MDTTQH448 4M37

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA

GUTIÉRREZ
OPTIMIZACIÓN DE UN PROTOCOLO DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens EN Pentalinon andrieuxii
OPCION X
INFORME DE RESIDENCIA PROFESIONAL
PARA OBTENER EL TITULO DE:
INGENIERO BIOQUÍMICO
PRESENTA:
KARINA ELIZABETH MARTÍNEZ SILVESTRE
ASESORES:
DR. FEDERICO ANTONIO GUTIÉRREZ MICELI
DR. GREGORIO GODOY HERNÁNDEZ
PERIODO DE REALIZACIÓN:
AGOSTO-DICIEMBRE 2018
Optimización de un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens en 2018
Pentalinon andrieuxii
AGRADECIMIENTOS
A Dios principalmente por cada momento vivido y por su infinita fidelidad.
A mis padres por amarme sin medida, por apoyarme siempre a pesar de las dificultades y por la
hermosa familia que me dieron que a pesar de no ser perfecta es una familia feliz.
A mis hermanas por ser mi inspiración.
Al Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez por abrir sus puertas y permitirme culminar mis estudios
de licenciatura.
A mi asesor el Dr. Federico Antonio Gutiérrez Miceli por todo el conocimiento compartido y
comprensión brindada durante el periodo de clases y residencia profesional.
Al Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. por darme la oportunidad de realizar mi

residencia profesional en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas (UBBMP) y por la
facilidad de los recursos necesarios para la realización de este trabajo.
Al Dr. Gregorio Godoy Hernández por aceptarme dentro de su grupo de trabajo, por sus consejos y
observaciones siempre en pro de mi formación y crecimiento como profesional y personal.
A la M.C. Elidé Avilés Berzunza, por el apoyo incondicional recibido, por su amistad, sus consejos, por
hacer este trabajo suyo sufriendo conmigo los desvelos y por su excelente calidad ser humana que hizo
más ameno el trabajo de laboratorio.
A mis amigos Merari, Zaraos, Ceci, Luis y Villarreal que se convirtieron en familia y fueron de gran
apoyo a lo largo de la licenciatura.
A mis compañeros y amigos del laboratorio 26, Cecilia, Couoh Cauich, Sami y Esteban que hicieron
muy agradable y divertida esta experiencia.
Seamos agradecidos con las personas que nos hacen felices, ellos son los encantadores jardineros que
hacen florecer nuestra alma.
Marcel Proust
RESUMEN
Pentalinon andrieuxii (Müll. Arg) B.F. Hansen & Wunderlin es una planta nativa de
la península de Yucatán que pertenece a la familia Apocynaceae. Estudios
recientes demuestran que esta planta produce derivados del ácido betulínico y
esteroles derivados del colesterol, reconocidos por sus propiedades
anticancerígena, antiinflamatoria, antiedémico y leishmanicida, por lo que esta
especie representa una fuente natural importante para extraer este tipo de
metabolitos con potencial aplicación en la industria farmacéutica.
El desarrollo de cultivo de tejidos vegetales y técnicas de elicitación de metabolitos

secundarios, constituyen alternativas biotecnológicas al cultivo de plantas
completas para la obtención de productos valiosos (fitoquímicos). Una de las
técnicas usadas en cultivo de tejidos es la transformación genética de plantas, la
cual es una herramienta que se ha ido desarrollando en el transcurso de los
últimos años que permite realizar modificaciones en el genoma de las plantas que
han sido utilizadas como modelo de estudio.
El objetivo de este trabajo fue la optimización del protocolo establecido por

Burgos, 2015, para la transferencia de ADN de Agrobacterium tumefaciens a
Pentalinon andrieuxii. Para ello, se utilizó el gen reportero GUS que detecta las
áreas infectadas en el explante. Se evaluó la densidad óptica y el tiempo óptimo
de cocultivo logrando establecer una densidad de la suspensión de A. tumefaciens
de 0.8 DO 600 nm y un tiempo de cocultivo de tres días coincidiendo con el
protocolo previamente establecido. Con estos resultados se procedió a evaluar la
concentración de acetosiringona y el tiempo de vacío idóneo en la agroinfiltración,
teniendo como valores óptimos una concentración de 140 μM de acetosiringona
con una agroinfiltración de 20 minutos. También, se estableció que el rango de pH
para el tiempo de cocultivo se encuentra entre 7 y 7.5 en medio de cocultivo
líquido. Con estos nuevos parámetros se incrementó el porcentaje de frecuencia
de infección y por ende se disminuyó la probabilidad de escapes en la
regeneración de brotes, esperando un incremento significativo en el porcentaje de
frecuencia de transformación.
INDICE
CAPÍTULO 1 ................................................................................................................................... 12
1. GENERALIDADES DE LA EMPRESA ................................................................................ 12
1.1. GENERALIDADES ............................................................................................................ 12
1.1.1. DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA U ORGANIZACIÓN .......................................................... 12
1.1.2. LOCALIZACIÓN ................................................................................................................. 13
1.1.3. GIRO DE LA EMPRESA ...................................................................................................... 13
1.1.4. MISIÓN Y VISIÓN ............................................................................................................. 13
1.1.5. PRODUCTOS Y CLIENTES.................................................................................................. 14
CAPÍTULO 2. .................................................................................................................................. 15
2. PROBLEMAS A RESOLVER ............................................................................................... 15
2.1. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 15
2.1.1. Objetivo General ............................................................................................................. 15
2.1.2. Objetivos específicos ....................................................................................................... 15
2.2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 16
CAPÍTULO 3. .................................................................................................................................. 17
3. MARCO TEORICO ................................................................................................................. 17
3.1. PENTALINON ANDRIEUXII ............................................................................................. 17
3.2. CLASIFICACIÓN BOTÁNICA.......................................................................................... 18
3.3. CARACTERISTICAS TAXONÓMICAS .......................................................................... 18
3.4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA ...................................................................................... 19
3.5. USOS Y APLICACIONES ................................................................................................. 20
3.6. CULTIVO IN VITRO ........................................................................................................... 21
3.7. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS ........................................................ 21
3.8. SISTEMAS DE TRANSFORMACION GENETICA DE PLANTAS ............................ 22
3.8.1. MÉTODOS INDIRECTOS ................................................................................................... 22
3.8.2. MÉTODOS DIRECTOS ....................................................................................................... 23
3.9. AGROBACTERIUM COMO METODO DE TRANSFORMACION VEGETAL ......... 25
3.10. PLÁSMIDO TI Y SU IMPORTANCIA ........................................................................... 27
3.10.1. Región T o ADN-T .......................................................................................................... 28
3.10.2. Región vir....................................................................................................................... 29
3.10.3. Genes vir........................................................................................................................ 29
3.10.4. LOCI tra y trb ................................................................................................................. 30

