“ENFERMEDAD DE CHAGAS-MAZZA:

TRATAMIENTO CON CLOMIPRAMINA EN

LA FASE CRÓNICA Y SU EVALUACIÓN
CON MÉTODOS NO CONVENCIONALES”

TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LA

SALUD

BIÓLOGA PAOLA CAROLINA BAZÁN

Facultad de Ciencias Médicas,

Universidad Nacional de Córdoba.

Córdoba, Argentina

2014
COMISIÓN DE TESIS

Director:

Prof. Dr. Walter Rivarola

Co-Director:

Prof. Dr. Rafael Gallerano

Comisión Asesora:

Prof. Dra. Adela Sembaj

Prof. Dr. Raúl Breglia

(R. D. 2634 )
CERTIFICO que el presente trabajo de Tesis de la Bióloga Paola Carolina Bazán, fue

realizado en la Cátedra de Física Biomédica de la Facultad de Ciencias Médicas,

Universidad Nacional de Córdoba.----------------------------------------------------------------

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Córdoba, Noviembre de 2014.

DEDICATORIA

A Luisa, Antonio, Nena y Pablo

 AGRADECIMIENTOS

A mi director de Tesis, Prof. Dr. Walter Rivarola, guía de este trabajo, cuyo constante

asesoramiento, apoyo, dedicación y amistad fueron de imponderable valor en la

realización de la presente tesis.

A la Prof. Dra. Patricia Adriana Paglini, quien me acompañó durante esta tesis,

brindándome no solo los conocimientos académicos, sino también el ejemplo de

constancia, sacrificio, perseverancia y dedicación al trabajo.

A los Señores Miembros de la Comisión Asesora, quienes me guiaron brindándome sus

conocimientos del tema, aportando ideas y sentido crítico, además de su apoyo

desinteresado para finalizar con éxito este trabajo.

A la Dra. Silvina Lo Presti, querida amiga, por su ayuda incondicional, su constante

apoyo y por ayudarme siempre; gracias por tanto.

A la Bióloga Mariana Strauss y la Dra. Alejandra Báez, por su amistad, y por hacer más

fácil el desarrollo de esta tesis brindándome un hermoso lugar de trabajo.

A la Méd. Noemí Miler, por compartir esta importante etapa de mi vida, haciéndola más

cálida y divertida.

A mis compañeros de laboratorio y amigos: Dra. María del Carmen Baez, Dra. Mariana

Tarán, Méd. Romina Blasco, Biól. Molec. Blanca Esteves, Biól. Daniela Velazquez, Dr.

Gustavo Mentesana, Méd. Ariel Balceda, a los tesinistas: Malena, Diego, Mariana y

Antonella, por todos los momentos compartidos y la alegría de estar trabajando juntos…

A las Dras. Vilma Campana y Mónica Moya, por su compañía en estos años,

brindándome su amistad, valores humanos y buenos consejos.

A mi Mamá por acompañarme y apoyarme en los diferentes aspectos de la vida,

brindándome confianza y su gran amor.

A Pablo, por su incondicional apoyo, por su amor, paciencia y por compartir esta y otras

etapas importantes de mi vida, estando siempre a mi lado y haciéndome muy feliz.

A mi Papá y abuela, por ser mi ejemplo a seguir y orgullo.

A mis amigas de la vida, por todos los momentos compartidos y la alegría que me brindan.

A todos aquellos que de alguna manera hayan colaborado para hacer posible este

trabajo…

… a todos ustedes MUCHAS GRACIAS!!

“LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS NO SE HACE SOLIDARIA CON

LAS OPINIONES DE ESTA TESIS”

(Art. 43 Del Reglamento para la carrera de doctorado en Ciencias de la Salud)

El presente trabajo fue realizado en el Instituto de Fisiología, Facultad de Ciencias

Médicas, Universidad Nacional de Córdoba, con fondos de:

Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCYT). Agencia Nacional

de Promoción Científica y Tecnológica.

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).

ÍNDICE

RESUMEN-----------------------------------------------------------------------------------------1-

ABSTRACT----------------------------------------------------------------------------------------5-

INTRODUCCIÓN---------------------------------------------------------------------------------9-

OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------------------32-

MATERIALES Y MÉTODOS-----------------------------------------------------------------33-

RESULTADOS----------------------------------------------------------------------------------40-

DISCUSIÓN--------------------------------------------------------------------------------------88-

CONCLUSIÓN-----------------------------------------------------------------------------------98-

BIBLIOGRAFÍA---------------------------------------------------------------------------------99-
RE S U M E N

La enfermedad causada por el Trypanosoma cruzi, a pesar de haber sido descubierta

hace más de 100 años por Carlos Chagas sigue siendo uno de los mayores problemas de
salud pública en Latino América. Esta enfermedad cursa con manifestaciones clínicas
variables que incluyen una etapa aguda y otra crónica, con y sin patología demostrada.
La cardiopatía chagásica es en nuestro medio la más frecuente y severa consecuencia
clínica de la infección causada por el T. cruzi. La presencia del parásito desencadenaría
un proceso inflamatorio y autoinmunitario de daño, que culminaría con focos de fibrosis
de acumulación progresiva. nifurtimox y benznidazol se emplean para tratar la
enfermedad de Chagas, ambas drogas tienen acción tripanocida, pero producen
múltiples efectos adversos lo que lleva a muchos pacientes a abandonar el tratamiento.
Por otra parte su eficacia depende de la susceptibilidad de la cepa de T. cruzi, ya que
han sido descriptas cepas resistentes. Nuevos enfoques para el tratamiento especifico
han provisto las bases para identificar nuevos blancos moleculares, a partir de los cuales
pueden desarrollarse drogas tripanocidas más específicas y más efectivas. Entre ellos la
enzima tripanotiona reductasa (TR) cumple una función vital en el T. cruzi. Los
psicofármacos tricíclicos, como las fenotiazinas, y los antidepresivos clásicos, como
imipramina, amitriptilina y derivados, son inhibidores de la TR; hemos demostrado en
nuestro laboratorio utilizando modelos experimentales, que drogas tricíclicas como la
clomipramina, tienen efecto en impedir la evolución de la infección por T. cruzi hacia el
estadio crónico. La relevancia del tratamiento antiparasitario en el manejo de la
enfermedad de Chagas ha sido motivo de numerosas controversias. Recientes estudios
sobre la patogénesis de ésta dolencia han llevado a un consenso en el que la eliminación
del agente etiológico, T. cruzi, en las personas infectadas, sería un requisito necesario y
suficiente para frenar la evolución de la enfermedad y evitar sus consecuencias a largo
plazo. Existen numerosos trabajos, donde los pacientes tratados en la fase crónica de la
enfermedad mostraron menor número de cambios electrocardiográficos y un menor
deterioro de la condición clínica, disminución de los títulos de anticuerpos y de la carga
parasitaria que los pacientes no tratados. La caracterización de la eficacia del
tratamiento antiparasitario específico en pacientes adultos en fase crónica por T. cruzi
no está del todo definida actualmente. Esto es debido a que la serología convencional
permanece reactiva en la gran mayoría de los pacientes, aún muchos años después de
finalizado el tratamiento tripanocida, sumado a que los métodos parasitológicos

1
tradicionales (xenodiagnóstico, hemocultivo) tienen escasa sensibilidad en esta etapa de
la infección. Además, la evolución clínica de la enfermedad es de lenta progresión y un
elevado porcentaje de pacientes infectados permanece aún sin tratamiento. Para evaluar
la respuesta a la quimioterapia específica, se recomienda utilizar la combinación
diagnóstica: inmunoserológica y parasitológica. Otras investigaciones, al analizar la
reactividad de muestras de suero de ratones infectados contra proteínas recombinantes
de T. cruzi, observaron que los antígenos más fuertemente reconocidos fueron 1, 2, 13,
30, 36 y SAPA. En pacientes chagásicos crónicos post tratamiento, el antígeno
recombinante 13 fue el más sensible a la eficacia del mismo, presentando una temprana
disminución y negativización.
Con respecto al diagnóstico parasitológico, en pacientes crónicos la única forma de
detección del T. cruzi es a través de la técnica de PCR convencional (cualitativa) y PCR
en tiempo real (cuantitativa). La PCR es útil para el control de tratamientos ya que se
utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez
iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo importante para ello disponer de
métodos cuantitativos; la técnica de PCR en tiempo real permite esta cuantificación.
Por ello el objetivo de la presente tesis fue evaluar con métodos no convencionales,
ELISA con antígenos individuales y PCR en tiempo real, el tratamiento con
clomipramina en la etapa crónica cardíaca de la enfermedad de Chagas experimental, en
ratones infectados con diferentes cepas de T. cruzi.
Se utilizaron ratones Albinos Suizos adultos con un peso promedio 30±1 g que fueron
divididos en los siguientes grupos: No infectados, sin tratamiento (n=10), No
infectados y tratados con clomipramina 5 mg/kg/día (n=10). Infectados: ratones
infectados con la cepa Tulahuen o con el aislamiento SGO Z12 (n = 90 para cada
cepa/aislamiento) y que, luego de realizarles el estudio electrocardiográfico, se
clasificaron en: sin alteraciones electrocardiográficas y con alteraciones (SA)
electrocardiográficas (CA); estos últimos a su vez fueron divididos en: No tratados
(NT) y Tratados (T) con clomipramina 5 mg/Kg/día. El tratamiento consistió en una
dosis diaria durante 60 días. Los ratones que ingresaron al grupo T fueron definidos
como crónicos con patología demostrada, en función de la presencia de alteraciones
electrocardiográficas (ECG): a los 90, 180, 270 y 360 días post infección. La evolución
de la infección experimental en los diferentes diseños se llevó a cabo a través del
seguimiento de la parasitemia, sobrevida, electrocardiografía, histopatología, PCR
convencional, PCR en tiempo real y serología (ELISA).

2
Los resultados muestran que la PCR en tiempo real resultó más sensible a la presencia
del parásito, ya que el grupo infectado con el aislamiento SGO Z12 y NT, que resultó
negativo para la presencia de T. cruzi por PCR convencional a los 90 d.p.i, fue positivo
por la PCR en tiempo real. Además, en ratones infectados con la cepa Tulahuen y T a
los 90 y 180 d.p.i. se observó una disminución de la cantidad relativa del producto
amplificado, al año de infección. Sin embargo, a los 270 días se observó que la cantidad
relativa del producto amplificado detectada fue mayor en aquellos animales T a los 90
d.p.i., comparado con los valores encontrados antes de comenzar el tratamiento. Por el
contrario, en los tratamientos realizados a los 90 y 180 d.p.i. vemos un aumento de la
cantidad relativa del producto amplificado en los grupos infectados con el aislamiento
SGO Z12 y T con clomipramina. El grupo más sensible al tratamiento resultó así ser el
infectado con la cepa Tulahuen, ya que los animales que fueron T a los 90 d.p.i,
disminuyeron la cantidad relativa del producto amplificado en un 40% al año de
infección; en los ratones NT por el contrario, aumentó un 225%. En cuanto a los
estudios serológicos, los antígenos totales permanecieron elevados a lo largo de la
evolución de la infección (360 d.p.i). Los antígenos 1 y 13 del grupo de ratones
infectados con la cepa Tulahuen y T a los 90 d.p.i presentaron una disminución
significativa con respecto a los no tratados. Por otro lado en los T a los 180 d.p.i. los
antígenos 1, 13, 36 y SAPA disminuyeron significativamente a los 360 d.p.i. Desde el
punto de vista serológico, el aislamiento SGO Z12 mostró ser más sensible al
tratamiento, ya que los animales T a los 90 y 180 d.p.i. presentaron una significativa
disminución en los títulos para la mayoría de los antígenos analizados (2, 13, 30 y
SAPA). En nuestro modelo experimental se observó que tanto en los ratones infectados
con la cepa Tulahuen como con el aislamiento SGO Z12, el porcentaje de ratones con
alteraciones electrocardiográficas aumentó a medida que progresa la infección. Se pudo
observar además que el porcentaje de ratones con alteraciones era el doble en los
infectados con SGO Z12 (100%) que en los infectados con Tulahuen (50%) a los 360
d.p.i. Aquellos animales tratados a los 90 d.p.i. presentaron una disminución progresiva
de las alteraciones ECG, hasta que al año de infección no se observaron ratones con
alteraciones ECG.
Similar comportamiento presentaron entre si los ratones infectados con el aislamiento
SGO Z12 y con cepa Tulahuen y T a los 180 d.p.i., en los que el 50% de los mismos
poseían alteraciones a los 360 d.p.i. Los efectos beneficiosos (prevención y regresión)
de los fármacos sobre la evolución del trazado electrocardiográfico, parecen también ser

3
independientes de la condición parasitológica: en el grupo infectado con el aislamiento
SGO Z12 y T con clomipramina a los 90 d.p.i. que no presentó alteraciones ECG al año
de infección, se detectó un nivel de parasitemia cuatro veces mayor que al inicio del
tratamiento. Los estudios histopatológicos demostraron en todos los grupos una mayor
cantidad de infiltrados inflamatorios en músculo esquelético que en músculo cardíaco.
Por otra parte se observaron diferencias entre el grupo infectado con SGO Z12 y el
grupo infectado con Tulahuen, en relación a los procesos inflamatorios y de fibrosis, ya
que el grupo infectado con la cepa Tulahuen presentó una mayor cantidad de áreas con
fibrosis, tanto en músculo cardíaco como en músculo esquelético. En los ratones
infectados con SGO Z12, no encontramos diferencias significativas (P>0.05) con
respecto al porcentaje de infiltrados inflamatorios entre T y NT a los 360 d.p.i. en
músculo cardíaco; sin embargo, los T a los 180 d.p.i presentaron menor porcentaje de
fibrosis en el corazón que los NT. Por el contrario, en los animales infectados con
Tulahuen, los T presentaron un menor porcentaje de infiltrados inflamatorios en
músculo cardíaco que en los NT a los 360 d.p.i., y se observó en los T a los 180 d.p.i.
una significativa reducción de la fibrosis cardíaca con respecto a los NT. Todos los
animales tratados, presentaron una sobrevida mayor a los NT, llegando a un 100 % de
sobrevida de los ratones infectados con SGO Z12 y T, frente a un 20% en los ratones
NT. La relevancia del tratamiento antiparasitario específico en la enfermedad de Chagas
fue objeto de un intenso debate por muchos años, en particular para la fase crónica de la
enfermedad. Ahora, se está llegando a un consenso en que se requiere la eliminación del
T. cruzi en los individuos infectados, para prevenir el desarrollo de las lesiones que son
características de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, en la actualidad la
quimioterapia disponible, sobre la base de nifurtimox o benznidazol, es insatisfactoria
debido a la eficacia limitada en la fase crónica de la enfermedad y debido a los efectos
secundarios tóxicos frecuentes. Además se necesitan de nuevos métodos para evaluar la
efectividad del tratamiento en la etapa crónica; el fármaco utilizado debe ser también
seguro y efectivo frente a la variabilidad que presenta el T. cruzi. La presente tesis
pretende ser un aporte en ese sentido.

4
AB S T R A CT

The disease caused by Trypanosoma cruzi, despite having been discovered over 100
years ago by Carlos Chagas, it remains as the largest public health problem in Latin
America. This disease presents with variable clinical manifestations including an acute
and a chronic phase, with or without established pathology. Chagas myocardiopathy is
the most common and serious clinical consequence of infection with T. cruzi. The
presence of the parasite triggers an inflammatory and autoimmune damaging process,
which culminates in fibrosis foci. Nifurtimox and benznidazole are used to this
infection; both drugs have trypanocidal action but produce multiple adverse effects,
leading many patients to discontinue the treatment. Their effectiveness depends on the
susceptibility of the strain of T. cruzi, as resistant strains have been described. New
approaches have provided the basis for identifying new molecular targets for treatment,
from which more specific and more effective trypanocidal drugs may be developed.
Among these, trypanothione reductase (TR) is an enzyme that plays a vital role in T.
cruzi. Tricyclic psychotropic drugs, such as phenothiazines, and classical
antidepressants, such as imipramine, amitriptyline and derivatives are inhibitors of the
TR; in our laboratory, using experimental models we have shown that tricyclic drugs,
such as clomipramine, are effective in preventing the progress of T. cruzi infection to
the chronic stage. The significance of antiparasitic treatments in the management of
Chagas disease has been the subject of much controversy. Recent studies on the
pathogenesis of this infection have led to a consensus that the removal of the etiologic
agent in the infected people would be a necessary and sufficient requirement to slow the
progression of the disease and prevent its long term consequences. Several studies had
shown that patients treated in the chronic phase of the disease had fewer
electrocardiographic changes and less deterioration of the clinical condition, with
decreased antibody titters and reduced parasite load than the untreated patients.
However, the effectiveness of specific antiparasitic treatment in adult patients
undergoing the chronic phase of T. cruzi infection is currently not fully established. This
is because conventional serology remains reactive in the majority of patients, even
many years after the end of trypanocidal therapy; moreover, traditional parasitological
methods (xenodiagnosis, blood culture) have low sensitivity at this stage of infection.
The clinical course of the disease is slowly progressive and a high percentage of the

5
infected patients still remain untreated. To assess the response to a specific
chemotherapy, a combined immunoserological and parasitological diagnosis is
recommended. Other researchers, analysing the reactivity of sera from mice infected
with T. cruzi recombinant proteins, observed that the most strongly recognized antigens
were 1, 2, 13, 30, 36 and SAPA. In post treatment chagasic patients, the recombinant
antigen 13 was the most sensitive to treatment effectiveness, presenting an early decline
and negative cultures.
With respect to parasitic diagnosis, the only way to detect T. cruzi in chronic patients is
through the conventional PCR (qualitative) and real-time PCR (quantitative). PCR is
used both for the selection of the patients to be treated and to test treatment
effectiveness; for this, it is important to have quantitative methods: the technique of
real-time PCR allows parasite quantification after specific chemotherapy.
Therefore, the purpose of this work was to evaluate, using unconventional methods
(single ELISA antigens and real-time PCR), clomipramine therapy in the chronic
cardiac stage of experimental Chagas disease, in mice infected with different T. cruzi
strains.
Adult Swiss albino mice (average weight 30±1 g) were divided into the following
groups: not infected and not treated (n=10); not infected and treated with clomipramine
5 mg/kg/day (n=10). Infected: mice infected with the Tulahuen strain or SGO Z12
isolate (n=90 for each strain/isolation) which then, after the electrocardiographic (ECG)
study, were classified into: without (SA) or with ECG alterations (CA); the latter in turn
were divided into: not treated (NT) and treated (T) with clomipramine 5 mg/kg/day. The
treatment consisted of a daily dose for 60 days. The mice which entered the T group
were classified as chronic with established pathology depending on the presence of
ECG abnormalities on days 90, 180, 270 and 360 post infection (p.i.). The study of the
evolution of the infection in the different experimental designs was carried out by
monitoring parasitaemia, survival, electrocardiography, histopathology, conventional
PCR, real time PCR and serology (ELISA).
Results show that real-time PCR resulted more sensitive to the parasite, since the group
infected with the SGO Z12 isolate and NT, which tested negative for the presence of T.
cruzi by conventional PCR on day 90 p.i., was positive using real-time PCR.
Furthermore, a decrease in the relative amount of amplified product a year after the
infection was observed in mice infected with the Tulahuen strain and T on days 90 and
180 p.i. However, the relative amount of amplified product detected on day 270 was

6
higher in the treated animals (treatment at day 90 p.i.), compared to the values found
before the treatment. By contrast, in treatments performed on days 90 and 180 p.i. on
the groups infected with the SGO Z12 isolate, we observed an increase in the relative
amount of amplified product. Thus, the group most sensitive to treatment was the
infected with the Tulahuen strain, since in the animals treated on day 90 p.i., the relative
amount of amplified product decreased 40% a year after the infection; in the NT
animals by contrast, increased 225%. Regarding the serological studies, the total
antigens fraction remained elevated throughout the course of the infection (360 days
p.i.). Antigens 1 and 13 in the mice infected with the Tulahuen strain and treated on day
90 p.i. showed a significant decrease compared to NT. Furthermore in T (180 days p.i.),
antigens 1, 13, 36 and SAPA decreased significantly by day 360 p.i. From the
serologically point of view, SGO Z12 isolate showed to be more sensitive to treatment,
since the animals treated on days 90 and 180 p.i. had a significant decrease in the titres
for most of the antigens tested (2, 13, 30 and SAPA). In our experimental model, we
observed that in animals infected with either the Tulahuen strain or the SGO Z12
isolate, the percentage of mice with ECG abnormalities increased as the infection
progresses. It was also observed that the percentage of mice with ECG alterations was
twice in SGO Z12 infected (100%) than in those infected with Tulahuen (50%) by day
360 p.i. Those animals treated on day 90 p.i. presented a progressive decrease in the
ECG alterations until the year of infection, when no mice with ECG alterations were
observed.
Similar behavior was observed between mice infected either with the SGO Z12 isolate
or the Tulahuen strain and were treated on day 180 p.i, in which 50% of them had
alterations by day 360 p.i. The beneficial effects (prevention and regression) of drugs
upon the evolution of the electrocardiographic tracings also appear to be independent of
the parasitological status: in the SGO Z12 group treated on day 90 p.i., which did not
present ECG alterations a year after the infection, parasitemia levels were four times
higher than at the beginning of the treatment. Histopathological studies in all groups
showed a greater number of inflammatory infiltrates in skeletal muscle than in cardiac
tissue. Furthermore, differences between the SGO Z12 and Tulahuen groups were
observed in relation to the inflammatory and fibrotic processes, as the Tulahuen strain
infected group had a larger amount of fibrotic areas, both in cardiac and skeletal
muscles. In SGO Z12 infected mice, we found no significant differences (P> 0.05) in
the percentage of inflammatory infiltrates in cardiac muscle between T and NT by day

7
360 p.i.; however, the group treated on day 180 p.i. showed a lower percentage of
fibrosis in the heart than the NT group. By contrast, in the animals infected with
Tulahuen, T showed a lower percentage of cardiac muscle inflammatory infiltrates than
NT by day 360 p.i.; a significant reduction in cardiac fibrosis was also observed with
the treatment on day 180 p.i. All treated animals had a higher survival than the NT ones,
with a 100% of survival in those infected with SGO Z12 and treated, versus 20% in the
NT mice.
The relevance of specific antiparasitic treatment in Chagas disease was the subject of
intense debate for many years, particularly in the chronic phase of the disease. Now, it is
coming to a consensus that the elimination of T. cruzi in infected individuals is required
to prevent the development of the lesions that are characteristic of Chagas disease.
However, currently available chemotherapy, based on nifurtimox and benznidazole, is
unsatisfactory due to the limited efficiency when used in the chronic phase of the
disease and due to the frequent toxic side effects. Furthermore, new methods are needed
to evaluate the effectiveness of the treatment in chronic phase; the drugs used should
also be safe and effective taking into considaration the variability presented by T. cruzi.
This thesis aims to contribute in this regard.

