UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

Práctica Número: 9

Diseño de Primers

Alumno: Mary Paz Guillermo Bolainas

Asignatura: Biotecnología y Bioinformática

Licenciatura: QFBT
Periodo: 2024-1
Fecha de entrega: 05 de junio del 2024
Docente: Aminta Marín Hernández.

RESUMEN

En esta práctica, se realizó el diseño de cebadores utilizando la base de datos del NCBI y las
herramientas que esta red ofrece, como "Primer-BLAST". Los pasos clave incluyeron la
búsqueda del gen de interés, en este caso, SOX9 de Gallus gallus, la obtención de su secuencia
FASTA y el diseño de cebadores específicos utilizando la herramienta mencionada. Además, se
analizaron las condiciones de la PCR para asegurar una amplificación eficiente del gen
seleccionado.

Palabras clave: NCBI, PCR, FASTA, Amplificación.

 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

INTRODUCCIÓN 5. Evitar regiones con potencial para

formar estructuras secundarias
El ADN está compuesto por una doble internas.
cadena en la que cada hebra está formada por
enlaces covalentes sucesivos entre un azúcar Existen varios programas para diseñar y
(desoxirribosa) y un fosfato. Cada azúcar en analizar un par de primers para su uso en
las dos cadenas está unido a una de las PCR, como NCBI y Primer-BLAST, que
siguientes cuatro bases nitrogenadas: adenina permiten especificar numerosas variables y
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). obtener primers de acuerdo con las
Un oligo (cebador o primer) es una secuencia indicaciones solicitadas. Estos programas
corta de nucleótidos que se hibrida con una también permiten agregar el número de
región específica del ADN objetivo, acceso de la secuencia presente en bases de
permitiendo, mediante el uso de otro oligo en datos internacionales y discriminar las
sentido contrario, la amplificación de una regiones de la secuencia que se deben incluir
zona determinada del ADN a través de la o excluir, así como el rango de tamaños del
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). producto deseado. Además, el software
permite especificar las características
El diseño preciso de los primers es crucial mínimas deseadas para los primers, como la
para la PCR. Los primers mal diseñados temperatura de fusión (Tm), el porcentaje de
pueden provocar amplificaciones GC y otros parámetros.
inespecíficas de otros fragmentos de ADN no
deseados, por lo que es esencial seguir ciertas
reglas básicas:

1. Cada primer debe tener una longitud

de 18-24 bases.
2. El contenido de G (Guanina) debe
estar entre el 40 y el 60%.
3. Los dos primers del par deben tener
una temperatura de fusión dentro de
los 5 °C de diferencia.
4. Las secuencias de los primers deben
comenzar y terminar con 1 o 2 bases
púricas.
 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA resultados precisos y reproducibles en la

amplificación del gen de interés.
La amplificación precisa de un gen de interés
mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es una técnica fundamental OBJETIVOS
en la investigación y la biología molecular.
Sin embargo, el éxito de la PCR depende en 1. Utilizar la base de datos del NCBI
gran medida del diseño de primers que se para buscar el gen específico que
unan exclusivamente al gen deseado y no a se desea amplificar.
otras regiones del genoma. 2. Determinar las condiciones
óptimas para la amplificación del
JUSTIFICACIÓN gen mediante PCR.

El diseño de primers específicos y la

optimización de las condiciones de PCR son
aspectos cruciales para la investigación
molecular y la detección precisa de genes. La
selección de primers incorrectos puede
generar resultados erróneos o no específicos.
Por lo tanto, es fundamental comprender los
principios y estrategias para diseñar primers
específicos y optimizar las condiciones de
PCR para garantizar la confiabilidad y
reproducibilidad de los resultados.