3.10.5. Región rep ..................................................................................................................... 30
3.10.6. Catabolismo de opinas .................................................................................................. 30
3.11. PROCESO DE INDUCCION TUMORAL ..................................................................... 31
3.12. UNION DE LA BACTERIA A LA CÉLULA VEGETAL.............................................. 31
3.13. PRODUCCION DE UNA COPIA TRANSFERIBLE DE T-DNA ............................... 32
3.14. TRANSFERENCIA DEL COMPLEJO T A LA CELULA VEGETAL ....................... 32
3.15. INTEGRACION DEL COMPLEJO T EN EL GENOMA NUCLEAR DE LA
PLANTA....................................................................................................................................... 34
3.16. FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ..................................................................................... 34
3.16.1. Tipo de explante ............................................................................................................ 34
3.16.2. Cepas de Agrobacterium tumefaciens .......................................................................... 35
3.16.3. Suspensión bacteriana .................................................................................................. 35
3.16.4. Infiltración por vacío ..................................................................................................... 35
3.16.5. Tiempo de precultivo .................................................................................................... 36
3.16.6. Condiciones de cocultivo............................................................................................... 36
3.16.7. Antibióticos ................................................................................................................... 36
3.17. MARCADORES GENÉTICOS ....................................................................................... 37
3.18. GEN GUS .......................................................................................................................... 38
3.19. PLÁSMIDO PCAMBIA 2301 .......................................................................................... 38
CAPÍTULO 4. .................................................................................................................................. 40
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 40
4.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ..................................................................................... 40
4.2. LOCALIZACIÓN ................................................................................................................. 41
4.3. OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL .................................................................... 41
4.4. CEPA BACTERIANA ........................................................................................................ 41
4.5. MEDIOS DE CULTIVO ...................................................................................................... 41
4.6. ASEPSIA Y GERMINACION DE SEMILLAS DE Pentalinon andrieuxii ................ 42
4.7. TRANSFORMACIÓN DE Pentalinon andrieuxii VIA Agrobacterium tumefaciens
....................................................................................................................................................... 42
4.8. EVALUACIÓN DE D.O. Y DÍAS DE COCULTIVO ....................................................... 45
4.9. EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA Y TIEMPO DE

VACÍO .......................................................................................................................................... 45
4.10. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL pH EN EL TIEMPO DE COCULTIVO ... 46
4.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................................................. 47
CAPÍTULO 5. .................................................................................................................................. 48
5. RESULTADOS ........................................................................................................................ 48
5.1. OBTENCIÓN DE PLANTULAS in vitro DE Pentalinon andrieuxii ......................... 48
5.2. EVALUACIÓN DE CONDICIONES DE ILUMINACIÓN .............................................. 48
5.3. PRUEBA HISTOQUÍMICA DE GUS ............................................................................... 50
5.4. MONITOREO DE DÍAS DE COCULTIVO Y DENSIDAD OPTICA ............................ 52
5.5. EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA Y TIEMPO DE
VACÍO .......................................................................................................................................... 54
5.5.1. Concentración de acetosiringona.................................................................................... 54
5.5.2. Tiempo de vacío .............................................................................................................. 56
5.6. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL pH EN EL TIEMPO DE COCULTIVO ..... 58
5.7. EVALUACIÓN DE MEDIO DE SELECCIÓN Y MEDIO DE RECUPERACIÓN ....... 63
6. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 65
7. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 66
8. ANEXOS .................................................................................................................................. 73
ANEXO 1 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO YEB ........................................................ 73
ANEXO 2 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO PC ........................................................... 73
ANEXO 3 MEDIO DE RECUPERACIÓN………………………………………………………74
ÏNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1.Ubicación geográfica del Centro de Investigación Científica de Yucatán, ... 13