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INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas, también llamada tripanosomiasis americana, es una

enfermedad potencialmente mortal causada por el parásito protozoo Trypanosoma cruzi.
Se calcula que en el mundo hay entre 7 y 8 millones de personas infectadas por T. cruzi,
la mayoría de ellas en América Latina. Inicialmente, la enfermedad de Chagas estaba
confinada a la Región de Centro y Sudamérica, pero en la actualidad, debido a las
migraciones, se ha propagado a otros continentes (WHO, 2014).
Se trata de una patología producto de un intrincado problema económico, ecológico y
político-social, que ha sido considerada como una enfermedad socioeconómica típica,
inseparable de la pobreza y el subdesarrollo, por su vinculación entre la proliferación de
los insectos vectores y las viviendas precarias donde se pueden alimentar y multiplicar
(Catalá et al, 2004).
Se presenta en regiones donde coexiste con otras patologías que son más aparentes y
menos silenciosas, razón por la cual frecuentemente pasa desapercibida como un
problema de salud. Esta enfermedad está asociada a las malas condiciones de vivienda
de las áreas rurales de todo el continente latinoamericano y a los cinturones de pobreza
alrededor de las grandes ciudades, donde las personas infectadas que migran buscando
mejores oportunidades de trabajo no tienen posibilidad de acceder a una atención
médica adecuada (WHO, 2007).
La tripanosomiasis americana, cumplió en 2009 un siglo desde que Carlos Chagas
anunciara el descubrimiento del T. cruzi, el insecto vector (conocido comúnmente como
vinchuca en Argentina) y un conjunto de síntomas clínicos característicos, en el Brasil
de principios de siglo XX donde el control de las enfermedades infecciosas parecía un
boleto seguro al orden y el progreso (Kropf, 2009; Delaporte, 1999).
Desde 1990, una serie de iniciativas internacionales basadas en el control de vectores, el
control sistemático de los donantes de sangre en todos los países endémicos, y la
detección y el tratamiento de la transmisión congénita se han puesto en marcha para el
control y eliminación de la enfermedad de Chagas. Estas estrategias han conducido a
una reducción significativa en el número de personas infectadas en todo el mundo
(WHO, 2007; Coura y Dias, 2009).

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Etiología

El agente etiológico de esta enfermedad es el Trypanosoma cruzi, protozoo flagelado

perteneciente a la familia Trypanosomatidae. Esta familia pertenece al super-reino
Eukaryota, Philum Euglenozoa, Orden Kinetoplastida. Todos los miembros de este
orden están caracterizados por la presencia de un orgánulo que los define, llamado
Kinetoplasto (McGhee y Cosgrove, 1980). Entre los miembros de este orden se
reconocen varios géneros que incluyen tripanosomas de vida libre (Proleptomonas),
parásitos de invertebrados solamente (Crithidia y Leptomonas, entre otros), parásitos de
plantas e invertebrados (Phytomonas), y parásitos de vertebrados e invertebrados (como
Trypanosoma y Leishmania). Dentro del género Trypanosoma encontramos especies
representativas de importancia médica como son T. cruzi y T. brucei. T. cruzi es un
parásito intracelular de vertebrados que en el ser humano produce la enfermedad de
Chagas, mientras que las subespecies T. brucei gambiense o T. brucei rhodesiense viven
y se replican en el torrente sanguíneo de sus huéspedes, ocasionando la enfermedad del
sueño. La subespecie T. brucei brucei produce una enfermedad en el ganado, pero no es
patógena para el hombre. Como T. cruzi se encuentra exclusivamente en América, y T.
brucei en África, también es frecuente referirse a estas especies como tripanosomas
americanos y africanos respectivamente (Trujillo et al, 2004).
El T. cruzi está muy adaptado a la forma de vida parasitaria, por lo que es capaz de
colonizar casi todos los tejidos de los cientos de especies de mamíferos que pueden ser
sus hospedadoras (Figura 1).

Figura 1: Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de

Chagas, entrando en los tejidos del huésped.
(Obtenido de http://www.ioc.fiocruz.br/pages/informerede/corpo/noticia/2006/marco/02_03_06_01.htm)

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Formas celulares y ciclo de vida del Trypanosoma cruzi

El principal mecanismo de transmisión de la enfermedad de Chagas es el vectorial (por

hemípteros redúvidos de la subfamilia Triatominae). Estos insectos, de hábito
hematófago, están ampliamente distribuidos en América. En nuestro país el más
importante es el Triatoma infestans (Atias y Negheme, 1991). Dependiendo del
hospedero en que se encuentre, T. cruzi adopta diferentes formas celulares:
epimastigote, tripomastigote y amastigote (Figura 2).
El epimastigote es la forma extracelular y replicativa presente en el intestino de los
triatominos. El tripomastigote es la forma extracelular, no replicativa e infectiva, que se
encuentra en la sangre de los mamíferos, en el intestino posterior de los vectores y en
sus deyecciones. Los amastigotes son las formas intracelulares replicativas que se
encuentran en las células de mamífero (Apt et al, 2008).

Figura 2: Formas celulares de Trypanosoma cruzi.

Cuando un triatomino portador del parásito se alimenta de un mamífero, ingiere sangre

y simultáneamente defeca. En las deyecciones se encuentran las formas tripomastigotes
que ingresan por el lugar de la picadura o por erosiones de la piel y son fagocitadas,
fundamentalmente por macrófagos. En la célula hospedera, el tripomastigote es rodeado
por una vesícula parasitófora, de la que escapa alojándose en el citoplasma, donde se
diferencia en amastigote. Esta forma celular inicia numerosos ciclos de división, en el
citoplasma de la célula hospedera. Posteriormente, los amastigotes se diferencian a
tripomastigotes altamente móviles, que son liberados al torrente sanguíneo desde donde
infectan otras células, tales como células ganglionares, musculares, entre otras (Andrade
y Andrews, 2005). Estos tripomastigotes sanguíneos, cuando son ingeridos por
triatominos, se diferencian en el intestino anterior a epimastigotes que se dividen y

11
migran hacia el intestino posterior del insecto. Cuando alcanzan el recto se adhieren a la
pared mediante su flagelo y se diferencian en tripomastigotes metacíclicos. Una vez que
se despegan de la pared intestinal, son eliminados por las heces de la vinchuca, cerrando
el ciclo de vida (Tyler y Engman, 2001) (Figura 3).

Figura 3: Esquema del ciclo de vida del T. cruzi.

Variabilidad genética del Trypanosoma cruzi

La especie T. cruzi muestra una considerable diversidad genética y fenotípica (Brisse et

al, 2001; De Freitas et al, 2006) la cual es probablemente el resultado de un modelo de
evolución predominantemente clonal (Anónimo, 1999; Gaunt y col, 2003). Numerosas
evidencias apoyan la existencia de esta estructura poblacional (Tibayrenc et al, 1986;
Tibayrenc y Ayala, 2002; Sturm y Campbell, 2010) debido a los diferentes ciclos de
transmisión, en los que se producen eventos aislados de recombinación, y que han sido
encontrados en la naturaleza y descriptos in vitro (Brisse et al, 2001; Gaunt, 2003; De
Freitas et al, 2006). Actualmente, se reconoce que la especie T. cruzi está compuesta por

12
diversas subpoblaciones que exhiben un alto grado de polimorfismo cuando son
analizadas por diferentes métodos bioquímicos y moleculares (Buscaglia y Di Noia,
2003; Macedo et al, 2004) presentando distintas características biológicas,
inmunológicas, bioquímicas y distinto comportamiento frente a la acción de fármacos
(Brener et al, 1992; Gomes et al, 1998).
Estas subpoblaciones están compuestas por un pool de cepas que circulan en los ciclos
doméstico y selvático de la enfermedad, que incluyen al hombre, insectos vectores y
reservorios. Todas ellas han sido recientemente agrupadas en seis grandes grupos,
linajes o unidades discretas de tipificación denominados T. cruzi I – VI (Zingales et al,
2009, 2012; Guhl y Ramírez, 2011), además del genotipo TcBat, recientemente
identificado, y restringido a los murciélagos (Zingales et al, 2009; Marcili et al, 2009).
Esta variabilidad genética del parásito en un mismo huésped determina un tropismo
diferencial de estos clones a los diferentes órganos del huésped (Vago et al, 2000; Mejia
y Triana, 2005; Andrade et al, 2010); es la distribución de estos clones la que podría
influir o determinar la patogénesis de la enfermedad. Algunas cepas presentan tropismo
por células musculares (esqueléticas o cardíacas); otras prefieren células mononucleares
fagocíticas; y un tercer grupo prefiere aún otros tipos de tejidos, entre los que se pueden
nombrar al tejido nervioso, tejidos del sistema reproductor, hígado, bazo y aún, tejido
adiposo (Andrade, 1999). En este sentido, en los últimos años, diferencias de virulencia
y tropismo han sido reportadas en diferentes cepas genéticamente distantes (Roellig et
al, 2010).
La aparición de cepas de T. cruzi naturalmente resistentes, es uno de los factores más
importantes para explicar las bajas tasas de curación en algunos pacientes chagásicos
tratados, procedentes de zonas endémicas (Filardi y Brener, 1987; Toledo et al, 1997).

Formas de transmisión

Las formas más frecuentes de contagio de la enfermedad de Chagas son la vectorial, la

transfusional, la transplacentaria, los trasplantes de órganos y los accidentes de
laboratorio. Como se mencionó anteriormente, la transmisión vectorial es causada por
las deyecciones de triatominos infectados por T. cruzi en la piel de mamíferos, en el
momento de alimentarse. Actualmente, con las efectivas medidas que se han tomado

13
para el control de los vectores así como el control de la sangre para transfusiones y de
donantes de órganos, en algunos países estas formas de transmisión han disminuido
significativamente (Cabello y Cabello, 2008).
En la actualidad existen 141 especies reconocidas de triatominos, pero sólo cinco de
ellas, pertenecientes a tres géneros (Triatoma, Rhodnius y Panstrongylus), pueden
considerarse importantes vectores de la enfermedad de Chagas (Noireau y Dujardin,
2010).
En este contexto, otras formas de contagio han tomado importancia; una de ellas es la
transmisión por vía oral debido al consumo de alimentos contaminados (Barbosa, 2006).

Figura 4: Formas de transmisión del T. cruzi

Aspectos clínicos de la enfermedad de Chagas

En la mayoría de los casos, la infección puede iniciarse imperceptiblemente para el

paciente, aunque en algunos casos es posible detectar el sitio de entrada del parásito con
lesiones en la piel provocadas por la picadura de la vinchuca.
Los parásitos depositados en la herida de la piel o en las mucosas estimulan una
reacción inflamatoria local (chagoma de inoculación o signo de Romaña) con una
respuesta linforeticular. Los tripomastigotes circulantes dentro de los macrófagos son

14
llevados al hígado, bazo, ganglios linfáticos y músculos esquelético y cardíaco, donde
forman pseudoquistes de amastigotes. Con la ruptura de estos pseudoquistes en el
miocardio y en los plexos mientéricos, comienza la miocarditis aguda mediada por
células T CD4+ y T CD8+ e interleuquinas (IL) –mayormente IL-2 e IL-4. Esta reacción
inflamatoria lleva a la destrucción muscular y nerviosa, que se mantiene por la presencia
del parásito o sus fragmentos (particularmente su ADN) (Coura, 2007).
Sin tener en cuenta el modo de invasión, la infección persiste en el huésped para toda la
vida, con manifestaciones clínicas variables y con una carga parasitaria que disminuye
con el tiempo. El curso de la infección estaría determinado por la cantidad de parásitos
con que se infectó el paciente (número de tripomastigotes), el linaje de T. cruzi
infectante (TcI – Tc IV), las posibles reinfecciones (Bustamante et al, 2003 a; 2003 b;
2007), el histotropismo de la cepa o aislamiento infectante, y la respuesta inmune del
paciente (Coura, 1988; Días, 1989; Macedo y Pena, 1998; Andrade et al, 2006; Teixeira
et al, 2006).
Según la última clasificación del Comité Científico de Enfermedad de Chagas de la
Federación Argentina de Cardiología y del Consejo de Miocardiopatías y Enfermedad
de Chagas de la Sociedad Interamericana de Cardiología, esta enfermedad comprende
dos etapas: CHAGAS AGUDO: Sintomático o Asintomático y CHAGAS CRÓNICO: Con
o sin patología demostrada (Mordini, 2010).

Etapa aguda

El curso de la etapa aguda varía según la cepa y la cantidad de parásitos, así como
también la vía de infección. En esta etapa se produce una elevada proliferación
intracelular del parásito (Andrade et al, 2000) y se puede manifestar de una forma típica
o atípica. En el primer caso puede observarse el chagoma hematógeno, que es una
tumoración dura, roja y dolorosa en el sitio de la inoculación, y edema de los miembros.
El segundo caso puede presentarse con un cuadro febril o manifestarse según el
compromiso orgánico que tenga; la afección cardíaca o meningoencefálica son las
responsables de los casos de muerte en este período (Chiarpenello, 2004). El
compromiso cardíaco se presenta como una miocarditis aguda difusa, con edema
intersticial, hipertrofia de las fibras miocárdicas y dilatación de las cavidades cardíacas.

15
El paciente presenta taquicardia e hipotensión. La destrucción de las neuronas cardíacas
y de los plexos mientéricos, con reducción en el número de neuronas, comienza en esta
etapa y continúa en la etapa crónica de la enfermedad (Tanowitz et al, 1992; Andrade,
2000; Andrade, 2005). La mortalidad en esta etapa implica alrededor del 5% de los
pacientes infectados, consecuencia de una miocarditis aguda o de meningoencefalitis.
Se destaca además, que la infección aguda puede tener un curso agresivo en casos de
infección transplacentaria, infección postransfusional o en pacientes
inmunocomprometidos. Sin embargo es fundamentalmente asintomática, y el 90% de
las personas sobreviven a la infección (Chiarpenello, 2004).

Etapa Crónica

La mayoría de los pacientes con enfermedad aguda se recuperan completamente a los 3

a 4 meses (Tanowitz et al, 1992) y continúan sin presentar síntomas por el resto de sus
vidas (etapa crónica sin patología demostrada) (Coura, 2003). Sin embargo,
aproximadamente un 27% de los pacientes infectados desarrollan síntomas cardíacos
que pueden llevar a la muerte súbita, daños digestivos (6%) y compromiso del sistema
nervioso periférico (3%) (Manoel-Caetano y Silva, 2007).

Sin patología demostrada

Los individuos infectados permanecen como fuente de parásitos para toda la vida, como
reservorio en etapa crónica sin patología demostrada. Este periodo puede durar desde
unos pocos meses hasta décadas (Macêdo, 1999). Esta etapa se define de acuerdo a los
siguientes criterios (Macêdo, 1999; Teixeira et al, 2006; WHO, 2002):

1) Test serológico específico positivo y/o diagnóstico parasitológico confirmado.

2) Ausencia de signos y síntomas de enfermedad de Chagas.
3) Ausencia de anormalidades electrocardiográficas.
4) Tamaño de corazón, esófago y colon normales (a través de rayos X).

16
Algunos autores postulan que los acontecimientos ocurridos en esta etapa pueden ser la
clave para determinar qué pacientes desarrollarán la miocardiopatía chagásica y por qué
un 70% de los pacientes infectados nunca desarrollarán la enfermedad cardíaca (Elizari,
1999).
A pesar de ser asintomáticos, estos pacientes presentan reacciones serológicas positivas
para la infección por T. cruzi y la mayoría de ellos puede presentar xenodiagnóstico y
reacción en cadena de la polimerasa [(PCR), por sus siglas en inglés] positivos repetidas
veces por muchos años. Por lo tanto, estos pacientes estarían presentando un verdadero
equilibrio entre el parásito y su sistema inmunológico (Coura, 2007). Las escasas
lesiones histopatológicas de la etapa crónica sin patología demostrada de la enfermedad
se caracterizan por la presencia de focos inflamatorios puntuales y aislados, y lisis y
degeneración de células del músculo esquelético (Sicca et al, 1995; Lo Presti et al,
2008). Las lesiones inflamatorias del corazón, del tracto digestivo y del músculo
esquelético son similares a las encontradas en los pacientes crónicos clínicamente
manifiestos, pero en un grado menor (Teixeira et al, 2006; Lo Presti et al, 2008).
También se presenta una leve reducción en el número de neuronas cardíacas y de los
plexos mientéricos que generalmente es insuficiente para producir manifestaciones
clínicas (Andrade et al, 1997).

Con patología demostrada

Forma cardíaca.

Esta forma es la manifestación más expresiva de la enfermedad de Chagas debido tanto

a su frecuencia como a su severidad. Generalmente aparece entre la segunda y la cuarta
década de vida, 5 a 15 años después de la infección inicial (Coura, 2007). El estudio de
la historia natural de la enfermedad ha demostrado que aproximadamente una tercera
parte de las personas infectadas desarrollan signos y síntomas de enfermedad cardíaca
de diferente grado (Elizari, 1999). En esta etapa puede aparecer una extensa fibrosis
miocárdica, destrucción del sistema de conducción, y una amplia reducción en el
número de neuronas cardíacas (Teixeira et al, 2006). La falla congestiva involucra las
cámaras derecha e izquierda del corazón, por lo que afecta toda la circulación
sanguínea. La cardiopatía crónica se caracteriza por dilatación inicial del ventrículo
derecho, adelgazamiento irregular de las paredes ventriculares, presencia de aneurisma
apical y trombosis intramural (Carrada-Bravo, 2004). Microscópicamente, se ha

17
observado destrucción y disminución de fibras cardíacas y fibrosis intersticial, con
liberación de antígenos intracelulares que suelen inducir la síntesis de auto-anticuerpos
contra el endocardio, vasos sanguíneos y fibras cardíacas. El sistema de conducción está
alterado y en todos los casos se presentan infiltrados inflamatorios (Teixeira et al,
2006). Así, la génesis de la cardiopatía es multifactorial: lisis del miocardio parasitado
por los amastigotes, denervación por ataque selectivo al sistema nervioso parasimpático
y generación de autoanticuerpos. A nivel ultraestructural, en adición a la asociación de
los infiltrados mononucleares con las células blanco que experimentan lisis, las fibras
miocárdicas se muestran hipertróficas, con dilatación mitocondrial (Báez et al, 2011),
necrosis, degeneración hialina, disrupción y pérdida de miofibrillas (Tafuri et al, 1973;
Teixeira et al, 2006).
El pronóstico de la forma cardíaca varía considerablemente de un caso a otro. Los
pacientes con lesiones mínimas, como sólo bloqueo de rama derecha o extrasístoles
unifocales ventriculares o auriculares, tienden a permanecer estables y la mayoría de
ellos sobreviven por largos periodos. Por otro lado, los pacientes con arritmias
complejas, extrasístoles multifocales, taquicardia paroxística, fibrilación auricular,
bloqueo aurículo-ventricular de tercer grado o insuficiencia cardíaca, tienen un
pronóstico de mayor gravedad (Coura, 2007).

