Marisa M.

Rodríguez
Licenciada en Ciencias Biológicas
MICROBIOLOGIA I
 Bacterias
Microorganismos unicelulares
procariotas, (entre 0,5 y 5 μm) .
Diversas formas incluyendo
cocos(esferas), bacilos(barras) y
espirilos(hélices).
Pared celular →peptidoglicano.
¿Qué sucede al
observarlas
al microscopio?
 El tamaño de la mayoría de las células
DIFICULTADES bacterianas es tal que resultan difíciles
de ver con el microscopio óptico.

La principal dificultad es la falta de contraste

entre la célula y el medio que la rodea, y el
CAUSA
medio más simple de aumentar el contraste
es la utilización de colorantes.

Estos pueden emplearse para distinguir entre

SOLUCION tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
Morfologia
El prisma hace que la imagen se forme en
el tubo del microscopio, haciendo la visión
más cómoda. La lente ocular vuelve a
aumentar la imagen y la enfoca en el ojo.

La luz transmitida penetra en la lente

objetivo, que aumenta la imagen

El condensador enfoca el haz de luz

sobre el espécimen, donde parte se
absorbe, parte se refracta, y parte se
transmite

La fuente de luz está en la base.

Tabla 3.1. Aumento
Total
Lente
Microscopio Lente ocular Ampliación total
objetivo
Microscopios ópticos
Debil seco 10x x 10x = l00x
Fuerte seco 40x x 10x = 400x
Aceite de inmersión 100x x 10x = 1000x
 Preparaciones en fresco
La forma más simple de preparar un espécimen para
su examen microscópico es hacer una preparación
en fresco.
Existen dos técnicas, una preparación en fresco
simple, una preparación en gota pendiente .
“Entre porta y cubre"
Colocar una gota de líquido con los
microorganismos sobre un
portaobjetos y a continuación
cubrirla con un cubreobjetos.
Una preparación en gota pendiente
colocando una gota del material en
un cubreobjetos y cubriéndolo con
un portaobjetos (invertido) con una
excavación central (portaobjetos
excavado).
Hay que sellar la preparación con
vaselina alrededor de la excavación
 La ventaja de esta última técnica, es que la
preparación no se seca y puede ser observada
durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para

observar microorganismos vivos.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en

fresco es que no permite aumentar el contraste de
la preparación
 ¿Qué son los colorantes?

Casi todos los colorantes son sales,

compuestos formados por iones
cargados.
Los colorantes son compuestos
orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares.
 TIPOS de COLORANTES
Catiónicos: se combinan con los constituyentes celulares
cargados celulares cargados negativamente tales como
como ácidos nucléicos, polisacáridos ácidos y superficies
celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta,
Safranina, rojo congo.
Aniónicos: se combinan con los constituyentes celulares
cargados celulares cargados positivamente
positivamente, tales como tales como numerosas
proteínas. Ejemplos: Eosina, Fucsina acida y Rojo congo.

Liposolubles: se combinan con las sustancias

grasas,material lipídico de la célula. Ejemplos: Sudan
negro.
MORDIENTE

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de

que la célula haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante por sí mismo.
Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el ácido tánìco.
El mordiente se combina con un constituyente
celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá
atacar el colorante.
 Simples uso de un
TINCIONES solo colorante. Sirven
para distinguir formas
Positivas: Colorantes que tiñen al
Diferenciales: uso de un
microorganismo y no al medio.
colorante inicial y luego
un colorante de
contraste. Sirven para
Negativas: Colorantes que no diferenciar distintos
tienen afinidad por los
componentes celulares (Ejemplo: tipos de células
nigrosina). Tiñen al medio y no a (Ejemplo: tinción Gram
las bacterias, sirven para ver
células con cápsulas de
mucopolisacáridos.
Tinción simple con azul
de metileno
Bacillus anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo) )
 Tinción de Gram
Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1938) fue un
bacteriólogo danés que desarrolló la tinción de
Gram, de amplio uso en microbiología.
Gram siguió el método de Paul Ehrlich, utilizando
una solución de anilina y violeta de genciana.
Después un tratamiento con lugol (iodo en yoduro
potásico acuoso) y etanol observó que algunas
bacterias retenían el colorante (por ejemplo los
neumococos) mientras que otras no lo hacían. Esto
permitió dividir las bacterias en Gram+ y en Gram-.
Hucker en 1921→ mejora el proceso tradicional
hallando la manera de que los reactivos fueran más
estables y mejorando la calidad diferenciadora del
proceso.
Kopeloff en 1923 →otra modificación d por que
permitía teñir de forma más eficiente aquellas
bacterias de difícil tinción, sobre todo las
anaerobias.
Pero la explicación de porqué se teñían de forma
diferente tuvo que esperar hasta 1974 cuando
Gregersen estableció que las diferencias entre las
GRAM+ y las GRAM- eran debidas a la diferente
composición de la pared celular.
 Pasos para teñir bacterias con la
tinción de GRAM:
Preparación de frotis