Ilustración 2.Pentalinon andrieuxii ............................................................................................. 17
Ilustración 3. A) Semillas, B) Vilano, C) Folículo de Pentalinon andrieuxii. ........................ 19
Ilustración 4.Distribución geográfica de Pentalinon andrieuxii. ............................................. 19
Ilustración 5. Método de transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens .......... 26
Ilustración 6. Esquema de plásmido Ti. .................................................................................... 27
Ilustración 7. Unión de Agrobacterium tumefaciens a la célula vegetal .............................. 31
Ilustración 8. Mecanismo de transformación de Agrobacterium tumefaciens. ................... 33
Ilustración 9. Esquema de la reacción histoquímica GUS. .................................................... 38
Ilustración 10. Esquema del plásmido pCAMBIA 2301 .......................................................... 39
Ilustración 11.Estrategia metodológica. .................................................................................... 40
Ilustración 12. Desarrollo de callos a las 8 semanas en fotoperiodo y luz continua.......... 49
Ilustración 13. Prueba histoquímica de GUS a explantes transformados con el protocolo
descrito por Burgos, ....................................................................................................................... 50
Ilustración 14. Prueba histoquímica de GUS a callos transformados con el protocolo
descrito por Burgos, 2015 a 2 meses después de la transformación .................................... 51
Ilustración 15. Prueba histoquímica de GUS a brotes regenerados. ................................... 52
Ilustración 16. Efecto del pH en el crecimiento de Agrobacterium tumefaciens. ............... 59
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación Taxonómica del género Pentalinon andrieuxii. ............................... 18
Cuadro 2. Clasificación Científica de Agrobacterium tumefaciens ........................................ 27
Cuadro 3. Organización genética del plásmido Ti.................................................................... 28
Cuadro 4. Concentración de antibióticos y reguladores de crecimiento en medio de
selección .......................................................................................................................................... 44
Cuadro 5. Parámetros evaluados de días de cocultivo y densidad óptica. .......................... 45
Cuadro 6. Concentraciones evaluadas de acetosiringona y tiempos de vacío. .................. 46
Cuadro 7. Modelo experimental de los efectos del pH en el tiempo de cocultivo ............... 46
Cuadro 8. Resultados de germinación de semillas de Pentalinon andrieuxii ...................... 48
Cuadro 9. Desarrollo de callos en condiciones de fotoperiodo y luz continúa .................... 49
Cuadro 10. Frecuencia de infección protocolo Burgos, 2015................................................. 50
Cuadro 11. Frecuencia de transformación protocolo Burgos, 2015. ..................................... 51
Cuadro 12. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes de raíz. ............................ 60
Cuadro 13. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes hoja. ................................. 61
Cuadro 14. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes de hipocótilo. .................. 62
Cuadro 15. Evaluación de medio de selección y medio de recuperación ............................ 63
ÏNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de hipocótilo. .................... 52
Gráfico 2. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de raíces primarias. ......... 53
Gráfico 3. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de raíces secundarias. .... 53
Gráfico 4. Efectos de la concentración de acetosiringona en transformación de explantes
de hipocótilo. ................................................................................................................................... 54
de raíces primarias. ........................................................................................................................ 55
de raíces secundarias.................................................................................................................... 55
Gráfico 7. Efectos de los tiempos de vacío en transformación de explantes de hipocótilo.
........................................................................................................................................................... 56
Gráfico 8. Efectos de los tiempos de vacío en transformación de explantes de raíces
primarias .......................................................................................................................................... 57
Gráfico 9. Efectos de los tiempos de agroinfiltración en transformación de explantes de
raíces secundarias. ........................................................................................................................ 57
GENERALIDADES DEL PROYECTO
INTRODUCCIÓN
En México, la familia Apocynaceae se ubica entre las 15 familias más diversas,

con 385 especies repartidas en 50 géneros y 3 subfamilias, de las cuales
Asclepiadoideae es la de mayor diversidad en géneros, esta familia incluye plantas
anuales o perennes, principalmente hierbas erectas o trepadoras y con menos
frecuencia árboles y arbustos (Juárez et al., 2007), algunas de estas especies son
de gran importancia en el campo de la medicina por lo que son objetos de estudio
en proyectos de investigación científica. Pentalinon andrieuxii es una de las
plantas más utilizadas en la Península de Yucatán para el tratamiento de
leishmaniasis, causada por parasitos protozoarios del género Leishmania, también
es utiliza para mordeduras de serpientes,alivo de dolores de cabeza y disturbiso
nerviosos (Pulido, 1993).
Los principios activos de las plantas medicinales son de gran importancia ya que
son moléculas resultantes del metabolismo celular, unas son principios inmediatos
como los azúcares, proteínas o lípidos, pero la mayoría de ellas son metabolitos
secundarios producidos en diferentes rutas metabólicas, esos metabolitos
bioactivos son utilizados como fármacos, pesticidas, colorantes, saborizantes y
fragancias, entre otros. Comúnmente, estos metabolitos secundarios se producen
en células, órganos y tejidos específicos, en fases determinadas del ciclo de vida
de la planta, bajo condiciones estacionales o de estrés por lo que su acumulación
es baja y lenta, lo que a menudo representa una limitante para su producción
comercial (Verpoorte et al., 2002). Por ello, se crearon técnicas de manipulación
genética las cuales permiten obtener metabolitos secundarios de mayor calidad y
cantidad. La transformación genética de especies vegetales es un mecanismo que
hoy en día es ampliamente utilizado dentro del campo del fitomejoramiento. De
esta manera, se obtienen plantas transgénicas, es decir, portadoras de un gen
ajeno o exógeno que se denomina transgen, esto se hace con el fin de conferirles
determinadas características (Trinidad, 2008).
El sistema de transformación mediado por Agrobacterium es influenciado por

