitar, disminuyen la estabili-
dad de ésta, favoreciendo la descomposición.
d) Abonado en verde. Una vez recogido el fruto, son las propias plantas de
este cultivo las que se incorporan al suelo (mediante el arado), con lo cual se
produce un aporte de materia orgánica al suelo. Esta práctica ayuda a incre-
mentar el número de microorganismos y por tanto, la velocidad de descom-
posición de la materia orgánica.
En la mayor parte de los suelos agrícolas, los niveles de MO, solo pueden
mantenerse en valores aceptables por:
- Inclusión de un cultivo de pradera en la secuencia.
- Adición de residuos orgánicos.
- Reducir al mínimo las operaciones de labranza.
- Maximizar el retorno de restos vegetales al suelo.
EXTRACCIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA

La materia orgánica del suelo forma parte de un sistema complejo, en el que
interactúan con iones metálicos, coloides minerales,...Para conocer pues su
estructura y propiedades, debemos aislarla del suelo, extraerla. Los métodos
de extracción deben basarse en las diversas formas de retención de la MO
en el suelo.
I. Como complejos macromoleculares insolubles.
II. Como complejos macromoleculares estabilizados por iones di y trivalen-
tes (Ca2+, Fe 3+ y Al 3+ ).
III. Combinada con los minerales de la arcilla, por puentes metálicos (MO-
Me-Arcilla), puentes de H,...
IV. Retenida en los espacios interlaminares de minerales de los silicatos ex-
pandibles.
En las turbas y sedimentos orgánicos similares, las arcillas inorgánicas y
complejos metálicos son muy escasos si los comparamos con el componen-
te húmico. En los horizontes B de los Spodosoles ricos en ácidos fúlvicos
(AF), las sustancias húmicas pueden ser separadas de los sesquióxidos por
extractantes no muy enérgicos. En los suelos agrícolas de zonas templadas,
la mayor parte de la MO se halla unida a los silicatos, esta materia orgánica
no se solubiliza con los extractantes convencionales, sólo con la destrucción
de los silicatos con HF.
Así pues, cualquier procedimiento efectivo de extracción de la MOS de-
be tener en cuenta las propiedades de los extractantes a utilizar, los materia-
les a extraer, y el tipo de asociación de los mismos con otros constituyentes
del suelo (Hayes, 1985).
La extracción ideal sería aquella que nos permitiera:
- Extraer toda la materia orgánica.
- Sin contaminantes.
- Sin alteraciones.
- Debe ser un método universal, válido para todo tipo de suelos.
- Método relativamente simple, que no requiera equipo muy sofisticado.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
Se han establecido cuatro criterios generales para los extractantes:

1. Alta polaridad y constante dieléctrica, para facilitar la dispersión de mo-
léculas cargadas.
2. Pequeño tamaño, porque así penetra mejor en las estructuras húmicas.
3. Capacidad para romper los puentes de hidrógeno establecidos y a la vez
proporcionar grupos alternativos capaces de formarlos entre extractantes
y compuestos húmicos.
4. Capacidad para inmovilizar los cationes metálicos.
En la Tabla 5.II se da una relación de los distintos extractantes empleados
para extracción de las sustancias húmicas del suelo.
Para la extracción de sustancias húmicas (aquellas de composición no
definida), los reactivos más utilizados son básicamente, NaOH (sosa) y
Na4P2O7 (pirofosfato sódico). Si bien el primero extrae mucha más materia
orgánica que el segundo (Tabla 5.II).
Tabla 5.II
DISOLVENTES Y REACTIVOS USADOS PARA LA EXTRACCIÓN DE SUSTANCIAS
HÚMICAS DEL SUELO Y RENDIMIENTO DE LA EXTRACCIÓN.
Extractante MO extraída
Bases fuertes:
NaOH Hasta un 80 %
Na2CO3 Hasta un 30 %
Sales neutras:
Na4P2O7, NaF Hasta un 30 %
Sales de ácidos orgánicos Hasta un 30 %
Quelatos orgánicos:
Acetilacetona Hasta un 30 %
Cupferron
8-quinolinol (8-hidroxiquinolina)
Ácido fórmico (HCOOH) Hasta un 55 %
Acetona-H2O-HCl Hasta un 20 %
Sin embargo, a la hora de elegir uno u otro habrá que tener en cuenta
diversos factores, así: la sosa, a pesar de extraer más, produce cambios quí-
micos en las estructuras de la materia orgánica y, además adiciona impurezas
inorgánicas. El pirofosfato extrae más compuestos aromáticos (Schnitzer y
Schuppli, 1989).
Extracción alcalina
Fueron los primeros reactivos usados como extractantes, y aún permanecen
como los más utilizados. Se lleva a cabo con disoluciones 0,1 a 0,5 N, con
una relación suelo / disolución de 1:5 a 1:2 (g/mL).
La solubilización del material húmico por los álcalis parece que es debi-
do a la ruptura de los enlaces que mantiene la materia orgánica unida a com-
ponentes inorgánicos del suelo, así como a la conversión de componentes
ácidos a sales solubles. Las sales de los cationes di y trivalentes son insolu-
bles, así, lavando el suelo con HC1 diluido o con HF-HC1, que elimina el Ca
y otros cationes polivalentes, se incrementa la eficacia de la extracción por
agentes alcalinos.
Los inconvenientes que presenta esta extracción son:
- Por disolver la sílice (SiO2), la materia orgánica se extrae contaminada
de SiO2.
- También son disueltos componentes y estructuras protoplasmáticas (bio-
masa) que no son verdaderas sustancias húmicas.
- Condensación entre anillos aromáticos y grupos C=O de aldehidos aro-
máticos y/o quinonas.
- Autooxidaciones. Así, en condiciones alcalinas, se observa un importan-

te consumo de O2 en el proceso de extracción, que puede originar:
• Ruptura de moléculas de AH.
• Cambios en la CIC.
• Cambios en los estados de oxidación.
Para minimizar estos cambios por autooxidación, se recomienda que la
extracción se realice en altmósfera inerte (N2).
Extracción con disoluciones salinas acuosas

Las sales sódicas y potásicas de ácidos orgánicos y agentes complejantes
son extractantes más suaves y selectivos que los anteriores, para compuestos
húmicos. Producen menores alteraciones, pero su rendimiento de extracción
es más bajo. Esto último puede atenuarse por pretratamiento de la muestra
de suelo con HC1 o HC1-HF.
De esta categoría de disoluciones salinas, la más frecuente es una diso-
lución 0,1 M de Na4P2O7, con un rendimiento próximo al 30% (Tabla 5.II).
Para minimizar las alteraciones se recomienda que se realice a un pH próxi-
mo a 7. Los compuestos húmicos extraídos con pirofosfato suelen contener
elevadas proporciones de Fe y Al.
Otras sales inorgánicas empleadas en extracción son, en orden decre-
ciente de eficiencia: NaF, (NaPO3)6, Na3PO4, Na2B4O7, NaCl, NaBr, Nal. Las
sales orgánicas sódicas más frecuentes son: oxalato, citrato, tartrato, malato,
salicilato, benzoato, sucinato y etanoato; en orden también decreciente de
eficacia.
La bondad de la extracción de este tipo de compuestos depende de su
capacidad para sustituir los cationes polivalentes que neutralizan las cargas
de las sustancias húmicas (SH) y los enlazan a los coloides minerales por el
ion sodio.
Un factor muy importante es la concentración salina de la disolución
extractante, así pues, un exceso de electrolito disminuye la hidratación de las
SH, y a su vez su posibilidad de disolución.
Agentes quelantes orgánicos

Compuestos como la acetilacetona, cupferron, 8-hidroxiquinoleina, son ca-
paces de formar quelatos con iones polivalentes. Se utilizan como agentes
extractantes de MO de horizontes iluviales (B) de Spodosoles. En otros tipos
de suelos son bastante ineficaces.
Tabla 5.III
DATOS DE EXTRACCIONES SUCESIVAS DE SUSTANCIAS HÚMICAS DEL SUELO
(Hayes, 1985)
Rendimiento (% de la MO total)
Extractante AH AF Total acumulado pHdel
extractante
Agua 0,0 2,8 2,8
DMF 15,0 2,2 20,0 6,8
Sulfolano 4,1 1,0 25,1 3,7
DMSO 0,7 0,2 16,0 5,9
Piridina 14,8 0,6 41,4 11,6
EDA 23,2 6,3 70,9 13,0
Extracción con disolventes orgánicos

En la Tabla 5.III podemos observar como la piridina extrae más que la DMF
(Dimetilformamida), sulfolano y DMSO (dimetilsulfóxido). Los autores
piensan que puede ser debido a un efecto del pH.
Las cantidades de SH extraídas con los disolventes apróticos dipolares
DMF, DMSO y sulfolano, depende de su capacidad para solvatar las macro-
moléculas de SH.
Parece ser que estos compuestos rompen puentes de hidrógeno o com-
plejos entre los metales y la materia orgánica. Sin embargo, presentan el
inconveniente de complejar Ca, Al y Fe, produciendo así disoluciones de
sustancias inorgánicas contaminantes. Presentan sin embargo, la ventaja de
ser compuestos polares con ningún efecto oxidante ni hidrolítico.
Extracción secuencial
Hayes (1985) ha desarrollado un método de extracción secuencial basado en
un aumento del poder extractante por variaciones de pH, y por cambio en la
naturaleza del extractante utilizado.
Como podemos ver en la Tabla 5.III, los reactivos utilizados por Hayes
(1985) fueron:
1. Agua.
2. DMF (Dimetilformamida).
3. Sulfolano.
4. DMSO (Dimetilsulfóxido).
5. Piridina.
6. EDA.
Otro método secuencial es el propuesto por Schnitzer y Schuppli (1989)
con la siguiente secuencia de extractantes:
1. n-Hexano (extrae aléanos y ácidos grasos).