Forma digestiva.
Otra porción de los enfermos chagásicos (entre 5 a 10% de los pacientes) desarrollan
megavísceras de esófago o colon. Estos síndromes aparecen principalmente por la
reducción en el número de neuronas de los plexos mientéricos del esófago y colon, que
lleva a la disperistalsis y a la dilatación de éstos y otros órganos huecos, como vejiga,
uréteres y vesícula biliar (Lopes y Chapadeiro, 1997; Prata, 2001; Dias y Macedo,
2005). Al alterarse la motilidad del esófago, se produce disfagia, dolor epigástrico o
retroesternal y regurgitaciones. El enfermo por lo tanto, se desnutre y sufre de
neumonitis por aspiración repetitiva. Cuando esta afección se da en los niños, suele
provocar malnutrición crónica y “enanismo chagásico” secundario (Carrada-Bravo,
2004). El pronóstico de la forma digestiva es generalmente bueno, a excepción de las
complicaciones que pudieran aparecer, como cáncer esofágico, obstrucción con torsión,
y necrosis en el colon (Coura, 2007).

18
Patogénesis de la miocardiopatía chagásica crónica

Los mecanismos por los cuales las lesiones tisulares se desarrollan en el curso de la
infección por T. cruzi han sido y continúan siendo objetivo de intensos debates.
Numerosos trabajos han propuesto diversas hipótesis sobre el origen de las lesiones
patológicas de la enfermedad (Levin, 1996; Kierszenbaum, 1999); sin embargo, aún es
un campo abierto para la investigación.
A pesar de más de un siglo de investigaciones, el desafío más interesante para entender
la fisiopatología de la forma cardíaca de la enfermedad de Chagas todavía yace en la
compleja interacción entre el parásito y el huésped (Kierszenbaum, 2005). Esta
interacción, a través de mecanismos que todavía no se comprenden completamente,
determina que la agresión miocárdica permanece controlada y en bajos niveles en la
mayoría de los pacientes. Estos pacientes permanecerán a lo largo de su vida en la etapa
crónica sin patología demostrada de la infección (Dias, 1989). Sin embargo, una tercera
parte de las personas infectadas desarrollan signos y síntomas de enfermedad cardíaca
de diferente grado que pueden llevar a la muerte súbita.
A partir de la evidencia obtenida a través de estudios en pacientes y en modelos
animales, se han propuesto cuatro mecanismos principales para explicar el desarrollo de
la forma cardíaca: la disautonomía cardíaca, los disturbios microvasculares, las lesiones
cardíacas dependientes de la presencia del parásito y el daño miocárdico mediado por la
respuesta auto-inmunológica del huésped (Marin-Neto et al, 2007):

 Disautonomía cardíaca: Diversos estudios han demostrado la presencia de

parasitismo neuronal cardíaco asociado con periganglionitis y anormalidades
degenerativas en las células de Schwann y fibras nerviosas. También se han encontrado
daños ganglionares y una reducción en el número de neuronas intramurales
subepicárdicas. Más tarde se demostró que esta reducción en el número de neuronas
parasimpáticas no es específica de la enfermedad de Chagas, aunque es más conspicua
en los pacientes chagásicos (Böhn, 1968). Consistentemente con la denervación
parasimpática demostrada por estudios morfológicos, los pacientes chagásicos presentan
también una regulación cardíaca autonómica anormal. Diversos estudios han
demostrado que estos pacientes están habitualmente desprovistos de la acción
inhibidora ejercida normalmente por el sistema parasimpático sobre el nodo sinusal
(Marin-Neto et al, 2007). Esta disfunción autonómica puede detectarse en los pacientes

19
chagásicos antes del desarrollo de la disfunción ventricular y en todas las etapas de la
enfermedad, aún en las formas indeterminada y digestiva (Marin-Neto et al, 1998;
Ribeiro et al, 2001). En los pacientes con la forma digestiva, la pérdida neuronal
intramural ha sido considerada como el mecanismo patogénico esencial para la
formación de megacolon y megaesófago (Meneghelli, 2004).
Debido a que los ganglios intramurales cardíacos son en su mayoría parasimpáticos, la
teoría neurogénica para explicar la patogénesis de la enfermedad de Chagas postula que,
de manera similar a lo que ocurre con los órganos del sistema digestivo, la
cardiomiopatía chagásica es esencialmente debida a una denervación parasimpática, lo
que implica que un prolongado desequilibrio autonómico llevaría eventualmente a una
cardiopatía inducida por catecolaminas (Köberle, 1968; Oliveira, 1969). Sin embargo,
más tarde se comprobó que es improbable que la disfunción autonómica juegue un rol
patogénico esencial en el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica crónica siendo sólo
un factor más que contribuye a las complicaciones de la etapa crónica (Marin-Neto et al,
2007).

 Trastornos microvaculares: Estudios patológicos (Rossi, 1990; Oliveira et al, 1985),

experimentales (Rossi et al, 1984; Factor et al, 1985; Tanowitz et al, 1996) y clínicos
(Arreaza et al, 1983; Marin-Neto et al, 1995; Torres et al, 1995) sugieren que las
anormalidades o disturbios microvasculares, que llevan a la isquemia miocárdica,
pueden contribuir a la patogénesis de la enfermedad de Chagas. En base a estos
estudios, es razonable hipotetizar que la hipoperfusión miocárdica crónica constituye un
mecanismo patogénico para el desarrollo de la disfunción ventricular izquierda
característica de la enfermedad de Chagas (Marin-Neto et al, 2007).

 Daño miocárdico relacionado directamente con la presencia del parásito: La

miocardiopatía chagásica es esencialmente una miocarditis con un proceso inflamatorio
continuo, aunque silente, en la etapa crónica de la enfermedad (Sin patología
demostrada), como ha sido demostrado por estudios experimentales (Andrade et al,
1997) y por biopsias y necropsias (Carrasco Guerra et al, 1987). Se ha observado que la
progresión de la enfermedad y la sobrevida son significativamente peores en pacientes
con enfermedad chagásica cardíaca que en aquellos con miocardiopatías dilatadas no
inflamatorias (Freitas et al, 2005). Además, a pesar de que aún no se conocen
completamente los mecanismos moleculares que determinan cómo se regula la

20
interacción entre el parásito y el huésped en relación a la invasión celular y a la
localización de los parásitos en los tejidos, se ha sugerido que las variaciones en el
tropismo tisular encontradas, que dependen de las propiedades genéticas tanto del
parásito como del huésped, pueden explicar las diferentes formas clínicas de la
enfermedad (Andrade y Andrews, 2005).
Desde los primeros estudios histopatológicos, el daño tisular del corazón y del tracto
gastrointestinal ocurrido en la etapa aguda ha sido claramente relacionado con la intensa
parasitemia y el parasitismo de los órganos blanco (Vianna, 1911). Sin embargo,
estudios histopatológicos posteriores, en la etapa crónica de la enfermedad, mostraron
un bajo grado de parasitismo en las fibras miocárdicas y una falta de correlación entre
los focos inflamatorios y los nidos de amastigotes. En base a esta evidencia, el rol del
parásito en la génesis del daño cardíaco durante la etapa crónica de la enfermedad, ha
sido cuestionado por los defensores de hipótesis patogénicas alternativas (Köberle,
1968; Kalil y Cunha-Neto, 1996).
Estudios posteriores, con técnicas histológicas más sensibles (inmunohistoquímica,
PCR e hibridación in situ), permitieron identificar antígenos del T. cruzi o su material
genético en los focos inflamatorios (Ben Younes-Chennoufi et al, 1988; Franco, 1990;
Higuchi et al, 1993 a; Jones et al, 1993; Bellotti et al, 1996; Añez et al, 1999). Estos
estudios destacaron nuevamente el rol patogénico de la persistencia del parásito en los
tejidos del huésped.
Modelos experimentales de tratamiento también sugieren que la persistencia del parásito
está directamente implicada en la patología de la etapa crónica, ya que una reducción en
la carga parasitaria, mediada por diferentes fármacos tripanocidas, lleva a una
atenuación en los síntomas de la miocardiopatía (Rivarola et al, 2001; Lo Presti et al,
2004; García et al, 2005; Rivarola et al, 2005; Bustamante et al, 2007; Gobbi et al,
2007).

 Mecanismos inmunológicos: Diversos estudios independientes han demostrado que

la miocarditis chagásica difusa, con miocitólisis y fibrosis reparativa, presenta las
características típicas de una reacción de hipersensibilidad retardada, con infiltrados
inflamatorios compuestos principalmente por células mononucleares (Andrade, 1983;
Higuchi et al, 1993 b). Estos resultados, junto a la presencia de inmunoglobulina y
proteínas del complemento en el tejido miocárdico, demuestran la participación de
factores inmunológicos en la patogénesis de la enfermedad de Chagas (Cunha- Neto et

21
al, 2006). A pesar de esta clara participación de la respuesta inmune en la génesis del
daño miocárdico, la naturaleza de los antígenos del parásito que provocan esta respuesta
inmunológica destructiva aún permanece sin determinar (Marin-Neto et al, 2007). En
este sentido, antígenos y ADN del T. cruzi han sido encontrados en tejidos cardíacos de
pacientes chagásicos crónicos, y células T CD8+ específicas del T. cruzi han sido
aisladas de biopsias endomiocárdicas de pacientes con enfermedad de Chagas (Fonseca
et al, 2005).
Estos resultados muestran el reclutamiento y la expansión de células T específicas del T.
cruzi en el miocardio, probablemente debido a la presencia del parásito en la forma
cardíaca de la etapa crónica de la infección (Marin-Neto et al, 2007).
Inmediatamente después del comienzo de la infección, el alto parasitismo tisular
provoca una fuerte respuesta inmune, tanto humoral como celular, contra el T. cruzi,
que lleva al control biológico del parásito, pero no a su eliminación. Macrófagos y
células dendríticas promueven la endocitosis de los parásitos y, junto a la expresión de
IL-12 y otras moléculas co-estimuladoras, activan células T productoras de interferón γ
(INF-γ) específicas del T. cruzi, que migran en respuesta a quimioquinas liberadas
localmente y participan en la respuesta inmunológica contra el parásito (Teixeira et al,
2002). En la infección crónica humana, el perfil de citoquinas se mantiene desplazado
hacia citoquinas de tipo Th1 como INF-γ, con supresión de citoquinas tipo Th2 como
IL-4 (Ribeirao et al, 2000; Abel et al, 2001), y niveles plasmáticos elevados del factor
de necrosis tumoral a (TNF-α) (Ferreira et al, 2003). Además, las células
mononucleares periféricas CD4+ de pacientes chagásicos con cardiopatía, producen más
INF-γ y menos IL-10 que las de los pacientes en la forma indeterminada de la
enfermedad (Abel et al, 2001; Gomes et al, 2003), lo que apoya la idea de que los
pacientes que evolucionan hacia la forma cardíaca desarrollan una respuesta inmune de
tipo Th1 más exacerbada (Marin-Neto et al, 2007).
Estudios en modelos experimentales y en pacientes infectados con T. cruzi han
demostrado la presencia de auto-anticuerpos específicos para varios autoantígenos
cardíacos, nerviosos y de otros tejidos del huésped, entre los que se pueden nombrar:
neuronas, proteínas estructurales como la miosina, desmina y actina cardíacas; músculo
cardíaco, liso y esquelético, receptores colinérgicos muscarínicos y receptores
adrenérgicos (Cunha-Neto et al, 2004; Lo Presti et al, 2009).

22
Ninguno de los mecanismos o hipótesis descriptos es mutuamente excluyente, por lo
que varios de ellos actuando en conjunto podrían ser los responsables de la génesis de la
cardiopatía (Tarleton, 2001; Hyland y Engman, 2006). La gran variabilidad de
manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas y el amplio rango de severidad,
aún entre aquellos individuos con cardiopatía, hace razonable considerar a la
enfermedad como dependiente de múltiples mecanismos patogénicos (Hyland y
Engman, 2006).

Tratamiento

Los primeros fármacos eficaces contra la infección por T. cruzi (nifurtimox, producido
por Bayer, y benznidazol, producido por Roche) llegaron a estar disponibles en los años
1960 (Coura y Castro, 2002; Dias y Macedo, 2005). Debido a que estos medicamentos
fueron inicialmente sólo recomendados para los casos agudos, la demanda internacional
de su producción era muy baja. En los siguientes 20 años, los buenos resultados del
tratamiento para la infección crónica en niños estimularon varios estudios en adultos en
la etapa crónica sin patología demostrada de la enfermedad e incluso en adultos en las
etapas iniciales de la miocardiopatía crónica (Andrade et al, 2011; Ministério da Saúde,
2005).
La eficacia antiparasítica de los compuestos varía según la región geográfica,
probablemente como resultado de la diferente susceptibilidad intrínseca a las drogas de
las cepas del T. cruzi que circulan en diferentes zonas endémicas (Andrade et al, 1992;
Cançado, 1999).
El nifurtimox y el benznidazol actúan inhibiendo el DNA, RNA y por consiguiente la
síntesis proteica del parásito y aumentan la degradación de macromoléculas (Gugliotta
et al, 1980; Goijman y Stoppani, 1985; Gonzales y Cazzulo, 1989). El ciclo redox de
ambas drogas genera especies reactivas del oxígeno lo que contribuye a su efecto
tripanocida, pero también a sus acciones tóxicas en el paciente (Marr y Docampo, 1986;
de Castro, 1993; Segura et al, 1994). Estos compuestos presentan frecuentemente
efectos colaterales deletéreos, que pueden conllevar a la interrupción del tratamiento
(Cançado, 1999). Ambos tienen efectos adversos especialmente en adultos, ya que
recién nacidos y niños menores toleran mucho mejor estos fármacos (Viotti et al, 2009).

23
Algunos autores señalan que son fármacos que podrían tener efectos mutagénicos
(Castro y Diaz de Toranzo, 1988; Gorla et al, 1989).
Los efectos secundarios del nifurtimox y benznidazol se describen en la Tabla 1.

Tabla 1: Reacciones adversas a nifurtimox y benznidazol

Alteraciones generales y digestivas

Baja de peso
Malestar gástrico
Náuseas
Vómitos
Alteraciones hematológicas (por hipersensibilidad)
Leucopenia
Trombocitopenia
Agranulocitosis
Alteraciones dermatológicas
Eritema, rash sensible a la luz
Dermatitis atópica (leve o severa)
Ocasionalmente síndrome de Stevens Johnson que
requiere la suspensión de la terapia
Alteraciones neurológicas
Polineuropatias dosis dependiente
En general se presenta en esquemas con altas dosis
Con las dosis habituales de 5 mg/kg/día de Benznidazol, 10-30% de los pacientes
presentan algún tipo de compromiso neurológico (Apt y Zulantay, 2011).

Varios estudios han demostrado el beneficio del tratamiento durante fase aguda con
benznidazol y nifurtimox. La evaluación de fracaso o la eficacia del tratamiento en
pacientes tratados durante la fase aguda es demostrable en poco tiempo porque la
parasitemia (test parasitológico o molecular), se convierte en negativa a los pocos días
después de finalizado el tratamiento. Además, los anticuerpos desaparecen
completamente (seronegativización) en al menos 65% de los casos, con algunos
estudios que demuestran la seronegatividad en el 100% de los casos hasta a los 18
meses de seguimiento después del tratamiento (Cerisola, 1977a; Blanco, 2000).
Desde hace décadas existe una controversia sobre el tratamiento que debe darse a los
enfermos crónicos de Chagas. El investigador brasileño Romeo Cançado en 1969,
describió la persistencia de anticuerpos (serología positiva) en pacientes crónicos
tratados con drogas parasiticidas, lo cual sugería que continuaba el estado de
enfermedad. Luego, entre 1977 y 1978, los resultados de las investigaciones
sistematizadas por Cerisola y colaboradores argentinos y brasileños (1977) acerca de la

24
efectividad del Nifurtimox en la fase crónica de la enfermedad, y por Barclay (1978) y
colaboradores argentinos, sobre la efectividad del Benznidazol en la misma fase,
demostraron altos porcentajes de cura de enfermos crónicos desde el punto de vista
parasitológico (desaparición del parásito en sangre). En este estado de incertidumbre e
indefinición, en 1983, las normas de tratamientos elaboradas por el Ministerio de Salud
de la Nación dejaron afuera del tratamiento parasiticida a los enfermos crónicos,
primando el criterio serológico sobre el parasitológico para la determinación de cura.
Pese a lo cual, o debido a ello, en Argentina la controversia médica no se cerró y se
siguieron desarrollando investigaciones tendientes a probar la eficacia de los
medicamentos en los enfermos crónicos (Cerisola et al, 1977b; Barclay et al, 1978).

Con respecto al diagnóstico y la determinación de la cura, existen, en la actualidad, tres

criterios diferentes, suficientemente estabilizados:

a. Parasitológico: se define por la ausencia de parásitos en sangre.

b. Serológico: se define por la ausencia de anticuerpos en el organismo.
c. Clínico: se observa la disminución de la cardiopatía y la mejora en la calidad de
vida de los pacientes.

A cada uno de estos criterios le corresponden, respectivamente, las siguientes técnicas

de diagnóstico: el xenodiagnóstico, la serología y, en el último caso, principalmente el
electrocardiograma y la evaluación general realizada por el médico tratante.
Sin embargo, las técnicas mencionadas no son suficientes para dar cuenta de todos los
casos ni todas las etapas de la enfermedad. En los últimos años, y como consecuencia
del proceso de «molecularización» que se produjo en el conjunto de las ciencias
biomédicas, se ha desarrollado un cuarto método, que se basa en la detección (o en la
ausencia) de fragmentos de ADN del parásito en la sangre y en los tejidos. Se realiza a
través de la difundida técnica de PCR que permite una mayor sensibilidad que las
técnicas de diagnóstico tradicionales (Kreimer et al, 2010).

25
¿Cómo evaluar si el tratamiento es efectivo en pacientes crónicos?

La caracterización de la eficacia del tratamiento antiparasitario específico en pacientes

adultos con infección crónica por T. cruzi con o sin patología demostrada, no está
definido actualmente. Esto es debido a que la serología convencional permanece
reactiva en la gran mayoría de los pacientes, aún muchos años después de finalizado el
tratamiento tripanocida, los métodos parasitológicos tradicionales (xenodiagnóstico,
hemocultivo) tienen escasa sensibilidad en esta etapa de la infección (Fabbro et al,
2007). Además, la evolución clínica de la enfermedad de Chagas es de lenta progresión
y un elevado porcentaje de pacientes infectados permanece, aún sin tratamiento, en el
período crónico sin patología demostrada, sin manifestaciones electrocardiográficas y
radiológicas (Rodrigues Coura y de Castro, 2002). Por otra parte, como dijimos
anteriormente los mecanismos por los cuales los pacientes con infección crónica
desarrollan enfermedad no son completamente conocidos. Esto demuestra la necesidad
de contar con herramientas sensibles y específicas que permitan monitorear la eficacia
del tratamiento de manera segura y eficiente.
Para evaluar la respuesta a la quimioterapia específica, se recomienda utilizar la
combinación diagnóstica: inmunoserológica y parasitológica.
La medición de la eficacia del tratamiento evaluada por métodos serológicos muestra
resultados que varían en el tiempo y por esto se recomienda que se deben tener en
cuenta al momento de analizar la eficacia, variables como:

a) los métodos utilizados,

b) la edad del paciente al recibir el tratamiento,

c) el tiempo transcurrido entre el tratamiento y el momento del control, y

d) el tiempo transcurrido desde que adquirió la infección (Sosa Estani et al,

2000).