factores tales como cepas bacterianas, densidad celular, especies y genotipos de
plantas, reguladores del crecimiento de las plantas, antibióticos, explantes, tipo de
heridas mecánicas y condiciones físicas de cultivo (Li et al., 1997; Zambre et al.,
2003; Yu et al., 2002; Olhoft et al., 2003; Shrawat y Lörz 2006; Tzfira et al., 2006).
El punto crítico en el desarrollo de un protocolo de transformación eficiente es
encontrar la combinación correcta de los muchos factores que actúan juntos
durante la transformación. Debido a que existen varios factores que intervienen en
el proceso de transformación genética de plantas, en este trabajo se realizó un
protocolo de optimización de transformación genética en Pentalinon andrieuxii
mediante Agrobacterium tumefaciens, modificando condiciones de transformación
como: densidad bacteriana, concentración de acetosiringona, tiempo de infección,
días de cocultivo y pH del medio de cocultivo para el incremento del porcentaje de
frecuencia de infección y porcentaje de transformación en brotes regenerados de
Pentalinon andrieuxii.
CAPÍTULO 1
1. GENERALIDADES DE LA EMPRESA
1.1. GENERALIDADES
1.1.1. DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA U ORGANIZACIÓN
El Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. (CICY) es una institución

que está en asociación con el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT), este consejo tiene la visión de impulsar y fortalecer el desarrollo
científico y la modernización tecnológica de México. El centro de investigación
tiene como enfoque principal la generación y explotación del conocimiento y el
desarrollo económico de los países, a través de la formación de recursos humanos
que puedan “generar nuevos productos, diseños, procesos, servicios, métodos u
organizaciones o de incrementar valor a los existentes” todo esto enfocado a los
diferentes campos de investigación que este centro ofrece. Con esto se pretende
lograr ventajas competitivas en la economía, que le permita alcanzar un
crecimiento económico sustentable.
Brinda apoyos a través de procesos, tanto a los investigadores como a las

empresas, con el propósito de facilitar la transición del laboratorio al sector
productivo. Dentro de los servicios se encuentran:
 Consultoría en temas relacionados con innovación y gestión de tecnología.

 Elaboración de propuestas para proyectos de innovación, proyectos
productivos y proyectos de transferencia de tecnología.
 Desarrollo de modelos de negocios con base tecnológica.
 Valoración económica de tecnologías.
 Capacitación en materia de gestión tecnológica y asesoría en registro ante
RENIECYT.
1.1.2. LOCALIZACIÓN
El Centro de Investigación Científica de Yucatán se localiza en la calle 43 No. 130

x 32 y 34 de la colonia Chuburná de Hidalgo en Mérida, Yucatán, México
(Ilustració1).
Ilustración 1.Ubicación geográfica del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Fuente: Google maps
1.1.3. GIRO DE LA EMPRESA
Investigación Científica Tecnológica
1.1.4. MISIÓN Y VISIÓN
Misión. Realizamos investigación científica, formamos recursos humanos,

divulgamos conocimiento, desarrollamos y transferimos tecnología e impulsamos
el desarrollo de la sociedad en armonía con el medio ambiente.
Visión. Ser una institución líder, reconocida local, nacional e internacionalmente,

innovadora en la generación y aplicación del conocimiento en beneficio de la
humanidad.
1.1.5. PRODUCTOS Y CLIENTES
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C (CICY), es un Centro Público

de Investigación que realiza investigación científica y tecnológica, forma recursos
humanos en las áreas de la biología vegetal, recursos naturales y de la ciencia de
los materiales, para el desarrollo sustentable del país, con la participación del
personal altamente calificado, el uso de tecnologías de frontera, la colaboración
con instituciones nacionales y extranjeras, y la vinculación con los diferentes
sectores de la sociedad. Las líneas de investigación que cuenta son: Bioquímica y
Biología Molecular de Plantas, Biotecnología, Materiales, Recursos Naturales,
Ciencias del Agua y Programa Institucional de Bioenergía. Programas
académicos: El CICY cuenta con dos posgrados, inscritos en el Padrón Nacional
de Posgrados del CONACYT (PNP). Ambos tienen programa de maestría y de
doctorado, y ofrecen la modalidad de doctorado directo. Los posgrados en
Ciencias y biotecnología de Plantas (Inaugurado en 1994) con tres opciones
terminales: Biología experimental, Biotecnología y Ecología, Sistemática y
evolución. Posgrados en Materiales Poliméricos (Iniciado en febrero de 2001).
Para realizar el enlace entre los sectores de la sociedad y el Centro, el CICY
cuenta con el área de vinculación y servicios: Laboratorio de Metrología,
Laboratorio GeMBio, Jardín Botánico regional Xítbal neek, Laboratorio del
Microscopio Electrónico de Barrido, Herbario U Najil Tikin Xiw.
CAPÍTULO 2.
2. PROBLEMAS A RESOLVER
 Aumentar los porcentajes de frecuencia de infección.