2. Cloroformo (ácidos grasos, alcoholes de cadena larga y esteres de ce-
ras).
3. 0,1 M Na2P2O7 (MO complejada a metales y arcillas).
4. 0,5 M NaOH (MO: «libre» (materiales menos descompuestos)).
5. Agua (MO «libre» (materiales menos descompuestos)).
Algunos autores han empleado otros métodos tales como resinas quelan-
tes y dispersión ultrasónica.
También se han desarrollado métodos para extraer compuestos especí-
ficos de la materia orgánica del suelo, como la extracción supercrítica con
CO2, n-pentano, etanol y mezclas acetona-agua. Estos métodos extraen: pa-
rafmas, compuestos aromáticos, nitrogenados y otros componentes de la ma-
teria orgánica del suelo.
FRACCIONAMIENTO
Una vez extraídas las sustancias húmicas, es necesario hacer una subdivisión
en distintas fracciones, de acuerdo a sus propiedades y composición mole-
cular, como un paso previo a los análisis y medidas físico-químicas de las
fracciones obtenidas. Se ha observado que los compuestos húmicos poseen
un amplio rango de valores para una propiedad molecular determinada. Así,
la razón fundamental para el fraccionamiento es determinar el rango de va-
riación para propiedades tales como: peso molecular, contenido de grupos
funcionales, composición elemental, etc.
El fraccionamiento podemos decir que está basado en la diferencia de
propiedades que presenta la materia orgánica. Se hace necesario además por,
la dificultad que existe en la medida de propiedades moleculares para una
mezcla tan heterogénea como son las sustancias húmicas.
Las propiedades físico-químicas utilizadas en el fraccionamiento son:
1. Fraccionamiento basado en solubilidad y precipitación.
a. Uso del pH.
b. Precipitación salina.
c. Precipitación con iones metálicos.
d. Uso de disolventes orgánicos.
2. Fraccionamiento basado en tamaño molecular.
a. Cromatografía.
b. Ultrafiltración.
c. Centrifugación.
3. Fraccionamiento basado en características de carga,
a. Electroforesis.
b. Intercambio iónico.
4. Fraccionamiento basado en adsorción.
FRACCIONAMIENTO BASADO EN SOLUBILIDAD Y PRECIPITACIÓN

Uso del pH
Dependiendo del pH podremos obtener distintas fracciones de las sustancias
húmicas. Las principales aparecen en la Fig. 5.5.
Como puede verse, ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y humina se diferen-
cian en base a su distinta solubilidad. Así, los ácidos húmicos serían aquellas
sustancias que se extraen con álcali y no son solubles en ácidos. La humina
no se solubiliza en álcali y los ácidos fúlvicos permanecen solubles en áci-
do.
El valor normal del pH de fraccionamiento es de 1, pero otros autores
como Flaig, et al. (1975) lo suben a valores de 1,5 a 2,0 o incluso superiores
(pH 4,8), no obteniendo buena separación, probablemente debido a procesos
de coprecipitación.
La utilización del pH es la técnica más extendida en el fraccionamiento
de sustancias húmicas, por obtener rápidamente grandes cantidades de mate-
rial. Sin embargo, presenta el inconveniente de obtener por coprecipitación
fracciones no definidas con un amplio rango de propiedades.
Suelo o sedimentos
i
Extracción con base
(Insoluble) (Soluble)
humina I
Tratamiento con ácido
. (Precipitado) (No precipitado)

Ácido húmico Ácido fúlvico
Extracción con alcohol

Redisolución en base y adición de electrolito
Ácido himatomelánico
(Precipitado) (No precipitado)
Ácido húmico gris Ácido húmico pardos
Fig. 5.5. Esquema del fraccionamiento de la materia orgánica del suelo en función del pH.
Fig. 5.6. Distribución de las formas del humus en distintos grupos de suelo (Stevenson,
1994).
¿Cómo se distribuyen las fracciones AH y AF? Depende en gran me-

dida del tipo de suelo. Así para suelos forestales (Alfisoles, Spodosoles y
Ultisoles) la relación AH/AF es menor que en suelos de pradera (Mollisoles).
También existen diferencias en su composición. Así los AH de suelos fores-
tales suelen ser menos aromáticos que los de pradera. En la Fig. 5.6 observa-
mos las formas de humus en cuatro grandes grupos de suelos.
Precipitación salina
Los compuestos húmicos son macromoléculas cargadas (polielectrolitos) y,
por tanto, su comportamiento en disolución está influenciado por la cualidad
y concentración del electrolito (sal) que le rodea.
Los efectos observados dependen de los cambios en la doble capa difusa,
que se producen con la variación en la concentración de sales:
- A baja concentración, la doble capa difusa es ancha. Cuando las macro-
moléculas en disolución se aproximan, predominan las fuerzas de repul-
sión intermoleculares sobre las de atracción. Debido a ello las moléculas
se repelen permaneciendo el polímero en dispersión, y no precipitando.
- Cuando la concentración del electrolito aumenta, disminuye el espesor
de la doble capa. Ello permite que las macromoléculas se aproximen
tanto entre sí como para que predominen las fuerzas atractivas sobre las
repulsivas. Gracias a ello se produce la coagulación o precipitación.
Como se ve, resulta interesante conocer la teoría general del comporta-

miento de macromoléculas cargadas en disolución de electrolitos.
Dependiendo del grado de saturación de la sal, se obtienen distintas frac-
ciones. En general, este procedimiento es muy poco usado para obtener frac-
ciones muy definidas debido a problemas de coprecipitación.
Utilización de iones metálicos

Desde los primeros tiempos de investigación con sustancias húmicas se com-
probó que éstas forman sales isolubles con los cationes metálicos, principal-
mente di-, tri- y tetravalentes. Así, Berzelius en 1839 utilizó el cobre para
precipitar ácido apocrénico y crénico (ácidos fulvicos).
Tal vez, la poca utilización de esta técnica se deba a la facilidad de preci-
pitación por único ajuste del pH.
Una forma de uso es la precipitación en medio cromatográfico con Zn(II),
Cu(II) y Ni(II) sobre sefarosa 6B (Swift, 1985).
Uso de disolventes orgánicos

Con ellos fraccionamos las sustancias húmicas que ya han sido extraídas.
(No confundir con extracción). Ej.: Precipitación fraccional de ácidos húmi-
cos en disolución alcalina por adición de etanol (Kyuma, 1964).
FRACCIONAMIENTO BASADO EN TAMAÑO MOLECULAR

Cromatografía de exclusión
Recibe también los nombres de «Cromatografía de filtración en gel» o, «cro-
matografía de permeabilidad en gel». Se trata de un método de separación de
moléculas por su tamaño, realizado normalmente en columnas rellenas con
gel. La permeabilidad diferencial dentro de los poros del gel (poliestireno,
polisacáridos como agarosa, poliamida) determina el orden de elución de la
muestra.
Esta técnica se desarrolló para el estudio de proteínas, y a comienzos de
la segunda mitad del siglo XX se empezó a utilizar en el estudio de compues-
tos húmicos. Es una técnica rápida, barata y muy versátil utilizada para sepa-
ración, purificación, fraccionamiento y determinación de pesos moleculares
de polímeros. El proceso se esquematiza en la Fig. 5.7.
En ella se aprecia:
- Si el compuesto es grande, es incapaz de interaccionar con los poros del
gel, con lo cual sale antes de la columna.
Fig. 5.7 Separación de partículas a través de la cromatografía de exclusión.
- Si el compuesto es de pequeño tamaño, puede penetrar en los poros del

gel, quedando más tiempo retenido y saliendo por tanto más tarde de la
columna.
El resultado neto sería: las moléculas de soluto son eludidas de la co-
lumna en orden decreciente de tamaño molecular. Se llama de exclusión por
excluir a las moléculas que no interaccionan con los poros.
Las columnas de relleno utilizan gel de Sephadex, de distinto tamaño. La
utilización de geles de rango adecuado, hace posible determinar pesos mole-
culares de polímeros cuyos valores van de miles a millones. Esta capacidad
de separación aparece en la Tabla 5.IV. Vemos los distintos rangos de pesos
moleculares de proteínas y polisacáridos que se pueden obtener, dependien-
do del tipo de gel usado.
Un ejemplo de separación de ácidos fulvicos aparece en la Fig. 5.8. En
ella vemos como se van obteniendo distintas fracciones: A, B, C y D con
distintos rangos de peso molecular; y distinta composición elemental (Tabla
Tabla 5.IV
RANGO DE FRACCIONAMIENTO Y LIMITE DE EXCLUSIÓN DE LOS GELES DE
SEPHADEX
Límite aproximado para
Tipo de gel exclusión completa Rango de fraccionamiento
(peso molecular) (peso molecular)
G-10 700 0-700
G-15 1500 0-1500
G-25 5000 100-5000
G-50 10.000 500-10.000
G-75 50.000 1.000-50.000
G-100 100.000 5.000-100.000
G-150 150.000 5.000-150.000
G-200 200.000 5.000-200.000
Fig. 5.8. Fraccionamiento de ácidos fulvicos por filtración en gel.
5.V). También podemos ver que los porcentajes de los distintos elementos no
siguen ninguna secuencia.
Hay que evitar la adsorción de los ácidos húmicos sobre los geles. Para
ello no se recomienda utilizar agua como eluyente (favorece la retención
superficial de los ácidos húmicos sobre los geles, por formar enlaces de hi-
drógeno), e incrementar el tamaño de la muestra (se produce una mayor reso-
lución en el cromatograma), obteniéndose mejores picos (Fig. 5.9).
Este método ha servido para demostrar la naturaleza polidispersa de las
sustancias húmicas, además del amplio rango de pesos moleculares que po-
seen. Cameron et al. (1972) obtuvo para ácidos húmicos, pesos que oscilaban
entre 200 y 1.500.000, con la porción más abundante en 100.000.
Tabla 5.V
CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DE LOS ÁCIDOS FULVICOS Y DE SUS FRACCIONES
OBTENIDAS POR FILTRACIÓN EN GEL (Schinitzer y Skinner, 1968)
Fracción Rendimiento C H N O
(%) (%) (%) (%) (%) Mn
Original 1.00 49,5 4,5 0,8 45,0 951
A 0,16 53,9 6,2 1,7 33,9 2110
B 0,23 55,4 6,1 0,7 37,6 1815
C 0,14 53,1 5,0 0,7 41,0 1181
D 0,27 54,2 4,9 0,8 39,9 883
D, 0,06 49,8 6,3 0,5 43,2 311
D, 0,02 275
Volumen de elución (mL)