En América Latina se desarrolló una técnica de ELISA con una mezcla de antígenos
recombinantes que comprende seis proteínas recombinantes de epimastigotes y
tripomastigotes de T. cruzi. Estos antígenos consistieron en un antígeno (SAPA), que es
reactivo durante la etapa aguda de la infección; antígenos 1, 2 y 30, que detectan
anticuerpos principalmente en individuos en la etapa crónica; y antígenos 13 y 36, que

26
son reactivos tanto durante la etapa aguda como en la crónica (Rassi y Luquetti, 2003;
Ibanez et al, 1988; Vergara et al, 1991).

Otros autores utilizaron ELISA con antígenos recombinantes individuales, llevado a

cabo con cada uno de ellos (1, 2, 13, 30, 36 y SAPA) de manera individual, en sueros
pre y post-tratamiento, supervisando los niveles de anticuerpos post-tratamiento en 18
pacientes chagásicos crónicos durante tres años, demostrando que el antígeno
recombinante 13 fue el más sensible a la eficacia del tratamiento, ya que el 66,6% de los
pacientes presentaron una temprana disminución y negativización de su serología.
(Sánchez Negrette et al, 2008).

Con respecto al diagnóstico parasitológico en pacientes crónicos, la única forma de

detección del T. cruzi es con la técnica de PCR debido a la baja carga parasitaria que
presenta esta etapa de la infección (López-Antuñano et al, 2000). Además, esta técnica
ha superado la sensibilidad de las técnicas convencionales de diagnóstico parasitológico
porque no sólo es capaz de detectar indirectamente a los parásitos como unidad, sino
también a segmentos específicos de ADN que están representados centenares de veces
en cada parásito (Mora et al, 1998).

Esta técnica sirve para:

1. Diagnóstico etiológico: es sobre todo útil en ausencia de métodos de diagnóstico

alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica
complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y
precoz del agente etiológico para poder iniciar el tratamiento específico lo antes posible.

2. Control del tratamiento: se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben
ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, siendo
importante para ello disponer de métodos cuantitativos. La nueva técnica de PCR en
tiempo real permite esta cuantificación. Esta es una importante técnica para analizar
muestras de sangre en serie y poder observar una tendencia creciente o decreciente en
las cargas parasitarias en pacientes crónicos en tratamiento (Duffy et al, 2009), siendo
de particular importancia para futuros ensayos de drogas (Molina et al, 2000).

27
3. Caracterización genética de agentes infecciosos: Genotipificación; identificación
de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia; epidemiología
molecular; etc. (Costa, 2004).

Tripanotiona reductasa

La búsqueda de nuevos blancos moleculares anti-T. cruzi, se ha basado principalmente

en vías metabólicas exclusivas del parásito. El sistema de defensa redox en mamíferos
se basa en la glutatión oxidasa (GSSG) y glutatión reductasa (GR) pero es reemplazado
en Trypanosoma y Leishmania por un sistema análogo basado en las enzimas
tripanotiona peroxidasa (TP) y tripanotiona reductasa (TR) (Fairlamb et al, 1985).
La TR es exclusiva del orden Kinetoplastide, por lo que le confiere una utilidad como
blanco molecular (Ravaschino et al, 2006).
Similitudes con el glutatión, sugieren que TR puede tener una función similar en el
secuestro de radicales libres y especies reactivas del oxígeno formadas por los procesos
metabólicos cuando los parásitos se encuentran sujetos al estrés oxidativo por la
respuesta inmune del huésped (Olin-Sandoval et al, 2010).
La TR interviene en reacciones redox dependiente de NADPH y es responsable de la
conversión de la forma oxidada T(S)2 [forma disulfuro] a la forma reducida T (SH)2
[forma dihidro sulfuro]:

Su acción en conjunto con la TP, contribuye a un eficaz sistema desintoxicante de

hidroperóxidos en tripanosomas (Krauth-Siegel y Schöneck, 1995):

28
Fármacos tricíclicos y su efecto sobre el Trypanosoma cruzi

Hammond y colaboradores, en 1984, llevaron a cabo un “screening” de 500 drogas

diferentes para determinar un posible efecto tripanocida. Informaron que 71 de estos
compuestos fueron activos contra el parásito a una concentración de 1 mM o menos.
Algunos fármacos eran fenotiazinas y antidepresores tricíclicos, como Clomipramina,
Clorpromazina, Prometazina, Tioridazina, etc (Hammond et al, 1984).
Los fármacos tricíclicos, fenotiazinas y antidepresivos relacionados, son usados en
tratamientos psiquiátricos y como antieméticos o antihistamínicos. Entre las diferentes
acciones biológicas que presentan, tienen una potente actividad antifúngica,
antibacteriana y antiplásmidos. Estas drogas también mostraron una actividad
antitumoral, antiinflamatoria, antihelmíntica, y contra la malaria. Además interactúan
con las membranas o sus componentes, con proteínas celulares, con receptores
dopaminérgicos, inhiben la actividad ATP-asa dependiente de Mg2+, aumentan la
fluidez de la membrana (Amaral y Kristiansen, 2000; Paglini-Oliva y Rivarola, 2003) y
presentan una marcada actividad anticalmodulina (Bondy, 1995; Paglini-Oliva y
Rivarola, 2003).
Se ha demostrado efecto tripanocida de algunas drogas tricíclicas en los diferentes
estadios del T. cruzi (epimastigotes y tripomastigotes) (Paglini-Oliva et al, 1998).
En nuestro laboratorio estudiamos la actividad biológica de algunas de ellas,
demostrando que Clomipramina, Trifluorperazina, Prometazina y Tioridazina ejercen un
marcado efecto tripanocida (Paglini-Oliva et al, 1998; Barioglio et al, 1987; Fernández
et al, 1997; Lacuara et al, 1991) sobre tripomastigotes y epimastigotes de T. cruzi cepa
Tulahuen. Estas investigaciones demostraron que el efecto letal de clomipramina puede
ser atribuido a su mecanismo anticalmodulina. Trifluorperazina indujo la disrupción de
la mitocondria del parásito, con marcada disminución en la capacidad de producir
energía (Lacuara et al, 1991) y Prometazina provocó la desorganización de la membrana
celular del T. cruzi, con aparente compromiso de lisosomas (Fernández et al, 1997).
Tioridazina, tuvo un efecto tripanocida directo, provocando la disrupción de la
mitocondria y del kinetoplasto en tripomastigotes de T. cruzi, cepa Tulahuen, y
condensación de los orgánulos celulares cerca de la membrana plasmática en
epimastigotes (Paglini-Oliva et al, 1998).
A concentraciones adecuadas estos fármacos producen la muerte de los tripomastigotes
e inhiben el crecimiento de los parásitos de cultivo (Lacuara et al, 1991).

29
Clomipramina

Clomipramina es un antidepresivo tricíclico que posee un grupo etileno en la posición

10 y un cloro en la posición 2, como puede observarse en la figura 5 (Barioglio et al,
1987).

Figura 5: Estructura química de Clomipramina

Estudios experimentales realizados con ratones demostraron que produce la muerte de

tripomastigotes y disminuye los síntomas de la miocardiopatía (Rivarola et al, 2005;
Gobbi et al, 2010). Sin duda, lo más interesante que poseen los fármacos tricíclicos es
que son inhibidores directos de la TR. La actividad del sistema activado tricíclico-
peroxidasa a través de tres peroxidasas diferentes fue estudiado por Guitierrez-Correa y
colaboradores (2001). Sus resultados apoyan la hipótesis según la cual los radicales
catiónicos producidos por peroxidación de los fármacos tricíclicos inhiben a la TR.
La figura 6 muestra la interacción de los tricíclicos con la TR.
Peroxidasa
Clomipramina Clomipramina++

Tripanotiona Tripanotiona Triparedoxina

Reductasa Peroxidasa

Figura 6: Interacción de Clomipramina con TR. Modificado de Rivarola y Paglini (2002).

30
Estudios realizados en ratones infectados con T. cruzi, hemos demostrado que si
clomipramina es utilizada en la fase aguda o crónica sin patología demostrada, modifica
la evolución natural de la enfermedad y previene la cardiopatía (Rivarola et al, 2001,
2005; Bazán et al, 2008).

La enfermedad de Chagas: Modelo murino

El uso experimental del modelo ratón propicia la oportunidad de estudiar y entender las
alteraciones promovidas por el parásito de forma sistemática y no solamente en un
órgano. La primer infección experimental con T. cruzi fue realizada por Oswaldo Cruz,
de acuerdo con la descripción del propio Chagas en 1909. Chagas inoculó
experimentalmente varias especies animales, entre ellas perros, cobayos y monos con T.
cruzi tratando de estudiar la evolución de la infección en diferentes vertebrados
(Romanha et al, 2010).
El modelo experimental con ratones para la enfermedad de Chagas fue descripto por
Laguens y colaboradores (1980) y se demostró que reproduce las 2 fases de la
enfermedad humana desde el punto de vista patológico, inmunológico y
electrocardiográfico. Además su pequeño porte, facilidad de obtención y mantenimiento
hace que sea el animal preferido para un gran número de experimentos. El modelo
murino de la cardiopatía crónica chagásica reproduce el cuadro de miocarditis crónica
con lesiones fibróticas e inflamatorias, cardiomegalia, dilatación y trombosis de las
cavidades cardíacas. También en este modelo se observan similitudes en relación a los
aspectos clínicos: serología positiva y disturbios hematológicos. Este modelo posibilita
el estudio de nuevos blancos terapéuticos en el control de la inflamación cardíaca como
propósito para mejorar la calidad de vida de los pacientes chagásicos (Laguens et al,
1980; Romanha et al, 2010).

31
OBJETIVO

Teniendo en cuenta todos estos aspectos analizados, entre los que se pueden destacar:

♦ la necesidad de contar con nuevos fármacos para el tratamiento de los enfermos

chagásicos, y que sean efectivos frente a cualquier cepa de T. cruzi,
♦ que aun hoy la efectividad del tratamiento de los pacientes chagásicos crónicos
está en dudas,
♦ la importancia de contar con métodos serológicos y parasitológicos más
sensibles a la efectividad del tratamiento en fase crónica, es que se propuso el
presente trabajo de tesis con el siguiente objetivo:

Evaluar con métodos no convencionales, ELISA con antígenos individuales y PCR en

Tiempo Real, la efectividad del tratamiento con clomipramina en la etapa crónica
cardíaca de la enfermedad de Chagas experimental, en ratones infectados con diferentes
cepas de T. cruz; dicha evaluación se realizó a través de:

• Parasitemia evaluada con PCR convencional (cualitativa) y PCR en tiempo real

(cuantitativa),
• Cuantificación de los niveles de anticuerpos a través de ELISA con antígenos
individuales: 1, 2,13,30, 33 y SAPA,
• Cambios electrocardiográficos,
• Histopatología de músculo cardíaco (MC) y músculo esquelético (ME) y,
• Sobrevida

Los resultados pretenden ser un aporte para mejorar el diagnóstico serológico y

parasitológico de los pacientes con enfermedad de Chagas así como analizar una
propuesta diferente de tratamiento efectivo en diferentes cepas de T. cruzi.

32
MATERIALES Y MÉTODOS

Animales. 200 ratones Albino suizos adultos, machos y hembras de un peso promedio
de 30 ± 1 g.

Parásitos. Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi, pertenecientes a la cepa Tulahuen,

designada como TINF/CL/1945/Tulahuen (Tc V), de acuerdo con la clasificación de la
OMS y en base a lo recomendado en la Reunión Satélite del Simposio Internacional
para conmemorar el 90 aniversario del descubrimiento de la enfermedad de Chagas.
Esta cepa fue aislada en 1945 de un Triatoma infestans encontrado en Chile y
corresponde al linaje V (Andrade, 1974; Miles et al, 1977; 1978, Lo Presti et al, 2014).
También se utilizaron tripomastigotes pertenecientes al aislamiento SGO Z12, obtenido
de un insecto vector de Santiago del Estero, zona endémica de nuestro país. Este
aislamiento, denominado SGO Z12 (debido a que pertenece al zimodema 12 de
Montamat y colaboradores –1996), fue adaptado y mantenido en ratones que luego se
utilizaron para la infección experimental. En nuestro laboratorio hemos determinado
que este aislamiento es una mezcla de linajes (Tc II y Tc VI).

Infección. 50 tripomastigotes/animal, inoculados por vía intraperitoneal, obtenidos de la

sangre heparinizada de ratones infectados para mantener la cepa de parásitos. Esta
cantidad de parásitos fue determinada por recuento en hemocitómetro y fue suficiente
para reproducir las etapas aguda y crónica de la infección experimental (Rottenberg et
al, 1988; Bustamante et al, 2003).

Drogas. Se utilizó Clomipramina de Sigma Chemical Co.

Modelo Experimental:
Los animales se dividieron en los siguientes grupos:
● No infectados, sin tratamiento (n=10).
● No infectados y tratados con clomipramina 5 mg/kg/día (n=10).
● Infectados: ratones infectados con las diferentes cepas/aislamiento (n = 90 por cada
cepa/aislamiento) y que se dividen en:
 Sin alteraciones electrocardiográficas (SA)
 Con alteraciones electrocardiográficas (CA)

33
 No tratados (NT): ratones infectados y no tratados.
Tratados (T): tratados con clomipramina 5 mg/Kg/día. En trabajos previos en
ratones, esta droga ha demostrado ser efectiva en el tratamiento de la
Enfermedad de Chagas Experimental en fase aguda y crónica sin patología
aparente (Rivarola et al, 2005; Bazán et al, 2008). El tratamiento consistió en
una dosis diaria durante 60 días.
Los ratones que ingresaron al grupo tratado fueron definidos como crónicos con
patología demostrada, en función de la presencia de alteraciones
electrocardiográficas (ECG): a los 90, 180, 270 y 360 días post infección.

Grupos experimentales

Grupos
experimentales

No infectados No infectados Infectados

Sin tratamiento Tratados con Tulahuen/SGO Z12
clomipramina

Sin alteraciones Con alteraciones

electrocardiográficas electrocardiográficas
(SA) (CA)

No tratados (NT)

Tratados (T)

34
El estudio de la evolución de la infección experimental en los diferentes diseños
planteados se llevó a cabo a través del seguimiento de la parasitemia, sobrevida
electrocardiografía, histopatología, PCR convencional, PCR en tiempo real y serología
(ELISA).

Parasitemia. Se realizó el seguimiento de los niveles de parásitos en sangre de todos

los grupos infectados, en cámara de Neubauer, en muestras de sangre obtenidas de la
cola de los ratones cada 7 días.

Sobrevida. Fue monitoreada diariamente.

Electrocardiografía. Se realizaron electrocardiogramas a los ratones de todos los

grupos antes de la infección y a los 90, 180, 270 y 360 dpi.
Los ECG se llevaron a cabo bajo anestesia con Ketamina ClH (Ketalar , Parke Davis,
Warner Lambert Co, USA – 10 mg/Kg), con electrocardiógrafo Fukuda Denshi
(Modelo FD 16) y electrodos adaptados para ratón, con una velocidad de
desplazamiento del papel de 50 mm/s y el animal ubicado dentro de una jaula de
Faraday. Las derivaciones a determinar fueron las bipolares (DI, DII y DIII) y las
unipolares de los miembros (aVR, aVL y aVF).
Se calculó la frecuencia cardiaca y los intervalos QT y PR del corazón de cada ratón. Se
midió el intervalo del complejo QT en lugar del complejo QRS debido a que en el ECG
de roedores la onda T no se encuentra separada de este último complejo (Bestetti y
Oliveira, 1990).
Se consideraron anormales (CA), los registros que mostraron uno o más de los
siguientes cambios en relación con los valores de referencia de ratones normales (SA):
Aumento o disminución de la frecuencia cardíaca (valores normales: 440,75-826,39),
prolongación o acortamiento de los intervalos PR (valores normales: 0.01-0,0303) y QT
(valores normales: 0,023-0,04).

Estudios histológicos. Las muestras de músculo cardíaco (MC) y músculo esquelético

(ME) de los ratones no infectados e infectados, y sus diferentes grupos, en cada
momento de la infección experimental fueron fijadas en formol bufferado (10%) y
embebidas en parafina. Los cortes de 5 mm de espesor fueron coloreados con

35
hematoxilina-eosina (HE) para determinar la presencia de infiltrados inflamatorios y
Tricrómico de Gomori (TG) para determinar la presencia de fibrosis. Un total de 3
cortes de cada órgano de cada animal (n=3 por grupo) fueron analizados con objetivos
de 4X, 10X, 20X y 40X.

Cuantificación de infiltrados inflamatorios y fibrosis. Para cuantificar el área

cubierta por infiltrados inflamatorios o fibrosis en los cortes de corazón y músculo
esquelético, se analizaron las fotografías tomadas a un aumento 4X con el programa
AxioVision 4.8.1. Para ello se tomó como 100% el área total del corte de cada uno de
los tejidos y se cuantificó el porcentaje de la misma cubierta con infiltrados
inflamatorios o fibrosis.

Extracción de ADN de muestras de sangre. Las muestras de sangre de cada ratón se

mezclaron con igual volumen de guanidina 6M / EDTA 0,2 M (Ávila et al, 1991).
El ADN se extrajo por técnicas convencionales con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(Lachaud et al, 2001) y se precipitó con etanol. Finalmente la solución se resuspendió
en agua estéril libre de nucleasas y se conservó a -20º C hasta su uso (Wincker et al,
1994) para la amplificación del contenido de ADN del parásito y su caracterización por
PCR.

Detección de T. cruzi en cada muestra mediante PCR convencional. La presencia de

T. cruzi en cada muestra se determinó mediante la amplificación de un fragmento de
188 pb correspondiente al ADN nuclear del parásito utilizando cebadores específicos:
TCZ-1 (5’CGA GCT CTT GCC CAC ACG GGT GCT 3’) y TCZ-2 (5’CCT CCA AGC AGC
GGA TAG TTC AGG 3’) (Virreira et al, 2003).
La calidad del ADN de cada una de las muestras se verificó mediante la amplificación
de un gen constitutivo del huésped (β-actina) de 289 pb, utilizando los cebadores
correspondientes: β-act-F (5’CGG AAC CGC TCA TTG CC 3’) and β-act-R (5’AAC CAC
ACT GTG CCC ATC TA 3’).
Los componentes de cada una de las reacciones y las condiciones de amplificación para
cada PCR se describen en las tablas 1 y 2 respectivamente. En todos los casos, los
productos de PCR se separaron mediante electroforesis. Cada reacción se realizó por
triplicado.

36
 Tabla 2: Componentes de cada una de las reacciones para la amplificación de los diferentes
marcadores moleculares.

Marcador Tris-Cl KCl Cl2Mg dNTPs Taq Cebadores ADN Volum

molecular (pH 8,4) (muestra) en
final
TCZ 10 mM 50 mM 1,5 mM 200 µM 0.5 U 25 ρmols ~ 2,5 ηg 25 µL

β-actina 10 mM 50 mM 1,5 mM 200 µM 0.5 U 10 ρmols ~ 2,5 ηg 25 µL

Tabla 3: Condiciones de reacción para la amplificación de cada uno de los marcadores moleculares.

Marcador Desnaturalización Número de Cada ciclo consistió de: Extensión

molecular inicial ciclos Desnaturalización Annealing Extensión final

TCZ 4 min; 95ºC 40 30 s; 95ºC 30 s; 60ºC 30 s 72ºC 5 min; 72ºC

β-actina 4 min; 95ºC 30 30 s; 95ºC 30 s; 60ºC 30 s; 72ºC 5 min; 72ºC
En todos los casos, las amplificaciones se llevaron a cabo en un Termociclador para ADN (Ivema T-18).

Electroforesis. En todos los casos 5 µL de producto de amplificación junto con 2 µL de

buffer de siembra (0,25% de azul de bromofenol y 30% de glicerol en Tris 10 mM pH
8) se sembraron en un gel de agarosa en TAE 1X con bromuro de etidio (concentración
final en el gel: 0,5 µg de EtBr/ml), y se corrió a 90 mV durante 1 hora. Como marcador
de tamaño molecular se utilizó ADN ladder 100 pares de bases (Productos Biológicos -
Universidad de Quilmes). Los geles se visualizaron en un transiluminador bajo luz UV.

