UNIVERSIDAD DE ALMERÍA

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Y FÍSICA

“Análisis de plaguicidas en fruta y verdura mediante cromatografía de

fluidos supercríticos acoplada a espectrometría de masas”

“Analysis of pesticides in fruit and vegetables using supercritical fluid

chromatography coupled to mass spectrometry”

Memoria presentada para optar al grado de

Doctor en Química

Víctor Manuel Cutillas Juárez

Almería, a Mayo 2022
 UNIVERSIDAD DE ALMERÍA

Departamento de Química y Física

LOS DIRECTORES DE LA TESIS:

El Dr. Amadeo Rodríguez Fernández-Alba, Catedrático del Departamento de Química y Física de la

Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad de Almería y la Dra. Carmen Ferrer Amate,
Investigadora de la Universidad de Almería, en calidad de director y codirectora, respectivamente,

CERTIFICAN:

Que la presente tesis doctoral, titulada: ¨ Análisis de plaguicidas en fruta y verdura mediante
cromatografía de fluidos supercríticos acoplada a espectrometría de masas ¨, presentada por Víctor
Manuel Cutillas Juárez graduado en Químicas, ha sido realizada dentro del programa de doctorado de
Química Avanzada bajo nuestra supervisión, en el Área de Química Analítica del Departamento de
Química y Física de la Universidad de Almería, y que a juicio de los directores, reúne los requisitos de
originalidad, extensión e interés teórico y práctico necesarios para ser presentada como Memoria para
optar al grado de Doctor en Química.

Y para que conste y surta los efectos pertinentes, expide el

presente certificado en Almería, Mayo 2022

Directores de la Tesis:

Dr. Amadeo Rodríguez Fernández-Alba Dra. Carmen Ferrer Amate

A mi familia y amigos por apoyarme siempre durante toda mi trayectoria. También quiero agradecer
a Amadeo y a mis compañeros del EURL-FV por proporcionarme los medios y la ayuda necesaria para
mejorar día a día como profesional y como persona.
ÍNDICE
 Índice

ÍNDICE

ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................................... 1

ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................................................................. 5
RESUMEN............................................................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................................................. 9
HIPÓTESIS ............................................................................................................................................ 15
OBJETIVOS........................................................................................................................................... 17
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 21
1. Marco regulatorio para el análisis de plaguicidas en alimentos: .............................................. 22
1.1 Límite máximo de residuo .................................................................................................. 23
1.2 Programas de vigilancia y cumplimiento: ........................................................................... 26
1.3 El sistema de alerta rápido para alimentos y piensos (RASFF). ......................................... 28
2. Cromatografía de fluidos supercríticos .................................................................................... 32
2.1 Evolución de la técnica cromatográfica de fluidos supercríticos. ....................................... 32
2.2 Determinación de la fase móvil .......................................................................................... 36
2.3 Determinación de la fase estacionaria ................................................................................. 45
2.4 Cromatografía preparativa .................................................................................................. 48
2.5 Cromatografía quiral ........................................................................................................... 53
2.6 Efecto matriz en SFC .......................................................................................................... 56
2.7 Aplicaciones........................................................................................................................ 58
3. Espectrometría de masas .......................................................................................................... 60
3.1 Fuentes de ionización. ......................................................................................................... 60
3.2 Analizadores de masa ......................................................................................................... 63
3.3 Detectores ........................................................................................................................... 66
Referencias........................................................................................................................................ 69
CAPÍTULO I ARTÍCULO CIENTÍFICO: “Supercritical fluid chromatography coupled to tandem
mass spectrometry for the analysis of pesticide residues in dried spices. Benefits and drawbacks” .... 79
CAPÍTULO II ARTÍCULO CIENTÍFICO: “Overcoming difficulties in the evaluation of captan and
folpet residues by supercritical fluid chromatography coupled to mass spectrometry” ....................... 93
CAPÍTULO III ARTÍCULO CIENTÍFICO: “Liquid chromatography versus supercritical fluid
chromatography coupled to mass spectrometry: a comparative study of performance for multiresidue
analysis of pesticides” ......................................................................................................................... 103
CONCLUSIONES ................................................................................................................................ 115
ANEXOS ............................................................................................................................................. 121
Anexo 1. Índice de acrónimos ........................................................................................................ 123
Índice

Anexo 2. Listado de publicaciones científicas no incluidas en la tesis. .......................................... 125

ÍNDICE DE TABLAS
Índice de tablas

2
 Índice de tablas

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de disolventes compatibles con la cromatografía de fluidos

supercríticos. PM: Peso molecular; Tc: Temperatura crítica; Pc: Presión crítica; Dc: Densidad crítica.

Tabla 2. Condiciones cromatográficas para diferentes aplicaciones de cromatografía preparativa de

fluidos supercríticos.

Tabla 3. Condiciones cromatográficas para la separación quiral de plaguicidas en alimentos

utilizando SFC.

Tabla 4. Principales modos de escaneo para el análisis y fragmentación de analitos en la

espectrometría de masas de triple cuadrupolo.

3
 Índice de figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

5
 Índice de figuras

Figura 1. Esquema bidireccional que conforma el establecimiento de los LMRs.

Figura 2. Número de muestras analizadas por cada Estado miembro para la detección de plaguicidas
en alimentos según el informe de 2019 de la EFSA.

Figura 3. Interrelaciones del sistema RASFF.

Figura 4. Número de notificaciones (RASFF/AAC) separadas por tipos presentadas durante los años
2017,2018 y 2019.

Figura 5. Sección transversal de la válvula reguladora de contrapresión (BPR) 1 = asiento de válvula,

2 = aguja, 3 = solenoide, 4 = sello, 5 = resorte de retorno, 6 = tornillo de ajuste, 7 = calentador.

Figura 6. Rango de aplicación de SFC incluyendo las diferentes variantes con co-disolventes y aditivos.

Figura 7. Sistema de purificación SFC/MS desarrollado por Wang y Kassel. (a) bomba del
modificador, (b) bomba de CO2, (c) detector de UV, (d) bomba LC 200 a 3 mL/min MeOH, (e) bomba
LC 200 a 200 µL/min 50:50 MeOH / agua que contiene ácido fórmico al 0,05%, (f) inyector Gilson 215
/ colector de fracciones y (g) espectrómetro de masas PE Sciex API-150 EX.

Figura 8. Diagrama de fases para un solo componente. Las áreas definidas son sólido (S), líquido (L),
gaseoso (G) o fluido supercrítico (SF). También están representados el punto triple (tp) y el punto
crítico (cp).

Figura 9. Diagrama tridimensional de una mezcla binaria en dos fases. La mezcla tipo I representada
es CO2 y metanol. La figura sombreada representa la región en dos fases.

Figura 10. Parámetros involucrados en el tiempo de retención de los analitos en SFC. En azul aquellos
que afectan al CO2 puro y con modificador; en rosa efectos propios de fluidos compresibles.

Figura 11. Diagrama de fases que representa las condiciones para alcanzar el estado de fluido
supercrítico para el dióxido de carbono puro (azul) y con diferentes porcentajes de mezcla con metanol
(verde). Las flechas rojas representan las isopicnas (densidad constante).

Figura 12. (A) Cromatograma utilizando fase móvil con 10Mm de formiato amónico como aditivo (B)
cromatograma empleando la misma fase móvil sin aditivos. Compuestos 1: metoprolol 2: propranolol
3: pindolol 4: etrone 5: progesterone 6: testosterone 7: bosentan, 8: amprenavir, 9: atazanavir, 10:
darunavir, 11: lopinavir, 12: nelfinavir, 13: ritonavir,14: adenine, 15: guanosine, 16: nicotinic acid,
17: theobromine, ( [C] = 100 ng/mL)

Figura 13. Curvas de Van Deemter para butylparaben en dos sistemas diferentes. H: Altura de platos.
u: velocidad lineal (Puntos azules: HPLC XTerra RP18 50mm×4.6mm,3.5µm. Picas naranjas: HPLC
Acquity Shield C18 50mm×2.1mm,1.7µm. Cuadrados púrpuras: SFC Acquity UPC2 BEH2-EP
100mm×3.0mm,3.5µm. Triángulos verdes: SFC Acquity UPC2 BEH2-EP 100mm×3.0mm, 1.7µm.

7
Índice de figuras

Figura 14. Diagrama radar basado en el modelo LSER teniendo en cuenta 5 descriptores.

Figura 15. Principales factores que controlan el rendimiento de la cromatografía preparativa SFC.

Figura 16. Representación de la cascada de electrones generada en un multiplicador de electrones de

dínodo discreto.

8
RESUMEN

ABSTRACT
Índice de figuras

10
 Resumen

RESUMEN

La aplicación de productos fitosanitarios y la evolución de estos anualmente, supone uno de los factores
determinantes en el crecimiento del sector agrícola actual. No obstante, este tipo de productos requieren
de un control para evitar que una aplicación errónea desemboque en un riesgo para la salud alimentaria
y/o medioambiental. Las técnicas, sin duda, más empleadas para llevar a cabo el análisis de estos
compuestos son la cromatografía líquida y la cromatografía de gases, ambas acopladas a analizadores
de masa de triple cuadrupolo (QqQ). Estas técnicas cromatográficas abarcan un rango bastante amplio
de plaguicidas de diversa polaridad que son capaces de detectar con elevada sensibilidad. Sin embargo,
los fitosanitarios también se aplican a matrices denominadas complejas, entendiendo por matrices
complejas aquellas que contienen una gran cantidad de compuestos químicos naturales que se extraen
junto con los compuestos de interés y afectan seriamente a la selectividad del análisis. Estas matrices
complejas pueden llegar a causar interferencias en el análisis e incluso degradar u obstruir los elementos
asociados al equipo.

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) surge como una alternativa a la cromatografía de

líquidos (LC), además, también tiene la capacidad de acoplarse a fuentes de ionización de
espectrometría de masas. Adicionalmente, debido a la particularidad de su fase móvil (dióxido de
carbono en estado supercrítico), permite en términos generales que la ionización sea más eficiente. En
definitiva, en muchos casos supone que el impacto negativo producido por las matrices complejas
durante el análisis se vea minimizado cuando se emplea esta técnica cromatográfica. Teniendo en cuenta
que en el ámbito de los análisis alimentarios existen matrices que suponen un reto analítico por su
elevada complejidad como pueden ser las especias, esta técnica puede ser de gran utilidad para facilitar
este tipo de análisis.

La cromatografía de fluidos supercríticos permite emplear métodos de detección multiresiduos muy

similares a los empleados en cromatografía líquida, sin embargo, por las características fisicoquímicas
de la fase móvil, también es útil para la detección de compuestos asociados a la cromatografía de gases.
De nuevo, su eficiente mecanismo de ionización permite emplear temperaturas relativamente bajas en
la fuente de ionización, dando lugar a que esta técnica sea útil para la detección de compuestos
termolábiles que son problemáticos para su análisis con las técnicas cromatográficas convencionales.
Por ello, es necesario definir qué familias químicas presentan una mayor sensibilidad usando
cromatografía de fluidos supercríticos, así como establecer si también la polaridad juega un papel
importante. Finalmente, el uso de dióxido de carbono (CO2), por su inocuidad ambiental, está alineado
con el nuevo desarrollo de la Química Verde, ya que elimina en gran medida la contaminación
producida por el uso de las fases móviles líquidas empleadas habitualmente en LC.

11
Resumen

En resumen, esta Tesis aborda como la cromatografía de fluidos supercríticos acoplada a espectrometría
de masas puede ser de utilidad en los diferentes aspectos que rodean los análisis de fitosanitarios en
alimentos; ya sea reduciendo los interferentes que afectan al análisis o aumentando la sensibilidad de
los residuos de plaguicidas a detectar.

12
 Abstract

ABSTRACT

The application of phytosanitary products and their annual evolution is one of the determining factors
in the growth of the current agricultural sector. However, this type of product requires to be carefully
controlled to prevent an erroneous application from leading to a risk for food or environmental health.
The most used techniques to carry out the analysis of these compounds are liquid chromatography and
gas chromatography, both coupled to triple quadrupole mass analyzers (QqQ). These chromatographic
techniques cover a wide range of pesticides of different polarities, which can be analysed with high
sensitivity. However, phytosanitary products are also applied to complex matrices, which are made up
of a large number of components, and these can affect to the selectivity of the analysis. This fact can
cause interference in the analysis and even degrade or clog the consumables associated with the
equipment.

Supercritical fluid chromatography emerges as an alternative that can also be coupled to mass
spectrometry ion sources, and due to the particularity of its mobile phase (supercritical state carbon
dioxide) the ionization is more efficient in general terms. Therefore, the negative impact of difficult
matrices on analysis is drastically reduced when using this type of chromatography. Considering that
there are matrices, such as spices, which are a significant challenge due to their complexity, this
technique can be very useful to facilitate this type of analysis.

Supercritical fluid chromatography allows the use of multi-residue detection methods very similar to
those used in liquid chromatography, however, due to the physicochemical characteristics of the mobile
phase, it is also useful for the detection of compounds associated with gas chromatography. Its efficient
ionization mechanism allows relative lower temperatures to be used in the ionization source and make
this technique useful for the detection of thermolabile compounds that are problematic to be detected
with the conventional chromatographic techniques. For this reason, it is of interest to define which
chemical families have a higher sensitivity using supercritical fluid chromatography, as well as to
establish if polarity plays an important role. Finally, the use of carbon dioxide (CO2) is aligned with the
new development of the Green Chemistry, since it eliminates the contamination resulting from the use
of LC liquid mobile phases.

In brief, this Thesis addresses how supercritical fluid chromatography (SFC) coupled to spectrometry
can be useful in the different aspects surrounding the analysis of phytosanitary products in food; either
by reducing the interferents that affect the analysis or by increasing the sensitivity of the pesticide
residues to be detected.

13
HIPÓTESIS
 Hipótesis

El pronunciado incremento de la actividad agrícola en la primera mitad del siglo XX dio lugar a la
necesidad de proteger y asegurar las producciones. Este hecho provocó una elevada inversión en el
desarrollo de plaguicidas que fueran capaces de eliminar aquellas plantas o insectos que interferían en
la correcta evolución de las plantaciones agrícolas. Sin embargo, las consecuencias de una aplicación
incorrecta de dichos fitosanitarios puede desembocar en consecuencias negativas para el consumidor.
Los análisis de residuos de plaguicidas en fruta y verdura no solo suponen una acción imprescindible
para la seguridad alimentaria, también son necesarios para el correcto funcionamiento del comercio
agrícola, tanto a nivel nacional como internacional. La cromatografía de gases (GC) y líquidos (LC)
acoplada a espectrometría de masas son las técnicas comúnmente utilizadas para llevar a cabo este tipo
de análisis. Sin embargo, las sustancias activas y los alimentos a analizar son cada vez más, y en algunos
casos estas técnicas cromatográficas pueden presentar dificultades para la detección de algunos de estos
analitos. Por lo tanto, se hace necesario la investigación en profundidad de nuevas técnicas que sean
capaces de abordar los problemas que provocan las matrices complejas en los equipos de los
laboratorios de rutina y, de alguna forma, facilitar el análisis de este tipo de alimentos y la detección de
los residuos de plaguicida en los mismos.

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) no es una técnica reciente; de hecho, es ampliamente

utilizada para la separación enantiomérica de fármacos. Sin embargo, la tecnología actual permite que
sea una técnica cromatográfica perfectamente reproducible para la utilización de métodos de análisis
multiresiduo de plaguicidas. El presente trabajo de investigación pretende evaluar cómo esta técnica,
también acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo, puede solucionar los problemas
causados por el efecto matriz de alimentos considerados “difíciles” debido a la complejidad de su
composición. Alimentos como las especias pueden dificultar el proceso de ionización de tal forma que
se produzca una supresión de la señal del analito objetivo, dificultando su detección y, por lo tanto,
aumentando los límites de cuantificación (LOQ) en dichas matrices.

El alcance de detección de plaguicidas empleando SFC es similar al de LC; sin embargo, la fase móvil
empleada en SFC (dióxido de carbono) ofrece ventajas y nuevas posibilidades. Por lo tanto, este trabajo
también pretende evaluar las ventajas de esta técnica cromatográfica respecto a LC, no solo en términos
de efecto matriz, sino también de sensibilidad de análisis en los compuestos según sus familias químicas
y polaridad. También se evaluará la efectividad de la técnica analizando compuestos termolábiles que
resultan problemáticos de analizar con GC y que a su vez no ionizan con facilidad en LC.

16
OBJETIVOS
 Objetivos

El objetivo de la presente tesis es evaluar los beneficios que puede otorgar la cromatografía de fluidos
supercríticos al análisis de residuos de plaguicidas en muestras de origen vegetal, especialmente para
aquellas consideradas matrices complejas. Para ello, empleando un método multiresiduo de plaguicidas
y siguiendo las directrices especificadas en el documento SANTE, se evaluarán diferentes parámetros
experimentales y se compararán con los obtenidos en las dos principales técnicas cromatográficas
empleadas actualmente en los laboratorios de rutina.

Para abarcar este objetivo principal, los objetivos específicos de esta tesis quedan subdivididos en los
siguientes capítulos:

Capítulo I:

• Evaluación del comportamiento de SFC con matrices complejas como las especias y
determinación del grado de reducción de efecto matriz, así como el incremento de sensibilidad
asociado al mismo.
• Desarrollo de un método multiresiduo de 162 plaguicidas y validación de este siguiendo las
directrices del documento SANTE: recuperaciones, linealidad, efecto matriz... etc.
Comprobación de la operatividad del método a través del análisis de muestras reales
provenientes de distintos países.