Fig. 5.9. Cromatografía de gel aplicada a la separación de ácidos húmicos.
Ultrajlltración
En el estudio de las macromoléculas biológicas, se utilizan para su separación
filtros de membrana. Los filtros se preparan con un tamaño de poro definido,
desde varios micrometros a varios nanometros de diámetro. Dependiendo
del tamaño de poro, la filtración se divide en dos grandes grupos:
A. Microfiltración: con tamaño de poro grande. Es utilizada para retener
microoganismos.
B. Ultrafíltración: con tamaño de poro pequeño. Es utilizada para retener
moléculas en disolución.
Debido a las interacciones de carga que se producen entre las sustancias
húmicas y las membranas, los valores límites moleculares deben ser tomados
con prudencia.
Es un método sencillo, que permite el fraccionamiento de grandes can-
tidades de sustancias húmicas, y que si se eligen membranas para sustancias
de peso molecular bajo (Cl, SO42~,...) permite desalinizar y/o concentrar.
Es un método muy útil de purificación de aguas pues eliminamos las
sustancias húmicas presentes en ellas.
Centrifugación
La centrifugación determina pesos moleculares de sustancias húmicas me-
diante la diferencia existente en sus velocidades de sedimentación.
En cualquier estudio de este tipo realizado con sustancias húmicas, es

necesaria la supresión de las interacciones intermoleculares por adición de
electrolitos (se añaden electrolitos antes de la centrifugación para evitar inte-
racciones entre las sustancias húmicas).
FRACCIONAMIENTO BASADO EN CARACTERÍSTICAS DE CARGA

Electroforesis
Es un método de separación basado en el hecho de que por acción de un
campo eléctrico:
- Las partículas con carga positiva emigran hacia el cátodo (polo negativo)
mientras que las negativas lo harán hacia el ánodo.
- Dependiendo del tamaño de las partículas, así como de la cantidad de
carga que posean, las partículas migrarán a distancia velocidad.
En la actualidad, se emplean técnicas de electroforesis avanzadas tales
como, electroforesis sobre gel de poliacrilamida (PAGE), enfoque isoeléctri-
co (IEF), e isotacoforesis (ITP), para el fraccionamiento de SH del suelo, a
veces en asociación con cromatografía sobre gel.
Intercambio iónico
Se utilizan resinas de intercambio aniónico. En ellas el material húmico es
retenido, y se puede fraccionar por elución con un gradiente salino y/o reac-
tivo alcalino (normalmente NaCl y NaOH respectivamente).
No se suelen obtener buenos fraccionamientos, debido probablemente a
la composición particular de las resinas de intercambio aniónico. Perlas de
poliestireno (no porosas), que restringen grandemente su área superficial. Al
ser pequeña esta área superficial, no existe pues una interacción con todos
los lugares de carga de los ácidos húmicos. Como consecuencia de ello no
existe una buena definición de cargas, con lo cual se produce una pérdida de
resolución en la separación.
Se consiguen mejores resultados con resinas porosas de celulosas y/o
geles. Las resinas de poliestireno son, sin embargo, muy utilizadas para la
eliminación de metales que acompañan a las sustancias húmicas. Algunos
autores creen que no se ha prestado la atención debida a este tipo de técnicas
de fraccionamiento, y que es un campo a desarrollar.
FRACCIONAMIENTO BASADO EN ADSORCIÓN

Es un procedimiento de fraccionamiento utilizado casi con exclusividad para
ácidos fülvicos.
Fig. 5.10. Fraccionamiento basado en adsorción.
Debido a la naturaleza de los extractantes, a los ácidos fúlvicos, suelen

acompañar impurezas de sustancias no húmicas y, a veces, es difícil distin-
guir entre fraccionamiento y purificación.
Como adsorbentes se emplean: carbón, alúmina y geles, la desorción se
realiza por disolventes orgánicos (etanol, etc.) o bien con ácidos y bases. Un
esquema de fraccionamiento aparece en la Fig. 5.10.
El procedimiento expuesto es más una purificación, por eliminación de
polisacáridos, que un fraccionamiento. Durante la desorción de sustancias
húmicas, se suelen producir modificaciones indeseables de su estructura.
PROCEDIMIENTO UNIVERSAL DE EXTRACCIÓN, FRACCIONAMIENTO Y

PURIFICACIÓN
En los últimos años, la Sociedad Internacional de Sustancias Húmicas (IHSS),
ha realizado un importante esfuerzo para establecer un método que permita
extraer, fraccionar y purificar SH de diversos orígenes: suelos, aguas, sedi-
mentos,... Sobre esta premisa, Thurman (1988), ha propuesto el esquema
siguiente de la Fig. 5.11.
Como se observa se parte de dos grandes grupos, muestras acuáticas y
sólidas (suelos, sedimentos,...). Primero se someten las muestras a un pretra-
Fig. 5.11. Procedimiento universal de extracción, fraccionamiento y purificación.
tamiento que facilita el proceso siguiente (extracción); en suelos este trata-

miento puede consistir en operaciones tales como: desmineralización en HC1
y/o HF, separación de fragmentos vegetales por flotación, etc.
La extracción se suele realizar mediante disoluciones de NaOH, pirofos-
fato, o de un disolvente aprótico dipolar como dimetilsulfóxido.
La etapa siguiente: acidificación, es una etapa común para cualquier tipo
de muestra, y consiste en la acidificación del extracto alcalino a pH < 2, con
HC1, y precipitación. Tras centrifugación, tenemos perfectamente separadas
las fracciones: AF (ácidos fúlvicos) en disolución y AH (ácidos húmicos)
precipitados.
En la siguiente etapa: purificación, se eliminan por métodos físicos,
compuestos que suelen acompañar a AH y AF como: polisacáricos, aminoá-
cidos, iones inorgánicos, lípidos, ácidos grasos, y que se encuentran unidos
físicamente a la SH.
El proceso concluye con una última etapa de verificación, para los AH y
AF obtenidos, mediante análisis elemental, de grupos funcionales, etc, que
nos permite confirmar su obtención e inferir algunas de sus principales pro-
piedades.
Fig. 5.12. Principales rutas de síntesis del humus.
BIOQUÍMICA DE FORMACIÓN DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS

La bioquímica de formación de las sustancias húmicas es uno de los aspectos
menos conocido de la química del humus. Los estudios sobre este tema son a
largo plazo, y la búsqueda continua se justifica tanto desde un punto teórico
como práctico:
- Desde el punto de vista teórico, la información de cómo se forman las
sustancias húmicas, aportará importantes datos sobre sus estructuras.
- Desde el punto de vista práctico, supondrá un mejor conocimiento del
ciclo del carbono.
Existen varias rutas de formación de sustancias húmicas a partir del des-
moronamiento de los restos vegetales y animales del suelo. Las principales
aparecen en la Fig. 5.12. Hay tres teorías que comprenden cuatro mecanis-
mos (Rutas):
- Teoría de la condensación de azúcares (1, Fig. 5.12).
- Teoría del polifenol (2 y 3, Fig. 5.12).
- Teoría de la lignina (4, fig. 5.12).
TEORÍA DE LA LIGNINA (RUTA 4)

Durante mucho tiempo se pensó que la lignina era la única fuente de las
sustancias húmicas. Waksman (1932) propuso que el contenido en N de los
AH provenía de la condensación de lignina modificada con proteínas, éstas

últimas producidas por síntesis microbiana.
La teoría de Waskman, ampliada por Mattson et al. (1943), proponía que
la lignina, durante la oxidación, reaccionaba con NH3 y daban productos de
condensación en los que el N se incorporaba a formas cíclicas.
Aunque la lignina es menos atacable que otros componentes de las plan-
tas, por microorganismos, existen muchos mecanismos naturales para su
descomposición aeróbica completa. Si esto no ocurriese se acumularían los
residuos de las plantas sobre la superficie del suelo hasta agotar el CO2 at-
mosférico. La capacidad para degradar lignina de los microorganismos del
suelo ha sido subestimada, así como la contribución de la lignina en la for-
mación del humus.
En suelos aeróbicos normales, la lignina puede descomponerse en pro-
ductos de bajo peso molecular antes de la síntesis del humus, como se verá
más adelante. En condiciones de humedad no se producirá esta descomposi-
ción. Por tanto, parece lógico que las ligninas modificadas tengan una mayor
contribución en suelo de turbas, sedimentos pantanosos o de lagos y suelos
poco drenados (turberas) o bien en suelos de tipo lacustre.
De acuerdo con esta teoría, la lignina es utilizada por los microorganis-
mos de forma incompleta y los residuos forman parte del humus del suelo.
Las modificaciones en la lignina incluyen pérdida de metoxilos (-OCH3) con
la formación de grupos o-hidroxifenoles y la oxidación de cadenas laterales
alifáticas, para dar grupos -COOH. El material modificado estará sujeto a
posteriores trasformaciones desconocidas para dar lugar primero a ácidos
húmicos (AH) y después ácidos fülvicos (AF) (Fig. 5.13).
Fig. 5.13. Representación esquemática de la teoría de la lignina en la formación del humus.

Fig. 5.14. Diferentes unidades estructurales de la lignina.
Estructura de la lignina
La lignina es un compuesto vegetal, de elevado peso molecular, formado
fundamentalmente por unidades de fenilpropano (C6-C3) del tipo de alcohol
coniferílico, alcohol p-hidroxicinámico y el sinapílico (Fig. 5.14).
No todos las ligninas de todos los vegetales son iguales, así en las conife-
ras predomina el alcohol p-hidroxicinámico, mientras en las herbáceas están
presentes las tres.
En la síntesis de la lignina se dan tres etapas (Stevenson, 1994):
1 2 3
Glucosa —> Unidades C6-C3 —> Ligninoles —> Lignina
(Digitoles)
1. Obtención de las unidades de fenilpropano

Un esquema del proceso sería el representado en la Fig. 5.15. La glucosa
producida en la fotosíntesis, se convierte en ácido fosfoenolpirúvico a través
de la glicólisis, y en D-eritrosa-4-fosfato vía pentosa-fosfato. La combina-
ción de los dos produce un compuesto que por adición de ácido pirúvico da
ácido prefénico. La descarboxilación forma los ácidos p-hidroxifenil y fenil-
pirúvico, de los que se producen por reducción de -COOH y metilación, las
unidades constitutivas de la lignina.
2 y 3. Formación de ligninoles y lignina

La formación de moléculas grandes a partir de las tres moléculas básicas,
puede explicarse mejor por un mecanismo de apareamiento relacionado con
Fig. 5.15. Vías de síntesis de las unidades básicas de la lignina: A: alcohol coniférico, B:
alcohol p-hidroxicinámilico, C: alcohol sinapílico.
radicales libres mesoméricos, como los que se muestran para el alcohol co-
niferílico (Fig. 5.16).
La deshidrogenación enzimática del alcohol, lleva a la formación de ra-
dicales fenoxi (IV), que está en equilibrio con sus formas monómeras V, VI
y VIL
El siguiente paso en la síntesis de la lignina parece ser el apareamiento de
los radicales libres en diversas combinaciones para dar digitoles, en los que
Fig. 5.16. Mecanismo de radicales libres en la síntesis de la lignina.

el enlace covalente une a dos monómeros. La unión de los radicales VI y VII

da un digitol, conocido como alcohol dehidrodiconiferílico, el VI y el VI un
pinoresinol, y así se han identificado muchos lignoles (Fig. 5.17).
Eterguaiacilglicerol-p-coniferil
Alcohol Pinoresinol
dehidrodiconiférilico XI
IX X
Fig. 5.17. Distintos lignoles identificados.
Fig. 5.18. Estructura de la lignina para la especie «Spruce Picea».