 Incrementar el porcentaje de transformación.
2.1. OBJETIVOS
2.1.1. Objetivo General
Optimizar el protocolo de transformación genética de Pentalinon andrieuxii

mediada por Agrobacterium tumefaciens.
2.1.2. Objetivos específicos
• Obtener plántulas de Pentalinon andrieuxii en condiciones in vitro.
• Establecer la densidad óptica y el tiempo óptimo de cocultivo.
• Definir la concentración optima de acetosiringona usada en la suspensión

bacteriana.
• Seleccionar el tiempo de vacío idóneo en la agroinfiltración.
• Delimitar el pH para el tiempo de cocultivo
• Confirmar la presencia del gen reportero GUS mediante la prueba

histoquímica de β glucuronidasa
• Determinar el tipo de explante con mayor porcentaje de transformación.
• Evaluar la influencia de las condiciones de luz en la regeneración de

brotes.
2.2. JUSTIFICACIÓN
Pentalinon andrieuxii (Müll. Arg.) es una enredadera nativa de la península de

Yucatán, utilizada en la medicina tradicional maya para el tratamiento de distintas
afecciones, incluyendo en tratamiento de leshmaniosis cutánea (Domínguez
Carmona et al., 2010). En la búsqueda de metabolitos con actividad
antiprotozoaria de Pentalinon andrieuxii se han aislado e identificado esteroles,
cumarinas, y triterpenoides con actividad anticancerigena y leishmanicida por lo
que esta especie representa una fuente natural importante para extraer este tipo
de metabolitos con potencial aplicación en la industria farmacéutica. (Pan el al.,
2012).
La transformación genética de plantas es una herramienta que se ha ido

desarrollando en el transcurso de los últimos años, esta permite realizar
modificaciones en el genoma de las plantas para diversos fines, entre estos se
encuentra el incremento en la producción de determinados metabolitos que la
planta produce o el seguimiento de rutas de biosíntesis.
Pentalinon andrieuxii es un modelo susceptible a la transformación, pero los bajos

porcentajes de frecuencia de infección y frecuencia de transformación han
representado un problema en las investigaciones realizadas en esta especie.
Debido a esto en este trabajo se plantea la optimización de un protocolo de
transformación previamente establecido (Burgos, 2015) para incrementar los
porcentajes de frecuencia de infección y así esperar mejores resultados en
porcentajes de transformación.
CAPÍTULO 3.
3. MARCO TEORICO
3.1. PENTALINON ANDRIEUXII
La familia Apocynaceae está conformada por árboles, arbustos, hierbas y muy a

menudo bejucos, todos ellos de gran importancia ya que proporcionan muchos
usos económicos tales como plantas ornamentales, látex, alcaloides, entre otros
(Ordoñez, 2003). Dentro de la familia Apocynaceae se encuentra el genéro
Pentalinon, el cual tiene dos especies: Andrieuxii y P. lutem (Juárez et al., 2007).
Pentalinon andrieuxii (ilustración 2) es conocida comúnmente como bejuco de

víbora, bejuco guaco o contrayerba. Del género Pentalinon se tienen pocos
reportes en cuanto a su composición química. En la literatura se ha mencionado la
producción de cardenólidos, alcaloides pirrolizidínicos, triterpenos, esteroles
glicósidos y cumarinas (Domínguez-Carmona et al., 2010; Tillequin et al., 1993).
Ilustración 2.Pentalinon andrieuxii

Fuente: Elaboración propia
3.2. CLASIFICACIÓN BOTÁNICA
Cuadro 1. Clasificación Taxonómica del género Pentalinon andrieuxii.
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Gentianales
Familia Apocynaceae
Subfamilia Apocynoideae
Género Pentalinon
Especie Andrieuxii
Autor del nombre: (Müll. Arg.) B. f. Hansen &
Wunderlin, 1986
Fuente: Hansen & Wunderlin, 1986- IBUNAM: MEXU ” UNBIO: Colecciones Biológicas. 2008-10.13
3.3. CARACTERISTICAS TAXONÓMICAS
Es una planta trepadora leñosa o semi leñosa de hasta 6 m de largo (Melchor et