Capítulo II:

• Estudio de la sensibilidad en SFC empleando diferentes temperaturas en la fuente de ionización

y observar si el comportamiento de la fase móvil es similar al de LC.
• Evaluar plaguicidas termolábiles como Captan y Folpet que no se pueden analizar empleando
LC y que presentan problemas de degradación utilizando GC. Además, optimizar y validar un
método de extracción que evite su degradación durante el proceso de tratamiento de muestra.

Capítulo III:

• Utilizando el mismo sistema de espectrometría de masas, analizar y evaluar diferentes matrices

vegetales a través de LC y SFC. Determinar la temperatura de ionización óptima para cada
cromatografía y realizar una comparativa en términos de sensibilidad.
• Comprobar si el incremento de la sensibilidad en una técnica cromatográfica o en otra está
relacionado con la polaridad o la familia química del analito.
• Comprobar si la reducción del efecto matriz en SFC, además de estar influenciada por la
eficiencia en la ionización, atiende a factores relacionados con la elución.

19
INTRODUCCIÓN
 Introducción

1. Marco regulatorio para el análisis de plaguicidas en alimentos:

Los productos fitosanitarios se definen como aquellas sustancias destinadas a combatir cualquier agente
que pueda provocar que las plantas enfermen. Este tipo de productos no pueden ser empleados a no ser
que hayan sido previamente aprobados por la Unión Europea (UE). Dicha aprobación debe estar
precedida de un estudio científico exhaustivo que demuestre que carece de efectos perjudiciales para
los consumidores y el medio ambiente. La UE, por lo tanto, ha desarrollado una legislación cada vez
más amplia y estricta que busca armonizar el control y desarrollo de los análisis entre los 27 Estados
miembros. La base que rige esta legislación comienza con el Reglamento (EC) 178/2002 [1]. En dicho
reglamento surge la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y se exponen los
procedimientos a seguir para el adecuado control de la seguridad alimentaria. El reglamento considera
la necesidad de garantizar la protección sanitaria durante todo el proceso de elaboración desde la
producción hasta la venta de los productos al consumidor, asegurando la trazabilidad del proceso
llevado a cabo. Uno de los aspectos que busca reforzar este reglamento es el de la homogenización a la
hora de aplicar legislaciones alimentarias. Antes de la publicación de dicho reglamente, los diferentes
Estados miembros no aplicaban las mismas medidas y procedimientos de seguridad alimentaria, lo cual
afectaba a la cadena de desarrollo de análisis y daba lugar a unas condiciones desiguales de
competencia. Por este motivo, era necesario el desarrollo de una normativa que centrase una base común
y promoviese la interconexión de laboratorios de calidad a escala regional y/o interregional con el
objetivo de prevenir posibles riesgos para la salud de los ciudadanos. Todo este proceso involucra a un
comité científico que será el responsable de proporcionar a la EFSA sus dictámenes científicos. Las
comisiones científicas estarán compuestas por expertos científicos independientes y cada uno
especializado en su ámbito de competencia. La EFSA surge como un organismo capaz de garantizar la
base científica y técnica de la legislación de la UE referente a la inocuidad de los alimentos y piensos.
Una de las comisiones técnicas corresponde a la fitosanidad, productos fitosanitarios y sus residuos. El
apartado 62 del reglamento establece las nuevas directivas y competencias relativas a los productos
fitosanitarios y el establecimiento de niveles máximos de residuos. Las versiones más recientes de
dichas directivas son las siguientes:

• Directiva 91/414/EEC [2]: Esta directiva del consejo tiene en cuenta que el rendimiento de la
producción agrícola se encuentra afectado de manera directa por ciertos organismos nocivos
que pueden mermar la productividad de las cosechas. Considera que la utilización de productos
fitosanitarios es uno de los métodos de protección que más beneficia a la producción agrícola,
pero a su vez recalca que un empleo de manera incorrecta de los mismos puede entrañar riesgos
y peligros para las personas, animales y medioambiente. Propone eliminar las diferencias que
se constituyen entre los estados miembros y aboga por una armonización de las prácticas. Los
criterios de evaluación para la aceptación de un fitosanitario y su posterior puesta en el mercado
son los siguientes: i) son eficaces y no tienen efectos negativos sobre los vegetales ii) no

22
 Introducción

presentan efectos nocivos sobre vertebrados de manera directa o indirecta (esto último
involucra otros medios de contaminación como puede ser el agua potable) iii) No dan lugar a
consecuencias negativas sobre el medio ambiente, incluyendo especies de vegetales ajenas al
objetivo. Este documento también tiene en consideración que los residuos resultantes del
empleo de dichos fitosanitarios sean capaces de detectarse mediante los métodos adecuados de
uso habitual.

• Reglamento (EC) 1107/2009 [3]: El objetivo del reglamento es buscar un compromiso entre la
protección de la salud (especialmente de aquellos grupos vulnerables como mujeres
embarazadas, lactantes y niños) y la competitividad de la agricultura comunitaria. Por lo tanto,
este reglamento debe garantizar que la industria demuestra que los productos comercializados
no presentan efectos nocivos inaceptables para la salud o el medio ambiente.

• Directiva 2009/125/EC [4]: Esta directa establece una serie de requisitos de diseño ecológicos
aplicables a los productos relacionados con la energía. De nuevo, una medida que busca
eliminar la disparidad entre los estados miembros y eliminar los obstáculos generados por las
medidas administrativas que pueden dar lugar a un impacto en el mercado interior. Por lo tanto,
la directiva armoniza los requisitos de diseño ecológico para todos los productos significativos
relacionados con la energía.

1.1 Límite máximo de residuo

El apartado 62 de dicho reglamento [1] también especifica que se deben fijar los límites máximos de
residuos (LMR) durante la fase de control. Las trazas que los plaguicidas dejan en los productos tratados
con fitosanitarios se denominan residuos. Los LMRs se definen como la concentración máxima de
plaguicida que está permitida legalmente en productos de alimentación y piensos, siempre teniendo en
cuenta que se ha seguido la normativa de aplicación correspondiente según las buenas prácticas
agrícolas (BPA). El LMR funciona como un límite de tolerancia en términos legales, pero no significa
que si la concentración de los plaguicidas supera su LMR suponga un riesgo elevado para la salud
pública. Como norma general existe un margen con la intención de proteger especialmente a aquellos
grupos vulnerables como pueden ser bebés, niños y vegetarianos.

La revisión sobre los LMR más importante hasta la fecha tuvo lugar en septiembre de 2008. Hasta
entonces los Estados miembros disponían de diferentes valores de LMR, esto suponía un conflicto para
comerciantes e importadores. Con esta nueva normativa los valores de LMR quedaron unificados,
evitándose las situaciones de inseguridad entre los consumidores, que no entendían como un LMR se
podía considerar seguro y aceptable en un Estado miembro y sin embargo tener un valor inferior en
otro. Además, con la armonización de los LMR se evita el sesgo de los alimentos y piensos con menores

23
 Introducción

residuos de plaguicidas hacia los países con LMR más restrictivos. Todas estas directrices que se aplican
a productos de origen animal y vegetal así como porciones de dichos productos que serán empleadas
como alimentos frescos y transformados quedan recogidas en el Reglamento (EC) 396/2005 [5]. Este
reglamento especifica que los Estados miembros deberán adoptar normas para sancionar posibles
infracciones y tomar las medidas necesarias para su cumplimiento. Las sanciones llevadas a cabo deben
ser eficaces, proporcionadas y disuasorias.

Este reglamento, a través de sus anexos, concreta de manera detallada los LMR que deben aplicarse a
cada producto. En el anexo I se especifica que en el reglamento (EC) 178/2006 [6] se incluyen todos
los productos para los que actualmente existe un LMR. Este documento es de especial importancia ya
que no solo indica a que grupos se aplican los LMRs y su denominación científica, sino que también
determina a que partes de los productos a analizar se le aplican dichos LMRs. Para algunos alimentos,
el LMR comprende el análisis del producto sin la cáscara, el tallo, la corona, las hojas e incluso la tierra
adherida en el caso de raíces y tubérculos. Los dos anexos siguientes especifican los LMRs de
plaguicidas específicos. Sin embargo, en el caso del anexo III se trata de los LMRs denominados
temporales. Estos LMRs son consecuencia del proceso de armonización mencionado anteriormente, ya
que se trata de una lista de 471 plaguicidas para los cuales los LMRs estaban establecidos únicamente
a nivel nacional antes de septiembre de 2008. Los siguientes anexos tratan casos más específicos como
plaguicidas que no necesitan LMR debido a su bajo riesgo (Anexo IV), plaguicidas que tienen LMR
por defecto por encima de 0.01 mg/kg (Anexo V) y factores de conversión para alimentos que han
sufrido una etapa de procesado (Anexo VI, todavía sin publicar).

Los LMRs de forma general están comprendidos en el rango de 0.01-10 mg/kg, dependiendo no solo
del plaguicida y su toxicidad, sino también de la matriz en la cual se haya aplicado. Sin embargo, existe
otro término, el límite de determinación (LD). Este se aplica para los cultivos en los que el plaguicida
no se ha utilizado o no hay información sobre residuos detectables. En la Unión Europea este límite se
establece en 0.01 mg/kg. Hay excepciones como por ejemplo los alimentos infantiles, a los cuales la
legislación impide comercializar con residuos de plaguicidas con concentraciones superiores a 0.003
mg/kg, ya que en el caso de los lactantes o niños de corta edad un límite de 0.01 mg/kg puede ser
peligroso. Este límite de 0.003 mg/kg se revisará de forma periódica teniendo en cuenta los datos sobre
contaminación ambiental. Por otro lado, la directiva 2006/125/EC [7] también establece algunas
exclusiones del LD ya que algunos plaguicidas pueden ser de elevada toxicidad y requerir LMRs
inferiores al LD o incluso, la prohibición de la utilización de los mismos.

La aprobación de los LMR no solo se lleva a cabo con la información proporcionada por los estudios
recabados por la UE. También se tienen en cuenta organismos externos ya que la comercialización de
los alimentos y piensos involucra a entidades fuera de la UE. Las observaciones de los socios
comerciales de la UE se transmiten a través de la Organización Mundial del Comercio. Una vez que los

24
 Introducción

LMR han sido armonizados y quedan aprobados, estos se registran de manera pública en la página web
de la Comisión Europea [8]. Actualmente hay más de 1000 sustancias activas registradas de las cuales
podemos obtener los LMRs que se les aplica según el producto. También se pueden observar los LMRs
de regulaciones previas y los datos sobre la información toxicológica de la sustancia activa como pueden
ser las dosis de referencia aguda (ARfD).

Figura 1. Esquema bidireccional que conforma el establecimiento de los LMRs.

Por lo tanto, el procedimiento para establecer los LMR involucra múltiples etapas, además, lo hace de
manera bidireccional como puede observarse en la Figura 1. Estas etapas pueden quedar resumidas de
la siguiente forma: primero se lleva a cabo la aplicación siguiendo las BPA, y los residuos resultantes
se evalúan experimentalmente. Posteriormente se procede al estudio toxicológico de la ingesta de dichos
residuos para los diferentes grupos de población (incluyendo los bebés, niños y vegetarianos), y de esta
manera los valores de referencia para la ingesta diaria admisible (IDA) y las ARfD quedan registrados.
Estos valores tienen en cuenta, siguiendo las metodologías de evaluación de riesgo acordadas
internacionalmente, la exposición a los plaguicidas a corto y largo plazo, así como de forma crónica.
Para llevar a cabo esta evaluación se emplea un modelo PRIMo desarrollado por la EFSA (modelo de
ingesta de residuos de plaguicidas). Este modelo tiene en cuenta las cifras nacionales de consumo de
alimentos y los pesos unitarios facilitados por los Estados miembros. La EFSA dispone de un
documento que describe de forma detallada el funcionamiento de la herramienta [9].

Siempre se busca garantizar que los LMRs sean lo más bajos posibles, obviamente estos no pueden
superar el límite que suponga un riesgo para algún grupo de consumidores. Sin embargo, a veces la
cantidad mínima de plaguicida necesaria para proteger un cultivo está muy por debajo del nivel que se
considera todavía seguro. Como norma general, el LMR se establece en el nivel inferior; no obstante,
las condiciones climatológicas en el territorio europeo difieren mucho entre sí y pueden dar lugar a que
las autorizaciones se lleven a cabo a nivel nacional. Por ejemplo, los países europeos situados más al
sur sufren un clima más cálido y son más propensos a la aparición y reproducción acelerada de insectos;

25
 Introducción

por lo tanto, necesitan emplear más cantidad de insecticidas. Otro ejemplo son los países en los que
debido a sus condiciones húmedas proliferan los hongos y necesitan utilizar un mayor volumen de
fungicidas.

1.2 Programas de vigilancia y cumplimiento:

Los Estados miembros de la UE son los encargados de vigilar que se lleve a cabo el correcto
cumplimiento de los LMRs y evaluar la exposición media de los grupos de consumidores a los residuos
de plaguicidas. Las muestras que son producidas en la UE se rigen por los programas de vigilancia,
mientras que aquellas que proceden de países externos se acogen a los programas de cumplimiento y,
por lo tanto, los controles se llevan a cabo en aduanas. La toma de muestra se realiza en diferentes
etapas de la cadena de mercado. La Directiva 2002/63/EC [10] es la que recoge en qué consisten los
métodos comunitarios oficiales de muestreo para los controles de residuos de plaguicidas. En estos
métodos se especifican diferentes procedimientos como las precauciones que hay que tener en cuenta
para evitar el deterioro de la muestra, el tamaño mínimo que debe tener la muestra primaria a recoger,
como se debe preparar la muestra a granel, así como todo el proceso de registro, envasado y traslado de
la muestra al laboratorio para su posterior análisis.

Las normas generales para la realización de los controles oficiales quedaban recogidas en el Reglamento
(EC) 882/2004 [11], el cual se sustituyó por el reglamento 625/2017 [12] que se aplica actualmente.
Los controles deben realizarse con regularidad, la frecuencia de estos quedará establecida según los
riesgos identificados en animales, piensos o alimentos (incluyendo procesos, materiales, sustancias u
operaciones directamente relacionadas). Estos controles serán de improviso, salvo en casos tales como
las auditorías, dónde se realizará una notificación previa. Los controles pueden llevarse a cabo en
cualquiera de las fases de la producción, estos se aplicarán con el mismo cuidado a exportaciones de
fuera de la Comunidad, de dentro de la Comunidad y a los productos procedentes de terceros países. En
el caso que un Estado miembro realice una comprobación en el lugar de destino y detecte algún
incumplimiento, podrá exigir la reexpedición al Estado miembro de origen. Para los métodos de
análisis, el reglamento remite a la norma comunitaria en vigor. En caso de ausencia de esta normativa
hay que proceder con las normas o protocolos internacionalmente conocidos como pueden ser aquellos
aceptados por el Comité Europeo de Normalización (CEN.)

Los alimentos más consumidos en la dieta de la UE componen, junto con los analitos seleccionados, el
alcance mínimo del programa de control multianual coordinado por la UE. Actualmente, este programa
se rige por el reglamento de ejecución 601/2021 de la comisión [13]. Estos reglamentos suelen
comprender un periodo de tres años ya que es necesaria una constante revisión de los plaguicidas y
matrices utilizados en la UE. La actual normativa comprende los años 2022, 2023 y 2024 e incluye un
anexo en el que se especifica el número de muestras de cada producto (incluidos los alimentos para

26
 Introducción

lactantes) así como aquellos procedentes de agricultura ecológica. El lote sometido a muestreo se elige
de forma completamente aleatoria.

En el programa de vigilancia de la UE se recogen aproximadamente 80000 muestras anuales en las

cuales se analizan más de 700 plaguicidas diferentes. Los laboratorios que llevan a cabo las
determinaciones analíticas dentro del programa de vigilancia de la UE son los denominados laboratorios
oficiales (OfL). Estos laboratorios disponen de instrumentación lo suficientemente efectiva como para
poder dar un correcto resultado, siguiendo siempre los procedimientos y métodos de análisis que han
sido validados previamente. Para asegurar que los laboratorios siguen esta metodología experimental
de forma adecuada surgen los Laboratorios de Referencia Europeos (EURLs) y los Laboratorios de
Referencia Nacionales (NRLs), los cuales quedaron designados en el reglamento (EC) 882/2004 [11]
mencionado anteriormente. Mediante la organización de ejercicios de intercomparación, validación de
nuevos métodos, y asesoramiento al personal de los laboratorios, se busca no sólo que los análisis de
residuos de plaguicidas sean de alta calidad, sino que además sean lo más uniformes posibles.

Figura 2. Número de muestras analizadas por cada Estado miembro para la detección de plaguicidas
en alimentos según el informe de 2019 de la EFSA.

La EFSA, como responsable de la coordinación de los resultados del programa de vigilancia europeo,
recoge una gran cantidad de resultados durante su actividad. Tras el tratamiento de esos datos, este
organismo es capaz de proporcionar un informe sobre la exposición a residuos de plaguicidas de los

27
 Introducción

consumidores europeos a través de las dietas más populares. En 2021 se publicó el informe
correspondiente al año 2019 [14], en la Figura 2 se puede observar un gráfico que desglosa las muestras
analizadas por cada Estado Miembro. De las 96302 muestras analizadas, 3.9% presentaban algún
plaguicida por encima del MRL, teniendo en cuenta la incertidumbre expandida del 50%. Tras evaluar
los resultados con los valores toxicológicos, se llegó a la conclusión de que ninguno de los alimentos
analizados suponía un riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, se establecen algunas
recomendaciones para incrementar la efectividad del programa de vigilancia europeo y sus sistemas de
control.