Según los conceptos actuales, la lignina es una extensión de las reac-

ciones emparejamiento citadas anteriormente, para producir polímeros, Una
representación esquemática de la estructura de la lignina para la especie
«Spruce Picea» (falso abeto), se muestra en la Fig. 5.19: En plantas se han
llegado a identificar di-, tetra- y hexalignoles.
Conversión de la lignina es sustancias húmicas

Asumiendo que las SH se forman a partir de ligninas modificadas, el cambio
más notorio en la lignina es la pérdida de grupos -OCH3 (metoxilo) y la oxi-
dación de las cadenas terminales a grupos -COOH.
Un grupo abundante de bacterias son capaces de desmetilar a la lignina
sin producir una degradación posterior del polímero. El esquema de una lig-
nina modificada puede verse en la Fig. 5.19.
Como puede observarse en la Fig. 5.19, la desmetilación y la oxidación
da lugar a productos ricos en grupos ácidos y fenólicos, en los que hay menos
carbono y más contenido en oxígeno que en la lignina (comparar la Fig. 5.18
con la Fig 5.19).
La teoría de la lignina fue modificada por Hatcher y Spiker (1988), al
hacerla extensible a otras macromoléculas refractarias vegetales (cutina, su-
berina) y microbianas (melaninas, macromoléculas parafínicas), como bio-
polímeros precursores de las sustancias húmicas.
Fig. 5.19. Lignina modificada por desmetilación y oxidación de cadenas laterales.

174 M. Juárez Sanz, J. Sánchez Artdreu y A. Sánchez Sánchez
El proceso sería una preservación selectiva de estos biopolímeros, opera-

cionalmente incluidos en la fracción de humina (fracción del humus insolu-
ble en álcali). Su degradación permite la formación de macromoléculas con
tamaño semejante, enriquecidos en grupos funcionales oxigenados (-COOH,
>C=O, -OH), con evolución a ácidos húmicos primero y fulvicos después.
En apoyo de lo expuesto, hay que afirmar la detección de estructuras
parafínicas refractarias, mediante espectroscopia 13C-RMN, en la fracción de
humina de algunos suelos (Stevenson, 1994).
Se debe aclarar sin embargo, que los grupos -COOH que surgen en las
cadenas terminales de las ligninas parecen ser insuficientes para justificar
el alto contenido -COOH de los ácidos fulvicos y húmicos. Los grupos -
COOH adicionales pueden aparecer de la ruptura de los anillos aromáticos
que componen la lignina.
En vista del gran tamaño de las macromoléculas de lignina y de su inso-
lubilidad en agua, las modificaciones mencionadas tendrían que tener nece-
sariamente lugar a cargo de enzimas extracelulares. Las unidades de o-dihi-
droxibenceno resultantes de la desmetilación de la lignina serían susceptibles
de pasar a quinonas, capaces a su vez de condensarse con NH3 y grupos
amino, como se ve a continuación:
TEORÍA DE LOS POLIFENOLES (RUTAS 3 Y 2)

La teoría clásica de Waksman de la lignina-proteina se considera en la actua-
lidad obsoleta, según algunos investigadores. De acuerdo con los conceptos
actuales, las quinonas procedentes de las ligninas, junto a las sintetizadas por
microorganismos, son los principales ladrillos (monómeros) en la construc-
ción de las SH.
En la ruta 3 (Fig. 5.12), la lignina también desempeña un papel importan-
te en la síntesis del humus, pero de forma diferente. En este caso, aldehidos
fenólicos y ácidos liberados de la lignina durante el ataque microbiano, su-
fren una conversión enzimática a quinonas, que se polimerizan en presencia
Fig. 5.20. Representación esquemática de la teoría de los polifenoles en la formación del

humus.
o ausencia de compuestos con nitrógeno amínico, para formar macromolé-

culas húmicas (Fig. 5.20).
La ruta 2 (Fig. 5.12) se diferencia de la ruta 3 en que aquí los polifenoles
se sintetizan por microoganismos a partir de sustancia distintas a la lignina
(Ej. Celulosa) (Fig. 5.20). Los polifenoles son entonces oxidados enzimáti-
camente a quinonas que se polimerizan en presencia de compuestos con N
amídico para dar SH. El orden de formación de las sustancias húmicas sería
pues: ácido fulvico —> ácido húmico —> humina.
La formación de sustancias de color pardo por reacciones en las que par-
ticipan las quinonas no es un proceso excepcional, sino por el contrario, es
un fenómeno bien conocido que ocurre en la formación de melaninas, como
en la pulpa de las frutas y hortalizas que han sufrido un corte mecánico.
Estas dos rutas predominan en suelos de tipo forestal.
Fuente de los polifenoles

Las posibles fuentes de los polifenoles para síntesis de humus incluyen lig-
nina, microorganismos, fenoles libres, glucósidos y taninos. De todos éstos,
sólo los dos primeros han sido considerados con atención. Estas dos fuentes
posibles para la obtención de polifenoles ha sido defendida por dos autores:
Concepto de Flaig
Flaig (1966) y Flaig et al (1975) postula las siguientes etapas para la forma-
ción del humus:
1. La lignina, libre de su unión a la celulosa durante la descomposición de
los residuos vegetales, es objeto de una oxidación con la formación de
unidades estructurales primarias (derivados del fenilpropano).
2. Las cadenas laterales de las unidades formadoras de lignina son oxidadas
y desmetiladas, y los polifenoles resultantes se convierte en quinonas por
las enzimas polifenoloxidasas.
3. Las quinonas formadas de la lignina (y también de otras fuentes) reac-
cionan con compuestos que contienen N, para dar polímeros de color
oscuro.
Concepto de Kononova
El papel de los microorganismos como fuente de polifenoles ha sido enfati-
zado por Kononova, quien por técnicas microscópicas y químicas ha estu-
diado la descomposición de residuos vegetales. Ella concluye que las SH se
forman por mixobacterias que descomponen la celulosa más que por des-
composición de lignina. Postula las siguientes etapas:
1. Los hongos atacan carbohidratos simples y parte de las proteínas y celu-
losa de la médula, cambium y cortex de los residuos de las plantas
2. La celulosa del xilema se descompone por mixobacterias aerobias. Los
polifenoles formados por las bacterias se oxidan a quinonas por enzimas
polifenoloxidasas, los cuales reaccionan con compuestos nitrogenados
para dar sustancias pardas.
3. La lignina se descompone. Los fenoles liberados también sirven como
fuente de materiales en la síntesis del humus.
La importancia relativa de las ligninas, microorganismos y celulosa co-
mo fuentes de unidades fenólicas en la síntesis del humus es desconocida
(dependerá de las condiciones ambientales del suelo). Dado que las ligninas
son relativamente resistentes a la descomposición microbiana y que son uno
de los constituyentes mayoritarios de las plantas, a veces se considera a éstas
como la mayor y primera fuente de unidades fenólicas. Sin embargo, como
ya se ha citado, algunos hongos microscópicos que descomponen lignina en
el suelo, producen SH acidas, en las que las unidades fenólicas se originan
tanto de lignina como de biosíntesis.
Pruebas indirectas de que tanto lignina como microorganismos contribu-

yen a la formación de SH se han obtenido por estudio de productos obtenidos
por ruptura oxidativa o reductora de AH, donde se han identificado compues-
tos típicos de ligninas (derivados de siringol y guayacol) y de microorganis-
mos (flavonoides).
Formación de polifenoles por biodegradación de la lignina

Los hongos son, sin duda, el grupo de microorganismos más importante res-
ponsable de la ruptura de la lignina. También participan ciertos tipos de bacte-
rias. De acuerdo con Martín y Haider (1971) los hongos del grupo Imperfecti
juegan un importante papel en la síntesis de los sustancias húmicas del sue-
lo. Han encontrado que los hongos: Hendersonula toruloidea, epicoccum
nigrum, Stachybotry atra, S. Chartarum, y Aspergillus sydowi degradan la
lignina, así como celulosa y otros constituyentes orgánicos, y en el proceso
sintetizan cantidades apreciables de polímeros tipo ácidos húmicos.
Fig 5.21. Vías de descomposición de la lignina por hongos.

Fig. 5.22. Transformación de coniferaldehído y p-hidroxicinamaldehído por E. nigritm, S.

atra, y A. sydowi.
La degradación de la lignina por los hongos se puede considerar, en pri-

mera aproximación, como el proceso inverso a la síntesis antes descrita. Así,
el paso inicial sería la liberación de digitoles (éter de guaiacilglicerol-(3-co-
niferil, pinoresinol y deshidrodiconiferil) y la formación de unidades de fe-
nilpropano (C6-C3). Por ejemplo, el digitol citado (éter de guayaquilglicerol)
daría, guayaquilglicerol, alcohol coniférilico, coniferilaldehido, ácido ferúli-
co y otras estructuras relacionadas (Fig. 5.21).
Las unidades C6-C3 se oxidan en las cadenas laterales para dar compues-
tos de bajo peso molecular como aldehidos y ácidos aromáticos como: Ácido
vainilico, siríngico, gálico, p-hidroxibenzoico y aldehidos siríngico y otros.
El estudio realizado por Martín y Haider (1971) de la degradación de co-
niferaldehído y p-hidroxicinamaldehído por hongos del grupo Imperfecti con-
firma la introducción de grupos -OH adicionales en los núcleos aromáticos; y
la oxidación y descarboxilación de las cadenas terminales (Fig. 5.22). Si bien,
Martín y Haider (1971) puntualizaron que aunque numerosos compuestos fe-
Fig. 5.23. Síntesis y transformación de fenoles por E. Nigrum. (Haider y Martín, 1967)
nólicos pueden formarse por estas transformaciones, algunos de los hongos

involucrados tienen una capacidad limitada para romper anillos aromáticos.
Síntesis a partir de microorganismos