al, 2005). Tiene tallos pilosos-híspidos, hojas opuestas, pecíolos de 8 a 20 mm,
canalículado del lado adaxial, lámina elíptica de 5-10 cm de largo y de 2-6 cm de
ancho, corta y acuminado en el ápice, verde oscuro en el haz y gris verdoso claro
en el envés, tiene de 4 a 7 nervaduras secundarias que junto con las terciarias
forma un retículo fino conspicuo en el envés; inflorescencia en forma de cima
escorpioide arqueada, con algunas ramificaciones dicotómicas de hasta 25 cm de
largo, las cuales pueden tener hasta 15 flores, pedúnculo de 6 cm, pedicelos de 4
cm con unas brácteas diminutas; segmento de cáliz es ovado a deltoides de 3 a 6
mm, glabros provistos en la base de pocas o numerosas escamitas; corola de
color amarillo de 7 cm, tubo de 0.8 a 1.7 cm de largo y de 2 a 3 mm de ancho,
garganta de 2.5 a 3.5 cm de largo y hasta 12 mm de ancho, lóbulos oblicuos
ovados de 10 a 23 mm; folículos (ilustración 3) de 20 a 28 cm de largo y de hasta
7 mm de ancho; semillas numerosas (ilustración 3) subfusiformes de
aproximadamente 7 mm de largo y 1 mm de ancho color cafés, en el extremo se
ubica un vilano de hasta 2.5 cm en color café claro (ilustración 3) (Rzedowski et
al., 1998).
A C
Ilustración 3. A) Semillas, B) Vilano, C) Folículo de Pentalinon andrieuxii.

Fuente: Elaboración propia
3.4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA
Esta especie se encuentra distribuida principalmente en Centroamérica y las

Antillas (Morales, 2009). En México, se puede encontrar en los estados de
Campeche, Chiapas, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí,
Tabasco, Veracruz y Yucatán (Juárez et al., 2007).
Ilustración 4.Distribución geográfica de Pentalinon andrieuxii.

Fuente: (Juárez et al., 2007)
3.5. USOS Y APLICACIONES
Pentalinon andrieuxii es una planta usada en la medicina tradicional maya contra

las mordeduras de serpientes, dolores de cabeza, entre otras (Pulido, 1993). Del
género Pentalinon se tienen pocos reportes en cuanto a su composición química.
En la literatura se ha mencionado la producción de cardenólidos, alcaloides
pirrolizidínicos, triterpenos, esteroles glicósidos y cumarinas (Domínguez-Carmona
et al., 2010). Los primeros reportes con P. andrieuxii señalaron que éste posee
actividad antiinflamatoria, antileishmania y antidepresivo (Lezama-Dávila y Issac-
Marquez, 1994). Posteriormente se encontró que los extractos de metanol de las
raíces de P. andrieuxii presentan una potente actividad citotóxica frente a varios
géneros de Leishmania spp. (Chan-Bacab y Peña-Rodríguez, 2003).
Del extracto de hoja de P. andrieuxii se ha logrado extraer ácido betulínico, el cual

es un triterpeno pentacíclico de tipo lupano, que se ha reportado que tiene
actividad antibacteriana, antifúngica, antiplasmódica, antiinflamatoria, antimalárica,
anticancerígena y antiviral (Moghaddam et al., 2012). El ácido betulínico, junto con
acetato de ácido betulínico, el ácido betulínico metil éster y la betulina fueron
evaluados por su actividad antiprotozoaria. Los resultados mostraron que la
modificación de la posición C-3 aumenta la actividad leishmanicida mientras que la
modificación de C-3 y C28 disminuye la actividad (Domínguez-Carmona et al.,
2009).
En otras investigaciones realizadas con el extracto de la raíz de P. andrieuxii se

logró aislar los trinorsesquiterpenoides, urechitol A y B. Las estructuras se
identificaron mediante la interpretación de sus datos espectroscópicos y la
estereoquímica del urechitol A fue confirmada a través de un estudio de
cristalografía de rayos X (Yam-Puc et al., 2009).
Hiebert-Giesbrecht y colaboradores (2016) estudió la relación espaciotemporal de

la variación del ácido betulínico y urechitol A en tres etapas de crecimiento en
plantas silvestres de P. andrieuxii, evidenciando que la planta produce
constantemente ácido betulínico en las hojas. Sin embargo, el urechitol A fue
detectado en raíces en un momento determinado del ciclo de vida de la planta,
presentando una relación de mayor crecimiento y mayor acumulación de urechitol

A. Desafortunadamente, el momento específico de la aparición de este terpeno es
desconocido, lo cual deja interrogantes sobre su posible función ecológica.
3.6. CULTIVO IN VITRO
El cultivo in vitro es una técnica extremadamente útil para una rápida

introducción de nuevos clones, propagación y mantenimiento de plantas libres de
virus, para la conservación de germoplasmas y estudios fisiológicos. Podemos
definirlo como el cultivo de todo tipo de células, tejidos u órganos vegetales bajo
condiciones de esterilidad, con este sistema de cultivo se pueden regular todos los
factores que influyen en la producción y cultivo de especies vegetales desde los
requerimientos nutricionales, pasando por la luz, fotoperíodo, temperatura,
humedad, entre otros (Hartmann et al., 2002).
El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido para

abarcar tanto el cultivo aséptico de tejidos como el de células y órganos, dentro de
un grupo de técnicas que se fundamentan en principios como el de la
totipotencialidad de la célula vegetal propuesto por Haberlandt (1902) (Roca y
Mroginski, 1991).
Las técnicas de cultivos asépticos han contribuido no sólo a un mejor