Detección de T. cruzi en cada muestra mediante PCR en tiempo real. La carga

parasitaria en cada muestra se determinó mediante la amplificación por PCR en tiempo
real, utilizando cebadores específicos para T. cruzi.
Cada tubo de amplificación contenía 10 µL de master mix SYBR Green qRT-PCR
(QuantiTect SYBR Green PCR Kit, QIAGEN), 1 µL de cada cebador (10 pmol, sentido
y antisentido) y 10 ngr de muestra de ADN. Se utilizaron los mismos cebadores
previamente descriptos para la PCR convencional (Tcz-1 y Tcz-2).
Las condiciones de PCR que se utilizaron fueron: 1 paso inicial de calentamiento de 15
min a 95 ºC, 40 ciclos que consistieron en: 30 seg a 95 ºC (desnaturalización), 1 min a
60 °C (annealing) y 30 seg a 72 ºC (extensión); por último 1 paso final que consistió en:
15 seg a 95 ºC, 1 min a 60 ºC y 30 seg a 95 ºC. El termociclador utilizado fue
Quantitative PCR thermocycler Stratagene Mx 3005P. El software para evaluar los

37
datos y calidad de las reacciones de amplificación fue el programa MxProTM QPCR
versión 3.20 (Stratagene. Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
Los datos se analizaron usando el método de 2–∆∆Ct (análisis de la expresión génica
relativa) (Livak et al, 2001). Los resultados expresan la relación entre los valores Ct de
la muestra inicial (90 o 180 d.p.i, según corresponda) y los valores Ct de las muestras a
comparar. Este método es un modelo matemático que calcula los cambios relativos de
expresión génica (número de veces) entre una muestra experimental o fragmento de
interés (TCZ) y un calibrador o gen endógeno (β-actina).

Serología. Se utilizaron dos combinaciones diferentes de Antígenos para ELISA.

a) ELISA con recombinantes totales. Se utilizaron microplacas sensibilizadas con 6

antígenos recombinantes: SAPA, 1, 2, 30, 13 y 36. Se siguieron las especificaciones del
kit ELISA Wiener Recombinante 3.0.

b) ELISA con antígenos recombinantes individuales. Utilizamos microplacas

sensibilizadas con uno solo de los antígenos recombinantes, por ejemplo contra SAPA,
1, 2, 30, 13 y 36. Se siguieron las especificaciones del kit ELISA Wiener Recombinante
3.0.

La sangre que se obtuvo de los diferentes grupos de ratones, se centrifugó a 5000 r.p.m
durante 15 minutos para separar el plasma.
Luego se realizó una dilución del plasma 1/20, añadimos las muestras a las placas de
micropocillos y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Después de cinco lavados (NaCl
[1,4 M] en tampón fosfato [100 mM]) para eliminar la inmunoglobulina (Ig) no unida,
las muestras fueron incubadas a 37 ° C durante 30 min con un conjugado anti-IgG
humana diluido (1: 40.000) y marcado con peroxidasa. El conjugado no unido, se
elimina mediante otro paso de lavado. Las placas de microtitulación fueron luego
reveladas con peróxido de hidrógeno (60 mM en tampón de citrato [50 mM], pH 3,2) y
tetramethybenzidine (0,01 mM en ácido clorhídrico [0,1 N]). La solución desarrolla un
color azul con una intensidad proporcional a la concentración y afinidad de los
anticuerpos anti-T. cruzi en la muestra. La reacción se detuvo mediante la adición de
ácido sulfúrico (2 N), y el color de la solución se volvió a amarillo.
Luego de 20 minutos, las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm. Una
muestra es considerado no reactivo si la absorbancia es menor que el valor de corte (Cut

38
off: Control Negativo [CN] + 0,300). Por otro lado, una muestra se considera reactiva si
la absorbancia es igual o mayor que el valor de corte. (Sáenz-Alquézar et al, 2004).
Los resultados se expresaron como densidad óptica (450 nm).

Análisis estadísticos. Los datos fueron analizados y comparados utilizando: ANAVA y

comparaciones múltiples por test de Fisher (parámetros electrocardiográficos y
serología); análisis de la varianza multivariado (MANOVA) por test de Hotelling
(parasitemia); test de sobrevida de Kaplan Meier (sobrevida); y Chi cuadrado de
Pearson (porcentajes de alteraciones en los ECG, porcentajes de infiltrados
inflamatorios y porcentaje de muestras PCR positivas). Fueron consideradas diferencias
significativas cuando p<0,05. El software utilizado fue Infostat.

39
RESULTADOS

La figura 7 muestra la evolución de los niveles de parásitos circulantes en sangre de los

grupos infectados con T. cruzi cepa Tulahuen (n = 90) y con el aislamiento SGO Z12 (n
= 90) a lo largo de la infección experimental. Como puede observarse, la curva de
parasitemia correspondiente al aislamiento SGO Z12 fue significativamente superior a
partir del día 21 post infección (p.i.) hasta el día 35 p.i. (P<0,0001), momento a partir
del cual ambos grupos comenzaron a negativizar sus parasitemias, manteniéndose de
esta manera hasta el final de los experimentos (360d.p.i.).

275 ∗

229
Parásitos por microlitro

183

138

92

∗
46

0
7 14 21 28 35 42 49
Días post infección

Figura 7:Evolución de las parasitemias de los ratones infectados con T. cruzi

cepa Tulahuen (n = 90) (
) y con el aislamiento SGO Z12 (n = 90) (♦). (∗)
indica diferencias significativas entre ambos grupos estudiados en los días
correspondientes (Test de Fisher; P<0,0001). Comparación entre ambas
curvas: test de Hotelling; P<0,0001.

Se considera que a partir del momento en que se negativiza la parasitemia detectada por
este método, los ratones infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12,
finalizan la etapa aguda e ingresan en la etapa crónica sin patología demostrada. A los
ratones de ambos grupos, a los 90 y 180 d.p.i. se les realizaron electrocardiogramas para
determinar el ingreso a la etapa crónica con patología demostrada.

40
 Tabla 4. Porcentaje de ratones que ingresaron a la etapa crónica con patología
demostrada a los 90 y180 d.p.i.

% de ratones que
ingresaron en la etapa
Días post infección Parásitos
crónica con patología
demostrada
Tulahuen 47
90
SGO Z12 36
Tulahuen 61
180
SGO Z12 62

A los ratones de cada grupo que ingresaron a la etapa crónica con patología demostrada
en cada momento según los estudios electrocardiográficos, se los dividió en: tratados
con clomipramina 5 mg/Kg/día durante 60 días y no tratado utilizado como control.

Tratamiento a los 90 d.p.i.

La efectividad del tratamiento en los diferentes diseños planteados se determinó a través

de estudios convencionales: electrocardiografía, histología (para cuantificar infiltrados
inflamatorios y áreas de fibrosis), PCR cualitativa y sobrevida, y estudios no
convencionales: PCR en tiempo real (cuantitativa) y serología con antígenos totales e
individuales (1, 2, 13, 30, 36 y SAPA).

Electrocardiogramas
Al grupo en la etapa crónica sin patología demostrada (es decir, sin alteraciones
electrocardiográficas –SA) y a los grupos en la etapa crónica con patología demostrada
T y NT se les realizaron electrocardiogramas cada 90 días hasta los 360 d.p.i.

En la tabla 5 se muestran los resultados de los estudios electrocardiográficos del grupo

infectado con la cepa Tulahuen. Cabe destacar que en la misma, las comparaciones de
los distintos momentos (180, 270 y 360 d.p.i.) se realizaron siempre con respecto a los
parámetros antes de iniciar el tratamiento. Como puede observarse, en los ratones NT el
porcentaje de ratones con alteraciones disminuyó, desde un 100%, con la evolución de

41
la infección (P< 0,0001) hasta llegar a un 50% de los individuos con alguna alteración
ECG a los 360 d.p.i. En los animales tratados (T 90) se observó una situación similar
(P< 0,0001), pero el porcentaje de ratones con alteraciones disminuye hasta un 0%.

En todos los momentos se encontraron diferencias significativas entre los grupos T y

NT (P< 0,001).

Tabla 5: Estudio electrocardiográfico de ratones infectados con T. cruzi cepa Tulahuen, sin y
con alteraciones ECG, NT y T (n=90).

Días % de ratones
Frecuencia
Grupo Post QRST (s) PR (s) con alteraciones
(latidos/min)
Infección EGC
Sin Infectar _ 555,54 ± 13,99 0,0298 ± 0,0008 0,0247 ± 0,0009 10
90 524,59 ± 161,10 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 100 (a)
180 431,71 ± 101,61 0,02 ± 0,049 0,04 33 (b)
NT 270 480 ± 83,67 0,01 ± 0,0022 0,04 50 (b)

CA 360 480 ± 83,67 0,01 ± 0,0022 0,04 50 (b)

180 411 ± 125,55 0,02 ± 0,0048 0,04 ± 0,038 57 (b)
Infectado T 90 270 532 ± 62,61 0,01 ± 0,0045 0,04 ± 0,0027 20 (b)
Tulahuen
360 532 ± 62,61 0,01 ± 0,0045 0,04 ± 0,0022 0 (b)
90 510,52 ± 70,29 0,04 ± 0,0048 0,03 ± 0,01 -

180 462,07 ± 72,65 0,04 ± 0,0013 0,02 ± 0,0039 -

SA
270 532,30 ± 80,16 0,04 ± 0,0024 0,01 ± 0,0035 -

360 532,30 ± 80,16 0,04 ± 0,0024 0,01 ± 0,0035 -

CA: con alteraciones ECG; SA: sin alteraciones ECG; NT: no tratado; T 90: tratado con clomipramina.

Letras distintas indican diferencias significativas entre los diferentes momentos con respecto al inicio
del tratamiento (90 d.p.i.) (Chi cuadrado de Pearson; P< 0,0001).

Los resultados de los estudios electrocardiográficos del grupo infectado con el

aislamiento SGO Z12 se muestran en la tabla 6. Al igual que en el caso anterior las
comparaciones de los distintos momentos (180, 270 y 360 d.p.i.) se realizaron siempre
con respecto a los parámetros antes de iniciar el tratamiento. En este caso, en los ratones
NT el porcentaje de los mismos con alteraciones disminuyó en un comienzo (P<
0,0001) y luego aumentó hasta que la totalidad presentó alteraciones ECG a los 360
d.p.i. En los animales T 90 se presentó una situación similar al grupo infectado con la
cepa Tulahuen, llegando a los 360 d.p.i con ningún ratón con alteraciones ECG.

42
En todos los momentos se encontraron diferencias significativas entre los grupos T y
NT (P< 0,0001), excepto a los 270 d.p.i.

Tabla 6: Estudio electrocardiográfico de ratones infectados con T. cruzi aislamiento SGO

Z12, sin y con alteraciones ECG, NT y T a los 90 d.p.i. (n=90).

Días % de ratones
Frecuencia
Grupo Post QRST (s) PR (s) con alteraciones
(latidos/min)
Infección EGC
Sin Infectar _ 555,54 ± 13,99 0,0298 ± 0,0008 0,0247 ± 0,0009 10
90 566,8 ± 91,47 0,05 ± 0,01 0,02 ± 0,0022 100 (a)
180 386,50 ± 160,51 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,0035 40 (b)
NT
270 667 0,04 0,015 50 (b)
CA 360 500 0,035 0,04 100 (a)
180 566,67 ± 57,74 0,04 ± 0,0029 0,02 ± 0,01 67 (b)
Infectado
T 90 270 633,50 ± 47,38 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,0035 50 (b)
SGO Z12
360 500 0,03 ± 0,0035 0,04 ± 0,01 0 (b)
90 554,88 ± 70,32 0,04 ± 0,003 0,02 ± 0,0041 -
180 516,75 ± 21,50 0,04 0,02 ± 0,025 -
SA
270 553,25 ± 35,50 0,04 ± 0,01 0,02 ± 0,0025 -
360 590,33 ± 16,74 0,035 ± 0,01 0,02 ± 0,0029 -

CA: con alteraciones ECG; SA: sin alteraciones ECG; NT: no tratado; T 90: tratado con clomipramina.

Letras distintas indican diferencias significativas entre los diferentes momentos con respecto al inicio
del tratamiento (90 d.p.i.) (Chicuadrado de Pearson; P< 0,0001).

PCR convencional
Las PCRs específicas para T. cruzi (utilizando los cebadores TCZ) se realizaron con el
fin de verificar la presencia de parásito en las diferentes etapas del estudio.
La calidad del ADN de las muestras se verificó mediante la amplificación de un gen
constitutivo del huésped (β actina).
En la figura 8 se puede observar la presencia del parásito en todos los grupos estudiados
e infectados con la cepa Tulahuen. A los 360 d.p.i el porcentaje de PCRs positivas para
los ratones NT y SA fue del 100% y en los T se observó una disminución significativa
(75%).
La figura 9 muestra la presencia de parásitos en la mayoría de los grupos infectados con
el aislamiento SGO Z12, excepto en los NT y T a los 270 d.p.i. A los 360 d.p.i los

43
ratones T y SA presentaron un 100% de PCRs positivas en sus muestras, no así los NT
donde la totalidad de las muestras presentaron PCRs negativas para T. cruzi.

b b b a a
100 100

a a a
Porcentaje de PCR positivas

Porcentaje de PCR positivas

80 ab a 80
b
b a
a bc
60 60
bb a

40 40

20 a 20

0 0
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 8: Porcentaje de ratones infectados Figura 9: Porcentaje de ratones infectados

con T. cruzi, cepa Tulahuen, con PCR con T. cruzi, aislamiento SGO Z12, con PCR
positivas, sin alteraciones ECG () y con positivas, sin alteraciones ECG () y con
alteraciones ECG (), tratados () y no alteraciones ECG (), tratados () y no
tratados (). Letras distintas indican tratados (). Letras distintas indican
diferencias significativas entre los diferentes diferencias significativas entre los diferentes
grupos en el mismo período de tiempo grupos en el mismo período de tiempo
(Chicuadrado de Pearson; P< 0,05). (Chicuadrado de Pearson; P< 0,05).

PCR en tiempo real

La tabla 7 muestra una disminución en la cantidad relativa del producto amplificado,
que corresponde a ADN del parásito, en el grupo infectado con la cepa Tulahuen y T a
lo largo de la infección, en comparación con el inicio del tratamiento; en los ratones NT
se pudo observar una mayor cantidad relativa del producto amplificado en todos los
períodos de tiempo en comparación con el inicio del tratamiento. Además, los ratones
NT, presentaron mayor cantidad relativa del producto amplificado que los T.

44
 Tabla 7: PCR en tiempo real de los diferentes grupos de tratamiento
infectados con la cepa Tulahuen en comparación con el momento antes
de iniciar los mismos (n=90).

Cantidad relativa
del producto de
Días post
Muestra amplificación en
infección
relación al inicio
del tratamiento

90 1,00

180 0,12
Tratados
270 5,21

360 0,59
CA
180 4,15
No
Infectado tratados 270 2,67
Tulahuen
360 2,25

90 0,04

180 0,31
SA
270 1,14

360 0,02
C con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG.
CA:

En el grupo infectado con el aislamiento SGO Z12 (Tabla 8) se observó un aumento en

la cantidad relativa del producto amplificado en los animales T, a lo largo de la
infección; los ratones NT se comportaron de manera diferente, disminuyendo la
cantidad relativa del producto amplificado en los diferentes períodos de tiempo en
comparación con el inicio del tratamiento.
Comparando ratones T y NT, los segundos presentaron menor carga parasitaria que los
primeros.

45
 Tabla 8: PCR en tiempo real de los diferentes grupos de tratamiento
infectados con el aislamiento SGO Z12 en comparación con el
momento antes de iniciar los mismos (n= 90).

Cantidad relativa
del producto
Días post
Muestra amplificado en
infección
relación al inicio
del tratamiento

90 1,00

180 1,23
Tratados
270 2,06

360 4,05
CA
180 1,85
No
Infectado tratados 270 0.74
SGO Z12
360 0.62

90 1,13

180 5,43
SA
270 1,97

360 2,57
CA: con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG.

Serología
Las figuras 10 y 11 muestran la concentración de los antígenos recombinantes totales a
lo largo de la infección experimental para los grupos infectados con la cepa Tulahuen y
el aislamiento SGO Z12 respectivamente y sus correspondientes tratamientos.

46
 3,00
a 3,00 ♦a

b ♦b

c ♦c
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 10: Concentración de los antígenos Figura 11: Concentración de los antígenos
totales en ratones infectados con T. cruzi, totales en ratones infectados con T. cruzi,
cepa Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y
NT (
). (n=90). (Densidad óptica: 450 nm). NT (♦). (n=90). (Densidad óptica: 450 nm).
(Letras diferentes indican diferencias (Letras diferentes indican diferencias
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). significativas P< 0,0001. Test de Hotelling).

Teniendo en cuenta la evolución de la concentración de cada uno de los antígenos

individualmente, se pudo observar que el antígeno 1 (figuras 12 y 13) presentó una
disminución significativa en el los ratones T con respecto a los SA y NT a lo largo de la
infección.

En la figura 14, que muestra la evolución de los niveles del antígeno 2, se pueden
observar diferencias significativas entre los distintos tratamientos de los grupos
infectados con la cepa Tulahuen. En los grupos infectados con el aislamiento SGO Z12
no se observan diferencias significativas entre los animales T y NT.

47
 3,00
a 3,00 ♦a

b ♦b

b ♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 12: Concentración de los niveles del Figura 13: Concentración de los niveles del
antígeno 1 en ratones infectados con T. antígeno 1 en ratones infectados con T.
cruzi, cepa Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T
CA, NT (
). (n=90). (Densidad óptica: 450 (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican
nm). (Letras diferentes indican diferencias
diferencias significativas P< 0,0001. Test de
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). Hotelling).

3,00
a 3,00 ♦a

b ♦b

c ♦ab
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica

1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 14: Concentración de los niveles del Figura 15: Concentración de los niveles del
antígeno 2 en ratones infectados con T. antígeno 2 en ratones infectados con T.
cruzi, con la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA; T
(
) y CA, NT (
). (n=90). (Densidad (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican
diferencias significativas P< 0,0001. Test de diferencias significativas P< 0,0001. Test de
Hotelling). Hotelling).

48
Los resultados obtenidos en los diferentes grupos infectados con la cepa Tulahuen,
utilizando la concentración del antígeno 13, demostró una disminución significativa de
anticuerpos entre los animales T y los demás grupos (figura 16); de manera similar, el
grupo infectado con el aislamiento SGO Z12 y T presenta diferencias significativas
entre éste y los demás grupos (figura 17).

3,00
a 3,00 ♦a

b ♦b

c
♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 16: Concentración de los niveles del Figura 17: Concentración de los niveles del
antígeno 13 en ratones infectados con T. antígeno 13 en ratones infectados con T.
cruzi, con la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T
(
) y CA, NT(
). (n=90). (Densidad (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican óptica: 450 nm).(Letras diferentes indican
diferencias significativas P< 0,0001. Test de diferencias significativas P< 0,0001. Test de
Hotelling) Hotelling)

La figura 18 muestra que no se encontraron diferencias significativas en los niveles del

antígeno 30 entre los diferentes tratamientos de los grupos infectados con la cepa
Tulahuen. Como puede observarse en la figura 19, el grupo infectado con el asilamiento
SGO Z12 y NT, presentó diferencias significativas con respecto a los demás grupos.
Con respecto al antígeno 36, en los grupos infectados con la cepa Tulahuen y con los
diferentes tratamientos se observaron diferencias significativas con los ratones NT
(figura 20); no así en el grupo infectado con el aislamiento SGO Z12, donde los
distintos grupos no presentaron diferencias significativas entre ellos (figura 21).

49
 3,00
a 3,00 ♦a

a ♦a

a ♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 18: Concentración de los niveles del Figura 19: Concentración de los niveles del
antígeno 30 en ratones infectados con T. antígeno 30 en ratones infectados con T.
cruzi, con la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T
(
) y CA, NT (
). (n=90). (Densidad (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican
diferencias significativas P< 0,0001. Test de diferencias significativas P< 0,0001. Test de
Hotelling). Hotelling).

3,00
a 3,00 ♦a

a ♦a

b ♦a
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica

1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 20: Concentración de los niveles del Figura 21: Concentración de los niveles del
antígeno 36 en ratones infectados con T. antígeno 36 en ratones infectados con T.
cruzi, con la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T
(
) y CA, NT (
). (n=90). (Densidad (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad óptica:
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican 450 nm). (Letras diferentes indican
diferencias significativas P< 0,0001. Test de diferencias significativas P< 0,0001. Test de
Hotelling). Hotelling).

50
En la evolución de la concentración del antígeno SAPA, se pudo observar que el grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12 y T, muestra diferencias significativas con
respecto a los grupos SA y NT (figura 23).