Pruebas de la formación de SH sin la participación de lignina se tiene por la
existencia de humus en suelos donde no hay lignina. Así en suelos turbosos,
muy húmedos, el humus se forma a partir de residuos que no contienen lig-
nina.
Los agentes que producen estas transformaciones son los hongos, acti-
nomicetos y bacterias.
En la Fig. 5.23, se puede ver un ejemplo de síntesis de fenoles llevado a
cabo por «Epicoccum nigrum». Una vez formados los polifenoles (sea cual
sea su origen, lignina y/o celulosa) por los microorganismos, son secretados
por estos al exterior. El proceso seguido a partir de ahora sigue el esquema:
Fig. 5.24. Formación de sustancias húmicas a partir de quinonas y aminoácidos, representa-

da por la reacción entre catecol y glicina.
Fig. 5.25. Polimerización oxidativa de polifenoles con unidades de aminoazúcares

(Stevenson, 1994).
Aunque la condensación de quinonas tiene lugar en condiciones simi-

lares a las que existen en el suelo, las reacciones se ven muy favorecidas
en presencia de compuestos amino, por ejemplo aminoácidos, péptidos, y
proteínas dan lugar a polimeros nitrogenados que tienen muchas de las pro-
piedades de los ácidos húmicos naturales. Las reacciones propuestas entre
quinonas y aminoácidos se muestran en la Fig. 5.24.
Un aspecto interesante de las investigaciones químicas sobre la naturale-
za de los ácidos húmicos sintéticos formados de quinonas y aminoácidos es
el que sólo una parte del N-aminoácido puede recobrarse por hidrólisis acida,
y parte del N-aminoácido se ve incorporado al polímero. Como puede dedu-
cirse u observarse de la Fig. 5.24, la reacción del aminoácido con un >C=O
de la quinona conduce a la degradación del aminoácido y a la formación de
una arilamina. También los minoazúcares, son capaces de reaccionar con los
fenoles, mediante una polimerización oxidativa (Fig. 5.25).
TEORÍA DE LA CONDENSACIÓN AZÚCAR-AMINOÁCIDO (RUTA 1)

La idea de que el humus se forma a partir de azúcares data de las primeras
investigaciones sobre la química del humus. Según esta teoría, los azúcares
reductores y los aminoácidos, formados como productos del metabolismo
microbial, sufren polimerización no enzimática para dar productos marro-
nes nitrogenados, del tipo de los productos en la deshidratación de ciertos
alimentos.
La producción de polímeros nitrogenados marrones por condensación
de azúcares reductores y aminas, ocurre extensamente en la deshidratación,
a temperaturas moderadas, de productos alimenticios, y se ha propuesto que
esta misma reacción tiene lugar en la formación de SH en los suelos. Una
objeción importante a esta teoría es que la reacción transcurre lentamente
a las temperaturas del suelo, en condiciones normales. Sin embargo, los
cambios frecuentes y drásticos en el ambiente del suelo, junto a la mezcla
de los reactivos con minerales de acción catalítica, pueden facilitar la con-
densación.
Un hecho a favor de la teoría es que los reactivos se encuentran en abun-
dancia, por la actividad microbiana. Un esquema del proceso global sería:
La reacción inicial de condensación azúcar-aminoácido supone la adición

del grupo amino a un aldehido del azúcar para dar una base de Schiff y la
glucosamina N-sustituida.
Aldosa
Compuestos de Base de Schiff
adición
Glucosamina
N-sustituida
La glucosamina sufre el «reordenamiento de Amadori» para formar el

producto 1 -amino-1 -desoxi-2-cetona-N-sustituida:
Glucosamina Base de Schiff Forma anólica 1-amina-1-desox¡-2-cetona

N-sustituida (catiónica) -N-sustituida
El producto resultante de la reordenación de Amadori es susceptible de

(Fig. 5.26):
-> Fragmentación: con liberación de amina y formación de aldehidos y
cetonas de tres átomos de carbono, como acetal, gliceraldehido y dihi-
droxiacetona.
-> Pérdida de dos moléculas de agua y amina para formar reductonas.
-» Pérdida de tres moléculas de agua y amina, con la formación del hidroxi-
metil furfural.
Todos estos compuestos son altamente reactivos y se polimerizan con
rapidez en presencia de compuestos amínicos para dar productos coloreados
de composición desconocida.
Fig. 5.26. Vías de formación de polímeros nitrogenados marrones por los productos de reor-
denación de Amadori (Stevenson, 1994).
La contribución de este mecanismo de condensación azúcar-aminoácido

a la formación de las sustancias húmicas, no es del todo conocida, posible-
mente sea de particular importancia en la síntesis de la fracción fulvica de la
materia orgánica del suelo.
Conclusiones
- La teoría más aceptada es la teoría de los polifenoles, pero las tres ponen
de manifiesto la extraordinaria complejidad de las SH.
- Salvo en el caso de la teoría de la lignina, los materiales de partida con-
sisten en compuestos orgánicos de bajo peso molecular, de los que se
forman moléculas más grandes por condensación y polimerización.
- Dado que el número de moléculas precursoras de estas SH es alto y por
lo tanto sus combinaciones, cabe pensar que no haya dos moléculas hú-
micas exactamente iguales.
Al hablar del origen de las SH se debe aclarar que en la actualidad toda-
vía no se ha desarrollado un esquema totalmente satisfactorio que explique
la naturaleza y aparición de las SH en los distintos ecosistemas. Las cuatro
rutas pueden operar en todos los suelos, pero no con la misma intensidad y
en el mismo orden. La ruta de la lignina puede predominar en suelos poco
drenados y húmedos. Mientras que la de los polifenoles predomina en suelos

forestales como muchos residuos foliares. Las variaciones de temperatura,
humedad y radiación en la superficie de los suelos en clima continentales se-
veros, puede favorecer la síntesis de humus por la teoría de la condensación
azúcar-aminoácido.
Una observación que tal vez no haya recibido la adecuada atención, es
que, para un suelo dado, no todos los componentes húmicos se tienen que
formar a partir de un mecanismo único. Así, los ácidos húmicos se pueden
formar a partir de polifenoles vegetales o microbianos, mientras que los áci-
Fig. 5.27. Unidades básicas de las sustancias húmicas.
Fig. 5.28. Estructura hipotética de un ácido húmico

dos fülvicos lo pueden hacer a partir de la condensación azúcar-aminoáci-

do.
De acuerdo con las distintas teorías de síntesis de las sustancias húmicas
en el suelo, se puede considerar que están formadas por las cuatro estructuras
básicas representadas en la Fig. 5.27; estas estructuras se unen entre si para
dar lugar a distintos combinaciones, que formarán la estructura central de las
sustancias húmicas del suelo (Fig. 5.28).
COMPOSICIÓN ELEMENTAL DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS Y RELACIONES

ATÓMICAS
El análisis elemental es la caracterización más usual para las SH. Nos ayuda
a describir y comprender su geoquímica, así como su posible origen. Un
problema importante es, sin embargo, su reproducibilidad. Aunque la com-
posición elemental no nos proporciona una fórmula molecular absoluta para
los ácidos húmicos y fülvicos, si que establece los límites para una posible
composición molecular. La composición elemental nos permite:
- Describir el comportamiento geoquímico de las sustancias húmicas.
- Establecer la pureza de las preparaciones de las sustancias húmicas.
- Distinguir las diferentes clases de sustancias húmicas.
En la Tabla 5.VI, se recoge la composición elemental de los AH y AF ex-
traídos de diferentes zonas climáticas, así como su composición media dada
por Senesi y Loffredo, 1999. Como se puede ver:
Tabla 5.VI
ANÁLISIS ELEMENTAL DE ÁCIDOS HÚMICOS Y FÚLVICOS DE DISTINTOS ORÍGENES
(Senes! y Loffredo, 1999).
Elemento % Ártico Clima frió Subtropical Tropical Rango Media IHSS
S. Ácido S. Neutro estándar
A. Húmicos
C 56.2 53.8-58.7 55.7-56.7 53.6-55.0 54.4-54.9 53.6-58.7 56.2 58.1
H 6.2 3.2-5.8 4.4-5.5 4.4-5.0 4.8-5.6 3.2-6.2 4.7 3.7
N 4.3 0.8-2.4 4.5-5.0 3.3-4.6 4.1-5.5 0.8-4.3 3.2 4.1
S 0.5 0.1-0.5 0.6-0.9 0.8-1.5 0.6-0.8 0.1-1.5 0.8 0.4
O 32.8 35.4-38.3 32.7-34.7 34.8-36.3 34.1-35.2 32.8-38.3 35.5 34.1
A. Fúlvicos
C 47.7 47.6-49.9 40.7-42.5 42.2-44.3 42.8-50.6 40.7-50.6 45.7 50.6
H 5.4 4.41-4.7 5.9-6.3 5.9-7.0 3.8-5.3 3.8-7.0 5.4 3.8
N 1.1 0.9-1.3 2.3-2.8 3.1-3.2 2.0-3.3 0.9-3.3 2.1 2.7
S 1.6 0.1-0.5 0.8-1.7 2.5 1.3-3.6 0.1-3.6 1.9 0.6
O 44,2 43.6-47.0 47.1-49.8 43.1-46.2 39.7-47.8 39.7-49.8 44.8 43.7
— El contenido elemental de las SH varía según se trate de ácidos húmicos