entendimiento de los eventos de la diferenciación celular, sino a un mejor
aprovechamiento de tales eventos en la explotación más eficiente de las plantas.
En este último aspecto vale la pena mencionar los siguientes usos de las técnicas
de cultivo in vitro: a) mejoramiento genético; b) obtención de plantas libres de virus
y otros patógenos; c) conservación de germoplasma; d) introducción de especies y
variedades e) propagación masiva de especies y f) micropropagación (Roca y
MroginskI, 1991; Seemann,1993).
3.7. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS
La transformación de plantas usa una amplia gama de herramientas, mediante, las

cuales, es posible la introducción de información genética foránea, sin afectar las
cualidades agronómicas y de mercadeo de los cultivos. La transformación de
plantas se ha definido como la incorporación estable de genes foráneos y la

expresión de estos en las plantas transformadas (Sharma et al., 2002; Rommens,
2004).
3.8. SISTEMAS DE TRANSFORMACION GENETICA DE PLANTAS
Se han desarrollado diferentes métodos de transformación genética, con el

propósito de hacer más eficiente la transferencia de ADN hacia células o tejidos
vegetales. Se busca transformar una variedad más amplia de plantas con mejores
resultados. Los sistemas de transformación con los que se cuenta en la
actualidad, se clasifican en métodos indirectos y métodos directos, de acuerdo con
el mecanismo utilizado para la transferencia del material genético hacia la célula
vegetal (Mohan Babua et al., 2003; Rao et al., 2009).
3.8.1. MÉTODOS INDIRECTOS
Son métodos basados en la utilización de vectores biológicos, empleando sus

características naturales de patogenicidad en plantas, para la introducción de los
genes de interés al genoma vegetal (Veluthambi et al., 2003; Rao et al.,
2009).Entre estos métodos se encuentran:
 Sistema Agrobacterium: Debido a la capacidad y a la eficiencia de este

género en infectar diversos organismos vegetales surgió la idea de utilizar
Agrobacterium como mediador para la introducción de genes de interés en
plantas (Hellens & Mullineaux, 2000; Tzfira et al., 2004). La transformación
mediada por Agrobacterium fue el primer sistema de transferencia de genes
en producir una planta modificada genéticamente en 1983, cuando
reportaron la transferencia de genes bacterianos a plantas y de una especie
vegetal a otra (Valentine, 2003; Vasil, 2007).
 Vectores virales: Algunos virus que afectan especies vegetales han sido
empleados como vectores para la transformación de plantas, con el objetivo
de producir proteínas de interés, por la expresión transitoria de genes
foráneos, mediante la replicación de los virus en las plantas. Los virus
deben ser modificados para que sean capaces de transportar el gen de

interés al interior de la célula vegetal. Se han desarrollado dos estrategias
para la construcción de vectores virales (Gleba et al., 2004). En la más
empleada, el gen foráneo, es introducido dentro del virus completo, por lo
general, precedido por el promotor duplicado de la proteína de la cápside
del virus (promotor fuerte) o fusionado a ésta, para que el gen de interés
sea expresado como un RNA subgenómico separado. La segunda
estrategia y las más recientemente desarrollada, el virus es completamente
reconstruido eliminando o sustituyendo regiones virales, además de la
inserción del gen de interés. Finalmente, estos vectores virales pueden ser
empleados en la transfección de la planta, como una partícula viral madura
o como copias del vector viral (Gleba et al., 2007).
3.8.2. MÉTODOS DIRECTOS
Debido a la dificultad de transformar monotiledóneas por medio de Agrobacterium,

se desarrollan sistemas de transferencia de genes, en los que se emplean
procedimientos de naturaleza química, fisicoquímica y mecánica. El desarrollo de
estos métodos, se basó en las técnicas físicas usadas en la transformación de
células animales en cultivo (Danilova, 2007; Rao et al., 2009). Entre estos
métodos podemos encontrar:
 Liposomas: Están conformadas por varias bicapas de lípidos que

encapsulan agua o gas, poseen diámetros del orden de nanómetros, con
diferentes formas y tamaños. Los liposomas presentan características muy
similares a las membranas biológicas, con una tendencia natural a ligarse a
células y tejidos interactuando con estos por absorción, fusión o intercambio
lipídico. (Morigaki & Walde, 2007; Hotani et al., 2003).
 Biobalística: El término biobalística proviene de la unión de “biología y

balística”. Este método fue ideado y refinado en la década de 1980, por un
grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (E.U.) e introducido
por Sanford, en 1987, por primera vez. Esta técnica, se basa en la
utilización de microproyectiles recubiertos del DNA que se desea transferir,

que son disparados sobre los tejidos vegetales a altas velocidades,
atraviesan la pared y la membrana celular y llevan al interior de la célula los
genes de interés para su posterior integración en el genoma vegetal
(Sanford, 2000; Martínez et al., 2004; Vasil, 2007).
 Sonicación: Es un método nuevo de transferencia de genes, utilizado con