1.3 El sistema de alerta rápido para alimentos y piensos (RASFF).

La Comisión Europea, como responsable de la gestión, estableció en 1979 una red para informar de
manera urgente sobre riesgos para la salud humana y animal. Esta red está compuesta por la EFSA, los
Estados miembros y los países miembros de la Asociación Europea del Libre Comercio (EFTA). A
través del programa de seguimiento los Estados miembros se analizan las muestras oficiales y se toman
medidas con aquellas que presentan niveles de residuos de plaguicidas considerados perjudiciales para
el consumidor. La finalidad del RASFF es proporcionar de manera rápida esta información a las
autoridades de control y que estas lo comuniquen a los Estados miembros de la red para que se pueda
actuar lo antes posible. Este procedimiento transfronterizo presenta una trazabilidad y permite una
coordinación con el objetivo de adelantarse a cualquier riesgo de salubridad alimentaria, ya sea directo
o indirecto. A la hora de dar la información también deben especificarse las acciones emprendidas o
medidas adoptadas.

El RASFF se rige por el Reglamento (EC) 178/2002 [1]; en el capítulo IV de dicho documento se
describe la información sobre el sistema de alerta rápida. En el artículo 52 de dicho documento se
especifican las normas de confidencialidad. La información relacionada con el riesgo para la salud que
presenta un alimento debe ser accesible al público. Esta información incluye la identificación del
producto, la naturaleza del riesgo y la medida adoptada. Sin embargo, con el fin de encontrar un
equilibrio entre la protección y el daño económico para el sector agroalimentario, los miembros de la
red deben evitar revelar la información obtenida para que esté protegida por secreto profesional. No
obstante, sí es necesario un ejercicio de transparencia para asegurar la salubridad de los consumidores,
y por ello, se hará pública toda la información protegida que sea de relevancia. El reglamento también
especifica que, si un alimento que haya sido objeto de notificación en el sistema de alerta rápida ha sido
enviado a un país tercero, este debe ser informado de manera correspondiente.

28
 Introducción

Figura 3. Interrelaciones del sistema RASFF.

En la Figura 3 se puede observar de forma esquemática cómo se desarrolla el sistema RASFF. Los
inspectores realizan una inspección en el mercado o en una frontera y proceden a la toma de muestra,
la cual se envía a un laboratorio de la red de laboratorios oficiales. Posteriormente, se comprueban los
resultados proporcionados por el laboratorio y se evalúa si existe un riesgo para la salud. En caso
afirmativo, a través de un formulario de notificación RASFF se especifican los detalles del resultado y
las acciones llevadas a cabo en consecuencia. Este formulario debe ir acompañado de todos los
documentos relevantes posibles como pueden ser las listas con las empresas que han recibido los
productos contaminados. A continuación, la Comisión Europea traslada la información a todos los
miembros del RASFF. Existen cuatro principales métodos de notificación:

• Notificaciones de alertas: Este tipo de notificación involucra que el alimento o pienso que
presenta el riesgo para la salud se encuentra ya en el mercado y, por lo tanto es necesario una
actuación inmediata. El Estado miembro que identifica el problema y toma las medidas
necesarias (como puede ser la retirada del producto), informa al resto de miembros del RASFF
para que siguiendo la trazabilidad comprueben si dicho producto también ha llegado a sus
mercados.
• Notificaciones de información: Este tipo de notificaciones se llevan a cabo cuando el riesgo
identificado no se considera grave y por lo tanto no requiere de una acción inmediata. Se pueden
diferenciar en notificaciones de información para seguimiento y notificaciones de información
para atención o cuidado. Las notificaciones de seguimiento hacen referencia a un producto que

29
 Introducción

puede ser depositado en un mercado de un miembro de la red RASFF y las de atención

corresponden a productos que todavía no han llegado al mercado o ya no se encuentra en él.
• Notificación de rechazos en frontera: Esta notificación tiene lugar cuando, tras realizar el
análisis del producto, un envío es rechazado en la frontera exterior de la UE debido a que se ha
identificado un riesgo sanitario. El propósito de este mensaje es reforzar los controles del
Espacio Económico Europeo (EEE) para asegurar que el producto no se introduce a través de
otro puesto fronterizo.
• Noticias: Las noticias involucran toda información que se considera de relevancia sobre la
seguridad alimentaria y de los piensos, pero que no cumple los requisitos para ser ninguna de
las notificaciones expuestas con anterioridad.
• Notificaciones de incumplimientos: Se considera un incumplimiento todos aquellos productos
agroalimentarios que no presentan un riesgo para la salud de las personas pero que pueden dar
lugar a leves riesgos para el bienestar animal y las plantas. Si, tras evaluar el incumplimiento,
se considera que existe un riesgo notable, se puede aplicar un procedimiento rápido para escalar
la notificación dentro de la plataforma RASFF.

La Figura 4 representa un gráfico con todos los tipos de notificaciones que han sido reportadas durante
las anualidades de 2017, 2018, 2019 y 2020. Estos datos también involucran el sistema de asistencia y
cooperación administrativa. (AAC). La comunicación entre ambos organismos se establece a través de
un “módulo de conversación”, una funcionalidad disponible en la plataforma electrónica iRASFF. En
la Figura 4 se puede observar cómo han ido aumentando las notificaciones de incumplimientos durante
este rango de tiempo.

Figura 4. Número de notificaciones (RASFF/AAC) separadas por tipos presentadas durante los años
2017,2018,2019 y 2020.

30
 Introducción

En el año 2019 se transmitieron más de 4118 notificaciones a través del sistema RASFF, de las cuales
1173 (29%) fueron clasificadas como alerta, 546 (13%) fueron marcadas como información para
seguimiento, 882 (21%) como información para atención, 1499 (36%) como rechazos en frontera y 18
(<1%) como noticias.

31
 Introducción

2. Cromatografía de fluidos supercríticos

2.1 Evolución de la técnica cromatográfica de fluidos supercríticos.

En 1962 se desarrolló una nueva técnica cromatográfica conocida como cromatografía de fluidos
supercríticos, denominada por sus siglas en inglés: SFC. La idea de esta técnica surge con un propósito
claro de combinar la cromatografía líquida (HPLC) y la cromatografía de gases (GC) en busca de una
cromatografía híbrida (HPGC) que proporcionase las ventajas de ambas y permitiese la detección y
análisis de compuestos no volátiles e inestables. El primer contacto con lo que hoy día conocemos como
SFC se puede encontrar en un artículo de Ernst Klesper [15]. Las dificultades que suponían el análisis
de ciertas porfirinas a través de GC, llevaron a Klesper a investigar otros gases que se pudieran emplear
para separar estos compuestos. Sus estudios se centraron en el aumento de la presión del sistema,
eludiendo elevar la temperatura a los niveles de la cromatografía de gases y, de esta forma, se evitó la
degradación de las porfirinas durante el análisis. Sin embargo, para la separación en columna (fase
estacionaria de polietilenglicol), Klesper empleó diclorodifluorometano como fase móvil. Sie, Van
Beersum y Rijnders fueron los primeros en publicar un estudio que utilizaba dióxido de carbono (CO2)
como fase móvil [16]. De esta forma la presión crítica necesaria para actuar como fase móvil se redujo
drásticamente en comparación con el diclorodifluorometano, además de que presentaba ventajas extra
como el hecho de ser muy económico y carecer de toxicidad. Durante los años venideros, SFC compitió
con GC destacando en un análisis más eficiente de aquellos compuestos que mostraban inestabilidad
térmica, así como aquellos que excedían el rango de peso molecular generalmente aplicado en métodos
de GC. Grindings, Myers y King fueron los primeros en proponer un método comparativo con HPLC
[17]. Este método se desarrolló para el análisis de compuestos no volátiles, los cuales eluían a través de
un gradiente de presión. De esta forma, Grindings quería demostrar que mediante la modificación de la
presión se podía alterar el poder solvente del gas empleado como fase móvil y mejorar a la HPLC en
diversos aspectos, especialmente en velocidad de análisis ya que permitiría el uso de flujos más
elevados, siendo esta una de las principales ventajas de este tipo de cromatografía hoy en día. Tras el
desarrollo de estas rampas de presión para controlar la elución, SFC oficialmente empezó a competir
con las dos principales técnicas cromatográficas ampliamente implantadas, GC y HPLC.

Sin embargo, se observaron algunos inconvenientes como la pronunciada caída de presión que se
experimentaba a la salida de la columna cromatográfica, especialmente en columnas capilares. Cuando
se empleaba dióxido de carbono puro como fase móvil, la caída de presión en la salida de columna
afectaba de manera notoria a la resolución cromatográfica. La resolución de los compuestos dependía
en gran medida de las condiciones de presión en el momento de la elución. Además, este hecho era
difícilmente predecible a través de una simple ecuación, ya que se mezclaban factores de separación
con factores de capacidad y el incremento del número de platos en la columna no daba lugar a una mejor
separación [18]. La caída de presión se magnificaba conforme menor era el tamaño de partícula y mayor

32
 Introducción

la longitud. Era necesaria la búsqueda de un compromiso entre la eficiencia, tamaño de partícula y la

caída de presión en columna, ya que si no las condiciones no se mantenían uniformes durante la
separación cromatográfica [19,20]. Hewlett Packard fue la primera empresa que fabricó dispositivos
específicos para aumentar la eficiencia de las capacidades de SFC. En concreto, Hewlett Packard
destacó por posicionar módulos de enfriamiento en los cabezales de la bomba, así como la incorporación
de una válvula reguladora de contrapresión (BPR) que permitía cierto control de la presión a lo largo
del sistema [21], el esquema de dicha válvula queda expuesto en la Figura 5. Por lo tanto, el concepto
de SFC utilizando columnas empaquetadas seguía siendo factible incluso empleando pequeños tamaños
de partícula. Posteriormente estos dispositivos acoplados a SFC se han ido perfeccionando. Un ejemplo
de ello fueron los restrictores que se implementaron posteriormente en los BPR para automatizar la
regulación de presión en función del flujo de CO2 proporcionado por la bomba; permitiendo al usuario
ajustar los parámetros de dicha regulación [22]. De esta forma el analista podía establecer una presión
fija a la salida de columna independientemente del flujo, lo cual mantenía la densidad de la fase móvil
y aumentaba la reproducibilidad del análisis.

Figura 5. Sección transversal de la válvula reguladora de contrapresión (BPR) 1 = asiento de válvula,

2 = aguja, 3 = solenoide, 4 = sello, 5 = resorte de retorno, 6 = tornillo de ajuste, 7 = calentador.
Reproducción sacada del artículo publicado en Chromatographia por M. Saito, Y. Yamauchi, H.
Kashiwazaki y M. Sugawara [22].

Las mejoras aplicadas al sistema de SFC provocaron una transición de una cromatografía de columna
capilar a una de columna empaquetada; más similar a la cromatografía de fase normal HPLC. Terry
Berger fue de los pioneros en acoplar SFC a espectrometría de masas y demostrar que con el uso de

33
 Introducción

modificadores en la fase móvil esta técnica adquiría la capacidad de detectar los analitos más polares
[23,24]. Berger profundizó en esta idea de SFC como una alternativa demostrable a HPLC en
cromatografía de fase normal e investigó como diferentes aditivos y modificadores podían afectar a la
forma de pico y especialmente a la ionización de los compuestos [25]. En la Figura 6 se puede observar
cómo poniendo en conjunto todos estos descubrimientos sobre control de la presión, codisolventes y
aditivos se pudo determinar el alcance actual de SFC en términos de polaridad [26]. De hecho, hoy en
día, el CO2 puro como fase móvil se utiliza en raras ocasiones, como puede ser la separación de
fracciones de petróleo [27]. Entre las principales ventajas de esta versatilidad en cuanto a polaridad que
nos puede proporcionar la fase móvil de SFC está el amplio alcance analítico. Comparado con LC, el
rango de analitos que pueden detectarse con esta técnica es bastante superior. Esto hace que SFC sea
una técnica útil en un amplio rango de campos de aplicación, sobre todo si tenemos en cuenta sus
ventajas en cromatografía quiral. Otra ventaja destacable es que SFC puede trabajar sin usar agua en la
fase móvil, de hecho, suele ser muy común. Esto supone una ventaja ya que algunos analitos pueden
sufrir hidrolisis durante la elución en cromatografía líquida de fase reversa (RPLC), dando lugar a una
cuantificación errónea.

Figura 6. Rango de aplicación de SFC incluyendo las diferentes variantes con co-disolventes y aditivos.

Durante las dos últimas décadas los instrumentos se fueron perfeccionando en cuestiones de hardware
y software para conseguir el mejor rendimiento. De esta forma, la adopción de SFC por parte de los
laboratorios fue cada vez mayor, sobre todo para la realización de purificaciones por parte de

34
 Introducción

laboratorios farmacéuticos. La combinación de fase estacionaria y fase móvil en cromatografía

preparativa con SFC permitió la separación de compuestos quirales empleando grandes flujos, lo cual,
facilitaba la rapidez del procedimiento y el reequilibrio de las condiciones iniciales sin afectar a la
eficiencia cromatográfica. Sin embargo, existía un inconveniente. La recogida de la muestra mediante
esta metodología requiere de separadores ciclónicos en el vial, los cuales evitan la diseminación de la
muestra mejorando el porcentaje de recuperación del analito. Utilizando estos separadores con SFC era
necesario que se limpiaran después de cada muestra, lo cual, para un laboratorio de rutina con un
elevado flujo de trabajo suponía un gran inconveniente. Además, este tipo de separadores ciclónicos
estaban ideados para HPLC, por lo que eran dispositivos diseñados para recoger grandes volúmenes de
la misma muestra. Berger pretendía usar SFC para la recogida de diferentes muestras y la dificultad en
la limpieza de estos aparatosos dispositivos generaba problemas de contaminación cruzada. Berger ideó
un método semipreparativo con SFC que permitía la autolimpieza y disminución del aerosol con
recuperaciones superiores al 95% [28]. Otra significativa mejora de la cromatografía preparativa con
SFC fue la incorporación de un mecanismo para desviar una fracción de la muestra a un detector. De
esta forma, los laboratorios no tenían que posteriormente analizar el extracto; mientras se recogía el
mismo, una fracción se destinaba a un detector para confirmar la separación. Wang y Kassel fueron los
primeros en documentar como posicionaron una válvula intercambiadora entre su cromatógrafo SFC y
su espectrómetro de masas que permitía llevar a cabo este proceso [29]. Esta modificación de la válvula
no afectaba a la recuperación con elevados rendimientos de la gran mayoría de los compuestos presentes
en las bibliotecas químicas de entonces. Por lo tanto, SFC se planteaba como una poderosa técnica
cromatográfica que proporcionaba una alternativa a la cromatografía de líquidos en fase reversa
convencional.

Figura 7. Sistema de purificación SFC/MS desarrollado por Wang y Kassel. (a) bomba del
modificador, (b) bomba de CO2, (c) detector de UV, (d) bomba LC 200 a 3 mL/min MeOH, (e) bomba

35
 Introducción

LC 200 a 200 µL/min 50:50 MeOH / agua que contiene ácido fórmico al 0,05%, (f) inyector Gilson 215
/ colector de fracciones y (g) espectrómetro de masas PE Sciex API-150 EX.

Hoy en día la configuración más demandada y considerada más efectiva es aquella que emplea
columnas empaquetadas. La configuración es muy similar a la de un HPLC exceptuando aquellos
dispositivos exclusivos de SFC como la bomba de CO2 o el regulador de contrapresión. Esta
configuración ha sido la mayoritariamente aceptada principalmente por ser más adaptable al análisis de
un gran espectro de compuestos [30]. En aspectos generales se considera a SFC como una cromatografía
de fase normal, pero sin los problemas comúnmente asociados a la cromatografía de fase normal HPLC,
siendo a su vez una alternativa muy viable para la separación en fase reversa HPLC. Los flujos de fase
móvil empleados permiten que el reequilibrado de las columnas sea muy rápido, alcanzándose las
condiciones iniciales en apenas 5 volúmenes de columna. Las ventajas de SFC respecto a HPLC están
bastante definidas. La fase móvil en estado supercrítico presenta una menor viscosidad y por lo tanto
una mayor difusividad respecto a los líquidos convencionales, lo cual proporciona separaciones más
eficientes en un menor especio de tiempo. Desde el punto de vista medioambiental, SFC entra dentro
del concepto química verde ya que la fase móvil está basada en CO2, un producto abundante en la
naturaleza, de toxicidad muy reducida y no inflamable [31], el cual se puede producir en gran escala y
con una excelente eficiencia energética. En resumen, el empleo de CO2 como fase móvil en
cromatografía da lugar a procesos más limpios y económicos, pero sin perder calidad analítica. La
cromatografía SFC se puede emplear como cromatografía de fase reversa, pero aporta algo más de
versatilidad en cuanto al alcance de los compuestos analizados si se introduce algún disolvente orgánico
como modificador [32]. Además, emplear un gradiente de modificador en SFC con algunas aplicaciones
como las separaciones quirales presenta múltiples ventajas ya que puede proporcionar mejor resolución
cromatográfica.

La cromatografía SFC se convirtió entonces una herramienta muy útil tanto para separación aquiral
como quiral. Conforme más se entendía la técnica y sus interacciones con las diferentes fases
estacionarias, más se ampliaba el rango de compuestos que se podían analizar. En definitiva, a lo largo
de las últimas décadas, la cromatografía SFC se ha convertido en una técnica muy bien comprendida
que proporciona la misma calidad y robustez que HPLC. Por lo tanto, se considera a SFC como una
técnica eficiente para el análisis cromatográfico, capaz, en muchas ocasiones, de dar solución a ciertas
limitaciones presentes en HPLC y GC.