HIPÓTESIS

Al utilizar la base de datos del NCBI y

herramientas bioinformáticas adecuadas, es
posible diseñar primers específicos que se
unan de manera selectiva al gen de interés,
minimizando la unión a otras secuencias no
deseadas en el genoma. Además, al verificar
la especificidad de los primers y optimizar las
condiciones de la PCR, obtendremos
 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

METODOLOGIA el tiempo necesario para que el

sistema identificara cebadores
específicos para la plantilla de ADN
1. Se ingresó al sitio web de la NCBI.
proporcionada.
2. Selección del Gen: Se localizó la
8. Análisis de Resultados: Una vez
sección de búsqueda y se agregó el
cargada la información, se observó
gen de interés para el diseño de los
una gráfica que representaba los pares
primers.
de cebadores. En la sección inferior se
3. Obtención de la Secuencia FASTA:
listaban los cebadores más
En la página de resultados, se
importantes, identificados como
seleccionó la sección que indicaba
“forward” y “reverse”.
FASTA para visualizar la secuencia
9. Secuencias Específicas e
del gen.
Inespecíficas: Se examinaron las
4. Copia de la Secuencia: Se copió la
secuencias proporcionadas por la
secuencia completa del gen,
herramienta, distinguiendo entre
asegurándose de incluir las
secuencias específicas y no
indicaciones de los extremos 5’ y 3’
específicas para el gen de interés.
de la cadena de ADN.
10. Complementación de la Secuencia:
5. Diseño de Primers: Se utilizó la
Para obtener la secuencia
opción “Primer-BLAST”.
complementaria de los extremos 5’ o
6. Especificación del Organismo: Se
3’, se recurrió a una página web
ingresó el nombre del organismo de
especializada en invertir y/o
interés en el campo correspondiente.
complementar secuencias de ADN.
7. Generación de Primers: Se dio clic
en el botón “get primers” y se esperó
 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

RESULTADO

Imagen 1. Primers creados.

 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

ANALISIS DE RESULTADOS RECOMENDACIONES PARA EL DISEÑO

DE PRIMERS:
El análisis de cuatro pares de primers reveló
que el par de primers 3 es la opción más
1. Longitud de los Primers:
favorable debido a su equilibrio entre varios • La longitud ideal de los primers se
factores clave. Este par presenta una encuentra entre 18 y 22 nucleótidos.
diferencia de temperatura de 0.6°C entre el • Primers demasiado cortos pueden no ser
primer forward y el reverse, dentro del rango lo suficientemente específicos, mientras
aceptable para una amplificación eficiente. que primers demasiado largos pueden
Además, tiene una complementariedad en el resultar difíciles de hibridar.
extremo 3' de 0-2, lo que indica una fuerte
unión con el ADN molde y favorece la 2. Temperatura de Hibridación:
especificidad de la amplificación. No • La temperatura de hibridación (Tm)
debe ser similar para ambos primers,
presenta desajustes en el extremo 3',
idealmente entre 55°C y 65°C.
asegurando estabilidad y eficiencia. En
contraste, el par de primers 1, aunque tiene
una menor diferencia de temperatura
(0.13°C), muestra menor complementariedad
en el extremo 3', lo que podría afectar la
especificidad. El par de primers 2 se descartó
debido a desajustes en el extremo 3',
específicamente un A-T en el último
nucleótido, y la presencia de timinas
repetidas en el extremo 5' que podría generar
horquillas. Finalmente, el par de primers 4 se
descartó por su baja complementariedad en el
extremo 3' y una mayor diferencia de
temperatura entre forward y reverse.
 UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MÉXICO.

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACÉUTICO

BIOTECNÓLOGO

CONCLUSION • Smith, J. y Johnson, K. (2020). Diseño de

cebadores para PCR: estrategias y
El análisis y selección de primers es crucial consideraciones. Biotécnicas, 68(1), 45-
para el éxito de la amplificación mediante
53. doi:10.2144/btn-2020-0012
PCR, siendo el par de primers 3 la mejor
opción debido a su equilibrio en las
condiciones de temperatura,
complementariedad y ausencia de desajustes.
Este par asegura una unión eficiente y
específica con el ADN molde, mejorando la
precisión y estabilidad de la amplificación.
En contraste, los pares de primers 1, 2 y 4
fueron descartados por diversas deficiencias
que podrían afectar negativamente la
amplificación, como menor
complementariedad, desajustes en el extremo
3', y potenciales problemas de formación de
horquillas. Este análisis subraya la
importancia de considerar múltiples factores
al diseñar primers para garantizar resultados
óptimos en PCR.

REFERENCIAS

• BLAST: Basic Local Alignment Search

Tool. (s. f.).
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
• National Center for Biotechnology
Information. (s. f.).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Giorgio, E. (2019). Técnicas y Análisis
Moleculares. Revista de biología
molecular, 112(3), 205-215.
doi:10.1016/j.jmb.2019.01.011