3,00
a 3,00 ♦a

a ♦b

b ♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 22: Concentración de los niveles del Figura 23: Concentración de los niveles del
antígeno SAPA en ratones infectados con T. antígeno SAPA en ratones infectados con T.
cruzi, con la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T cruzi, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T
(
) y CA, NT (
). (n=90). (Densidad (♦) y CA, NT (♦). (n=90). (Densidad
óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican óptica: 450 nm). (Letras diferentes indican
diferencias significativas P< 0,0001. Test de diferencias significativas P< 0,0001. Test de
Hotelling). Hotelling).

Histopatología

Cuantificación de infiltrados inflamatorios

Las figuras 24 y 25 muestran el porcentaje del área del corazón cubierta por infiltrados
inflamatorios en los diferentes grupos estudiados a lo largo de la infección. Como puede
observarse, tanto en los grupos infectados con la cepa Tulahuen como en aquellos
infectados con el aislamiento SGO Z12, el área del corazón cubierta por infiltrados se
mantuvo por debajo del 1%. En ME (figuras 26 y 27), el área cubierta por infiltrados
inflamatorios fue levemente superior al MC del mismo grupo.

51
 Figura 24: Porcentaje de infiltrados Figura 25: Porcentaje de infiltrados
inflamatorios en MC de ratones infectados inflamatorios en MC de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuen en los grupos con T. cruzi, aislamiento SGO Z12 en los
SA ( y ); CA: antes del tratamiento () grupos SA ( y ); CA antes () del
y después, T () y NT () (Tinción: HE). tratamiento y después, T () y NT ()
(Tinción: HE).

20
b
20
Porcen taje de in filtrados inflam atorios

18
Porcentaje de infiltrados inflam atorios

18

16 16
b
13 13

11 11

9 9

7
7 a
4
4 a
a a
aa a 2
2
a a
0
0
90 180 270 360
90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 26: Porcentaje de infiltrados Figura 27: Porcentaje de infiltrados

inflamatorios en ME de ratones infectados inflamatorios en ME de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuen en los grupos SA con T. cruzi, aislamiento SGO Z12 en los
( y ); CA: antesdel tratamiento () y grupos SA ( y ); CA antes () del
después, T () y NT () (Tinción: HE). tratamiento y después, T () y NT ()
Letras distintas indican diferencias (Tinción: HE).
significativas entre los diferentes grupos en el
mismo período de tiempo (Chicuadrado de
Pearson; P< 0,05).

52
Cuantificación de áreas de fibrosis

Con respecto a las áreas cubiertas por fibrosis en el MC, se puede observar que al final
de la infección (360 d.p.i.) en los grupos infectados con la cepa Tulahuen, el grupo T
fue el que presentó un ligero aumento en el porcentaje de áreas de fibrosis (figura 28),
sucediendo lo mismo en el grupo infectado con el aislamiento SGO Z12 (figura 29).

Figura 28: Porcentaje de área con fibrosis Figura 29: Porcentaje de área con fibrosis
en MC de ratones infectados con T. cruzi, en MC de ratones infectados con T. cruzi,
cepa Tulahuen en los grupos SA ( y ); aislamiento SGO Z12 en los grupos SA (
CA: antes del tratamiento () y después, T y ); CA antes () del tratamiento y
() y NT () (Tinción: TG). después, T () y NT () (Tinción: TG).

En las figuras 30 y 31 se pueden observar los porcentajes de áreas de fibrosis en ME, en

los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12, respectivamente.
Las mismas muestran que al final de la infección, en ambos grupos, el grupo SA fue el
que presentó mayor porcentaje de áreas con fibrosis.

53
 22 22
b

Po rcen taje d e área co n fib ro sis

20

Po rcen taje d e área co n fib ro sis

20

17 17

15 15

12 12

10 10

7 a 7
a a
5 aa 5
a aa
2 a 2
a
0 0
90 180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 30: Porcentaje de área con fibrosis en Figura 31: Porcentaje de área con fibrosis
ME de ratones infectados con T. cruzi, cepa en ME de ratones infectados con T. cruzi,
Tulahuen en los grupos SA ( y ); CA: aislamiento SGO Z12 en los grupos SA (
antes del tratamiento () y después, T () y y ); CA antes () del tratamiento y
NT () (Tinción: TG). Letras distintas después, T () y NT () (Tinción: TG).
indican diferencias significativas entre los
diferentes grupos en el mismo período de
tiempo (Chicuadrado de Pearson; P< 0,05).

Infiltrados inflamatorios

Las figuras 32 y 33 muestran cortes histológicos de MC y ME respectivamente,

correspondientes al grupo sin infección. Estos cortes se tomaron como control para la
comparación con los obtenidos de los grupos infectados con T. cruzi.

a b c d

Figura 32: MC de ratones sin infección. Se Figura 33: ME de ratones sin infección. Se
observa una estructura muscular sin observa una estructura muscular sin
alteraciones. a) Tinción HE y b) Tinción TG. alteraciones. c) Tinción HE y d) Tinción TG.
Aumento 200X. n= 3 cortes. Aumento 200X. n= 3 cortes.

54
 Las figuras 34 y 35 muestran cortes histológicos de MC y ME correspondientes a los
grupos SA y CA respectivamente, a los 90 d.p.i. En MC, tanto en los grupos infectados
con la cepa Tulahuen, como con el aislamiento SGO Z12, se observaron leves
infiltrados inflamatorios (figura 34 a y c; 35 a y c). Por el contrario, el ME, presentó
mayor porcentaje en ambos grupos (figura 34 b y d; 35 b y d).

Sin alteraciones Con alteraciones

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

b d
MC MC

 b d b d



ME ME




Figura 34: Secciones histológicas Figura 35: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) correspondientes al grupo CA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12 infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (tinción: HE) 200X; (: infiltrados
inflamatorios). inflamatorios).

55
A los 180 d.p.i en los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12
se observó la presencia de leves infiltrados inflamatorios en MC tanto en los grupos SA
(figura 36 a y c), NT (figura 37 a y c) y T (figura 38 a y c). En ME se pudo observar
mayor presencia de infiltrados inflamatorios en todos los grupos mencionados
anteriormente.

Sin alteraciones
Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

 

Figura 36: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X;
(: infiltrados inflamatorios).

56
 No tratados Tratados
Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c


MC MC


b d b d




ME  ME

Figura 37: Secciones histológicas Figura 38: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
ME del grupo infectado con la cepa del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo MC y d) ME del grupo infectado con el
infectado con el aislamiento SGO Z12 aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X;
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (: infiltrados inflamatorios).
inflamatorios).

A los 270 d.p.i, se observa un perfil similar a los 180 d.p.i, se detecta mayor cantidad de
infiltrados inflamatorios en ME (figura 39, 40 y 41).

57
 Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC


b d

ME


Figura 39: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X; (:
infiltrados inflamatorios).

No Tratados Tratados
Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC MC

b b d



ME ME

 



Figura 40: Secciones histológicas Figura 41: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
ME del grupo infectado con la cepa del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo MC y d) ME del grupo infectado con el
infectado con el aislamiento SGO Z12 aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X;
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (: infiltrados inflamatorios).
inflamatorios).

58
Los estudios histopatológicos del MC y el ME de los ratones infectados con la cepa
Tulahuen, a los 360 d.p.i, mostraron un mayor porcentaje de infiltrados inflamatorios en
el grupo NT en ambos tejidos, pero en mayor proporción en ME (figura 42, 43 y 44).
Los grupos infectados con el aislamiento SGO Z12, presentaron mayor porcentaje de
infiltrados inflamatorios en el grupo SA en MC y el grupo T para ME. Siempre el ME
presentó mayor porcentaje de infiltrados inflamatorios que el MC.

Sin alteraciones
Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d



ME

Figura 42: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados
inflamatorios).

59
 No Tratados Tratados
Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC  MC

 

b d b d

 

ME ME
  

Figura 43: Secciones histológicas Figura 44: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
ME del grupo infectado con la cepa del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo MC y d) ME del grupo infectado con el
infectado con el aislamiento SGO Z12 aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X;
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (: infiltrados inflamatorios).
inflamatorios).

Áreas de fibrosis

En la figura 45 y 46 se pueden observar cortes histológicos de MC y ME

correspondientes a los grupos SA y CA a los 90 d.p.i. En MC se observaron leves focos
de fibrosis. Por el contrario, el ME, presentó mayor porcentaje de fibrosis.

60
 Sin alteraciones Con alteraciones
Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC
MC

b d b d




ME
ME

Figura 45: Secciones histológicas Figura 46: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME correspondientes al grupo CA a) MC y b)
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) ME del grupo infectado con la cepa
MC y d) ME del grupo infectado con el Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
: infectado con el aislamiento SGO Z12
fibrosis). (tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

Las figuras 47, 48 y 49 muestran cortes histológicos de MC y ME correspondientes a

los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12, SA y CA; T y
NT a los 180 d.p.i. Todos los grupos analizados presentaron leves focos de fibrosis, el
mayor porcentaje se encontró en ME.

61
 Sin alteraciones
Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

ME

Figura 47: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

No Tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c




MC MC

b d b
d

ME
ME

Figura 48: Secciones histológicas Figura 49: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12 infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis). (tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

62
Las figuras 50, 51 y 52 muestran cortes histológicos de MC y ME correspondientes a
los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12, SA y CA; T y
NT a los 270 d.p.i, presentando las mismas alteraciones mencionadas anteriormente.

Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

ME

Figura 50: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
:
fibrosis).

63
 No Tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c




MC MC

b d b d


ME


ME

Figura 51: Secciones histológicas Figura 52: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
ME del grupo infectado con la cepa del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo MC y d) ME del grupo infectado con el
infectado con el aislamiento SGO Z12 aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X;
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis). (
: fibrosis).

A los 360 d.p.i., el MC y ME de los ratones infectados con la cepa Tulahuen y el

aislamiento SGO Z12, presentaron similares alteraciones a los demás períodos
mencionados con anterioridad, es decir, leves áreas de fibrosis en ambos tejidos.

64
 Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

ME

Figura 53: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

No Tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC MC

b d b d

ME ME

Figura 54: Secciones histológicas Figura 55: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) ME correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
: aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
:
fibrosis). fibrosis).
65
Sobrevida

Las figuras 56 y 57 muestran la sobrevida de los diferentes grupos a lo largo de la

evolución de la infección, hasta los 360 d.p.i. Como puede observarse en los grupos
infectados con la cepa Tulahuen (figura 56) el mayor porcentaje de sobrevida lo
presentaron los ratones T (67%), luego los NT (63%) y por último el grupo SA (27%).
Como puede observarse en la figura 57, se encontraron diferencias significativas entre
los 3 grupos infectados con el aislamiento SGO Z12, presentando los ratones T un
porcentaje significativamente superior (P<0,0001) a los demás grupos (100%).

1,00 1,00 a

0,75 0,75
a
a
Sobrevida
Sobrevida

0,50 0,50 b

b c
0,25 0,25

0,00 0,00
0 90 180 270 360 0 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 56: Sobrevida de los grupos Figura 57: Sobrevida de los grupos
infectados con T. cruzi, cepa Tulahuen, SA infectados con T. cruzi, aislamiento SGO
(
); CA, T (
) y CA, NT (
), (n = 90). Z12, SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦), (n =
(Letras diferentes indican diferencias 90). (Letras diferentes indican diferencias
significativas. Chi cuadrado de PearsonP<
significativas. Chi cuadrado de PearsonP<
0,0001).
0,0001).

66
Tratamiento a los 180 d.p.i

En la tabla 9 se muestran los resultados de los estudios electrocardiográficos del grupo

infectado con la cepa Tulahuen. En la misma las comparaciones de los distintos
momentos (180, 270 y 360 d.p.i.) se realizaron siempre con respecto a los parámetros
antes de iniciar el tratamiento. Como puede observarse, en los ratones NT el porcentaje
con alteraciones disminuye con la evolución de la infección (P< 0.0001) hasta llegar a
un 33% de los individuos con alguna alteración ECG a los 360 d.p.i. En los animales T
se presenta una situación similar (P< 0.0001), pero el porcentaje de ratones con
alteraciones disminuye hasta un 50%.

En todos los momentos se encontraron diferencias significativas entre los grupos

tratados y no tratados (P< 0,001).

Tabla 9: Estudio electrocardiográfico de ratones infectados con T. cruzi cepa Tulahuen, sin
y con alteraciones ECG, NT y T (n= 90).

Días % de ratones
Frecuencia
Grupo Post QRST (s) PR (s) con alteraciones
(latidos/min)
Infección ECG
Sin Infectar _
555.54 ± 13.99 0.0298 ± 0.0008 0.0247 ± 0.0009 10

180 410.45 ± 122.97 0.02 ± 0.0038 0.04 ± 0.0032 100 (a)

270 533.33 ± 57.74 0.01 ± 0.0029 0.04 ± 0.01 33 (b)

NT
CA 360 533.33 ± 57.74 0.01 ± 0.0029 0.04 ± 0.01 33 (b)

270 456.60 ± 77.68 0.01 ± 0.0027 0.04 ± 0.0045 60 (b)

Infectado T 180
Tulahuen 360 463.83 ± 71.71 0.01 ± 0.0026 0.04 ± 0.0042 50 (b)

90 510.52 ± 70.29 0.04 ± 0.0048 0.03 ± 0.01 -

180 462.07 ± 72.65 0.04 ± 0.0013 0.02 ± 0.0039 -
SA
270 532.30 ± 80.16 0.04 ± 0.0024 0.01 ± 0.0035 -
360 532.30 ± 80.16 0.04 ± 0.0024 0.01 ± 0.0035 -
CA: con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG. NT: no tratado; T 180: tratado con clomipramina.

Letras distintas indican diferencias significativas entre los diferentes momentos con respecto al inicio
del tratamiento (180 d.p.i.) (Chi cuadrado de Pearson; P< 0,0001).

67
En el análisis electrocardiográfico del grupo infectado con el aislamiento SGO Z12, se
pudo observar que el grupo CA y NT mantuvo el porcentaje de alteraciones ECG que
presentaba antes de iniciar el tratamiento (100%), a los 360 d.p.i. De manera diferente
se comportaron los ratones T los cuales, a los 360 d.p.i, presentaron una disminución
significativa (P< 0.0001) con respecto al momento antes de iniciar el tratamiento (50%).
En todos los momentos se encontraron diferencias significativas entre los animales
tratados y no tratados (P< 0,001).

Tabla 10: Estudio electrocardiográfico de ratones infectados con T. cruzi aislamiento SGO
Z12, sin y con alteraciones ECG, NT y T (n= 90).

Días % de ratones
Frecuencia
Grupo Post QRST (s) PR (s) con alteraciones
(latidos/min)
Infección ECG
Sin Infectar _ 10
555.54 ± 13.99 0.0298 ± 0.0008 0.0247 ± 0.0009

180 439,33 ± 145,80 0,03 ± 0,01 0.02 ± 0.029 100 (a)

270 626,33 ± 70,44 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01 80 (b)

NT
CA 360 500 0.04 0.035 100 (a)

270 667 0.025 0.03 50 (b)

T 180
Infectado 360 600 0.04 0.04 50 (b)
SGO 12
90 554.88 ± 70,32 0.04 ± 0.003 0.02 ± 0.0041 -

180 516,75 ± 21,50 0,04 0,02 ± 0.025 -

SA
270 553,25 ± 35,50 0,04 ± 0,01 0.02 ± 0.0025 -

360 590,33 ± 16,74 0,035 ± 0,01 0.02 ± 0.0029 -

CA: con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG. NT: no tratado; T 180: tratado con clomipramina.

Letras distintas indican diferencias significativas entre los diferentes momentos con respecto al inicio
del tratamiento (180 d.p.i.) (Chi cuadrado de Pearson; P< 0,0001).

PCR convencional
La figura 58, muestra que el parásito se encontró en todos los grupos infectados con la
cepa Tulahuen analizados a lo largo de la infección, en un porcentaje del 100% en los
ratones NT y SA a los 360 d.p.i, no así en los ratones T donde se pudo observar que el
67% de las muestras fueron positivas para T. cruzi en ese mismo momento.

68
En los grupos infectados con el aislamiento SGO Z12, todos presentaron PCR positivas
en los diferentes períodos de tiempo, excepto en el grupo SA a los 270 d.p.i, donde no
se detectó la presencia del parásito en las muestras. A los 360 d.p.i, los animales T y
NT, presentaron un porcentaje del 50% de muestras positivas para T. cruzi; en el grupo
SA el porcentaje fue del 100% (figura 59).

bb b
100 100
Porcentaje de PCR positivas

Porcentaje de PCR positivas

80 80
c a
a
60 b 60
a b a a
a
40 40 a
a b

20 20

0 0
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 58: Porcentaje de ratones infectados Figura 59: Porcentaje de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuen; con PCR con T. cruzi, aislamiento SGO Z12; con PCR
positivas, SA () y CA (), T () y NT (). positivas, SA () y CA (), T () y NT ().
Letras distintas indican diferencias Letras distintas indican diferencias
significativas entre los diferentes grupos (Chi significativas entre los diferentes grupos (Chi
cuadrado de Pearson; P< 0,05). cuadrado de Pearson; P< 0,0001).

PCR Tiempo Real

En la tabla 11 se puede observar que en los grupos infectados con la cepa Tulahuen, T y
NT se produce una disminución de la carga parasitaria a lo largo de la infección. A
diferencia de lo mencionado anteriormente, en los grupos infectados con el asilamiento
SGO Z12, los ratones T y NT aumentan la cantidad relativa del producto amplificado
presente en las muestras con respecto al inicio del tratamiento, a lo largo de la infección
(Tabla 12).

69
Tabla 11: PCR en tiempo real de los diferentes grupos de tratamiento
infectados con la cepa Tulahuen en comparación con el momento
antes de iniciar los mismos (n= 90).

Cantidad relativa
del producto de
Días post
Muestra amplificación en
infección
relación al inicio
del tratamiento

180 1,00

270 0,13
Tratados
360 0,08
CA
No 270 0,06
tratados
Infectado 360 0,02
Tulahuen
90 0,04

180 0,31
SA
270 1,14

360 0,02

CA: con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG.

Tabla 12: PCR en tiempo real de los diferentes grupos de

tratamiento infectados con el aislamiento SGO Z12 en
comparación con el momento antes de iniciar los mismos (n= 90).

Cantidad relativa
del producto de
Días post
Muestra amplificación en
infección
relación al inicio
del tratamiento

180 1,00

270 24
Tratados
360 16,77
CA
No 270 1,25
tratados
Infectado 360 1,13
SGO Z12
90 5,43

180 1,97
SA
270 2,57

360 24

CA: con alteraciones ECG. SA: sin alteraciones ECG.

70
Serología

Las figuras 60 y 61 muestran la concentración de los antígenos recombinantes totales a

lo largo de la infección experimental para los grupos infectados con la cepa Tulahuen y
el aislamiento SGO Z12 respectivamente y sus correspondientes tratamientos.

3,00
ab 3,00 ♦a

b ♦a

a
♦a
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 60: Concentración de los antígenos Figura 61: Concentración de los antígenos
totales en ratones infectados con T. cruzi, con totales en ratones infectados con T. cruzi,
la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y
NT (
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). CA, NT (♦). (n= 90). (Densidad óptica: 450
(Letras diferentes indican diferencias nm). (Letras diferentes indican diferencias
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). significativas P< 0,0001. Test de Hotelling).

Los resultados obtenidos en los diferentes grupos infectados con la cepa Tulahuen,
utilizando el antígeno 1 demostraron diferencias significativas entre los ratones T, los
cuales manifestaron una disminución significativa de anticuerpos a lo largo de la
infección con respecto a los NT (figura 62). En los grupos infectados con el aislamiento
SGO Z12 no se observaron diferencias entre los grupos (figura 63).

Las figuras 64 y 65 muestran las concentraciones plasmáticas del antígeno 2 en los

grupos infectados con la cepa Tulahuen (figura 64) y con el aislamiento SGO Z12
(figura 65). En ambos grupos no se observa disminución de los niveles de anticuerpos
en los ratones T con respecto a los NT.

71
 3,00
a 3,00 ♦a

a ♦a

b
♦a
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 62: Concentración del antígeno 1 en Figura 63: Concentración del antígeno 1 en
ratones infectados con T. cruzi, con la cepa ratones infectados con T. cruzi, aislamiento
Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, NT SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦).
(
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (Letras
(Letras diferentes indican diferencias diferentes indican diferencias significativas
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). P< 0,0001. Test de Hotelling).

3,00
a 3,00
♦a

b ♦ ab

c
♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica

1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 64: Concentración del antígeno 2 en Figura 65: Concentración del antígeno 2 en
ratones infectados con T. cruzi, con la cepa ratones infectados con T. cruzi, aislamiento
Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, NT SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦).
(
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (Letras
(Letras diferentes indican diferencias diferentes indican diferencias significativas
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). P< 0,0001. Test de Hotelling).