2.2 Determinación de la fase móvil

Los tres principales tipos de cromatografía difieren principalmente en las propiedades fisicoquímicas
de la fase móvil. En LC, las interacciones son dependientes de la naturaleza del eluyente, ya que según

36
 Introducción

sus propiedades proporcionará un tipo de interacción molecular u otro con la fase estacionaria. En GC
la fase móvil es un gas que arrastra los analitos y los separa por interacción con la fase estacionaria en
una columna capilar, basando el gradiente del método en la temperatura del horno. En SFC, la fase
móvil es un fluido con una temperatura y presión próximas o por encima de la temperatura y presión
críticas. La densidad del fluido juega un papel crucial en las interacciones moleculares con el analito y
la fase estacionaria. Sin embargo, esta fase móvil de SFC es sobre todo eficiente con compuestos de
baja polaridad; para el análisis de compuestos con una polaridad más elevada es necesario añadir
modificadores orgánicos. Estos disolventes modifican las propiedades del CO2 supercrítico:
incrementan la viscosidad y reducen el coeficiente de difusión. Por esta razón se añaden en pequeñas
proporciones [33]. Hoy en día la gran mayoría de sistemas SFC emplean fases móviles modificadas de
CO2 sobre columnas empaquetadas.

Si observamos el diagrama de la Figura 8 que representa un componente individual y puro [34],

dependiendo de la temperatura (T) y la presión (P) se pueden dar los tres estados de la materia. Cuando
se alcanza el punto triple (tp) estos tres estados de la materia coexisten. Sin embargo, la sección del
gráfico que involucra a SFC es la delimitada por el punto crítico (cp), donde la temperatura y presión
del compuesto se encuentran por encima de sus valores críticos y, por lo tanto, las diferencias entre el
estado líquido y el gaseoso son prácticamente inexistentes. Hay controversia sobre si la zona del gráfico
que muestra la región de supercrítico corresponde a un cuarto estado de materia o no, de hecho, si se
cruzan las líneas discontinuas no se está produciendo un cambio de fase. Al cruzar una línea continua
del diagrama, se produce un cambio de fase que desemboca en un cambio drástico en la densidad,
viscosidad y difusividad. En el diagrama se puede observar otra forma de trasformar, por ejemplo, un
gas en un líquido. Siguiendo la flecha representada, el cambio de gas a líquido se realiza de forma
gradual sin afectar de manera abrupta en las propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, no se produce
un cambio de fase.

Figura 8. Diagrama de fases para un solo componente. Las áreas definidas son sólido (S), líquido (L),
gaseoso (G) o fluido supercrítico (SF). También están representados el punto triple (tp) y el punto
crítico (cp).

37
 Introducción

Si tenemos en cuenta LC, las mezclas producidas son entre dos líquidos miscibles, la mezcla más
sencilla que se puede dar. Sin embargo, el comportamiento de una fase binaria en SFC es mucho más
complejo. Para representar la composición del fluido es necesario observar la Figura 9 donde escalamos
a un diagrama en tres dimensiones que incluye un tercer eje para el modificador. La región que
comprende a la figura sombreada correspondería a la zona donde se mezclan ambas fases [35]. En
definitiva, aunque existe cierta controversia sobre el estado de la fase móvil en SFC cuando se aplica
un modificador, lo que está perfectamente definido es que las principales propiedades de un fluido
supercrítico son la alta difusividad y la baja viscosidad.

Figura 9. Diagrama tridimensional de una mezcla binaria en dos fases. La mezcla tipo I representada
es CO2 y metanol. La figura sombreada representa la región en dos fases.

Este tipo de fluidos no se suelen dar de forma espontánea en la naturaleza. Berger describe la multitud
de fluidos que han sido estudiados como fase móvil para SFC [23]. Entre ellos destacan el óxido
hiponitroso (N2O), amoníaco (NH3), halocarburos, dióxido de azufre (SO2) e incluso agua. En el libro
de B.E. Poling [36] se encuentra la Tabla 1 que resume el peso molecular, la temperatura crítica, presión
crítica y la densidad de fluidos que podrían ser utilizados como fases móviles o aditivos en SFC. Es
necesario tener en consideración que realizar cualquier análisis en unas condiciones próximas al punto
crítico es completamente desaconsejable. Está demostrado que los coeficientes de difusión se ven
modificados drásticamente cuando se trabaja a temperaturas y presiones próximas a las críticas [37].

38
 Introducción

Por lo tanto, para evitar resultados inesperados y operar de manera reproducible es necesario trabajar
considerablemente por encima del punto crítico.

Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de disolventes compatibles con la cromatografía de fluidos

supercríticos. PM: Peso molecular; Tc: Temperatura crítica; Pc: Presión crítica; Dc: Densidad crítica.

Disolvente PM Tc (K) Pc (atm) Dc (g/ml)

Dióxido de carbono (CO2) 44.01 304.12 73.7 0.469

Amoniaco (NH3) 17 405.4 113.5 0.235

Óxido nitroso (N2O) 44 309.6 72.5 0.450

Agua (H2O) 18.015 647.1 220.6 0.322

Metano (CH4) 16.04 190.6 46 0.162

Etano (C2H6) 30.07 305.3 48.7 0.203

Propano (C3H8) 44.09 369.8 42.5 0.217

Etileno (C2H4) 28.05 282.3 50.4 0.215

Propileno (C3H6) 42.08 364.9 46.0 0.232

Metanol (CH3OH) 32.04 512.6 80.9 0.272

Etanol (C2H5OH) 46.07 513.9 61.5 0.276

Acetona (C3H6O) 58.08 508.1 47.0 0.278

Trifluorometano (CHF3) 70.01 298.97 48.4 0.526

Tras innumerables evaluaciones de fluidos supercríticos para el desarrollo de SFC, ninguno se aproxima
a la eficiencia que proporciona el dióxido de carbono. El dióxido de carbono tiene un punto crítico muy
fácil de alcanzar, puede comprimirse en un fluido supercrítico a los 31 ºC de temperatura y los 70 bar
de presión. Al no ser necesario emplear elevadas temperaturas, evitamos la degradación de compuestos
termolábiles. Además, se trata de un gas muy fácil de conseguir ya que se emplea en multitud de
industrias de alimentación y a su vez también se recoge como producto de desecho en otros sectores
industriales. Este es el motivo de que la bombona de CO2 resulte a un precio muy económico y de que
SFC se encuentre dentro del concepto química verde ya que el CO2 es un gas reciclable. En lo que
respecta a la seguridad, el dióxido de carbono no es tóxico en pequeñas concentraciones, los flujos
empleados en SFC no afectan de manera considerable al dióxido de carbono ya presente en un
laboratorio.

39
 Introducción

Pero sin duda alguna, una de las propiedades más importantes del CO2 supercrítico es que es miscible
con una gran cantidad de disolventes polares. Actualmente, el disolvente más empleado como
modificador es el metanol (MeOH). Se trata de un disolvente bastante polar que es completamente
miscible con el CO2, con baja toxicidad y accesible a un precio reducido. La densidad del CO2 ha
demostrado tener un rol importante a la hora de modificar los tiempos de retención de los analitos,
especialmente de aquellos que tenían una baja polaridad. Considerando la mezcla metanol/CO2 , la
densidad aumenta conforme se incrementa la concentración de metanol en la fase móvil [38]. Esto se
traduce en que la densidad es el principal parámetro para estudiar la solubilidad ya que es la capacidad
del fluido para establecer interacciones con los solutos. En términos generales, un cambio en la densidad
del fluido afectará directamente a la viscosidad (que a su vez interviene en el coeficiente de difusión) y
la conductividad térmica (que contribuye al intercambio de temperatura en las columnas). La
temperatura es un parámetro que influye también en la densidad. Un descenso de la temperatura en la
región más próxima al estado gaseoso, puede incrementar la densidad ya que se favorece el contacto
entre moléculas, sin embargo, este fenómeno es más probable cuando tenemos CO2 puro. Otro
parámetro bastante común que suele influenciar en la densidad es la contrapresión, y otros menos
comunes son: el flujo, las dimensiones de la columna (longitud, diámetro interno y tamaño de partícula)
y el tipo de porosidad de la fase estacionaria. Por lo tanto, SFC es una técnica muy compleja a la hora
de predecir la separación y los tiempos de retención ya que multitud de factores se ven involucrados
(Figura 6).

Es necesario tener en cuenta que la temperatura crítica del metanol es 240ºC y su presión crítica son 82
bares, por lo que cuando el metanol se mezcla con el CO2 en raras ocasiones estaremos ante un fluido
supercrítico a no ser que la concentración de metanol sea muy reducida [37]. En RPLC es normal
observar un gradiente de 0 a 100% de fase acuosa a fase orgánica. Esta situación no se da en SFC, donde
la concentración de CO2 debe ser siempre superior al 30-40% si se quiere disfrutar de los beneficios de
solubilidad, viscosidad y velocidad de transferencia de masa que proporciona este fluido. Además, la
modificación de la viscosidad y los coeficientes de difusión al añadir modificadores no se produce de
forma lineal; por lo tanto, la adición de estos en las cantidades adecuadas es un parámetro esencial a la
hora de optimizar un método en SFC.

40
 Introducción

Figura 10. Los parámetros involucrados en el tiempo de retención de los analitos en SFC. En azul
aquellos que afectan al CO2 puro y con modificador; en rosa efectos propios de fluidos compresibles
[39].

Generalmente se emplean gradientes que oscilan entre 2-50% dependiendo de la polaridad de los
compuestos a separar. En la Figura 7 sacada del artículo de E. Lesellier y C. West [39] se observa como
las condiciones para mantener el estado supercrítico se modifican drásticamente conforme la adición
de metanol aumenta. La temperatura crítica continúa subiendo conforme el porcentaje de modificador
aumenta de 0-100%. Sin embargo, la presión crítica alcanza un valor máximo entre el 35-40% de
metanol y posteriormente desciende de nuevo conforme continua el incremento de modificador. Este
gráfico también representa las líneas isopicnas, líneas que representan una densidad constante. La teoría
dice que los métodos más robustos, es decir, aquellos menos influenciados por las caídas de presión,
son aquellos que se mantienen por encima de la línea isopicna de 0.75 g/mL. Esta línea ve modificados
sus valores de temperatura y presión conforme aumentamos el porcentaje de modificador en la fase
móvil. La conclusión es que lo que en hoy día se nombra como SFC no es del todo cierto ya que el uso
de porcentajes superiores al 10% de modificador, por norma general, implica que no se cumplan todas
las condiciones características de un fluido supercrítico. Teniendo en cuenta que generalmente se trabaja
con una temperatura en el horno del cromatógrafo entre 40-50 ºC, aunque al inicio si nos encontremos
en condiciones supercríticas, conforme avance el gradiente de modificador estaremos trabajando con
un “fluido subcrítico”. Al operar bajo una temperatura inferior a la temperatura crítica realmente
estamos trabajando con un líquido de alta densidad que tiene la capacidad para disolver los analitos.

41
 Introducción

Figura 11. Diagrama de fases que representa las condiciones para alcanzar el estado de fluido
supercrítico para el dióxido de carbono puro (azul) y con diferentes porcentajes de mezcla con metanol
(verde). Las flechas rojas representan las líneas isopicnas (densidad constante).

Para mejorar la elución o retención en ocasiones se emplean aditivos en el disolvente modificador y en

el disolvente make-up. El disolvente make-up está presente en la gran mayoría de configuraciones
actuales de SFC. Cuando el flujo de fase móvil alcanza la fuente de ionización, la gran mayoría de este
corresponde a metanol, ya que el CO2 pierde las condiciones que le confieren el estado supercrítico tras
abandonar el regulador de contrapresión. El CO2 se expande aproximadamente 430 veces llegando
incluso a influir levemente en el porcentaje de gases involucrados en el proceso de nebulización. Sin
embargo, el principal problema reside en que sobre todo al inicio del gradiente, el porcentaje de
modificador durante la elución es muy reducido (1-5%) por lo tanto la cantidad de disolvente que queda
tras la vaporización del dióxido de carbono es ínfima. Colocando una bomba que proporcione un
pequeño flujo de disolvente se consigue que tras la expansión del CO2 siga habiendo suficiente volumen
de disolvente para evitar que el soluto se quede adherido a las paredes de cualquier material que
componga la línea de transferencia hacia el espectrómetro de masas. La correcta optimización de las
condiciones del make-up, por tanto, se convierte en un factor importante para alcanzar la mayor
sensibilidad posible [40]. Bien optimizado, el efecto de dilución o degradación de las propiedades
cromatográficas apenas es perceptible. La composición del make-up es un parámetro muy importante:

42
 Introducción

generalmente se usa metanol puro porque el voltaje que se necesita en la fuente de electrospray (ESI
)para provocar la ionización en metanol es casi la mitad comparado con el necesario para producir este
mismo efecto en agua [41]. Sin embargo, un pequeño porcentaje de agua puede tener otros efectos. Por
ejemplo, el CO2 gaseoso se disuelve en agua produciendo numerosas especies entre las que se incluye
el ácido carbónico, el cual puede disociarse y convertirse en una fuente de protones. No es recomendable
que la composición del make-up contenga más del 10% de agua ya que se empezará a producir un
descenso en la eficiencia de la ionización debido al incremento de la tensión superficial.

Una ventaja adicional del make-up es que se aprovecha la incorporación de esta bomba para añadir al
disolvente aditivos que mejoren la ionización antes de la entrada a la fuente de ionización ESI. Existen
diversos factores que pueden afectar a la ionización de un analito en fuentes ESI: pH, flujo,
concentración de electrolitos, composición de la fase móvil, tensión superficial de la disolución,
viscosidad y aditivos. Sin duda alguna, estos últimos juegan un papel crucial para aumentar la
sensibilidad de un método analítico. A través de estos aditivos puede favorecerse la formación de ciertos
aductos [42]. La adecuada elección de un aditivo puede, por lo tanto, dar lugar a un incremente notorio
de la sensibilidad. Ya en la fase líquida se produce la carga del analito (protonación de la molécula),
posteriormente los aductos formados son eyectados a la fase gaseosa. No obstante, es necesario elegir
los aditivos adecuados, ya que la formación de múltiples aductos [M + H]+, [M + Na]+, [M + K]+ o
[M + NH4]+ puede dar lugar a una reducción en la sensibilidad e incluso problemas de reproducibilidad
[43]. En algunos casos muy específicos que requieren la supresión o reducción de la formación de cierto
aducto, hay aditivos que pueden provocar este fenómeno. Existen multitud de aditivos, pero sin duda el
ácido fórmico es uno de los más empleados para favorecer la protonación de los analitos. En menor
medida también se emplea formiato amónico, ya que algunas moléculas presentan una señal de mayor
intensidad cuando se forma el aducto de amonio. Sin embargo, existen otros aditivos menos comunes,
pero que pueden ser muy efectivos para el análisis de ciertos analitos. Uno de estos es el disolvente
aprótico dimetil sulfóxido (DMSO). Utilizando fuentes de ionización ESI, cuando se emplea DMSO
como aditivo en cantidades iguales o inferiores al 5% da lugar a un incremento de la señal en el análisis
de péptidos o compuestos de bajo peso molecular presentes en plasma y orina. En algunos casos, el
aducto formado [M+Na+DMSO]+ simplifica enormemente el espectro de masas sin reducir la señal del
analito. En definitiva, la incorporación de un módulo de bomba make-up aporta un incremento de
sensibilidad al sistema SFC sin afectar a las condiciones de la elución, ya que se introduce después de
la columna. Además, la mezcla producida en la fase post-columna no produce un cambio dramático en
la presión del sistema ya que esta se encuentra controlada en todo momento por el módulo de
contrapresión [44]. No obstante, es necesario optimizar el flujo de make-up del método ya que si este
flujo es demasiado elevado podemos experimentar una reducción en la sensibilidad al producirse
pérdida de eficiencia en la ionización debido a que el flujo que llega a la fuente ESI es mayor.

43
 Introducción

Figura 12. (A) Cromatograma utilizando fase móvil con 10mM de formiato amónico como aditivo (B)
cromatograma empleando la misma fase móvil sin aditivos. Compuestos 1: metoprolol 2: propranolol
3: pindolol 4: etrone 5: progesterone 6: testosterone 7: bosentan, 8: amprenavir, 9: atazanavir, 10:
darunavir, 11: lopinavir, 12: nelfinavir, 13: ritonavir,14: adenine, 15: guanosine, 16: nicotinic acid,
17: theobromine, ( [C] = 100 ng/mL)

Los efectos de aditivos en cantidad similares a las empleadas habitualmente en HPLC no proporcionan
cambios significativos en la polaridad [45]. Sin embargo, el pH de la fase móvil si se ve modificado y
es un factor para tener en cuenta, ya que la mezcla de CO2/MeOH se puede considerar ácida con un pH
próximo a 5. La acidez aumenta al incrementar el porcentaje de metanol en la fase móvil, debido a la
formación de derivados ácidos alquilcarbónicos [46]. Por lo tanto, la incorporación de aditivos básicos
como el formiato amónico a la fase móvil incrementan ligeramente el pH y ayudan a regularlo conforme
avanza el gradiente, haciendo que el impacto no sea tan drástico. Estos aditivos, aunque se encuentren
en concentraciones muy inferiores al 1% del total de la fase móvil, pueden adsorberse en la fase
estacionaria y formar mono capas que cambian las características e interacciones de la columna. West
et al. testearon acetato de amonio en 32 fases estacionarias diferentes y, aunque encontraron algunos
inconvenientes en el equilibro y reproducibilidad de las más polares, observaron una mejora

44
 Introducción

significativa de la resolución cromatográfica [47]. Como se puede observar en la Figura 8, la retención

de los analitos de naturaleza básica no se veía apenas afectada, sin embargo, la forma de pico de la
mayoría de los compuestos (especialmente de aquellos con características ácidas) mejoraba de forma
notable.