o fülvicos.
- Los AH y AF de los suelos neutros tienen un rango más estrecho en el
porcentaje de C, H y O que los de suelos ácidos.
- Los ácidos húmicos poseen mayor contenido en C, H y N que los fülvi-
cos.
- Los ácidos fülvicos poseen mayor contenido en O y S que los húmicos.
Steelink (1985) y Senesi y Loffredo, (1999), a partir de los análisis ele-
mentales obtenidos para ácidos húmicos y fülvicos han postulado las si-
guientes fórmulas químicas para estos compuestos:
C,0H12O5N => ÁCIDO HÚMICO
C12H12O9N => ÁCIDO FÚLVICO
El contenido elemental de la humina es similar a la de los ácidos húmicos.
La composición elemental de las SH puede depender del: pH, material
primario, vegetación y edad del suelo, así como de los métodos de extracción
y fraccionamiento de las SH (Stevenson, 1994).
Las relaciones atómicas como: H/C, O/C, y N/C, pueden ser útiles para
(Steelink, 1985):
- Identificar los tipos de SH.
- Registrar cambios estructurales.
- Inferir fórmulas estructurales para las SH.
Así, las relaciones O/C y H/C, para AH son respectivamente 0,5 y 1,0,
mientras que para AF de suelo son 0,7 y 1,4 respectivamente. El cociente
O/C hace referencia a la presencia de grupos funcionales oxigenados, tales
como grupos -COOH y carbohidratos, mientras la relaciones de H/C, indi-
can el carácter alifático de las SH.
GRUPOS FUNCIONALES DE LAS SH
La química de los coloides orgánicos del suelo es uno de los aspectos me-
nos conocidos de la ciencia del suelo. Muchas de las principales funciones
del humus, como su efecto en la estructura, quelación de metales pesados
y la absorción de plaguicidas y otros contaminantes tóxicos, permanecerán
oscuras hasta que se conozca más sobre la química estructural de los ácidos
ful vicos y húmicos.
De los distintos grupos funcionales que presentan las sustancias húmi-
cas (Tabla 5.VII) los más frecuentes en la estructura de ácidos húmicos y
fülvicos suelen ser: -COOH, -OH (fenólicos y alcohólicos), quinónicos y
cetónicos. En la Tabla 5.VIII se indica en que concentración se encuentras
Tabla 5.VII
GRUPOS FUNCIONALES PRESENTES EN LAS SUSTANCIAS HÚMICAS (Stevenson, 1994).
Amino -NH2 Anhídrido R-CO-O-CO-R'
Amina R-CH2-NH2 Imina R-CHNH
Amida R-CO- NH 2 Imino =NH
Alcohol R-CH2-OH Éter R-CH2-O-CH2-R'
Aldehido R-CHO Ester R-COOR'
Carboxilo R-COOH Quinona
Carboxilato R-COO Hidroxiquinona
Enol R-CH=CH-OH
Cetona R-CO-R' Péptido R-CH(NH2)-NH-
CH(COOH)-R
Ceto-ácido R-CO-COOH
Carbonilo insaturado -CH=CH-CHO
Tabla 5.VIII
GRUPOS FUNCIONALES DE LOS ÁCIDOS HÚMICOS Y FULVICOS DE DIFERENTES
ORÍGENES (Senesi y Loffredo, 1999).
Grupo funcional Clima frió
(cmol/kg) Ártico S. Acido S. Neutro Subtropical Tropical Rango Media
A. Húmicos
TOTAL ACIDEZ 560 570-890 620-660 630-770 620-750 560-890 670
COOH 320 150-570 390-450 420-520 380-450 150-570 360
OH FENÓLICO 240 320-570 210-250 210-250 220-300 210-570 390
OH ALCOHÓLICO 490 270-350 240-320 290 20-160 20-490 260
C=O QUINÓNICO 230 140-260
C=O CETÓNICO 170 10-180 450-560 80-150 30-140 10-560 290
OCH3 40 40 30 30-50 60-80 30-80 60
A. Fúlvicos
TOTAL ACIDEZ 1100 890-1420 ND 640-1230 820-1030 640-1420 1030
COOH 880 610-850 ND 520-960 720-1120 520-1120 820
OH FENÓLICO 220 280-570 ND 120-270 30-250 30-570 300
OH ALCOHÓLICO 380 340-460 ND 690-950 260-520 260-950 610
C=O QUINÓNICO 200 ND 30-150
C=O CETÓNICO 200 170-310 ND 120-260 160-270 120-420 270
OCH3 60 30-40 ND 80-90 90-120 30-120 80
ND=No Determinado
estos grupos funcionales para las sustancias húmicas de distintos orígenes.

La acidez total, y por tanto los grupos que más contribuyen a ella (-COOH y
-OH) es más alta en los ácidos fulvicos que en los húmicos. Por el contrario
los ácidos húmicos tienen un mayor porcentaje de grupos quinónicos. Los
ácidos húmicos y fulvicos tendrán aproximadamente la misma concentra-
ción de grupos metoxilo (-OCH3).
BASES ESTRUCTURALES DE LAS SH
Las SH consisten en una mezcla heterogénea de compuestos. Cada fracción

de AH y AF está constituida por una serie de moléculas de distinto tamaño,
pocas con la misma estructura y colección de grupos reactivos.
Para poder estudiar estas sustancias deberemos de emplear métodos que
transformen a los AH y AF en sustancias más simples (monómeros). Son los
llamados métodos de degradación (Stevenson, 1994).
Métodos de degradación de AH y AF
Se dividen en cuatro grandes grupos:
1. Métodos oxidativos.
a. Cu-NaOH.
b. Nitrobenceno alcalino.
c. KMnO4 Alcalino.
d. Ácido nítrico.
e. Ácido peracético.
f. Hipoclorito sódico.
g. Peróxido de hidrógeno.
2. Métodos reductores.
a. Amalgama de Na.
b. Destilación con Zn en polvo.
3. Métodos de hidrólisis.
a. Agua.
b. Básica.
c. Acida.
4. Otros: pirólisis, degradación microbiana.
Los métodos más utilizados son los oxidativos.
Productos obtenidos por degradación de AH y AF

Se han identificado más de 300 compuestos diferentes en los productos de
degradación de las sustancias húmicas, pero no todos se puede considerar
Tabla 5.IX
LISTA PARCIAL DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS IDENTIFICADOS COMO
PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN QUÍMICA DE ÁCIDOS HÚMICOS Y FÚLVICOS
(Stevenson, 1994)
Siringaldehido
Ácido siringico
Ácido siringilpropionico
Vanilina
Ácido vanílico
Ácido guayacilpropionico
Ácido p-hidroxibenzoico
p-hidroxibenzaldehido
Catecol
Ácido protacatechuico
Pirogalol
Ácido 2,3,4-trihidroxibenzoico
Resorcinol
Ácido 2,4-dihidroxibenzoico
Floroglucinol
Ácido m-hidroxibenzoico
Ácido 2,4-dihidroxibenzoico
Otros
Ácidos benceno carboxílicos y hidroxicarboxílicos
Nitrofenoles (oxidación con ácido nítrico)
Anillos policíclicos
que procedan del núcleo central «corazón» de las macromoléculas. Ya que,

un constituyente liberado inicialmente en la degradación se puede transfor-
mar en otro producto durante su permanencia en la mezcla de reacción. En
la Tabla 5.IX se muestra una lista parcial de los fenoles y ácidos fenólicos
obtenidos en la degradación de las sustancias húmicas. Otros compuestos
son: ácidos benceno carboxílicos (oxidación con KMnO-alcalino), nitrofe-
noles (oxidación con ácido nítrico), hidrocarburos policíclicos (destilación

con Zn en polvo), y cadenas aromáticas con lugares alifáticos (degradación
con sulfuro sódico) (Stevenson, 1994).
MODO DE CARACTERIZACIÓN DE LAS SH. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN
La absorción en las regiones UV (200-400 nm) y visible (400-800 nm) es

debida a vibraciones atómicas y electrométricas, al pasar electrones de los
orbitales a, n y rj a niveles de energía superiores. Así, compuestos que po-
sean electrones libres en los átomos de O y de S, así como, dobles enlaces
conjugados, son capaces de presentar adsorción.
Dado que los espectros UV (Fig. 5.29) y visibles (Fig. 5.30) de las sus-
tancias húmicas del suelo, no presentan rasgos distintivos, se suele trabajar
con el llamado índice de condensación aromática E4/E6. Este índice es el
cociente entre la absorbancia que presenta la sustancia a 465 nm y a 665 nm.
Algunos investigadores proponen este índice como la relación de absorción
E400/E600. Una disminución del índice indica un aumento del peso molecular y
de la condensación aromática, por tanto se puede considerar como un índice
de humificación.
Los valores del índice oscilan entre 6-8,5 para ácidos fulvicos y menor
de5paraAH(Tabla5.X).
Como resumen, podemos afirmar que la absorción de luz UV-Vis por SH
se incrementa con:
1. Grado de condensación aromática.
Fig. 5.29. Espectro UV de un AH (A) y de un AF (B).

Fig. 5.30. Espectro visible de un AH (A) y un AF (B).
Tabla 5.X
RELACIÓN E4/E6 DE ÁCIDOS HÚMICOS Y ÁCIDOS FULVICOS
Ácidos E4/E6
Ácidos húmicos
Podsol ±5,0
Forestal +3,5
Chernozem 3,0-3,5
Castaño 3,8-4,0
Serozem 4,0-4,5
Krasnozem ±5,0
Ácidos fúlvicos 6,0-8,5
2. Contenido total de C.
3. Peso molecular.
4. Relación C aromático/C en cadenas alifáticas laterales.
ESPECTROSCOPIA IR
El barrido se produce entre 400 y 4000 nm, y el espectro obtenido nos pro-
porciona información sobre:
- Naturaleza, reactividad y estructura de grupos que contienen oxígeno.
- Presencia de proteínas y carbohidratos.
Fig. 5.31. Espectros de IR correspondientes a AH y AF de distinto origen.
- Presencia o ausencia de compuestos inorgánicos.