72
Analizando la concentración del antígeno 13 a lo largo de la infección, se observó que el
grupo infectado con la cepa Tulahuen y T presentó un marcado descenso en los niveles
de anticuerpos, presentando diferencias significativas (P< 0,0001) con respecto a los
demás grupos (figura 66). Algo similar sucedió en los grupos infectados con el
aislamiento SGO Z12, donde los ratones T presentaron niveles inferiores de anticuerpos
al compararlos con los demás grupos (figura 67).

3,00
a 3,00
♦a

b

c
♦b
♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 66: Concentración del antígeno 13 en Figura 67: Concentración del antígeno 13 en
ratones infectados con T. cruzi, con la cepa ratones infectados con T. cruzi, aislamiento
Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, NT SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦).
(
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (Letras
(Letras diferentes indican diferencias diferentes indican diferencias significativas
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). P< 0,0001. Test de Hotelling).

La figura 68 muestra la concentración del antígeno 30 en los grupos infectados con la

cepa Tulahuen (figura 68), donde no se observan diferencias significativas entre los
diferentes grupos analizados. En los grupos infectados con el aislamiento SGO Z12
(figura 69), los animales T presentan diferencias significativas con respecto a los NT
(P< 0,0001).

Las figuras 70 y 71 muestran la concentración del antígeno 36 en los grupos infectados

con la cepa Tulahuen y con el aislamiento SGO Z12, respectivamente. En ambos grupos
se observa diferencias significativas (P< 0,0001) entre los ratones T y NT.

73
 3,00
a 3,00 ♦a

a ♦a

a
♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 68: Concentración del antígeno 30 en Figura 69: Concentración del antígeno 30 en
ratones infectados con T. cruzi, con la cepa ratones infectados con T. cruzi, aislamiento
Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, NT SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦).
(
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (Letras
(Letras diferentes indican diferencias diferentes indican diferencias significativas
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). P< 0,0001. Test de Hotelling).

3,00
a 3,00 ♦a

a ♦b

b ♦c
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica

1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 70: Concentración del antígeno 36 en Figura 71: Concentración del antígeno 36 en
ratones infectados con T. cruzi, con la cepa ratones infectados con T. cruzi, aislamiento
Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, NT SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y CA, NT (♦).
(
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). (Letras
(Letras diferentes indican diferencias diferentes indican diferencias significativas
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). P< 0,0001. Test de Hotelling).

74
Las curvas de concentración del antígeno SAPA, se observan en las figuras 72 y 73 en
los diferentes grupos, infectados con la cepa Tulahuen (figura72) y con el aislamiento
SGO Z12 (figura73). Ambos mostraron diferencias significativas entre los animales T y
NT, siendo los primeros los que presentaron menor valor de densidad óptica al final de
la infección (360 d.p.i).

3,00
a 3,00 ♦a

b ♦b

b
♦b
2,25 2,25
Densidad óptica

Densidad óptica
1,50 1,50

0,75 0,75

0,00 0,00
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 72: Concentración del antígeno Figura 73: Concentración del antígeno
SAPA en ratones infectados con T. cruzi, con SAPA en ratones infectados con T. cruzi,
la cepa Tulahuen. SA (
); CA, T (
) y CA, aislamiento SGO Z12. SA (♦); CA, T (♦) y
NT (
). (n= 90). (Densidad óptica: 450 nm). CA, NT (♦). (n= 90). (Densidad óptica: 450
(Letras diferentes indican diferencias nm). (Letras diferentes indican diferencias
significativas P< 0,0001. Test de Hotelling). significativas P< 0,0001. Test de Hotelling).

Histopatología

Cuantificación de infiltrados inflamatorios

Las figuras 74 y 75 muestran el porcentaje del área del corazón cubierta por infiltrados
inflamatorios en los diferentes grupos estudiados a lo largo de la infección. Como puede
observarse, tanto en los grupos infectados con la cepa Tulahuen como en aquellos
infectados con el aislamiento SGO Z12, el área del corazón cubierta por infiltrados se
mantuvo por debajo del 1%. En ME (figuras 76 y 77) el área cubierta por infiltrados
inflamatorios fue levemente superior al MC del mismo grupo.

75
 Figura 74: Porcentaje de infiltrados Figura 75: Porcentaje de infiltrados
inflamatorios en MC de ratones infectados inflamatorios en MC de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuen en los grupos con T. cruzi, aislamiento SGO Z12 en los
sin alteraciones ECG ( y ); con grupos sin alteraciones ECG ( y ); con
alteraciones ECG: antes del tratamiento () alteraciones ECG antes () del tratamiento y
y después, T () y NT () (Tinción: HE). después, T () y NT () (Tinción: HE).

20 20
Po rcen taje d e in filtrad o s in flam ato rio s
Po rcen taje d e in filtrad o s in flam ato rio s

18 18
b
16 16

13 13

11 11

9 9

7 a 7

4
a 4
a
2 a a 2
a a
0 0
180 270 360 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 76: Porcentaje de infiltrados Figura 77: Porcentaje de infiltrados

inflamatorios en ME de ratones infectados inflamatorios en ME de ratones infectados
con T. cruzi, cepa Tulahuen en los grupos con T. cruzi, aislamiento SGO Z12 en los
sin alteraciones ECG ( y ); con grupos sin alteraciones ECG ( y ); con
alteraciones ECG: antesdel tratamiento () alteraciones ECG antes () del tratamiento
y después, T () y NT () (Tinción: HE). y después, T () y NT () (Tinción: HE).

76
Cuantificación de áreas de fibrosis

En relación a las áreas cubiertas por fibrosis en el MC, se puedo observar que al final de
la infección (360 d.p.i.) en los grupos infectados con la cepa Tulahuen, los animales NT
presentaron mayor porcentaje de área de fibrosis (figura 78). En los grupos infectados
con el aislamiento SGO Z12 (figura 79), los animales T fueron los que presentaron
mayor porcentaje de fibrosis.

Figura 78: Porcentaje de área con fibrosis Figura 79: Porcentaje de área con fibrosis
en MC de ratones infectados con T. cruzi, en MC de ratones infectados con T. cruzi,
cepa Tulahuen en los grupos sin aislamiento SGO Z12 en los grupos sin
alteraciones ECG ( y ); con alteraciones alteraciones ECG ( y ); con alteraciones
ECG: antesdel tratamiento () y después, T ECG antes () del tratamiento y después, T
() y NT () (Tinción: TG). () y NT () (Tinción: TG).

En las figuras 80 y 81 se pueden observar los porcentajes de áreas de fibrosis en ME, en

los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12, respectivamente.
Las mismas muestran que al final de la infección, en ambos grupos, los animales T
presentaron menor porcentaje de áreas con fibrosis, en relación a los demás grupos.

77
 22 22

Porcentaje de área co n fibrosis

20 20

Po rcen taje d e área d e fib ro sis

17 17
15 15
12 12
10 10

7 7

5 5

2 2

0 0
180 270 360 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 80: Porcentaje de área con fibrosis Figura 81: Porcentaje de área con fibrosis
en ME de ratones infectados con T. cruzi, en ME de ratones infectados con T. cruzi,
cepa Tulahuen en los grupos sin aislamiento SGO Z12 en los grupos sin
alteraciones ECG ( y ); con alteraciones alteraciones ECG ( y ); con alteraciones
ECG: antesdel tratamiento () y después, T ECG antes () del tratamiento y después, T
() y NT () (Tinción: TG). () y NT () (Tinción: TG).

Infiltrados inflamatorios

A los 180 d.p.i se observan cortes histológicos de MC y ME correspondientes a los

grupos SA y CA respectivamente, en los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el
aislamiento SGO Z12. Se observó la presencia de leves infiltrados inflamatorios en
ambos tejidos.

78
 Sin alteraciones Con alteraciones

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC
MC


b d b d



ME ME

Figura 82: Secciones histológicas Figura 83: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) correspondientes al grupo CA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12 infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (tinción: HE) 200X; (: infiltrados
inflamatorios). inflamatorios).

Los estudios histopatológicos de los ratones infectados con la cepa Tulahuen y con el
asilamiento SGO Z12, a los 270 d.p.i, mostraron menor porcentaje de infiltrados
inflamatorios en MC que en ME en todas las muestras estudiadas (figuras 84, 85 y 86).

79
 Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d


ME
 

Figura 84: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X; (:
infiltrados inflamatorios).

No tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c



MC MC

b d b d

ME  ME



Figura 85: Secciones histológicas Figura 86: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
ME del grupo infectado con la cepa del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo MC y d) ME del grupo infectado con el
infectado con el aislamiento SGO Z12 aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X;
(tinción: HE) 200X; (: infiltrados (: infiltrados inflamatorios).
inflamatorios).

80
Al final del estudio, a los 360 d.p.i, la totalidad de los grupos, infectados con la cepa
Tulahuen o el aislamiento SGO Z12, presentaron mayor porcentaje de infiltrados
inflamatorios en ME que en MC, como se observara en períodos anteriores (figuras 87,
88 y 89).

Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d


ME

Figura 87: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X; (:
infiltrados inflamatorios).

81
 No Tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c


MC MC


b d b d


ME   ME




Figura 88: Secciones histológicas Figura 89: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) ME correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X; (: aislamiento SGO Z12 (tinción: HE) 200X; (:
infiltrados inflamatorios). infiltrados inflamatorios).

Areas de fibrosis

En las muestras de MC y ME utilizadas para determinar el área de fibrosis, a los 180

d.p.i., se puedo observar que en los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el
aislamiento SGO Z12, tanto en los grupos SA como CA se presentaron leves áreas de
fibrosis (figura 90 y 91).

82
 Sin alteraciones Con alteraciones

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC MC

b d b d

ME ME

Figura 90: Secciones histológicas Figura 91: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b) ME correspondientes al grupo CA a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
: aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
:
fibrosis). fibrosis).

Las figuras 92, 93 y 94 muestran cortes histológicos de MC y ME correspondientes a

los grupos infectados con la cepa Tulahuen y el aislamiento SGO Z12, SA y C, T y NT
a los 270 d.p.i. Todos los grupos analizados presentaron leves focos de fibrosis, el
mayor porcentaje se encontró en ME.

83
 Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

ME

Figura 92: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

No Tratados Tratados
Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC MC

b d b d

ME ME

Figura 93: Secciones histológicas Figura 94: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) ME correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
: aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
:
fibrosis). fibrosis).

84
A los 360 d.p.i., los corazones y el ME de los ratones infectados con la cepa Tulahuen y
el aislamiento SGO Z12, presentaron similares alteraciones a los demás períodos
mencionados con anterioridad, es decir, leves áreas de fibrosis en ambos tejidos,
principalmente en MC (figuras 95, 96 y 97).

Sin alteraciones

Tulahuen SGO Z12

a c

MC

b d

ME

Figura 95: Secciones histológicas

correspondientes al grupo SA a) MC y b)
ME del grupo infectado con la cepa
Tulahuen; c) MC y d) ME del grupo
infectado con el aislamiento SGO Z12
(tinción: TG) 200X; (
: fibrosis).

85
 No Tratados Tratados

Tulahuen SGO Z12 Tulahuen SGO Z12

a c a c

MC MC

b d b d

ME ME

Figura 96: Secciones histológicas Figura 97: Secciones histológicas

correspondientes al grupo NT a) MC y b) ME correspondientes al grupo T a) MC y b) ME
del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c) del grupo infectado con la cepa Tulahuen; c)
MC y d) ME del grupo infectado con el MC y d) ME del grupo infectado con el
aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
: aislamiento SGO Z12 (tinción: TG) 200X; (
:
fibrosis). fibrosis).

Sobrevida

La figura 98 muestra la sobrevida de los grupos infectados con la cepa Tulahuen

estudiados a los largo de las diferentes etapas de la infección experimental. Como se
puede ver, el 86% de los ratones correspondientes al grupo T, el 75% de los animales
NT y el 67% del grupo SA sobrevivieron hasta los 360 d.p.i. Se observaron diferencias
significativas entre los ratones T y SA (P>0,0003).
En los grupos infectados con el aislamiento SGO Z12 (figura 99), los ratones NT y SA
no presentaron diferencias entre ellos a diferencia de los animales T que si presentaron
diferencias significativas (P>0,0003) con los grupos anteriormente mencionados. Los
porcentajes de sobrevida a los 360 d.p.i fueron de 75% en el grupo T y 50% para los
ratones NT y SA.

86
 1,00 1,00

a
a
0,75 b 0,75 a
b

Sobrevida
Sobrevida

0,50 0,50 b

0,25 0,25

0,00 0,00
0 90 180 270 360 0 90 180 270 360
Días post infección Días post infección

Figura 98: Sobrevida de los grupos Figura 99: Sobrevida de los grupos
infectados con T. cruzi, cepa Tulahuen, SA infectados con T. cruzi, aislamiento SGO
(
); CA, T (
) y CA, NT (
) (Letras Z12, SA (♦); CA, T (♦ ) y CA, NT (♦)
diferentes indican diferencias significativas (Letras diferentes indican diferencias
P< 0,005. Test de Hotelling). (n = 90) . significativas P< 0,0003. Test de Hotelling).
(n = 90) .

87
DISCUSIÓN

“La tierra se resquebraja bajo sus pies, el sol quema su piel trigueña, posee seis o, tal
vez, siete años. Sentado sobre un tronco a modo de silla, espera que los días se sucedan
unos tras otros. Primero fue su ojo derecho, ahora, es el izquierdo; no puede abrir el
párpado por la hinchazón. Posee el signo de Romagna ó chagoma de inoculación en su
rostro, la marca de que ha sido picado por una Vinchuca y que el Trypanosoma cruzi
ha ingresado a su cuerpo. Ese niño que está sentado sobre el tronco tiene la
particularidad de encontrarse en varios lugares a la vez. Puede estar en el Chaco, en el
noroeste argentino, o en la región de Chiapas, o tal vez sea un campesino colombiano,
o uno de los "sin tierra" del Brasil, o cualquier otro en Iberoamérica. Un paisaje
diferente para la misma situación”.
Esta enfermedad es uno de los problemas sanitarios más relevantes de la Argentina.
Aproximadamente unas 3.000.000 de personas están infectadas y entre un 15% a un
30% de ellos presentan lesiones cardíacas o de otros órganos, que son irreversibles
(OPS, 2006).
Las drogas de uso clínico habitual y aprobadas por la OMS han sido por años
Nifurtimox y Benznidazol, las cuales generalmente se usan en la etapa aguda y menos
frecuentemente en el estadio crónico de la enfermedad (Duschak, 2011; Villarreal et al,
2004).
La problemática de esta enfermedad se profundiza aún más debido a que la búsqueda de
nuevos fármacos para su tratamiento no es redituable para las industrias farmacéuticas;
la raíz de este problema es el alto costo de las inversiones y la falta de un mercado
potencial y seguro en los países en desarrollo. De las 1393 nuevas drogas sintetizadas
entre 1975 y 2000, menos de 1,1% fueron para enfermedades tropicales (WHO, 2010).
Por estas razones la OMS establece que para el desarrollo de una quimioterapia
antiparasitaria para la enfermedad de Chagas se debe tener en cuenta:
1) Los principios activos de plantas utilizadas en medicina popular.
2) Fármacos ya aprobados para el tratamiento de otras enfermedades, ya que éstos
han sido sometidos a ensayos clínicos.
3) La determinación de blancos específicos identificados en vías metabólicas
claves del parásito.

88
Estudios recientes han permitido la identificación de blancos potenciales en T. cruzi,
que incluyen el metabolismo de esteroles, ADN (particularmente del kinetoplasto) y
diferentes enzimas propias del parásito (Lisboa de Castro y Soeiro, 2007), que
contribuyen a la especificidad del tratamiento y a la disminución de los efectos adversos
de las drogas, comunes en los fármacos de uso habitual.
En la búsqueda de blancos específicos identificados en vías metabólicas claves del
parásito, uno de los grandes hallazgos fue la tripanotiona y la tripanotiona reductasa
(Lantwin et al, 1994). Clomipramina, droga que demostró inhibir la enzima tripanotiona
reductasa, se ha convertido en un prometedor agente tripanocida para el tratamiento de
la enfermedad (Rivarola et al, 2005; Bazán et al 2008; Gobbi et al, 2010).
Por otra parte es necesario que estos nuevos fármacos sean seguros y efectivos tanto en
fase aguda como en la fase crónica de la enfermedad de Chagas.
Se ha estimado que aproximadamente 8 millones de personas se encuentran en la fase
crónica de la enfermedad de Chagas (OPS, 2006), una gran proporción de los cuales no
reciben tratamiento antiparasitario específico. Se recomienda el tratamiento
antiparasitario para la enfermedad de Chagas universalmente para los casos agudos y
para los niños de hasta 14 años de edad en la mayoría de los países (WHO, 2002). A
pesar de la inclusión de los pacientes crónicos en las guías de tratamiento, la mayoría de
los médicos sólo prescriben el tratamiento sintomático de la cardiomiopatía y los
síntomas digestivos y evitan las drogas antiparasitarias (Brener, 1984).
El uso de técnicas de laboratorio de mayor sensibilidad ha demostrado que el parásito se
oculta profundamente en el corazón y otros tejidos, circulando en la sangre en bajo
número, lo que coincide con la fase crónica de la enfermedad (Clayton, 2010). Además
se ha demostrado experimentalmente que la eliminación de los parásitos resulta en la
reducción o eliminación de las respuestas autoinmunes, que atacarían al miocardio, en la
fase crónica de la infección (Garcia et al, 2005).
En la presente tesis se buscó evaluar a través de métodos no convencionales
(inmunológicos y moleculares), el efecto de clomipramina en el tratamiento en fase
crónica de la enfermedad de Chagas de ratones infectados con el aislamiento SGO Z12
y con la cepa Tulahuen.
La detección de los parásitos se realizó por técnicas moleculares: PCR convencional
(cualitativa) y PCR en tiempo real, permitiendo esta última la determinación de la
cantidad relativa del producto amplificado, que corresponde a ADN del parásito. En
numerosos trabajos de investigación, la técnica de PCR se ha propuesto como una

89
herramienta alternativa para la detección y cuantificación del T. cruzi; esta técnica es
más sensible que los métodos parasitológicos tradicionales, tales como el examen de
gota fresca, hemocultivo y xenodiagnóstico (Moser et al, 1989; Junqueira et al, 1996;
Kirchhoff et al, 1996; Marcon et al, 2002, Caldas et al, 2012). En este contexto,
considerando que la presente investigación se basa en la etapa crónica experimental, fue
necesario utilizar esta técnica para la determinación de la cantidad relativa del producto
amplificado, debido a la imposibilidad de realizarlo con las técnicas tradicionales.
Los resultados obtenidos avalan la presencia del T. cruzi en la fase crónica de la
enfermedad, aun después de un año de haber sido infectados los ratones con el
aislamiento SGO Z12 o con la cepa Tulahuen. Ambas técnicas de PCR, convencional y
en tiempo real, son técnicas muy sensibles a la presencia del parásito, ya que al año de
infección detectaron la presencia de T. cruzi en sangre. Sin embargo, la técnica de PCR
en tiempo real resulto ser más sensible: el grupo infectado con el aislamiento SGO Z12
y no tratado resultó negativo para la presencia del parásito por PCR convencional a los
90 d.p.i., parásitos que sí fueron detectados por PCR en tiempo real. Como hemos
podido comprobar en este estudio, no todas las técnicas de amplificación genómica
muestran la misma sensibilidad analítica. La PCR convencional que utilizamos
rutinariamente se basa en la amplificación del ADN del parásito y su detección
mediante la visualización de las bandas amplificadas en geles de agarosa. Esta técnica
es por lo tanto ligeramente subjetiva y precisa de una carga de ADN mínima para poder
ser observada; no así la PCR en tiempo real que detecta niveles más bajos de parásitos
(Reina et al, 2014; Cummings y Tarleton, 2003).
Además, en ratones infectados con la cepa Tulahuen y tratados a los 90 y 180 d.p.i. se
observó una disminución de la cantidad relativa del producto amplificado al año de
infección. Sin embargo, a los 270 días se observó que la cantidad relativa del producto
amplificado detectado fue mayor en aquellos animales tratados a los 90 d.p.i.,
comparado con los valores encontrados antes de comenzar el tratamiento. Esta mayor
cantidad relativa del producto amplificado podría coincidir con las parasitemias
intermitentes características de la fase crónica que estarían influenciando la cantidad de
parásitos que circulan en el momento de la extracción de sangre (Castro et al, 2002).
Al analizar el efecto del tratamiento realizado sobre ratones infectados con el
aislamiento SGO Z12 se encontraron resultados controversiales. En los tratamientos
realizados a los 90 y 180 d.p.i se observó un aumento de la cantidad relativa del
producto amplificado en los animales tratados con clomipramina. Esto podría deberse a