2.3 Determinación de la fase estacionaria

A partir de la década de los 90, en SFC empezaron a utilizarse columnas con dimensiones, longitudes
y empaquetamientos iguales o similares a las empleadas en LC. Las separaciones en SFC pueden
realizarse de forma más rápida debido a que el coeficiente de difusión es varias veces superior respecto
a LC debido a las propiedades del fluido explicadas con anterioridad. No obstante, la rapidez en las
separaciones se ve muy influenciada por la fase estacionaria empleada. La principal desventaja de SFC
residía en la expansión de la fase móvil a lo largo de la columna; este fenómeno generaba gradientes de
temperatura axiales y radiales [48]. Las consecuencias de estas modificaciones en la temperatura eran
cambios en las propiedades fisicoquímicas del fluido (densidad, viscosidad, coeficiente de
difusión...etc.). La carente homogeneidad en la velocidad de flujo provoca una pérdida en la eficiencia
cromatográfica y la reproducibilidad del análisis. En HPLC, sin embargo, las transferencias de calor
son desde el centro de la columna hasta la pared exterior de la misma, la dirección opuesta a SFC. Este
hecho es uno de los responsables del tremendo desequilibrio que supone trabajar en SFC con
temperaturas próximas al punto crítico del CO2 [49]. A la hora de realizar un análisis multiresiduo,
empleando las columnas y tamaños de columna convencionales, HPLC da lugar a un funcionamiento
algo mejor que SFC. Sin embargo, columnas de mayor longitud se pueden emplear en SFC sin perder
eficiencia de análisis debido a la reducida viscosidad de la fase móvil. De esta forma, el número de
platos se aumenta considerablemente, las separaciones son mejores y el tiempo de análisis no se ve
afectado de la misma forma que en HPLC. Grand-Guillaume Perrenoud et al. evaluaron los beneficios
y limitaciones de ambos tipos de cromatografía usando columnas con dos tamaños de partícula, uno de
ellos por debajo de 2µm [50]. En la Figura 9, que corresponde a dicho artículo, se pueden observar las
curvas de Van Deemter. Esta ecuación relaciona la longitud de la columna con la velocidad lineal de la
fase móvil a través de las propiedades físicas, cinéticas y termodinámicas de una separación. En HPLC
se observa un comportamiento muy dispar utilizando los diferentes tamaños de partícula. Usar columnas
con tamaño de partícula superior a 2µm en HPLC provoca que la velocidad lineal óptima sea muy baja
y limitada. Por otro lado, la baja viscosidad de la fase móvil en SFC hace que los coeficientes de difusión
sean mejores y por lo tanto la eficiencia óptima es mucho mayor. Usando columnas con tamaño de
partícula inferior a 2µm este efecto se diluye, ya que la velocidad lineal y la transferencia de masas
incrementan drásticamente. Sin embargo, otros inconvenientes pueden surgir como el calor friccional
consecuencia de las bruscas caídas de presión.

45
 Introducción

Figura 13. Curvas de Van Deemter para butylparaben en dos sistemas diferentes. H: Altura de platos.
u: velocidad lineal (Puntos azules: HPLC XTerra RP18 50mm×4.6mm,3.5µm. Picas naranjas: HPLC
Acquity Shield C18 50mm×2.1mm,1.7µm. Cuadrados púrpuras: SFC Acquity UPC2 BEH2-EP
100mm×3.0mm,3.5µm. Triángulos verdes: SFC Acquity UPC2 BEH2-EP 100mm×3.0mm, 1.7µm.

El hecho de que el comportamiento de SFC con las columnas sea diferente ha dado lugar a que en los
últimos años se realicen diferentes estudios testeando multitud de fases estacionarias con esta técnica.
C. West et al. analizaron 109 compuestos empleando 31 fases estacionarias con la intención de facilitar
la elección de aquellas más eficientes para análisis multiresiduo con SFC [51]. Para ello, se basaron en
la ecuación de relaciones lineales de energía de solvatación (modelo de Abraham) la cual a través de
ecuaciones multiparámetricas permite entender la fuerza relativa de las interacciones químicas
involucradas en la retención y selectividad de los diferentes tipos de cromatografía:

Las letras mayúsculas representan los descriptores del soluto o propiedades de interacción de los
solutos, por otro lado, las letras minúsculas están relacionadas con las constantes del sistema, es decir,
aquellos efectos complementarios sobre dichas interacciones. Definiendo más los términos de la
ecuación, c es el término de intersección del modelo, E es el exceso de refracción molar, S es la
polarizabilidad del soluto, A y B son la acidez y basicidad global del enlace de hidrógeno del soluto, y
V es el volumen característico de McGowan. Los parámetros que representan las constantes del sistema
(e,s,a,b y v) se obtienen mediante una regresión multilineal para un número definido de solutos con
unos descriptores conocidos; estos reflejan la magnitud de la diferencia de dicha propiedad particular

46
 Introducción

entre ambas fases (móvil y estacionaria). De esta forma, si un coeficiente en particular destaca
numéricamente, entonces el soluto que tenga la propiedad complementaria interactuará de manera muy
pronunciada con la fase móvil (si el coeficiente es negativo) o la fase estacionaria (si este es positivo).
Por lo tanto, esta ecuación proporciona un sistema de comparación entre las diferentes fases
estacionarias y permite realizar agrupaciones en cuanto selectividad [52]. El estudio concluye con un
diagrama radar (Fig.14) que facilita la elección de una columna y por lo tanto acelera el desarrollo de
métodos que utilizan SFC.

Determinar un modelo predictivo para el tiempo de retención de los analitos en SFC no es algo sencillo
comparando con RP-HPLC, donde la polaridad del analito es el factor determinante en la elución.
Bamba et al. proponen un modelo predictivo generado usando los resultados de selectividad de los
analitos en diferentes fases estacionarias [53]. Para el experimento usaron hexano y etanol como fase
móvil en RP-HPLC, buscando asemejarse lo máximo posible a la fase móvil usada en SFC. Analizaron
solutos con diversas propiedades físico-químicas (polares, apolares, ácidos y básicos). Comparando los
factores de retención se pueden obtener predicciones sobre el comportamiento de cada tipo de
compuesto en una técnica y en otra. La evaluación de diferentes fases estacionarias denota que en SFC,
al utilizar una fase móvil con una menor densidad, el coeficiente de distribución se reduce y las
interacciones con la fase estacionaria incrementan. En el caso de una fase móvil compuesta por dióxido
de carbono cuyo momento dipolar es 0, pueden cobrar relevancia fuerzas de dispersión de London e
interacciones entre orbitales π-π, especialmente cuando se utilizan fases estacionarias apolares. Bamba
et al. llegan a la conclusión que, a la hora de separar anillos aromáticos, compuestos con enlaces
insaturados o de polaridad similar, las fases estacionarias que funcionan a través de las interacciones de
dispersión son las más recomendables, entre ellas las columnas C18.

47
 Introducción

Figura 14. Diagrama radar basado en el modelo LSER teniendo en cuenta cinco descriptores.

2.4 Cromatografía preparativa

Este tipo de cromatografía se considera una purificación desde el punto de vista químico, ya que
procedemos a la separación de nuestro analito objetivo de todas las impurezas y contaminantes del
medio en el que se encuentra. Mediante una correcta separación cromatográfica los analitos pueden ser
recogidos en fracciones utilizando un sistema recolector. En cromatografía preparativa se emplean
flujos mucho más elevados en comparación con la versión analítica, empleándose flujos de cientos de
mililitros por minuto. Otra de las principales diferencias entre la separación analítica y la preparativa
reside en que esta última está muy limitada por la fase estacionaria. En las separaciones de

48
 Introducción

cromatografía preparativa la columna empleada es el principal factor a tener en cuenta. Una correcta
selección de la fase estacionaria y una apropiada optimización de la elución de los compuestos permitirá
la separación de los picos cromatográficos y una correcta recolección de los analitos objetivo. Los tres
principales factores que afectan de manera directa al rendimiento de la cromatografía preparativa SFC
son: el sistema de introducción de disolvente, el mecanismo de inyección y las condiciones de
separación [54]. Además, la inyección de grandes volúmenes de muestra (a grandes concentraciones)
también juega un papel fundamental ya que limita el acceso de los analitos a las moléculas de la fase
estacionaria ya que estos se ven influenciados por otras moléculas de la muestra. En la Figura 15 se
puede observar una imagen esquemática de todos estos factores que influyen de manera notoria en la
cromatografía preparativa SFC.

Figura 15. Principales factores que controlan el rendimiento de la cromatografía preparativa SFC.

En el campo de la cromatografía preparativa, la compresibilidad del CO2 y su capacidad para producir

separaciones eficientes con elevados volúmenes de fase móvil, hacen que SFC sea una excelente opción.
Sin embargo, el dióxido de carbono en estado supercrítico presenta una solubilidad limitada. Como se
ha explicado anteriormente, este problema fue solventado con la introducción de disolventes

49
 Introducción

modificadores (principalmente alcoholes). Sin embargo, en cromatografía preparativa la

despresurización del fluido puede dar lugar a inconvenientes. El modificador puede no abandonar
completamente el ciclo (cuando se produce la recogida de la fracción) e introducirse de nuevo, lo cual
provocaría una fluctuación en la cantidad de total de modificador, pudiendo incluso llegar a alterar la
eficiencia de la separación [55]. Además, el CO2 puede llegar a ser un inconveniente en la recogida de
ciertos compuestos que presentan sensibilidad al pH ácido. Durante el proceso de recogida, grandes
cantidades de CO2 pueden provocar la formación de ácidos alquilcarbónicos (metilcarbónicos en el caso
de metanol) y provocar la degradación de ciertos analitos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que
este hecho depende en gran medida del sistema utilizado y su proceso de presurización en la separación.
No obstante, existen soluciones para evitar esta degradación, como la sustitución de metanol por
acetonitrilo en el modificador, bombeo de nitrógeno en el colector de fracciones para retirar el CO2 del
metanol o la adición de aminas para neutralizar el carácter ácido [56]. Sin embargo, en comparación
con la cromatografía preparativa HPLC, el CO2 supercrítico presenta múltiples beneficios debido a las
propiedades de su fase móvil [57]. Como se ha mencionado con anterioridad, la baja viscosidad del
fluido permite emplear flujos de fase móvil elevados que dan lugar a tiempos de análisis mucho más
cortos, pero sin pérdida de resolución durante el proceso. Además, las fracciones se recogen en metanol
(disolvente modificador) el cual se puede evaporar de manera mucho más rápida que las fracciones
acuosas recogidas mediante cromatografía preparativa HPLC. Speybrouck et al. exponen un resumen
de las aplicaciones de la cromatografía preparativa de SFC desde 2016 hasta 2020 [58]. En numerosos
estudios queda descrito el incremento de la productividad usando SFC, así como las reducciones en el
coste de la separación y en el impacto ambiental. La aplicación de este tipo de cromatografía preparativa
se extiende principalmente a productos naturales, pequeñas moléculas como productos intermedios de
medicamentos y pesticidas. Un resumen de las condiciones experimentales para la separación de
algunos de estos productos se puede encontrar en la Tabla 2.

50
 Introducción

Tabla 2. Condiciones cromatográficas para diferentes aplicaciones de cromatografía preparativa de fluidos supercríticos.

Concentración
Familia de Fase Volumen
Analito Sistema Fase móvil Psalida Flujo de la disolución Referencia
compuestos estacionaria inyectado
feed
CSP-1
(250x20mm,
CO2:MeOH/DCM (1/1) 50 mg/mL 1/1
5µm) 1.8 mL
Galbelgin, (-)- 85:15 MeOH/DCM
SFC prep 80 CSP-2
Ganschisandrin, CO2:MeOH/DCM (1/1) 150 15 mg/mL 1/1
system and (250x20mm, 60 g/min 0.8 mL [59]
Galgravin y (-)- 80:20 bar MeOH/DCM
Productos six (Waters) 5µm)
Veraguensin CO2:MeOH/DCM (1/1) 30 mg/mL 1/1
Naturales CSP-2 1.5 mL
80:20 MeOH/DCM
(250x20mm,
5µm)
SFC prep 80 EnantioPak AD
100 40 mg/mL 1/1
Dihydromyricetin system and (250x20mm, CO2:MeOH 60:40 40 g/min - [60]
bar MeOH/DCM
six (Waters) 10µm)
1-benzyl-3- Chiralpak AD-H
methyl-2- (250 x 30 mm,
CO2:EtOH 95:5
piperidone 5µm) 120
- CO2:iPrOH/DEA - - - [61]
Regioisómeros del Chiralpak IC ml/min
75:25/0.25%
iodoaryl (250 x 30 mm,
5µm)
Lux Cellulose-4
(250 x 30 mm,
Synthetic CO2:n- 29.2 mg/mL 8/2
Berger 5µm)
intermediate A Hept/iPrOH/DEA 88:12 n-Hept/iPrOH
Moléculas MGII and Chiralpak IC
Synthetic (80/20)/0.15% 100 220 mg/mL 1/1
farmacéuticas Thar SFC (250 x 30 mm, - - [62]
intermediate B CO2:MeOH 90:10 bar ACN/DCM
Prep 350 5µm)
Synthetic CO2:MeOH/ACN/DCM 50 mg/Ml 1/2
(Waters) Lux Amylose-2
intermediate C 50:50 (20/20/10) MeOH/DCM
(250 x 30 mm,
5µm)
Berger
120 100 mg/mL
MGII and Chiracel OJ-H
Ácido propanoico CO2:MeOH 80:20 100 mL/min MeOH
Thar SFC (250 x 30 mm, - [63]
AyB CO2:MeOH 70:30 Bar 100 75 mg/mL
Prep 350 5µm)
mL/min MeOH
(Waters)

51
 Introducción

Concentración
Familia de Fase Volumen
Analito Sistema Fase móvil Psalida Flujo de la disolución Referencia
compuestos estacionaria inyectado
feed
Waters
Chiralpak AD-H
Compuestos MGII 100 85
(250 x 30 mm, CO2:MeOH 70:30 - - [64]
atropisoméricos preparative Bar mL/min
5µm)
device
18 mg/mL EtOH
SFC-
15.8 mg/mL
PICLAB CO2:EtOH 85:15 250 µL
Chiralpak AD-H EtOH
4 derivados de Hybrid 10- CO2:EtOH 90:10 150 250 µL
(250 x 4.6 mm, 4 mL/min 13.2 mg/mL [65]
isoxazole 20 device CO2:EtOH 93:7 Bar 485 µL
5µm) EtOH
(PIC CO2:EtOH 90:10 485 µL
13.5 mg/mL
solution)
EtOH
Chiralpak IC
145 mg/mL 1/1
(250 x 30 mm, 180
Thar SFC MeOH/DCM -
5µm) 100 mL/min
Receptor S1P1 Prep 350 CO2:MeOH 50:50 80 mg/mL 1 mL [66]
Chiralpak AD-H bar 130
device MeOH
(250 x 4.6 mm, mL/min
5µm)
EnantioPak OD
(250 x 30 mm,
5µm)
CO2:iPrOH 95:5
SFC prep 80 EnantioPak AD
4 isómeros de β - CO2:EtOH 80:20 100 18 mg/mL iPrOH
Pesticides system (250 x 30 mm, 40 g/min 2 mL [67]
Cypermethrin CO2:EtOH 85:15 bar
(Waters) 5µm)
EnantioPak AD
(250 x 30 mm,
5µm)

52
 Introducción

2.5 Cromatografía quiral

Se denomina estereoisómeros a aquellos compuestos que poseen idéntica formula molecular y la misma
secuencia de conexiones atómicas, pero difieren la disposición espacial de las mismas. Al tener tantas
similitudes estructurales, sus propiedades físicas y químicas son muy similares, siendo extremadamente
difícil separar estereoisómeros usando las fases estacionarias convencionales. En cromatografía quiral,
grupos funcionales quirales se enlazan con la superficie de un material inerte como pueden ser las
partículas de gel de sílice. Mediante la formación de diversos enlaces como dipolo-dipolo, enlaces de
hidrógeno, enlaces π–π e interacciones espaciales se produce la separación de los estereoisómeros.