- Análisis cuantitativo.
- Interacciones con plaguicidas y compuestos organometálico.
En la Fig. 5.31 se representan los espectros IR de distintos AH y AF.
Esta técnica permite clasificar a los AH y AF según el tipo de espectro que
presenten.
RMN
Posiblemente la técnica que últimamente más ha contribuido al conocimien-
to estructural de la materia orgánica del suelo.
Los espectros de RMN se deben a la interacción de una radiación elec-
tromagnética con especies nucleares, atómicas o moleculares. Al estudio
de la materia orgánica del suelo se ha aplicado 13C-RMN, 'H-RMN, 15N-
RMN, 31P-RMN, y RMN de estado sólido (Stevenson, 1994; Mahieu, et al.
2000a,b). El RMN de estado sólido está adquiriendo una gran relevancia ya
Fig. 5.32. Típico espectro de 13C-RMN de un AH.
que se evitan las interferencias de los disolventes, y que se puede analizar el

suelo directamente sin ser tratado, no es necesario extraer la materia orgáni-
ca y disolver la muestra. Además consume menos tiempo (unas 3 h para un
espectro 13C-RMN de estado sólido, frente a 26-30h para 13C-RMN de estado
líquido cuantitativo) (Schnitzer, 1991).
Tabla 5.XI
GRUPOS ASIGNADOS A LAS DISTINTAS REGIONES DEL ESPECTRO DE 13C-RMN
(Gaffney, et al. 1996)
Región del espectro Grupo asignado
0-45 ppm Estructuras parafínicas (C, CH, CH2, CH,)
40 - 60 ppm C-N Alifático
50 - 58 ppm Metoxilo
60 - 95 ppm O-alquilo (carbohidratos, alcoholes)
95- 110 ppm Carbono acetal y cetal (carbohidratos)
100- 140 ppm Carbonos con H-aril y C-aril
140- 160 ppm Carbonos con O-aril y N-aril
160- 180 ppm Carboxilos y carbono amina
180 -200 ppm Aldehidos y cetonal
Los distintos picos del espectro de RMN permiten conocer la distribu-

ción media de los distintos grupos funcionales con carbono que el material
posee (Fig. 5.32). Se pueden integrar los distintos picos del espectro y de esta
manera cuantificar (porcentaje respecto al total) los distintos grupos funcio-
nales del carbono. Por ello se ha generalizado la división del espectro en dis-
tintas regiones, cada una correspondiente a un grupo funcional determinado
(Tabla 5. XI)
Una de las características más importantes que se derivan del espectro de
13
C-RMN es la aromaticidad, que se puede calcular a partir del espectro de
la siguiente forma:
C aromático (106 -150) +
• -j j Cfenólico (151-170) 1AA
% aromaticidad = — 100
C aromático + C fenólico +
Califático (0-105)
En el cálculo se omite el C de los grupos CO2H por no conocer cuantos gru-

pos CO2H están unidos a estructuras aromáticas y cuantos a alifáticas.
PIRÓLISIS
La pirólisis consiste en aplicar energía térmica (400-500°C) a una muestra
produciendo rupturas de enlaces débiles en las macromoléculas, con libe-
ración de los productos característicos de sus estructuras. Es una técnica de
aplicación a la caracterización de biomateriales como las sustancias húmicas
del suelo, ceras naturales, ligninas, etc. Se utilizan dos técnicas:
1. Calentamiento casi instantáneo o pirólisis de Curie.
2. Programación a temperatura controlada.
Cuando un material dieléctrico se le aplica un campo eléctrico tiene lugar
la polarización eléctrica del material. Algunas sustancias (materiales piezo-
eléctricos) mantiene una fuerte polarización dependiendo de la temperatura,
después de eliminar el campo. Los materiales piezoeléctricos pierden su po-
larización residual cuando se calientan a la temperatura denominada punto
de Curie. Los métodos de punto de Curie son muy reproducibles y pueden
aplicarse a muestras de pequeño tamaño.
El segundo método presenta el inconveniente de que se pueden producir
reacciones secundarias con la formación de compuestos no relacionados con
el material que está siendo pirolizado.
Para poder establecer la composición de los materiales orgánicos some-
tidos a pirólisis se ha acoplado a ésta distintas técnicas o métodos de sepa-
ración e identificación como la cromatografía de gases y la espectrometría

de masas. El desarrollo de la espectroscopia de masa ha abierto nuevas po-
sibilidades a la identificación de los componentes mayoritarios de las sus-
tancias pirolizadas. La técnica permite la pirólisis de la muestra dentro del
espectrómetro de masas que da lugar a iones, lo que permite le identificación
de los componentes por espectroscopia de masas de campo de ionización de
acuerdo con su relación masa carga. El método presenta: una alta reprodu-
cibilidad, detecta especies muy polares, tiempo de análisis muy corto y es
sensible a las variaciones. Por el contrario presenta los inconvenientes de no
diferenciar entre compuestos de pesos moleculares similares, y no identifica
todos los productos de pirólisis.
La cromatografía de gases es un separador ideal por tanto el acoplamien-
to pirólisi cromatógrafo de gases y espectrómetro de masas (Py-CG-EM),
permite la degradación de la materia orgánica, separación de los componen-
tes e identificación de los mismos.
Los espectros obtenidos con esta metodología ha permitido establecer
que los ácidos húmicos contienen materiales proteináceos, ácidos n-grasos,
n-alcanos, n-alquil esteres, y bastantes fenoles y monómeros y dímeros de
lignina (Schnitzer, 1991).
ESPECTROMETRÍA DE RESONANCIA DE SPIN ELECTRÓNICO

Las sustancias húmicas son relativamente ricas en radicales libres del tipo
de semiquinonas (Senesi y Schnitzer, 1978). En las sustancias húmicas se
presentan radicales libres permanentes, que persisten durante largos perio-
dos de tiempo, y transitorios, que se generan por aumento del pH, reducción
química, y por irradiación, y tienen una vida de minutos a horas (Senesi y
Schnitzer, 1977). Este método permite detectar radicales libres. Su número
varía:
AF > AH > humina
Es probable que los radicales libres de las sustancias húmicas, jueguen
un importante papel en las reacciones de polimerización-despolimerización,
y en los efectos fisiológicos que las sustancias húmicas tienen sobre el ve-
getal (Tema 9).
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
La estructura de las SH que se ven en una microfotografía, depende de los
cationes que lo saturan. Así, en los suelos calizos el Ca compacta las SH, con
lo que en una microfotagrafía se observarían pocos espacios internos. Por el
Fig. 5.33. Composición aproximada de un AH medio (Schnitzer, 1991).
contrario, en los suelos con MO saturada de H+ se forman estructuras más

esponjosas, con gran cantidad de espacios internos.
El estudio de la composición de las sustancias húmicas del suelo por las
distintas técnicas ha permitido establecer que la aromaticidad en los ácidos
húmicos está entorno al 45 % (Fig. 5.33), la humina tiene una composición
similar a la de los ácidos húmicos y los fúlvicos son más ricos en componen-
tes alifáticos y polisacáridos pero más pobres en fenoles y ligninas.
CARACTERÍSTICAS COLOIDALES DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS

Los datos obtenidos sobre tamaño, forma y peso molecular de los materiales
húmicos (Tabla 5.XII), a partir de la presión y tensión superficial, y de la
viscosidad a distintos pH, y concentraciones del material, en un electrolito
neutro, indican que a pH 2,0, el peso molecular del AF (Mn) es cuatro veces
mayor que a pH 6,5 y 9,5. Parece que a pH 2 se combinan cuatro moléculas
para formar un agregado. El área molecular y la distancia de punta a punta
son también mayores a pH 2 que a los valores de pH más altos. Por lo que
Ghosh y Schnizer (1980) indican que los tres parámetros que controlan las
características moleculares de los AH y AF son: concentración del material
húmico, pH y fuerza iónica del medio.
Los AH y AF son coloides sin carga, rígidos a: a) altas concentraciones
de muestra (>3,5 g/L); b) pH bajo (< 3,5); y c) concentraciones de electrolito
mayores o iguales a 0,05 M. Pero tanto los AH como los AF son polielectro-
Química del suelo y medio ambiente
Tabla 5.XII
EFECTO DEL pH EN LAS CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE LOS AF (Schnitzer,
1991)
pH Mna A0b (mVmg) (R')"2c(Á)
2,0 4270 0,044 302,8
3,5 1180 0,030 233,9
6,5 1020 0,024 210,0
9,5 1080 0,026 226,6
Fig. 5.34. Configuración molecular de las macromoléculas de AF y AH a diferentes pH y

concentración de electrolito.
Utos lineales frexibles a: a) concentraciones bajas de muestra (< 3,5 g/L): b)

pH > 3,5; y c) fuerza iónica < 0,05 M (Fig. 5.34). Por tanto en la disolución
del suelo y aguas naturales, donde normalmente tanta la concentración de las
sustancias húmicas es baja y los pH mayores de 3,0, éstas están como polie-
lectrolitos lineales. Estos datos están abalados por microscopia electrónica.
ESTRUCTURA DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS

El estudio de las estructuras moleculares de las sustancias húmicas, ha sido
objeto de atención preferente para los científicos preocupados por conocer
las estructuras responsables del color, reactividad y propiedades físico-quí-

micas de las sustancias húmicas.
Aunque no podemos obtener fórmulas definidas, si es posible obtener
una estructura «típica o media», a partir de los estudios de composición ele-
mental, grupos funcionales, productos de degradación, datos espectroscópi-
cos y propiedades físico-químicas.
Las principales utilidades de los métodos estructurales son:
- Representar las propiedades medias de los ácidos húmicos y fúlvicos.
- Ayudar en la formulación de nuevas hipótesis en relación a su estructura,
y al desarrollo de nuevos esquemas experimentales de investigación.
- Ilustrar los mecanismos de enlace con los metales y compuestos xeno-
bióticos.
En la discusión de las estructuras moleculares, debemos de tener en
cuenta las siguientes consideraciones:
- Los núcleos aromáticos son importantes en la estructura molecular de las
sustancias húmicas, principalmente en los ácidos húmicos.
- Las estructuras alifáticas son más frecuentes de lo que en un principio
se creyó. En general, las sustancias húmicas acuáticas son más ricas en
estas estructuras que las del suelo.
- Los ácidos fúlvicos tienen menor peso molecular y contenido de C que
los húmicos, pero mayor contenido en oxígeno y grupos funcionales áci-
dos, especialmente -COOH.
- Otra diferencia importante es que mientras en los AF el O se incluye en
grupos funcionales periféricos (COOH, OH, C=O) en los AH se incluyen
en los componentes estructurales del núcleo (éter, esteres,...).
- Los ácidos grasos e hidrocarburos de cadena larga, no aparecen siempre.
Los primeros, a veces, aparecen como esteres con fenoles y otros com-
puestos con grupos OH. En algunos AH, los aléanos se presentan como
cadenas laterales aisladas o uniendo estructuras aromáticas.
- Las estructuras de anillos condensados aunque presentes, no son impor-
tantes en los ácidos húmicos y fúlvicos de suelos.
ESTRUCTURA PROPUESTAS PARA LOS ÁCIDOS HÚMICOS