90
numerosas causas. Por un lado el T. cruzi presenta una población heterogénea que está
compuesta por diferentes cepas que varían ampliamente en su respuesta a fármacos
(Correia Soeiro et al, 2013). En este sentido, en nuestro laboratorio hemos encontrado
que el aislamiento SGO Z12 está formado por una mezcla de los linajes II y VI; la cepa
Tulahuen por su parte pertenece al linaje V de T. cruzi (resultados aún no publicados).
Esta diferente composición genética podría explicar parte de las diferencias
encontradas.
En infecciones experimentales mixtas con parásitos de diferentes genotipos, puede
producirse una interacción entre las subpoblaciones, dando lugar a cambios importantes
en las características biológicas de los parásitos y en la evolución de la infección (Deane
et al, 1984; da Silveira Pinto et al, 1998, 2000; Martins et al, 2006, 2007). Las
infecciones mixtas muestran respuestas al tratamiento distinta de la respuesta esperada
en base a análisis de una infección única (Martins et al, 2007), lo que sugiere que la
correlación esperada entre la susceptibilidad al tratamiento es difícil de establecer para
las infecciones duales, en las que puede producirse combinación genética. La existencia
de una alta incidencia de infecciones mixtas en seres humanos (Solari et al, 2001) y
vectores (Bosseno et al, 2000) ha sido verificada y plantea preguntas acerca de sus
consecuencias en cuanto a la morbilidad, la dinámica de la transmisión del parásito y la
respuesta a la quimioterapia. Los resultados contradictorios obtenidos por diferentes
autores en relación al tratamiento en seres humanos, están probablemente influenciados
por la ocurrencia de infecciones mixtas, ya que las personas provenientes de zonas
donde la enfermedad es endémica pueden volver a infectarse varias veces, muy
probablemente con diferentes poblaciones de parásitos (Brenière et al, 1998). Estos
resultados enfatizan la importancia de la diversidad genotípica de las diferentes
poblaciones de T. cruzi en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Chagas.
Otro aspecto a tener en cuenta es que los tratamientos con antidepresivos
(clomipramina, imipramina, citalopram) tienen efectos inmunoreguladores negativos,
suprimiendo de forma significativa la secreción de IL-2 e IFNγ por linfocitos T y de IL-
1 por macrófagos (Maes, 2001; Diamond et al, 2006).
Cuando el T. cruzi ingresa al organismo, el sistema inmunológico está equipado para
detectar y controlar los parásitos a través de la respuesta inmune. El IFN-γ producido
por las células T activadas CD4+, CD8+ y Natural Killers juega un papel crucial en la
eliminación del parásito (Cardillo et al, 1996; Sardinha et al, 2006). El IFN-γ potencia la
actividad efectora de macrófagos mediante la inducción de la transcripción del gen

91
codificador de la enzima óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), que actúa
produciendo óxido nítrico, y el aumento de éste tiene un potente efecto en la
eliminación del parásito (Gazzinelli et al, 1992). Se ha informado que los ratones
deficientes en iNOS son altamente susceptibles a la infección (Saeftel et al, 2001); sin
embargo otros investigadores (Cummings y Tarleton, 2004) demostraron que iNOS es
importante pero no esencial para el control de la infección por T. cruzi. Si bien, la
concentración de clomipramina utilizada en el presente estudio corresponde a una
concentración subterapéutica (Rivarola et al, 2005), la droga podría estar interfiriendo
en el sistema inmunológico, lo que también explicaría el aumento de la carga parasitaria
en los grupos infectados con SGO Z12 y tratados.
Por otro lado, el grupo más sensible al tratamiento resultó ser el infectado con la cepa
Tulahuen, ya que los animales que fueron tratados a los 90 d.p.i, disminuyeron la
cantidad relativa del producto amplificado en un 40% al año de infección, de acuerdo a
los resultados obtenidos con la técnica de PCR en tiempo real; en el grupo NT por el
contrario, la cantidad relativa del producto amplificado aumentó un 225%. Los linajes
de T. cruzi presentan distintas características biológicas, inmunológicas y bioquímicas
(Brener, 1992; Gomes et al, 1998, Zingales et al, 2009, 2012; Correia Soeiro et al,
2013). En el presente trabajo se evaluó el efecto de clomipramina sobre la cepa
Tulahuen y el aislamiento SGO Z12 que, como se mencionó anteriormente, están
formados por linajes diferentes; debido a que el blanco molecular de clomipramina es la
enzima TR (Ravaschino et al, 2006; Olin-Sandoval et al, 2010), la expresión de esta
enzima podría variar en cada uno de los linajes, observándose un efecto diferencial en la
actividad de la droga, como lo obtenido en los presentes resultados.
La eficacia del tratamiento antiparasitario específico en pacientes adultos con infección
crónica por T. cruzi no es actualmente del todo comprobable, debido a que la serología
convencional permanece reactiva en la gran mayoría de los pacientes, aún muchos años
después de finalizado el tratamiento tripanocida, sumado a que los métodos
parasitológicos tradicionales (xenodiagnóstico, hemocultivo) tienen escasa sensibilidad
en esta etapa de la infección. Además la evolución clínica de la enfermedad de Chagas
es de lenta progresión y un elevado porcentaje de pacientes infectados permanece, aún
sin tratamiento, en el período indeterminado sin manifestaciones electrocardiográficas y
radiológicas (Fabbro et al, 2007).

92
Los estudios serológicos llevados a cabo en el presente trabajo presentan un
comportamiento similar a los reportados por otros investigadores. Los antígenos totales
permanecen elevados a lo largo de la evolución de la infección (360 d.p.i.), en forma
parecida a lo que ocurre con el tratamiento en fase crónica en humanos. Para algunos
investigadores, la conversión serológica es indicación de curación, pero esto sólo
sucede en el 70-75% de los casos agudos adquiridos y en el 100% de los casos agudos
congénitos; en los casos crónicos, la seroconversión muchas veces ocurre recién a los
20 o 30 años después del término de la terapia, y en muchos casos los pacientes fallecen
antes que esto suceda (Apt y Zulantay, 2011). Es decir, en los casos crónicos puede
haber curación parasitológica aún con serología convencional positiva. En estudios
recientes realizados en animales infectados con T. cruzi y curados, que no presentaban
parásitos ni antígenos de T. cruzi, tenían linfocitos CD8+ centrales de memoria que
mantenían una serología positiva por más de un año (Bustamante et al, 2008), lo cual
podría indicar una cura parasitológica en casos crónicos, sin conversión serológica. En
el presente trabajo medimos antígenos recombinantes que, como se mencionó
anteriormente, comprenden seis proteínas recombinantes de epimastigotes y
tripomastigotes, medidos en conjunto (antígenos totales) o cada uno de ellos por
separado (1, 2, 13, 30, 36 y SAPA). Los resultados obtenidos marcan una mayor
sensibilidad de algunos de estos antígenos al tratamiento. Los niveles de antígenos 1 y
13 del grupo de ratones infectados con la cepa Tulahuen y tratados a los 90 d.p.i.
presentaron una disminución significativa con respecto a los NT. Por otro lado en los
tratados a los 180 d.p.i. los antígenos 1, 13, 36 y SAPA también disminuyeron
significativamente a los 360 d.p.i. Desde el punto de vista serológico, el aislamiento
SGO Z12 mostró ser más sensible al tratamiento, ya que los animales tratados a los 90 y
180 d.p.i. presentaron una significativa disminución de los títulos para la mayoría de los
antígenos analizados (2, 13, 30 y SAPA).
Similares resultados fueron encontrados por Sanchez Negrette y colaboradores, quienes
demostraron que el antígeno 13 muestra niveles de absorbancia mayores en muestras
obtenidas antes del tratamiento que en las obtenidas después del mismo: de los nueve
pacientes originalmente positivos para este antígeno, seis pacientes se convirtieron en
negativos después del tratamiento. Estos mismos autores encontraron que el antígeno
SAPA tiene una buena capacidad de detectar regresiones, ya que en tres de los nueve
pacientes los títulos de anticuerpos disminuyeron de forma clara y todos los pacientes
analizados muestran un cierto grado de regresión. El antígeno 36 mostró una regresión

93
en 2 de los pacientes. Finalmente, los antígenos 1, 2, y 30 tenían menos capacidades
para revelar regresiones, aunque se observó la tendencia general hacia una regresión a
la negatividad, incluso con los últimos tres antígenos (Sánchez Negrette et al, 2008).
La importancia o no de la eliminación o disminución del parásito en el organismo
infectado, y de la consecuente disminución de los títulos de anticuerpos, se asocia a la
controversia pendiente acerca de la fisiopatogenia de la enfermedad de Chagas.
No hay datos que demuestren sin lugar a dudas que esta enfermedad resulte de un
proceso autoinmune (Benoist y Mathis, 2001). En los últimos años se asigna cada vez
más relevancia a la presencia y persistencia del parásito como hecho indispensable para
el desarrollo de la enfermedad.
Algunos investigadores postulan la presencia de un “disparador” que inicia el proceso
patológico. Este “disparador” o gatillo activaría algunos linfocitos T (específicos para
autoantígenos y/o antígenos de reacción cruzada del parásito). Cuando estas células T
son activadas, segregan citoquinas inflamatorias que serían responsables del daño
cardíaco. Los autoantígenos liberados (por ejemplo la miosina) son reconocidos por otro
grupo de células T autoreactivas y otros autoanticuerpos, los cuales dañan el tejido
cardíaco. Simultáneamente, este daño cardíaco favorecería la inducción de moléculas
co-estimuladoras necesarias para la activación específica de las células T autorreactivas
(Girones y Fresno, 2003).
Más allá de las controversias sobre los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad,
los pacientes obtienen beneficio real con una reducción de la carga parasitaria (Tarleton,
2003).
Las manifestaciones cardíacas precoces de la enfermedad de Chagas son detectadas por
el electrocardiograma. Las alteraciones de la conducción cardiaca preceden a las
lesiones de los miocitos y de la microcirculación (Prata, 1990). La electrocardiografía es
así uno de los métodos de diagnóstico más sensibles para diagnosticar la miocarditis
chagásica crónica (Madoery, 1993), especialmente en pacientes con serología positiva y
antecedentes epidemiológicos para Chagas. La detección de trastornos de la conducción
intraventricular, como el bloqueo de rama derecha con o sin hemibloqueo anterior,
constituye un marcador diagnóstico altamente sensible. Si a ello se agregan presencia de
bradicardia, alteraciones inespecíficas de la repolarización y arritmia ventricular, el
diagnóstico de miocardiopatía chagásica crónica es prácticamente seguro, en especial si
se trata de una persona joven (Elizari, 1999).

94
En nuestro modelo experimental se observó que tanto en los ratones infectados con la
cepa Tulahuen como con el aislamiento SGO Z12, el porcentaje de ratones con
alteraciones electrocardiográficas aumenta a medida que progresa la enfermedad. Se
pudo observar además que el porcentaje de ratones con alteraciones era el doble en los
infectados con SGO Z12 (100%) que en los infectados con Tulahuen (50%) a los 360
d.p.i. Esta condición no estaría relacionada con la cantidad de parásitos, ya que en SGO
Z12 medimos un 40 % menos de parásitos a través de PCR en tiempo real, mientras que
el grupo infectado con Tulahuen presentó un 400% más de T. cruzi al año de infección.
Existen diversos estudios en pacientes chagásicos no tratados que determinan que la
parasitemia no se asocia a la evolución o condición clínica de estos individuos (Castro
et al, 2005; Monteon-Padilla, 2001), mientras que otros autores, establecen una estrecha
correlación entre la persistencia de T. cruzi y la progresión de la enfermedad (Rangel-
Flores et al, 2006; Zulantay et al, 2005).
Con respecto a los grupos infectados con SGO Z12 o con Tulahuen y tratados a los 90
d.p.i. presentaron una disminución progresiva de las alteraciones ECG, hasta que al año
de infección no se observaron ratones con alteraciones en la conducción.
Similar comportamiento presentaron entre si los ratones infectados con el aislamiento
SGO Z12 y con cepa Tulahuen y tratados a los 180 d.p.i., en los que el 50% de los
mismos poseían alteraciones a los 360 d.p.i. Los efectos beneficiosos (prevención y
regresión) de los fármacos sobre la evolución del trazado electrocardiográfico, parecen
también ser independientes de la condición parasitológica: en el grupo SGO Z12 tratado
con clomipramina a los 90 d.p.i. que no presentó alteraciones ECG al año de infección,
se detectó un nivel de parasitemia cuatro veces mayor que al inicio del tratamiento.
Nuestros resultados son concordantes a los obtenidos por Viotti y colaboradores (1994),
que observaron en individuos tratados con Benznidazol y evaluados durante 8 años
post-terapia, una marcada reducción en el desarrollo de alteraciones ECG y una menor
frecuencia del deterioro de la condición clínica, a pesar de la persistencia de las pruebas
parasitológicas positivas. También se han reportado resultados similares en pacientes
chagásicos crónicos tratados con itraconazol y alopurinol (APT et al, 2003).
Algunos investigadores sostienen que cuando las anormalidades electrocardiográficas
son iniciales, es posible la regresión. Conversiones de alteraciones menores tales como
QT prolongado y bloqueo aurículo-ventricular de 1º y 2º grado, pueden ser observadas
incluso, en ausencia de tratamiento. La intervención quimioterapéutica puede causar así,

95
reversión de anormalidades más severas, tales como bloqueos fasciculares y
bifasciculares, modificando la historia natural de la enfermedad (Arribada et al, 1993).
La cardiomiopatía chagásica es en parte el resultado de un proceso inflamatorio, y la
presencia de un gran número de células inflamatorias en el miocardio y en ME es una de
las características patológicas de la infección crónica (Gutierrez et al, 2009). Los
estudios histopatológicos realizados mostraron en todos los grupos una mayor cantidad
de infiltrados inflamatorios en ME que en MC. Este es un aspecto que ya ha sido
señalado por otros investigadores en animales de experimentación, donde también se
encontraba un claro predominio del compromiso esquelético sobre el miocardio (Pizzi
et al, 2005; Lo Presti et al, 2009). Estos datos coinciden con los encontrados en
humanos, donde esta enfermedad produce alteraciones en los músculos esqueléticos
periféricos, lo cual puede contribuir a la incapacidad funcional que presentan muchos de
los enfermos chagásicos. Es posible que al estar alterada la microcirculación, el riego y
la oxigenación de las fibras musculares estén disminuidos, originando cambios
metabólicos anaeróbicos y comprometiendo la función muscular (Montes de Oca et al,
2007).
Por otra parte se observaron diferencias entre el grupo infectado con SGO Z12 y el
grupo infectado con Tulahuen, en relación a los procesos inflamatorios y de fibrosis, ya
que el grupo infectado con la cepa Tulahuen presentó una mayor cantidad de áreas con
fibrosis, tanto en ME como en MC. Esto estaría relacionado con lo demostrado por
numerosas investigaciones, donde el tipo de T. cruzi que infecte al huésped determinaría
el curso clínico de la infección (Coura, 1988; Días, 1989; Macedo y Pena, 1998;
Andrade et al, 2006; Teixeira et al, 2006).
Con respecto al tratamiento, también observamos diferente comportamiento de acuerdo
a la cepa infectante: en los ratones infectados con SGO Z12, no encontramos diferencias
significativas (P>0.05) con respecto al porcentaje de infiltrados inflamatorios entre T y
NT a los 360 d.p.i. en MC; sin embargo, los T a los 180 d.p.i presentaron menor
porcentaje de fibrosis en MC que los NT. Por el contrario, en los animales infectados
con Tulahuen, los grupos tratados presentaron un menor porcentaje de infiltrados
inflamatorios en el MC que el grupo NT a los 360 d.p.i., y se observó en los T a los 180
d.p.i. una significativa reducción de la fibrosis en MC con respecto a los NT. Este
comportamiento variado frente al tratamiento de las diferentes cepas de T. cruzi
concuerda con lo descripto por numerosos autores (Bustamante et al, 2007; Mejía-
Jaramillo et al, 2012).

96
Algunos trabajos reportan que 27% de las cepas de T. cruzi aisladas de diferentes
orígenes biológicos y geográficos, poseen resistencia natural al benznidazol y al
nifurtimox, con porcentajes de curación en ratones menores al 50%, a pesar de que los
parásitos nunca habían estado en contacto con estos medicamentos. Además, se reportó
que es posible inducir resistencia en este parásito, tanto in vitro como in vivo, por
presiones continuas por la utilización de estos medicamentos, lo cual generaría
poblaciones resistentes a concentraciones de benznidazol de hasta 220 µM; incluso se
han propuesto algunos genes involucrados en el surgimiento del fenotipo de resistencia
a este medicamento (Villarreal et al, 2004)
Se ha descrito que no existe una clara relación entre los niveles de parasitemia y la
sobrevida de los animales infectados. Estudios previos con la cepa Brazil de T. cruzi
mostró que cepas de ratones con altos niveles de parasitemia mueren en un lapso corto
de tiempo, mientras que aquellos con bajos niveles, sobreviven a la infección. Estos
resultados, sugerirían que el grado o magnitud de la parasitemia sería responsable de la
muerte. Sin embargo, este mismo estudio mostró que ratones resistentes de la cepa
B10.S infectados con la cepa Perú de T. cruzi presentaban niveles de parasitemia iguales
o superiores a los de las cepas susceptibles (Zuñiga et al, 1998). Nuestros resultados en
relación a la sobrevida concuerdan con esta situación, puesto que todos los grupos de
animales tratados, presentaron una sobrevida mayor a los NT, llegando a un 100% de
sobrevida en los ratones infectados con SGO Z12 y tratados, frente a un 20% en los
ratones NT, a pesar que la parasitemia evaluada por PCR en tiempo real se presenta en
forma variable. Resulta claro entonces que el nivel de parasitemia es solo uno de los
muchos factores involucrados en determinar la susceptibilidad o resistencia a la
infección y la efectividad del tratamiento.
El patrón inmunogenético del hospedero y la demostrada heterogeneidad de las
poblaciones circulantes de T cruzi, podrían ser factores que den cuenta de la
independencia observada entre evolución clínica y parasitemia (Zulantay et al, 2005).

97
CONCLUSIONES

 Los efectos sobre el huésped de la infección con la cepa Tulahuen o con el

aislamiento SGO Z12 fueron diferentes, de acuerdo a los parámetros observados.
 Los métodos no convencionales utilizados, PCR en tiempo real y medición de
los antígenos 1, 2, 13, 30, 36 y SAPA por ELISA, resultaron ser más sensibles a
la presencia del parásito (PCR en tiempo real) y a la disminución de los títulos
de anticuerpos en los grupos tratados (ELISA) que los métodos convencionales
(PCR convencional y antígenos totales).
 Los ratones infectados con SGO Z12 o con Tulahuen y tratados a los 90 d.p.i.
revirtieron, al año de observación, en un 100% las alteraciones ECG.
 Clomipramina fue efectiva para normalizar la mayor cantidad de los parámetros
estudiados en los ratones inoculados con la cepa Tulahuen; a pesar de ello los
ratones infectados con SGO Z12 y tratados a los 90 d.p.i, tuvieron una sobrevida
del 100%.
 La histopatología mostró en todos los grupos una mayor cantidad de infiltrados
inflamatorios y fibrosis en músculo esquelético que en músculo cardíaco.
 El tratamiento con clomipramina no logró la negativización de la serología, pero
si la disminución significativa de los niveles de algunos antígenos medidos en
forma independiente.

La relevancia del tratamiento antiparasitario específico en la enfermedad de Chagas fue

objeto de un intenso debate por muchos años, en particular para la fase crónica de la
enfermedad. Ahora, se está llegando a un consenso en que se requiere la eliminación del
T. cruzi en los individuos infectados, para prevenir el desarrollo de las lesiones que son
características de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, en la actualidad la
quimioterapia disponible, sobre la base de nifurtimox o benznidazol, es insatisfactoria
debido a la eficacia limitada en la fase crónica de la enfermedad y debido a los efectos
secundarios tóxicos frecuentes. Además se necesitan de nuevos métodos para evaluar la
efectividad del tratamiento en la etapa crónica; el fármaco utilizado debe ser también
seguro y efectivo frente a la variabilidad que presenta el T. cruzi. La presente tesis
pretende ser un aporte en ese sentido.

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