Las fases estacionarias empleadas en SFC provienen directamente de las que fueron diseñadas para
HPLC. Existe una gran diversidad de fases estacionarias que se usan en SFC para la separación de
compuestos quirales: polisacáridos inmovilizados, “tipo de cepillo”, proteínas unidas, ciclodextrina,
éter de corona, intercambio de ligandos… etc. Pero sin duda alguna, las fases estacionarias mayormente
utilizadas están basadas en polímeros de polisacáridos, ya que combinadas con SFC proporcionan una
excelente resolución de los picos cromatográficos. Uno de los principales problemas de este tipo de
columnas reside en que la tecnología que utilizan no es muy robusta en términos mecánicos. Los
polisacáridos se encuentran recubriendo las partículas de sílica, lo cual limita los tipos de disolventes
que pueden ser empleados sin que la fase estacionaria corra el peligro de ser disuelta. Esta desventaja
ha provocado durante años que la vida útil de las columnas fuera bastante corta. Sin embargo, en los
últimos años se han desarrollado modelados con fases estacionarias inmovilizadas, que cumplen la
misma función y amplían el rango de disolventes que se pueden emplear en la separación quiral. La
principal ventaja de fases estacionarias como las de “tipo de cepillo” o “Brush-type”, es que son capaces
de proporcionar una excelente estabilidad ya que sus grupos funcionales se encuentran inmovilizados
directamente en la superficie del gel de sílice. Estas columnas pueden emplearse incluso en condiciones
“extremas”, como pueden ser el uso de ácidos, bases o disolventes poco comunes. Sin embargo, como
la fase móvil en SFC es ligeramente ácida, existe la posibilidad de que surjan grupos silanol que
modifiquen las interacciones quirales (se trata de un hecho poco probable). Otro tipo de columnas
bastante estudiadas son las basadas en antibióticos macrocíclicos. Son columnas muy versátiles al
poseer un elevado número de sitios quirales activos debido a sus estructuras macromoleculares. Harps
et al. exponen un excelente resumen de esta aplicación en el campo del bioanálisis [68]. Quedan
reflejados numerosos métodos que corresponden con los artículos científicos más relevantes sobre
separaciones enantioméricas usando SFC desde el año 2014 hasta el año 2018. En dicha revisión
podemos observar que la mayoría de los métodos emplean columnas con fase estacionaria basada en
polisacáridos, además, podemos encontrar todos los diferentes parámetros evaluados para este
propósito: BPR, modificadores, condiciones del make-up… etc. Las separaciones quirales están a la

53
 Introducción

orden del día en la industria farmacéutica. La Food and Drug Administration (FDA), agencia del
gobierno de Estados Unidos, fue de las pioneras en establecer la norma de asegurar que los
medicamentos se desarrollaban a través de metodologías que proporcionaban compuestos
enantiomericamente selectivos. Bernal et al. [69], en uno de sus trabajos proceden a la separación de
fármacos utilizando dos fases estacionarias basadas en derivados de polisacáridos. Sus resultados
demostraron que en HPLC no se podían separar compuestos que en SFC no daban lugar a ningún
problema de separación. Además, las separaciones enantioméricas en SFC se alcanzaban a tiempos de
retención mucho menores, con consumos de disolventes más reducidos y con mejores resoluciones
cromatográficas. La cromatografía quiral no está muy extendida en el análisis de plaguicidas,
principalmente porque no existe una normativa tan restrictiva como la mencionada anteriormente de la
FDA. Existen muchos plaguicidas quirales, pero no existe la obligación de separar y cuantificar por
separado sus enantiómeros. Sin embargo, algunos estudios recientes han demostrado que plaguicidas
como lambda-cyhalothrin poseen enantiómeros que difieren en sus propiedades [70]. Gamma-
cyhalothrin presenta una mayor actividad insecticida y su dosis de referencia aguda (DRfA) es la mitad
que la de su enantiómero, lo cual quiere decir que presenta mayor toxicidad. La mayoría de los artículos
se centran en el análisis de plaguicidas en concreto como: napropamid [71], pyrisozazole [72] o
triticonazole [73]. En estas separaciones estereoselectivas se testearon diferentes modificadores, flujos
y presiones en el BPR; sin embargo, todas coinciden en el uso de derivados de polisacáridos como fases
estacionarias quirales. La Tabla 3 es una simplificación de la expuesta en el artículo de Fanali et al.
[74], dónde se recogen las condiciones cromatográficas para el análisis enantiomérico de algunos
plaguicidas.

Un factor a tener en cuenta es el valor utilizado en el BPR. Está demostrado que la contrapresión afecta
a las separaciones cuando se utiliza CO2 como fluido supercrítico. Por lo tanto, es necesario optimizar
este valor para asegurar la mejor resolución cromatográfica en un análisis de compuestos quirales. Wang
et al. describen todos los valores que se ven afectados por la contrapresión y a su vez exponen cómo
estos se modifican cuando la presión va ascendiendo [75]. Se testearon 10 columnas quirales usando 11
pares de enantiómeros (fármacos) con tiempos de retención que cubrían un amplio rango. Los resultados
obtenidos demostraron que se observan notorias modificaciones en las retenciones en columna de los
analitos conforme la contrapresión se aumentaba de 100 a 200 bares. Al incrementar este valor, la
densidad de la fase móvil aumenta y, en consecuencia, también lo hace su poder de solvatación. Sin
embargo, la resolución de los pares enantioméricos no se veía visiblemente afectada.

54
 Introducción

Tabla 3. Condiciones cromatográficas para la separación quiral de plaguicidas en alimentos utilizando SFC.

Tratamiento
Plaguicida(s) Matriz Fase estacionaria quiral Fase móvil Detector Referencia
de muestra
CO2/2-propanol
(R) y (S)- Cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate), UV (254
Tomates QuEChERS (80:20, v/v); Flujo: [76]
Prothioconazole EnantioPak (150x4.6 mm, 5 µm) nm)
2.5 mL/min
Tomates, pepinos,
Fenbuconazole y manzanas, CO2/ethanol; Flujo:
QuEChERS Amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) MS/MS [77]
sus metamolitos melocotones, arroz y 1.8 mL/min
trigo.
Tris(3,5-dimethylphenylcarbamoyl) cellulose, CO2/ethanol (80:20,
Triticonazole Pepinos y tomates QuEChERS - [73]
EnantioPak OD (150x4.6 mm, 5 µm) v/v)
Amylose tris (3,5-dimethylphenylcarbamate, Chiralpak
AD-3 (150x4.6 mm, 3 µm) y Amylose tris(3,5- CO2/2-ethanol
Propiconazole Trigo Fase sólida MS/MS [78]
dimethylphenylcarbamate), Chiralpak IA3 (150x4.6 (93:7, v/v)
mm, 5 µm)

55
 Introducción

2.6 Efecto matriz en SFC

Conforme más se extendía el uso en los laboratorios de la espectrometría de masas, más se estudiaba el
fenómeno de la supresión iónica que tiene lugar en la fuente de ionización [79]. La espectrometría de
masas, pese a ser una excelente herramienta para el análisis cuantitativo, puede ver reducida su eficacia
debido a la supresión iónica. Esta puede producirse por diversos motivos, pero en su mayoría se debe a
una coelución de compuestos provenientes de la matriz analizada. Entre las especies que pueden afectar
a la intensidad de la señal del analito, se encuentran las especies iónicas (sales), compuestos de elevada
polaridad (pigmentos, fenoles) y moléculas orgánicas (carbohidratos, lípidos, aminas, ureas, péptidos,
etc.). En general todas las fuentes de ionización acopladas a HPLC se ven afectadas por este fenómeno,
pero hay evidencias que demuestran que las fuentes ionización de electrospray (ESI) se ven más
afectadas que, por ejemplo, las de ionización química a presión atmosférica (APCI) [80]. La supresión
iónica puede tener lugar tanto en fase líquida como en fase gaseosa. De hecho, hay evidencias de que
coeluyentes poco volátiles presentes en la matriz dan lugar a una mayor supresión ya que dificultan la
eficiencia en la evaporación. Como norma general, compuestos de mayor tamaño suelen disminuir la
ionización de los compuestos más pequeños, esto también es aplicable entre analitos. Además, las
moléculas que se encuentren presentes en elevadas concentraciones incrementarán la viscosidad y la
tensión superficial de las gotas producidas en la fuente de ionización, dificultando aún más la capacidad
de los analitos para alcanzar la fase gaseosa [81]. El uso de aditivos que formen pares iónicos con los
analitos también puede influir en la sensibilidad del análisis. Por ejemplo, el ácido trifluoro acético
(TFA) se emplea con regularidad en análisis con detector UV por sus beneficios cromatográficos. Sin
embargo, este ácido provoca una notoria supresión de la señal cuando se utiliza espectrometría de
masas. Este tipo de supresión es de las más perjudiciales para el análisis, ya que el aditivo se encuentra
en la fase móvil y, por lo tanto, la supresión se produce a lo largo de todo el cromatograma. Hoy en día
se usan otros aditivos en la fase móvil; ácidos más débiles como el ácido fórmico. Por último, cabe
destacar que los compuestos polares son más susceptibles a la supresión iónica [82].

Como consecuencia de la supresión iónica, se puede ver mermada la señal del analito y, por lo tanto,
reducirse su capacidad de detección. En este caso, puede dar que la concentración sea reportada por
debajo de la real e incluso puede dar lugar a un falso negativo debido a que se considere como no
detectado porque no cumpla los criterios de identificación. También puede suceder la situación
contraria, el incremento de la señal (es un fenómeno más común en cromatografía de gases). Si se
produce este efecto, la señal puede aumentar de tal forma que supere el límite máximo de residuo (LMR)
o de lugar a un falso positivo. Por otro lado, la repetitividad y reproducibilidad también son factores
que pueden verse alterados, ya que esta supresión o incremento de la señal no se produce de manera
constante.

56
 Introducción

Existen diferentes metodologías para evitar o reducir los efectos matriz [81]. Una de las más comunes
es proceder a la cuantificación de los analitos a través de la utilización de patrones internos. La
cuantificación no solo tiene en cuenta la respuesta del analito en el detector, sino que se trata de una
respuesta relativa teniendo en cuenta la adición de patrón interno tanto a la recta de calibrado como a
las muestras. De esta forma, la señal del patrón se verá modificada dependiendo la matriz y se tendrá
en cuenta a la hora de cuantificar. Sin embargo, la supresión iónica puede variar entre unos compuestos
y otros, pudiendo ser el patrón interno una referencia inexacta a la hora de cuantificar. Si el analito se
ve más afectado que el patrón, puede dar lugar a una infraestimación de la concentración, en el caso
contrario, puede producirse una sobreestimación. La solución consta de utilizar un patrón interno que
se asemeje lo máximo posible al analito objetivo, de forma que su respuesta ante las diferentes matrices
sea lo más parecida posible. Para conseguir este propósito, la mejor opción es emplear patrones
marcados isotópicamente, de tal forma que la variabilidad en la medida será mínima. Sin embargo, para
el análisis de algunos analitos esta solución no es viable. Por ejemplo, el análisis de residuos de
plaguicidas comúnmente implica métodos con cientos de plaguicidas en su alcance. Conseguir patrones
marcados isotópicamente para cada uno de los plaguicidas de un método multiresiduo no es solo un
proceso económicamente difícil de llevar a cabo, sino que desde el punto analítico también conlleva
dificultades ya que la velocidad de análisis de los espectrómetros de masas se vería comprometida al
tener que realizar una medición del doble de plaguicidas en el mismo rango cromatográfico.

Modificando los parámetros que influyen en la elución, podemos conseguir una mejor separación de
los compuestos y a su vez reducir el número de coeluciones con componentes de la matriz. Por lo tanto,
la elección de la fase estacionaria y la composición de la fase móvil juegan un papel crucial en los
efectos matriz, ya que pueden dar lugar a un aumento de la eficiencia en la separación cromatográfica.
No obstante, es necesario entender que un método capaz de evitar todas las interferencias de la matriz
es altamente improbable. Silvestro et al. describen algunas pautas para reducir estos efectos matriz
utilizando la cromatografía [83]. La pauta principal consiste en buscar un compromiso entre velocidad
y resolución. Los métodos hoy en día se buscan lo más rápidos posibles, pero es necesario mantener los
picos de la matriz lo más separados posibles de los picos de interés. Por otro lado, el volumen de
inyección también representa un papel importante. Compensar la falta de sensibilidad con la inyección
de volúmenes más elevados de muestra no siempre es una estrategia adecuada. Si sobrecargamos la
columna de muestra, provocará un deterioro de los picos cromatográficos. Este hecho también afectará
a los picos de la matriz produciendo un ensanchamiento que puede llegar a interferir con el analito
debido a la pérdida de separación cromatográfica. También influye, como se ha mencionado
anteriormente, la composición de la fase móvil, los aditivos que contenga y el flujo que llegue a la
fuente. La fase estacionaria también influye; un estudio previo de los componentes más comunes en las
matrices a analizar nos puede ayudar a elegir una fase estacionaria que mejore de manera notable la
separación de nuestros analitos con respecto a las interferencias isobáricas. Por último, hay diversos

57
 Introducción

factores no tan comunes pero que pueden ser efectivas en casos concretos como la composición de los
reactivos o algunas pautas para resolver el efecto matriz que también son efectivas pero muy específicas,
como la derivatización, el uso de cromatografía bidimensional o la programación de la válvula de
inyección para desechar interferentes de la matriz y que estos no atraviesen la columna y puedan
contaminar la fuente de ionización.

Las diferentes respuestas de SFC y LC con respecto a los efectos matriz han sido estudiadas
previamente. En el artículo de Desfontaine et al. analizan compuestos de naturaleza básica en matrices
biológicas (orina y plasma) utilizando LC y SFC [84]. El experimento se llevó a cabo utilizando tres
columnas diferentes en SFC. Aunque los efectos matriz variaban según la fase estacionaria empleada,
en todos los casos fueron inferiores usando SFC. Svan et al. también compararon los efectos matriz de
muestras biológicas en ambos tipos de cromatografía acopladas a ESI-MS [85]. Además, completaron
el estudio realizando perfiles de matriz gracias al modo de adquisición en full-scan de un detector
Tiempo-de-vuelo (ToF-MS). Determinaron que la elución de especies con similar polaridad puede dar
lugar a una respuesta diferente según el tipo de cromatografía. Por ejemplo, muestras de plasma
contaminadas con polietilenglicoles (PEG) pudieron separarse de forma más eficiente en LC dando
lugar a una supresión de la señal que afectó a los compuestos en un rango de tiempo más amplio; sin
embargo, en SFC los PEGs eluyeron como un único pico causando menores interferencias. Este hecho,
como ya se ha mencionado previamente [84], está influenciado por la columna empleada para la
separación cromatográfica. Asimismo, sus resultados destacan que, dentro de los compuestos afectados
por los efectos matriz, hay más casos de aumento de la señal en LC en comparación con SFC. En lo
referente a plaguicidas, Wang et al. utilizaron un método con 112 plaguicidas y evaluaron el efecto
matriz en muestras de crisantemos utilizando ambas técnicas cromatográficas [86]. De nuevo, SFC-
MS/MS demostró ser la técnica que proporcionaba mejores resultados de efectos matriz.

2.7 Aplicaciones

La cromatografía de fluidos supercríticos acoplada a espectrometría de masas ha sido utilizada en

numerosos métodos de análisis en laboratorios de rutina. Existen amplios campos de aplicación en los
que esta técnica ha sido muy útil, la mayoría de ellos concuerdan con aquellos compatibles con las otras
dos técnicas predominantes de cromatografía (LC y GC). En un inicio, SFC era una técnica muy
centrada en la separación quiral de compuestos caracterizados por su baja polaridad. Sin embargo, esta
perspectiva de análisis se ha ido ampliando y actualmente el análisis multiresiduo está muy extendido
en el ámbito farmacéutico, alimentario y medioambiental.

Múltiples estudios demuestran que SFC, por ejemplo, es una gran herramienta para el análisis de
compuestos en metabolómica [87]. Se ha comprobado que es una técnica perfectamente válida para el
análisis de aminoácidos. Worab et al. incluso prueban los dos tipos de fuentes de ionización más
comunes ESI y APCI, determinando que la primera es más efectiva par aminoácidos que presentan

58
 Introducción

residuos hidrofóbicos y APCI da mejores resultados con aminoácidos con cadenas polares [88]. Sin
embargo, es importante tener en cuenta que SFC presenta ciertas limitaciones para el análisis de
compuestos muy polares, ya que en términos generales es más complicado emplear una fase móvil polar
en SFC. También es una técnica muy utilizada para el análisis de muestras biológicas, especialmente
en la búsqueda de sustancias dopantes. El efecto matriz suele ser muy pronunciado en muestras
biológicas y a bajas concentraciones se puede poner en riesgo la precisión de la cuantificación. Como
ya se ha descrito anteriormente, en este tipo de muestras, SFC da lugar a un menor efecto matriz
comparado con LC [89]. También es muy común el uso de SFC para el análisis de productos naturales.
Por ejemplo, Huang et al. desarrollaron y validaron un método para el análisis de 12 flavonoides en
extractos de plantas [90]. Este tipo de metabolitos son muy comunes en las plantas utilizadas para la
medicina tradicional china. Duval et al. desarrollaron un método para el análisis de aceites vegetales
que empleaba SFC acoplado a alta resolución [91]. En este caso, establecieron que el uso de make-up
y las condiciones empleadas en el mismo influían de manera notoria en el análisis, especialmente en la
robustez de este. Continuando con la dinámica del análisis de compuestos naturales, Jiang et al.
desarrollaron un método para el análisis de alquilfenol etoxilatos en vegetales mediante SFC-MS/MS
[92]. En este caso, aprovecharon las propiedades del supercrítico para emplear flujos elevados de fase
móvil que les permitieran analizar todos los compuestos en 5 minutos, cumpliendo con todos los
parámetros de validación. En cuanto al ámbito de los análisis farmacológicos, SFC está ampliamente
implementada en los laboratorios para realizar separaciones con fases estacionarias quirales. Płotka et
al. detallan en su revisión múltiples ejemplos sobre las metodologías y fases estacionarias empleadas
para realizar separaciones enantioméricas de fármacos [93]. Este tipo de separaciones, aunque menos
comunes, también se realizan en el ámbito del análisis de plaguicidas. Algunos ejemplos se pueden
encontrar en la subsección de cromatografía quiral dentro de esta tesis doctoral. Por último, en lo que
se refiere al análisis multiresiduo de plaguicidas, no ha sido una técnica muy predominante y no hay
muchos artículos en literatura, especialmente cuando se busca acoplada a espectrometría de masas. Sin
embargo, debido a las mejoras de hardware en el sistema, ha habido un interés creciente en los últimos
años y algunos grupos como el de Takeshi Bamba, han sabido destacar el potencial de esta técnica
acoplada a espectrometría de masas para el análisis multiresiduo de plaguicidas [94,95]