A lo largo del tiempo se ha ido proponiendo distintas estructuras basadas en
los resultados de la investigación.
Modelo de Fuchs
Derivada de los estudios realizados con ácidos húmicos de carbones. Consiste
en un sistema de anillos condensados, con COOH y OH periféricos. Se con-
Fig. 5.35. Estructura de los AH de acuerdo con Fuchs.
tradice con la última afirmación sobre las estructuras de los anillos conden-
sados (Fig. 5.35).
Modelo de Dragunov
Los resultados obtenidos para la reactividad de los grupos funcionales y so-
bre los productos de degradación química, sugieren que el «núcleo» o co-
razón de los AH del suelo están constituidos, al menos en parte, por anillos
Fig. 5.36. Estructura de Dragunov para los AH. Muestra 1) anillos aromátics de tipo di y tri-
hidroxibencenos, parte de los cuales tienen grupos quinona, 2) el N en formas cíclicas, 3)N
en cadenas periféricas y 4) residuos carbohidatos.
Fig. 5.37. Estructura hipotética de ácidos húmicos de acuerdo con Flaig.
aromáticos del tipo di- o tri-fenoles, enlazados entre sí por puentes de -O-,
-(CH2)n-, -NH-, -N-, y otros, y que contienen grupos -COOH y OH-, así
como uniones tipo quinona. Además, en estado natural, la molécula de AH
suele contener residuos proteínicos y de carbohidratos enlazados al «núcleo»
por enlaces covalentes.
De acuerdo con estos criterios se plantea el modelo propuesto por
Dragunov (Fig. 5.36). La estructura carece de grupos -COOH unidos a ani-
llos bencénicos que expliquen como se forman los anhídridos de los ácidos
húmicos.
Modelo de Flaig (Fig. 5.37)

Este modelo es similar al anterior. Se le reprocha la falta de -COOH aromá-
ticos.
Fig. 5.38. Estructura hipotética de los AH con, grupos OH fenólicos, quinonas, nitrógeno y
oxígeno como puentes de unión, y grupos COOH en anillos aromáticos (Stevenson, 1994).
Fig. 5.39. Esquema de la célula estructural de un AH. A: núcleos: B: parte periférica. (Orlov,
1985)
Modelo de Stevenson (Fig. 5.38)

En este caso es mayor el número de grupos -COOH aromáticos, pero al
igual que los modelos anteriores, de acuerdo con los estudios de 13C-RMN,
carecen de la cantidad adecuada de compuestos alifáticos, de proteínas y de
hidratos de carbono.
Modelo de Orlov (Fig. 5.39)

Trata de resolver las carencias de los modelos anteriores, pero carece de su-
ficientes grupos -COOH y OH.
Modelo de Schulten
Schulten y Schnitzer (1993) desarrollan una estructura para ácidos húmicos,
basados en datos obtenidos por 13C-RMN, pirólisis y degradación oxidativa.
Las estructura consiste en anillos aromáticos unidos por largas cadenas alquí-
licas, formando una red flexible capaz de atrapar y enlazar otros compuestos
orgánicos. Los grupos COOH y OH son abundantes, y ocupan posiciones
tanto en anillos aromáticos como en cadenas alifáticas (Fig. 5.40).
Schulten (1996) continuó trabajando en modelos estructurales de ácidos
húmicos, utilizando el apoyo de la informática que ha permitido calcular dis-
tancias de enlaces exactas, ángulos de enlace, ángulos de torsión, distancias
no enlazadas, fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno, cargas iónicas,
etc. Todo esto se tradujo en nuevos modelos muchos más complejos como
los de las Figuras 5.41 y 5.42. en los que se muestra la conformación de un
pentadecámero de un ácido húmico. En la Figura 5.41 se dibujan la estructu-
Fig. 5.40. Estructura química para los ácidos húmicos propuesta por Schulten y Schnitzer en
1993.
ra y se puede ver la formación a partir de tres unidades pentámeras de ácido

húmico, podemos ver los huecos en el esqueleto C-C formado principalmen-
te por anillos aromáticos unidos por cadenas alifáticas de diferente longitud.
En la Figura 5.42 se representa el modelo geométricamente optimizado de
este polímero o complejo húmico, donde las bolas blancas son los átomos
de hidrógeno, las azul claro los átomos de carbono, las rojas los átomos de
oxigeno y las azules oscuras los átomos de nitrógeno. De este tipo de repre-
sentaciones podemos saber que este complejo tendría 11.370 átomos (n ~
15), la masa molecular sería de 84.607,88 g/mol, la composición elemental
QjagHs^^sO! 344 y el análisis elemental determinado 67,12% en C, 6,22%
H, 1,24% N y 25,42% O. El límite de convergencia < 4,19 KJ (0,1 nm)-1.
A la hora de tener en cuenta la estructura de las sustancias húmicas en
medio acuoso, existen puntos de vista contrapuestos, por un lado autores
como Macalady y Ranville, 1998 o Swift, 1989 consideran que el material
húmico está compuesto por polímeros al azar formados por una gran va-
riedad de monómeros biológicos. Otros autores como Wershaw (1993) o
Piccolo y Conté, (2000) proponen un comportamiento alternativo, centrado
en una estructura supramolecular donde existirían asociaciones de moléculas
Figura 5.41. Estructura química para un ácido húmico pentadecámero propuesta por
Schulten en 1996.
Figura 5.42. Estructura química tridimensional para un ácido húmico propuesta por Schulten
en 1996.
Fig. 5.43. Estructura para AF del suelo propuesta por Schnizer (1978).
relativamente pequeñas, estas asociaciones estarían estabilizadas por débiles

fuerzas hidrofóbicas.
ESTRUCTURA PROPUESTAS PARA LOS ÁCIDOS FÚLVICOS

Modelo de Schnitzer
Según esta teoría los AF son ácidos fenólicos y carboxílicos, unidos por
puentes de H para formar estructuras de alta estabilidad (Fig. 5.43).
En los huecos podrían colocarse iones metálicos complejados, o pestici-
das de bajo peso molecular (recordar que los AF son más complejantes que
los AH por poseer más grupos COOH).
Modelo de Buffle (5.44)

Consta de estructuras aromáticas y alifáticas con grupos funcionales con oxí-
geno.
Fig. 5.44. Modelo estructural de AF de acuerdo con Buffle (1977).

Fig. 5.45. Modelo de estructura media propuesta para AF.
Esta estructura está de acuerdo con los resultados de 13C-RMN, que indi-
can la preeminencia de estructuras alifáticas en ácidos fulvicos.
En base a los estudios realizados sobre AF acuáticos se ha propuesto la
estructura media de la Fig. 5.45, para estos ácidos (Stevenson, 1994). En la
que destaca la presencia de anillos condensados a los que se unen los radica-
les alquílicos. La mayor parte de los grupos -COOH se hallan incluidos en
la cadena alifática.
A la vista de las estructuras descritas podemos decir que no hay estructu-
ras muy definidas para AH y AF.
La molécula tipo de AH constaría de: un núcleo (benceno, indol, furano,
pirimidina, etc), asociado con grupos reactivos (cetonas, hidroxidos, car-
boxilos, amida, etc.). Los núcleos se unen entre sí por unidades puente (N,
O, S). Para los AF la estructura sería semejante, pero con menor proporción
de unidades aromáticas.
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5. FRACCIÓN ORGÁNICA DEL SUELO. HUMUS.

ORIGEN. COMPOSICIÓN Y DINÁMICA

Fig. 5.1. Distintas fracciones orgánicas del suelo.

Estudios realizados con 14C en residuos vegetales en suelos de zonas

no descompuestos, los productos de descomposición parcial y la bioma-

ORIGEN DE LA MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO

Fig. 5.3. Origen de la materia orgánica del suelo.

La velocidad de estas conversiones depende de:

CONTENIDO EN MATERIA ORGÁNICA DEL SUELO

FACTORES QUE REGULAN EL CONTENIDO EN MATERIA ORGÁNICA DE LOS

Fig. 5.4. Evolución de la materia orgánica del suelo con el tiempo.

- La asociación de humus, elementos metálicos y materiales de la arcilla

Por ello los suelos de pradera presentan un mayor contenido de N orgánico

Influencia de algunas prácticas agrícolas en el nivel de materia orgánica

A lo largo de los años de cultivo, en un suelo se habrán efectuado distin-

EXTRACCIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA

Se han establecido cuatro criterios generales para los extractantes:

- Autooxidaciones. Así, en condiciones alcalinas, se observa un importan-

Extracción con disoluciones salinas acuosas

Agentes quelantes orgánicos

Extracción con disolventes orgánicos

1. n-Hexano (extrae aléanos y ácidos grasos).

FRACCIONAMIENTO BASADO EN SOLUBILIDAD Y PRECIPITACIÓN

Tratamiento con ácido

. (Precipitado) (No precipitado)

Extracción con alcohol

¿Cómo se distribuyen las fracciones AH y AF? Depende en gran me-

Como se ve, resulta interesante conocer la teoría general del comporta-

Utilización de iones metálicos

Uso de disolventes orgánicos

FRACCIONAMIENTO BASADO EN TAMAÑO MOLECULAR

Fig. 5.7 Separación de partículas a través de la cromatografía de exclusión.

- Si el compuesto es de pequeño tamaño, puede penetrar en los poros del

Fig. 5.8. Fraccionamiento de ácidos fulvicos por filtración en gel.

Volumen de elución (mL)

En cualquier estudio de este tipo realizado con sustancias húmicas, es

FRACCIONAMIENTO BASADO EN CARACTERÍSTICAS DE CARGA

FRACCIONAMIENTO BASADO EN ADSORCIÓN

Fig. 5.10. Fraccionamiento basado en adsorción.

Debido a la naturaleza de los extractantes, a los ácidos fúlvicos, suelen

PROCEDIMIENTO UNIVERSAL DE EXTRACCIÓN, FRACCIONAMIENTO Y

Fig. 5.11. Procedimiento universal de extracción, fraccionamiento y purificación.

tamiento que facilita el proceso siguiente (extracción); en suelos este trata-

Fig. 5.12. Principales rutas de síntesis del humus.

BIOQUÍMICA DE FORMACIÓN DE LAS SUSTANCIAS HÚMICAS

TEORÍA DE LA LIGNINA (RUTA 4)

AH provenía de la condensación de lignina modificada con proteínas, éstas

Fig. 5.13. Representación esquemática de la teoría de la lignina en la formación del humus.

Fig. 5.14. Diferentes unidades estructurales de la lignina.

1. Obtención de las unidades de fenilpropano

2 y 3. Formación de ligninoles y lignina

Fig. 5.16. Mecanismo de radicales libres en la síntesis de la lignina.

el enlace covalente une a dos monómeros. La unión de los radicales VI y VII

Fig. 5.18. Estructura de la lignina para la especie «Spruce Picea».

Según los conceptos actuales, la lignina es una extensión de las reac-

Conversión de la lignina es sustancias húmicas

Fig. 5.19. Lignina modificada por desmetilación y oxidación de cadenas laterales.

El proceso sería una preservación selectiva de estos biopolímeros, opera-

TEORÍA DE LOS POLIFENOLES (RUTAS 3 Y 2)

Fig. 5.20. Representación esquemática de la teoría de los polifenoles en la formación del