SF

portaobjetos de vidrio limpio, Emulsionar

desengrasado y seco,
 Fijación:
Fijar el material en el portaobjeto pasándolo 3 o 4 veces a
través de la llama de un mechero, de modo que el material no
sea lavado durante el procedimiento de tinción.
 Colocar el frotis sobre un soporte para tinción y se cubrir
la superficie con solución de cristal violeta. Después de un
minuto de exposición al cristal violeta, lavar totalmente la
superficie del portaobjetos con agua destilada, vertida en
forma suave.
1´de
exposición
al cristal
violeta
 Cubrir el frotis con solución de yodo (lugol)
durante un minuto. Lavar nuevamente con agua.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las
células bacterianas (tanto gram positivas como gram
negativas) a través de la pared bacteriana

El lugol es un compuesto formado por I2 /KI y Siulterio,

los cuales están presente para solubilizar el yodo, y
actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se
fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta..
Sostener el frotis entre los dedos pulgar e índice y
se cubre la superficie con unas gotas de
decolorante de alcohol y acetona hasta que no se
desprenda más color violeta. Habitualmente esto
tarda 10 segundos más o menos.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para
realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el
complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos
no se decoloran, mientras que los gram negativos sí lo
hacen.

Para poner de manifiesto las células gram negativas se

utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células gram
negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.
Lavar con agua corriente y se coloca otra vez el
preparado sobre el soporte para tinción. Cubrir la
superficie con la safranina durante un minuto. Se
lava con agua corriente, vertida en forma suave.
Dejar secar al aire en posición vertical.
 ¿Cuáles son las fuentes de errores
más comunes en la tinción de Gram?
Tiempo de tinción y decoloración
Errores técnicos incorrectos.
del operador
→Mala fijación del preparado.

Concentración inadecuada de
La calidad de los los colorantes y decolorantes.
reactivos pH incorreto en los colorantes
y decolorantes

Calidad de las Repiques de 24 horas de

muestras antigüedad, y puros.
Streptococcus sp.
 Micrococcus sp

Clostridium sp
Bacilo Gram +
 Neisseria
Coco Gram -

Acinetobacter sp
Coco bacilo Gram +
 Escherichia coli
Bacilo Gram -

Vibrio sp
Gram -
 Coloración de Ziehl-Neelsen.
Tinción diferencial rápida y económica, usada
para la identificación de microorganismos
patógenos, como M. tuberculosis o el género
Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.
Se utiliza para colorear a las bacterias llamadas
ácido-alcohol resistentes, ya que por la
naturaleza química de su pared necesitan de
calor o detergentes para que el primer colorante
penetre, como así también resisten la
decoloración con solventes orgánicos fuertes.
Las paredes celulares contienen ácidos grasos (ácidos micólicos)
de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) les confieren la
propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después
de la tinción con colorantes básicos.
Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se
caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.
 Coloración de Ziehl-Neelsen
Extender y diseminar el material a estudiar ,
utilizando ansa, sobre la superficie de
portaobjetos delgados y nuevos, desengrasados.
Una vez secados y fijados al calor, cubrirlos con la
solución colorante de Ziehl (fucsina fenicada) y
calentar hasta emisión de vapores, durante 3
minutos.
Lavar con agua.
Decolorar con alcohol ácido.
Lavar con agua.
Cubrir el extendido con la solución de azul de metileno. Dejar en
contacto durante 3 minutos.
Lavar con agua.
Observar con objetivo de inmersión
 Tinciones Negativas:
Colorantes que no tienen afinidad por los componentes
celulares (Ejemplo: nigrosina).

Tiñen al medio y no a las bacterias, sirven para ver

células con cápsulas de mucopolisacáridos.

Método para aumentar el contraste de las células en

microscopia optica.

Su máxima utilidad está en revelar la presencia de

cápsulas alrededor de las células bacterianas
TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)
Algunos géneros bacterianos, producen en su
interior formas de resistencia denominadas
endosporas(Clostridium y Bacillus).

Se producen cuando las condiciones ambientales

son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos
tóxicos, etc.) formándose una espora por cada
forma vegetativa.
Al finalizar el proceso de esporogénesis, la
célula vegetativa se lisa y libera la espora al
exterior.
Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma
vegetativa.
La capacidad de germinar perdura durante
años.
Algunas de las bacterias productoras de
endosporas son patógenas para el hombre,
por lo que su estudio y observación son de
enorme interés.
 FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas
que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos(en el microscopio óptico
como estructuras refringentes y de difícil tinción).
La tinción específica de esporas requiere dos
colorantes:
1.Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en
caliente.
2.Safranina: colorante de contraste que tiñe las
formas vegetativas.
 Las endosporas, no perderán el
colorante en el lavado conH2O, y sí lo
harán las formas vegetativas,
(quedarán teñidas con el 2do
colorante)