59
 Introducción

3. Espectrometría de masas

3.1 Fuentes de ionización.

La espectrometría de masas (MS) se puede definir como una técnica analítica que permite, a través de
una ionización previa de las moléculas de la muestra, detectar los analitos en función de su ratio masa-
carga (m/z). Este tipo de instrumentación es muy común en los análisis de alimentos ya que crea una
eficiente sinergia con casi cualquier cromatógrafo. Además, la cada vez mayor aceptación de la
espectrometría de masas de alta resolución, proporciona una adicional serie de ventajas como los
espectros de masa en full-scan y la posibilidad de analizar datos con retrospectiva [96]. Los
espectrómetros de masas están compuestos principalmente por la fuente de ionización, el analizador de
masas y el detector [97,98]. Posteriormente, las señales recogidas por el detector se transforman en
datos procesables. La muestra entra en el espectrómetro a través de la fuente de ionización; sin embargo,
existen muchos tipos de fuentes dependiendo de cómo se proceda a la ionización de los analitos:

• Ionización por impacto electrónico (EI): la principal característica de esta fuente de ionización
reside en el bombardeo de electrones que se produce tras la vaporización de la muestra. Las
moléculas en fase gaseosa se ven impactadas por un flujo acelerado de electrones a 70 eV.
Como consecuencia, la molécula liberará un electrón y quedará en forma de catión. Esta forma
de ionización es bastante agresiva por lo que generalmente da lugar a la fragmentación de las
moléculas ionizadas. Estos fragmentos pueden ser usados posteriormente para ayudar a la
elucidación estructural de desconocidos [99]. Este tipo de fuente de ionización se utiliza de
forma habitual cuando el espectrómetro está acoplado a cromatografía gaseosa y permite
separar y detectar de manera efectiva la mayoría de los compuestos organometálicos,
hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc. [100]. Por otro lado, cuando se trata de compuestos
como plaguicidas, el ión precursor utilizado para la detección suele ser un fragmento y este
hecho puede ser problemático. Si se analizan a la vez familias de compuestos con estructura
parecida (como pueden ser los piretroides), van a dar lugar a fragmentos similares y las
transiciones empleadas para la detección y cuantificación de los compuestos pueden llegar a
ser las mismas, siendo necesario conseguir la selectividad a través de la cromatografía [101].
Esta precaución no suele necesitarse con otras fuentes de ionización menos agresivas.
• Ionización química (CI): Cuando se emplea ionización química, se utiliza un gas reactivo
(bombardeado previamente con electrones) como puede ser el metano. Este gas reactivo se
encuentra en un pronunciado exceso con respecto a los analitos de la molécula,
aproximadamente 104:1. La ionización se produce mediante protonación, el gas reactivo
transfiere un protón al analito dando lugar a un ión con carga positiva. También se pueden
formar iones negativos mediante la extracción de protones. Este tipo de fuentes también suelen
combinarse con cromatografía de gases. Sin embargo, al contrario de lo que sucedía con EI,

60
 Introducción

este tipo de ionización se considera suave por lo que no es común la elevada fragmentación de
las moléculas en la fuente. Este hecho junto con la posibilidad de aplicar modificadores dan
lugar a nuevos rangos de detección de plaguicidas cuando se usa cromatografía de gases [102–
104].
• Ionización por electrospray (ESI): Esta fuente de ionización es una de las más empleadas en la
actualidad debido el gran número de aplicaciones para las cuales este tipo de fuente de
ionización es útil, entre otras cosas, por el amplio rango de polaridades y pesos moleculares
que abarca de manera eficiente. ESI es considerada como una ionización suave, difícilmente se
produce fragmentación durante el proceso de ionización. Esta técnica es muy empleada en el
análisis de macromoléculas ya que se generan de forma habitual iones múltiplemente cargados
(z>1). El proceso de ionización transcurre de la siguiente manera: la muestra alcanza la fuente
de ionización en una fase líquida, seguidamente atraviesa un capilar cargado con un voltaje
específico y a la salida de este se emite un aerosol con gotas de diámetros inferiores a 10µm.
Este fenómeno tiene lugar gracias a la forma del cono de Taylor [105], cuando se alcanza un
voltaje específico, el equilibro de las fuerzas electroestáticas y la tensión superficial se vuelven
independientes del radio de curvatura, el radio por lo tanto se convierte teóricamente en 0 y se
inicia el electrospray [106]. El disolvente que se encuentra en las gotas generadas en el proceso
de electrospray comienza a evaporarse. Las moléculas de disolvente empiezan a abandonar la
gota, incrementando la densidad en la superficie de las gotas, y las moléculas de analito se
aproximan hasta tal punto que se repelen. Esta repulsión vence la tensión superficial, lo cual da
lugar a que las gotas “estallen” gracias al fenómeno conocido como explosiones de coulomb.
Este proceso se da de forma reiterada y tras un periodo de tiempo de apenas unos
microsegundos, se habrán generado gotas con diámetros muy inferiores a aquellos de las gotas
eyectadas en primer lugar [107]. La dispersión del disolvente tiene lugar de forma gradual, sin
una evaporación brusca, generalmente favorecida por el empleo de gases como nitrógeno que
ayudan a la nebulización. Las gotas generadas de esta forma contienen los iones que serán
recogidos por el espectrómetro de masas. Esta fuente de ionización acoplada a cromatografía
líquida o SFC proporciona un gran alcance permitiendo la detección de un amplio rango de
compuestos en una sola inyección, por ello, es sin duda alguna la fuente de ionización más
utilizada actualmente con estos tipos de cromatografía [108].
• Ionización química a presión atmosférica (APCI): Este tipo de ionización es también muy
habitual. Presenta muchas similitudes con ESI, ya que se dan procesos de nebulización,
desolvatación e incluso la interfaz suele ser muy parecida (se suele emplear el mismo cono que
en ESI). También se considera una técnica que produce una ionización suave, pero a diferencia
de ESI, aquí se emplean temperaturas más elevadas (alrededor de 400 ºC) y pueden llegar a
causar reacciones de pirolisis con los analitos, por ello se recomienda analizar moléculas
termoestables. Sin embargo, la principal diferencia reside en que en APCI los iones se forman

61
 Introducción

en estado gaseoso y no en disolución. El voltaje no se aplica en un capilar; en su lugar, la fase

móvil se evapora por completo y entra en contacto con una aguja cargada a un determinado
voltaje [109]. En este momento se produce la ionización a través de un proceso denominado
corona de descarga, en el cual se ioniza previamente el disolvente que se encuentra en exceso
con respecto a los analitos y, a continuación, tienen lugar una serie de reacciones en cascada
que terminan ionizando las moléculas de analito. En términos generales de sensibilidad y efecto
matriz, las fuentes ESI presentan mejores resultados para el análisis de plaguicidas [110]. La
principal utilidad de APCI reside en un alcance de compuestos diferente y una ionización más
suave.
• Fotoionización a presión atmosférica (APPI): Este método de ionización surge como una
respuesta intermedia a los dos tipos de fuentes de ionización explicados anteriormente, ESI y
APCI. También se trata de un tipo de ionización suave, que no da lugar a la fragmentación y
que se puede acoplar a cromatografía de gases para el análisis de alcanos, alcoholes, ésteres y
aminas como demuestra uno de los primeros estudios realizados en GC-MS con APPI [111].
El mecanismo de ionización implica diferentes etapas con la principal diferencia de que se
emplean flujos de ultravioleta [112]. En primer lugar, se da un proceso similar al de impacto
electrónico en el cual se genera un radical con número impar de electrones. Posteriormente,
debido al gran número de colisiones a presión atmosférica se producen moléculas protonadas
[113]. En este proceso se suelen emplear disolventes como acetona o tolueno que puedan
favorecer la protonación de las moléculas analito, esto provoca que el espectro de masas con
esta fuente de ionización sea muy peculiar ya que pueden coexistir ambos tipos de iones, el
catión radical y la molécula protonada. El rango de aplicación de APPI es muy similar al de
APCI, sin embargo, esta última es menos común hoy en día y se emplea principalmente para el
análisis de compuestos con una polaridad muy reducida como puede ser el caso de los
esteroides.
• Plasma acoplado inductivamente (ICP): También se trata de método de ionización a presión
atmosférica, pero a diferencia de ESI, APCI y APPI, en este caso sí se considera un método de
ionización fuerte. Esta fuente de ionización consiste en un sistema de nebulización que
introduce la muestra a través de un spray en una cámara donde se emplea plasma de argón. La
muestra, que generalmente precisa de la adición de un estándar interno, se ioniza en el plasma
y se miden las longitudes de onda de la luz que emiten los iones generados. El plasma de argón
se consigue gracias a una bobina de radio frecuencia y puede alcanzar temperaturas en el rango
de los 6000 a los 10000 K. Esta técnica de ionización es comúnmente empleada para el análisis
de elementos traza en laboratorios clínicos, ya que puede proporcionar una elevada sensibilidad
permitiendo detectar analitos a niveles de partes por trillón (ppt). Es difícil encontrar
interferentes que afecten a los analitos usando ICP, pero cuando estos se producen (como puede
ser el caso del óxido de argón) pueden dar lugar a grandes dificultades para el análisis. Por ello,

62
 Introducción

las fuentes ICP actuales presentan una zona previa al analizador en la cual se introduce un gas
reactante, como el amonio, que produce la eliminación de las interferencias previo a la
introducción de la muestra [114]. No obstante, el problema para elucidar interferencias con la
misma masa nominal se puede solucionar también empleando. espectrometría de masas de alta
resolución, lo cual hace que sea una de las combinaciones habituales con este tipo de fuentes
de ionización.
• Desorción/Ionización láser asistida por matriz (MALDI): Se trata de una técnica de ionización
suave empleada asiduamente para el análisis de péptidos, proteínas, carbohidratos, etc… En
términos generales, para moléculas poco volátiles [115]. Estos analitos de gran tamaño se
transforman directamente del estado sólido al estado gaseoso. Esto se consigue gracias a los
procesos de intercambio de energía que tienen lugar cuando se incide un rayo láser sobre la
muestra. Previamente el analito debe estar en suspensión o disuelto en la matriz (se suelen
emplear ratios molares de 1000:1 a 10000:1 matriz:muestra). El láser ultravioleta provoca la
desorción de la muestra (la matriz absorbe la luz ultravioleta) y los iones producidos son
acelerados e introducidos en el espectrómetro de masas. Las matrices utilizadas suelen ser
pequeños compuestos orgánicos capaces de absorber la luz ultravioleta y transferir fácilmente
la energía acumulada a la muestra favoreciendo el proceso de ionización. Esta fuente de
ionización se utiliza frecuentemente para el análisis de muestras forenses, ya que se puede
acoplar directamente a un analizador de tiempo de vuelo (QTOF) y cada pulso de rayo láser
puede generar un grupo selectivo de iones que se transfiere al analizador.

3.2 Analizadores de masa

Una vez que los analitos de la muestra son ionizados, estos se introducen en el analizador de masas.
Estos equipos basan su funcionamiento en cómo se comportan las partículas cargadas a través de
campos eléctricos y magnéticos en un sistema de vacío. Los analizadores de masas separan las partículas
considerando la ratio masa-carga (m/z) y posteriormente las trasladan al detector. Teniendo en cuenta
cómo los analizadores llevan a cabo este proceso de gestión del haz de iones se pueden diferenciar en
dos grupos principales; aquellos que emplean trampa de iones y los que no. En los sistemas que carecen
de trampa, el haz de iones atraviesa el instrumento hasta finalmente encontrar el detector. Sin embargo,
si el analizador tiene una trampa de iones, estos quedan retenidos en una región del equipo gracias a
una combinación de campos magnéticos y/o electroestáticos. En términos generales la espectrometría
de masas se considera una técnica destructiva ya que los iones se detectan mediante un proceso que
impide la recuperación de la muestra. Los principales analizadores de masas se describen a
continuación:

63
 Introducción

• Cuadrupolo: Este analizador de masas desbancó al de sector magnético como el instrumento

más estandarizado en espectrometría de masas. El analizador de cuadrupolo tiene múltiples
virtudes que hacen que se adecue perfectamente a la mayoría de las aplicaciones. Se trata de un
sistema muy intuitivo, flexible, de tamaño reducido y cuyos requisitos de funcionamiento no
son exigentes y a la vez son económicos. La estructura de un analizador de cuadrupolo consta
de cuatro barras cilíndricas paralelas que actúan como electrodos. El haz de iones atraviesa en
paralelo el canal generado por las cuatro barras. Cuando se seleccione un rango de m/z, solo
aquellos iones que cumplan las especificaciones de m/z serán capaces de atravesar el
cuadrupolo y el resto serán eyectados fuera del cuadrupolo. Esta selectividad se consigue
gracias a la superposición de campos electromagnéticos de radiofrecuencia y diferentes voltajes
de corriente continua. Los movimientos oscilantes de las partículas y su trayectoria responden
a una compleja ecuación diferencial denominada la ecuación Mathieu [116].
• Sector magnético: Los cuadrupolos son inferiores a este tipo de analizadores en términos de
sensibilidad y resolución. Sin embargo, el sector magnético carece de las principales cualidades
de un analizador de cuadrupolo, ya que se trata de instrumentación costosa, de gran tamaño y
difícil de manejar. Los analizadores de sector magnético desplazan los iones hacia el detector
empleando un campo magnético. El radio de curvatura de la trayectoria de estos iones
dependerá del voltaje aplicado y la fuerza del campo: solo aquellos iones con la m/z adecuada
conseguirán la curvatura necesaria para llegar al detector. La resolución de estos analizadores
se puede incrementar situando previamente un analizador electroestático que concentre los
iones con la misma m/z pero con ligeras diferencias de energía cinética.
• Tiempo-de-vuelo (TOF): Tiempo de vuelo es un analizador de alta resolución donde se da
prioridad a un espectro de masas completo en lugar de filtrado de m/z a través de un escaneo
secuencial. La información adquirida por un TOF nos da una imagen global de la matriz y los
analitos analizados. Los analizadores TOF se caracterizan por su elevada velocidad de
adquisición, así como su gran resolución. Tienen un rango de masa casi ilimitado y
proporcionan resultados con bastante sensibilidad sin ser equipos excesivamente costosos.
Actualmente estos analizadores usan su elevada precisión de masa para realizar análisis de
“masa exacta” cuyos márgenes de error se evalúan en partes por millón (ppm). Esta
funcionalidad hace que este tipo de analizadores sean ampliamente usados para confirmar la
fórmula molecular de compuestos desconocidos. El fundamento analítico de estos sistemas se
basa en el peso de los iones, los iones se aceleran y se igualan en energía cinética,
posteriormente estos se desplazarán a mayor o menor velocidad en el sistema de vacío según
sean más ligeros o pesados. El espacio por el que se desplazan se denomina tubo de vuelo y el
detector está situado al final de este. El tiempo que tarda en alcanzar el detector se denomina
tiempo de vuelo y está directamente relacionado con la m/z del ion analizado.

64
 Introducción

• Trampa de iones: El analizador de trampa iónica consiste en un electrodo con forma de anillo.
En estos sistemas es habitual que los iones generados se trasladen al interior del anillo a través
de electrodos con aperturas perpendiculares situados en la parte superior e inferior del anillo.
Los iones quedan atrapados mediante campos eléctricos y comienzan a oscilar en un espacio
tridimensional. La frecuencia de oscilación de cada ion dependerá de su m/z. En la trampa se
suele introducir un gas amortiguador, como el helio, que ayuda a retener los iones en la trampa
y favorece la disociación inducida por colisión (CID). El voltaje y la frecuencia se mantienen
constantes pero diferentes amplitudes se aplican al anillo, lo cual hace que ciertas m/z sean
inestables y eyecten de la trampa. Por lo tanto, a diferencia del cuadrupolo, la trampa de iones
separa y detecta las masas descargando los iones mediante modificaciones de los parámetros
del sistema que generan oscilaciones inestables.
• Orbitrap: El fundamento principal de este tipo de analizador de masas se basa en atrapar los
iones empleando un campo magnético. Este sistema ideado por Alexander Makarov permite
alcanzar resoluciones con valores próximos a 100.000, tiene una precisión de masa de sub
partes por millón y un rango dinámico de cuatro ordenes de magnitud [117]. La estructura del
analizador consiste en un electrodo exterior con forma de barril y un electrodo interior con
forma de huso. El electrodo interior confina a los iones de forma que orbitan alrededor del
electrodo y estos, a través de su oscilación, generan una señal que será dependiente de su m/z.
La sensibilidad obtenida por este tipo de instrumentación hace que sea una herramienta
eficiente para el análisis de compuestos objetivos, pero además, la posibilidad de procesar los
datos con retrospectiva junto con las enormes bases de datos que se están generando, hacen de
este tipo de analizador una instrumentación muy útil para el análisis de compuestos
desconocidos [118].

Los analizadores de masas se pueden emplear de forma individual o configurarse de manera que queden
acoplados de manera secuencial dos o más analizadores. Este tipo de hibridación de sistemas de
espectrometría de masas se denomina espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Los analizadores
se suelen acoplar de manera lineal en el espacio, mientras que en aquellos que emplean trampa de iones,
el experimento de MS/MS se lleva a cabo llevando los iones a una región individual del equipo antes o
después de interaccionar con el otro analizador. Gracias a esta hibridación se pueden realizar multitud
de métodos de escaneo de iones como se puede ver en la tabla 4. Sin duda alguna, el método más usado
en MS/MS es el “multiple reaction monitoring” (MRM). Es un tipo de escaneo comúnmente asociado
a los espectrómetros de masas de triple cuadrupolo (QqQ). En este tipo de sistemas el ion precursor es
aislado según su m/z en un primer cuadrupolo, seguidamente es trasladado a una celda de colisión
(segundo cuadrupolo) donde se produce la CID gracias al empleo de un gas inerte (comúnmente argón)
y finalmente los fragmentos son de nuevo filtrados en el tercer cuadrupolo. Se trata de una metodología

65
 Introducción

muy selectiva (las interferencias se reducen drásticamente) y que aporta una elevada sensibilidad. Otro
ejemplo de espectrometría de masas en tándem son los TOF acoplados a cuadrupolo de manera que
combinan la eficiencia de este con la velocidad de análisis y sensibilidad del TOF. Los analizadores
QTOF han sufrido diversas modificaciones para optimizarlos hasta alcanzar la resolución y tiempos de
ciclo actuales [119]. Este tipo de hibridación también tiene lugar actualmente en los analizadores de
masas Orbitrap [120]. Sin duda alguna, los espectrómetros de masas en tándem son los más utilizados
hoy en día debido a su sensibilidad y versatilidad.

Tabla 4. Principales modos de escaneo para el análisis y fragmentación de analitos en la

espectrometría de masas de triple cuadrupolo.

Modo de escaneo Descripción

- Q1 se configura para que solo permita la entrada de una
Escaneo de ion fragmento m/z.
- El ion precursor colisiona con el gas inerte dando lugar a
(Product ion scan) los iones producto.
- Los iones producto son escaneados en Q3.

Escaneo de ion precursor - Q1 escanea el rango de m/z especificado

- Los iones precursores colisionan con el gas inerte.
(Precursor ion scan) - Q3 se configura para permitir el paso de solo una m/z
- Q1 y Q3 escanean
Pérdida neutra - Los iones precursores colisionan con el gas inerte.
(Neutral loss) - En Q3 solo se detectan los iones que se producen con la
pérdida de interés.
- Q1 se configura para que solo permita la entrada del ion
precursor de interés.
MRM - Se produce la fragmentación con el gas inerte.
- Q3 se configura para solo permitir el paso del ion(es)
producto de interés.

3.3 Detectores

Cuando en espectrometría de masas los iones alcanzan el detector, se emite una señal, es decir, los iones
se interpretan como una corriente y esta es amplificada. Existen diversos tipos de detectores como la
copa de Faraday, los fotomultiplicadores, los detectores de corriente de imagen, pero sin duda alguna
los multiplicadores de electrones son los detectores más empleados en la espectrometría de masas
moderna.

• Multiplicadores de electrones: No obstante, aunque todos los multiplicadores de electrones

empleen el mismo principio físico de detección, existen varios tipos de diseño como pueden ser
los multiplicadores de dínodo discreto, los multiplicadores de dínodo continuo y los de placa
de microcanal. En la Figura 16 se puede observar cómo funciona un multiplicador de electrones
de dínodo discreto. Cuando un ion alcanza el primer dínodo, se produce una eyección de

66
 Introducción

electrones y estos son acelerados hacia el segundo dínodo. Una vez se produce el impacto en el
segundo dínodo, se produce de nuevo una eyección, pero otros dos o tres electrones son
generados en el proceso. De nuevo, se produce una aceleración hacia el siguiente dínodo y
nuevamente se producen electrones adicionales tras la eyección. Este proceso se repite una y
otra vez en todos los dínodos del multiplicador (la mayoría de los diseños constan de 12 a 24
dinodos). Al final del proceso se obtiene un incremento de la señal entre 104 a 108 gracias a esta
cascada de electrones, todo ello en un espacio de tiempo inferior a 10 ns. Por otro lado, los
multiplicadores de dínodo continuo presentan un diseño diferente. Empleando materiales
semiconductores se construye un canal de vidrio que finaliza en un embudo. La emisión
secundaria se genera gracias a que los electrodos producen una resistencia creciente. En la parte
con forma de embudo del “cuerno” se utiliza un voltaje negativo elevado y conforme este se
estrecha se alcanza un voltaje positivo. De esta forma, se establece un gradiente de potencial.
La miniaturización de este diseño es lo que se conoce como una placa de microcanal.

Figura 16. Representación de la cascada de electrones generada en un multiplicador de

electrones de dínodo discreto.

• Copa de Faraday: A diferencia de los mencionados anteriormente, este dispositivo no funciona

como un multiplicador de electrones, sino que consiste en un electrodo que recoge el haz de
electrones. A través de amplificadores electrónicos la señal se magnifica de manera directa.
Este tipo de detectores se suelen usar cuando las magnitudes de las señales generadas son muy
elevadas, de forma que un multiplicador de electrones puede dar lugar a una señal tan intensa
que genere saturación. Algunos instrumentos como los ICP-MS emplean ambos detectores para
ampliar el rango dinámico.

67
 Introducción

• Fotomultiplicador: Estos detectores funcionan de manera muy similar a los multiplicadores de

electrones, pero con un paso de transformación intermedio. Los iones golpean un dínodo y se
produce la emisión de electrones, sin embargo, a continuación, entran en contacto con una
pantalla de fósforo dando lugar a una generación abrupta de protones. Seguidamente, estos se
introducen en un multiplicador donde tiene lugar la cascada que da lugar a la amplificación de
la señal (de manera muy similar a como sucede en el multiplicador de electrones).
• Corriente de imagen: Este tipo de detector también detecta la corriente de los iones de manera
directa, pero con la ventaja de que los iones no son destruidos en el proceso de detección y por
lo tanto se puede seguir recopilando información sobre ellos. Este tipo de detectores se emplean
para la espectrometría por resonancia ciclotrónica de iones (ICR), aunque este tipo de detección
también está presente en los analizadores Orbitrap, ya que usan como principio básico la
transformada de Fourier.

68
 Introducción

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77
 CAPÍTULO I
ARTÍCULO CIENTÍFICO:
“Supercritical fluid chromatography coupled to
tandem mass spectrometry for the analysis of
pesticide residues in dried spices. Benefits and
drawbacks”

Víctor Cutillas, María Murcia-Morales, María del Mar Gómez-Ramos, Sherif M.Taha,
Amadeo R. Fernández-Alba

Revista: Analytica Chimica Acta

Factor de impacto: 6.558
Cuartil: Q1
Citaciones: 14
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
 CAPÍTULO II
ARTÍCULO CIENTÍFICO:
“Overcoming difficulties in the evaluation of captan
and folpet residues by supercritical fluid
chromatography coupled to mass spectrometry”

Víctor Cutillas, Florencia Jesús, Carmen Ferrer, Amadeo R. Fernández-Alba

Revista: Talanta
Factor de impacto: 6.057
Cuartil: Q1
Citaciones: 4
95
96
97
98
99
100
101
 CAPÍTULO III
ARTÍCULO CIENTÍFICO:
“Liquid chromatography versus supercritical fluid
chromatography coupled to mass spectrometry: a
comparative study of performance for multiresidue
analysis of pesticides”

Víctor Cutillas, Carmen Ferrer, Amadeo R. Fernández-Alba

Revista: Analytical and Bioanalytical Chemistry

Factor de impacto: 4.157
Cuartil: Q1
Citaciones: 2
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
CONCLUSIONES
 Conclusiones

CONCLUSIONES

La conclusión general que se extrae de la presente Tesis Doctoral es que la cromatografía de fluidos
supercríticos es, sin duda, una técnica cromatográfica que funciona como una perfecta alternativa a las
dos técnicas cromatográficas empleadas con mayor asiduidad actualmente en los laboratorios de rutina
para el análisis de residuos de plaguicidas. Este sistema, además, proporciona una serie de ventajas a la
hora de analizar matrices complejas y ciertos compuestos que presentan dificultades para su análisis a
través de LC o GC.

A continuación, se exponen las conclusiones concretas de los capítulos en los cuales se subdivide la
Tesis Doctoral.

Capítulo I:

• Se ha validado un método analítico para la detección y cuantificación de 162 plaguicidas en

cayena y pimienta negra. Se estudió la repetitividad y reproducibilidad del método y se
establecieron los límites de cuantificación a 50 y 200 µg kg-1 , pudiendo detectarse la gran
mayoría de plaguicidas del método multiresiduo al punto más bajo de la recta de calibrado (5
µg kg-1) , cumpliendo los criterios de linealidad recogidos en el documento DG-SANTE.
• Utilizando el método validado, se analizaron 47 muestras reales de especias provenientes de
diferentes países. El 81% de las muestras presentaba uno o más plaguicidas, detectándose 46
plaguicidas diferentes, algunos de ellos por encima del límite máximo de residuo.

Capítulo II:

• Se evaluaron los plaguicidas termosensibles captan y folpet a diferentes temperaturas de la

fuente de ionización ESI y utilizando dos técnicas cromatográficas (SFC y LC). Se determinó
que en SFC se podía operar con temperaturas inferiores a los 200ºC, permitiendo la detección
y cuantificación de estos compuestos a la concentración de 10 µg kg-1.
• Se desarrolló un método de extracción que incluía la utilización de hielo seco y ácido ascórbico
durante el triturado de la muestra. Gracias a esta etapa previa, se podía evitar la degradación de
estos plaguicidas y obtener recuperaciones en el rango del 84-105%.
• El método se validó en términos de linealidad y reproducibilidad siguiendo los criterios de la
DG-SANTE. Por último, las recuperaciones se compararon con las obtenidas por GC a través
de sus metabolitos, siendo estas últimas inferiores a los resultados de SFC.

Capítulo III:

• Se desarrolló un método multiresiduo con 215 plaguicidas y se evaluó empleando SFC y LC,
ambas acopladas al mismo espectrómetro de masas con fuente ESI. Se observó que LC necesita

117
Conclusiones

las temperaturas de la fuente más elevadas (350ºC) para obtener la mayor sensibilidad. Sin
embargo, esta diferencia de sensibilidad entre temperaturas no se experimentó usando SFC.
• Se evaluaron los plaguicidas más sensibles en cada técnica a través de sus propiedades
fisicoquímicas. Se determinó que ciertos grupos químicos, como los triazoles, son más
sensibles en SFC. Por otro lado, tras comparar los coeficientes de partición octanol/agua, se
observó que la polaridad no es un factor determinante en la sensibilidad.
• Se realizó una comparación del total ion chromatogram “TIC” de diferentes matrices y se
observó que la reducción de los efectos matriz en SFC no está solo relacionada con la eficiencia
en la ionización, sino también los diferentes mecanismos de elución que pueden provocar que
los analitos eluyan con un menor número de componentes de la matriz.

118
 Conclusiones

CONCLUSIONS

The general conclusion that can be extracted from this Thesis is that supercritical fluid chromatography
has proven to be an effective alternative to the conventional chromatographic technics used nowadays
at pesticide residue analysis routine laboratories. Moreover, SFC has some advantages for the analysis
of complex matrices and challenging compounds that present difficulties to be analyzed by LC and GC.

Below, more specific conclusions related to the chapters in which this thesis is subdivided can be
considered.

Chapter I:

• An analytic method has been validated for the detection and quantification of 162 pesticides in
cayenne and black pepper. Repeatability and reproducibility of the method were studied, 50
and 200 µg kg-1 were the limits of quantification established, but most of the pesticides were
detected at the lowest point of the calibration curve, fulfilling the DG-SANTE linearity criteria.
• Forty-seven real samples of spices from different countries were analyzed using the validated
method. Around 81% of the spice samples presented one or more pesticides, 46 different
pesticides were detected, some of them were above the maximum residue level.

Chapter II:

• An evaluation of two thermolabile compounds (captan and folpet) was performed at different
temperatures using an ESI ionization source coupled to SFC and LC. It was determined that
SFC can work at temperatures below 200ºC allowing the detection and quantification of these
compounds at the 10 µg kg-1 concentration level.
• An extraction method using dry ice and ascorbic acid during sample treatment was developed.
Thanks to this step during the milling, the degradation of these pesticides was avoided and
recoveries in the range of 84-105% were obtained.
• This method was validated in terms of linearity and reproducibility following the criteria of the
DG-SANTE document. Finally, the recoveries were compared with those obtained by GC
through their metabolites. The GC recoveries were lower compared to SFC results.

Chapter III:

• A multiresidue method of 215 pesticides was developed. This method was tested using SFC
and LC, both coupled to the same mass spectrometer with an ESI ion source. It was observed
that LC needed the highest temperatures evaluated (350ºC) to obtain the higher sensitivity,
however, this difference between temperatures was not observed using SFC.

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Conclusiones

• The pesticides that presented the highest sensitivity in each technic were evaluated in terms of
their physicochemical properties. It was determined that some chemical groups, like triazoles,
showed more sensitivity using SFC. On the other hand, after comparing the octanol/water
coefficients, it was observed that the polarity does not play an important role in sensitivity.
• The total ion chromatogram (TIC) of different matrices was compared and it was noted that the
reduction of the matrix effects in SFC it is not only related to the ionization efficiency, but also
with the different elution mechanisms which can produce that the analytes elute with a lower
amount of coextracted matrix components.

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ANEXOS

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 Anexo 1. Índice de acrónimos

Anexo 1. Índice de acrónimos

APCI Ionización química a presión atmosférica

ARfD Dosis de referencia aguda

APPI Fotoionización a presión atmosférica

BPA Buenas prácticas agrícolas

BPR Regulador de contrapresión

CEN Comité Europeo de Normalización

CI Ionización química

CID Disociación inducida por colisión

DG-SANTE Dirección General de Salud y Seguridad Alimentaria.

dSPE Extracción en fase sólida dispersiva

EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria

EI Ionización por impacto electrónico

ESI Ionización por electroespray

EURL Laboratorios de Referencia Europeo

FDA Administración norteamericana de Medicamentos y Alimentos

GC Cromatografía gaseosa

GC-MS/MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en tándem

IDA Ingesta diaria admisible

LC Cromatografía líquida

LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem

LC-TOF-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con analizador

de masa exacta tiempo de vuelo.

LMR Límites máximos de residuos

LOQ Límite de cuantificación

MRM Métodos multirresiduo

MS Espectrometría de masas

NRL Laboratorio Nacional de Referencia

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Anexo 1. Índice de acrónimos

QqQ Analizador triple cuadrupolo

Q-TOF Analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo

RASFF Sistema de alerta rápido para alimentos y piensos

RSD Desviación estándar relativa

SAX Intercambiador de aniones fuerte

SFC Cromatografía de fluidos supercríticos

Cromatografía de fluidos supercríticos acoplada a espectrometría de

SFC-MS/MS masas en tándem

TOF Analizador de tiempo de vuelo

UE Unión Europea

UV Detector Ultravioleta

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 Anexo 2. Listado de publicaciones científicas no incluidas en la tesis

Anexo 2. Listado de publicaciones científicas no incluidas en la tesis.

• Título: Removal of pesticide residues from beeswax using a methanol extraction-

based procedure: A pilot-scale study. Environmental Technology and Innovation
(2021)
Autores: Alba Luna; Raúl Alonso; Víctor Cutillas; Carmen M. Ferrer; M.J. Gómez
Ramos; M.Dolores Hernando; Antonio Valverde; J.M. Flores; Amadeo R. Fernández-
Alba; Antonio R. Fernández-Alba.

• Título: Analysis by LC-MS/MS of polar pesticides in fruits and vegetables using new
hybrid stationary phase. MethodsX (2021)
Autores: Víctor Cutillas; Amadeo Rodríguez Fernández-Alba

• Título: A three-year large scale study on the risk of honey bee colony exposure to
blooming sunflowers grown from seeds treated with thiamethoxam and clothianidin
neonicotinoids. Chemosphere (2021)
Autores: José M. Flores; Victoria Gámiz; Segio Gil-Lebrero; Inmaculada Rodríguez;
Francisco J. Navas; Ana I. García-Valcárcel; Víctor Cutillas; Amadeo Rodríguez
Fernández-Alba; M.Dolores Hernando.

• Título: Quantitative determination of pesticide residues in specific parts of bee

specimens by nanoflow liquid chromatography high resolution mass
spectrometry.Science of the Total Environment. 2020.
Autores: David Moreno González; Víctor Manuel Cutillas Juárez; M.Dolores
Hernando; Jaime Alcantara Durán; Juan Francisco García Reyes; Antonio Molina
Díaz.

• Título: Supercritical fluid chromatography separation of chiral pesticides: Unique

capabilities to study cyhalothrin and metalaxyl as examples. Journal of
Chromatography A. 2020.
Autores: Víctor Manuel Cutillas Juárez; Mar García Valverde; María del Mar Gómez
Ramos; Francisco José Díaz Galiano; Carmen María Ferrer Amate; Amadeo
Rodríguez Fernández-Alba.

• Título: Supercritical Fluid Chromatography and Gas Chromatography Coupled to

Tandem Mass Spectrometry for the Analysis of Pyrethroids in Vegetable Matrices: A
Comparative Study. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 - 46, pp.12626 -
12632. 2019.
Autores: María Murcia Morales; Víctor Manuel Cutillas Juárez; Amadeo Rodríguez
Fernández-Alba

• Título: Coupling Ion Chromatography to Q-Orbitrap for the Fast and Robust Analysis
of Anionic Pesticides in Fruits and Vegetables. Journal of AOAC International. 101,
pp 352-359. 2018
Autores: Lukasz Rajski; Francisco José Díaz-Galiano, Víctor Manuel Cutillas Juárez;
Amadeo Rodríguez Fernández-Alba.

• Título: Evaluation of supercritical fluid chromatography coupled to tandem mass

spectrometry for pesticide residues in food. Journal of Chromatography A. 1545, pp
67-74. 2018.
Autores: Víctor Manuel Cutillas Juárez; María Martínez-Galera; Lukasz Rajski;
Amadeo Rodríguez Fernández-Alba.

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Anexo 2. Curriculum vitae (CV)

• Título: A non-targeted metabolomic approach to identify food markers to support

discrimination between organic and conventional tomato crops. Journal of
Chromatography A. 1546, pp.66 - 76. 2018.
Mª Jesús Martínez Bueno; Francisco José Díaz Galiano; Lukasz Rajski; Víctor
Manuel Cutillas Juárez; Amadeo Rodríguez Fernández-Alba.

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Anexo 3. Listado de publicaciones científicas no incluidas en la tesis

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