éxito en la transformación de tejidos vegetales, células intactas y
protoplastos. Se emplea ultrasonido con frecuencias superiores a 20 KHz,
para generar permeabilidad en las membranas, mediante la inducción de
poros transitorios, a través de los cuales, el DNA foráneo puede ingresar al
interior de la célula vegetal. Este fenómeno también es conocido como
Sonoporación. El dispositivo empleado para la producción de los pulsos de
ultrasonido empleados durante este proceso es conocido como sonicador
(Mehier Humberta et al., 2005; Deng et al., 2004).
 Electroporación: Con esta metodología, se busca permeabilizar las

membranas, mediante el aumento significativo de la conductividad eléctrica,
causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Las membranas,
se desestabilizan originando una pérdida temporal de la permeabilidad
produciendo poros reversibles, por los que se produce el paso de
macromoléculas, fuga de iones, escape de metabolitos y mayor absorción
de DNA, por parte de las células (Krassowska & Filev, 2007; Fox et al.,
2006).
 Microinyección: La microinyección es una de las técnicas más precisas

para la introducción de DNA foráneo o de macromoléculas dentro de los
compartimentos intracelulares específicos de las células. La microinyección
utiliza microcapilares o microagujas de vidrio y sistemas de microscopía
para depositar el DNA foráneo, en el interior de células vegetales. Además,
el hecho que junto al DNA desnudo se puedan inyectar otros elementos
genéticos, como plastidios, mitocondrias y cromosomas, hace de la

microinyección una técnica interesante y muy útil para la transformación de
plantas. El equipo que se requiere para realizar el proceso de
microinyección es llamado micro manipulador, compuesto por un
microscopio y por los accesorios de guía, para realizar desplazamientos
(Sharma et al., 2002; Holm et al., 2000)
 Microláser: El objetivo de esta metodología es la permeabilización de las

membranas, que se lleva a cabo mediante la utilización de un chorro de
microláser enfocado en el sistema de iluminación de un microscopio,
permitiendo así abrir orificios o poros transitorios en la pared celular y en la
membrana plasmática de las células vegetales, que se desean transformar.
Así, se facilita la posterior entrada del DNA foráneo hacia el interior de las
células. Como en este sistema no requiere de vectores o portadores del
DNA de interés, para el proceso de transformación, se pueden emplear
moléculas de DNA lineales (Kajiyama et al., 2007; Mohan Babua et al.,
2003).
Existe un gran número de métodos de transformación de plantas que se

encuentran disponibles para su uso, aunque la mayoría son muy poco utilizados
en el laboratorio. Los métodos más empleados son la transformación mediada por
Agrobacterium y la Biobalística, tanto para usos experimentales como para usos
comerciales. Aunque para muchos de estos métodos se deben realizar ensayos y
estudios para su optimización, empleando diferentes genotipos, puesto que la
mayoría presenta un gran problema, que es la baja eficiencia de transformación.
La eficiencia de estos sistemas está supeditada a los métodos de cultivo de tejido

que se empleen y a los avances que en esta área se tenga sobre el genotipo a
transformar (Holm et al., 2000).
3.9. AGROBACTERIUM COMO METODO DE TRANSFORMACION VEGETAL
Agrobacterium tumefaciens y sus especies relacionadas como A. rhizogenes y A.

vitis son patógenos reconocidos de plantas y tienen la capacidad de integrar
establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero

(Tzfira y Citovsky, 2000). Esta técnica está descrita en la ilustración 5.
Ilustración 5. Método de transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens

Fuente: (Petri et al., 2005)
En la actualidad la clasificación taxonómica de este grupo de bacterias se

encuentra establecida como se muestra en la cuadro 2.
Cuadro 2. Clasificación Científica de Agrobacterium tumefaciens
Dominio Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Alphaproteobacteria
Orden Rhizobiales
Familia Rhizobiaceae
Género Agrobacterium
Especies tumefaciens.
Fuente: Madigan et al., 2009.
3.10. PLÁSMIDO TI Y SU IMPORTANCIA
El plásmido Ti (ilustración 6) es una molécula de DNA circular de doble cadena y

de un tamaño de entre 200800 Kb. Contiene un origen de replicación (ori) que le
permite mantenerse de forma estable en la bacteria, el t-DNA o región de
transferencia, delimitada por dos bordes de 25 pares de bases (borde derecho y
borde izquierdo) y la región de virulencia (vir) necesaria para el procesamiento y
transferencia del t-DNA a la célula de la planta. El t-DNA codifica para las
hormonas de crecimiento citoquinina y auxina y para opinas que sirven de fuente
de alimento a la bacteria (Hernández, 2015).
Ilustración 6. Esquema de plásmido Ti.

Fuente: (Hernández, 2015)
Las células de A. tumefaciens inducen la formación de tumores solo cuando

contiene el plásmido Ti, dado que en él se encuentran las regiones codificantes de
una amplia gama de proteínas que la bacteria emplea en el establecimiento de la
relación simbiótica con la planta, como se muestra en la ilustración 5.
Tras la infección, de una parte de plásmido Ti denominada el DNA de

transferencia (T-DNA) se integra en el genoma de la planta. El T- DNA es el
portador de los genes para la formación del tumor, y también para la producción
de diferentes aminoácidos modificados denominados opinas (Madigan et al.,
2009).
La organización genética del plásmido Ti está dispuesta en mosaico donde las

regiones están más o menos bien conservadas. Globalmente, presenta una
estructura modular con genes de funciones similares agrupados juntos. Así, se
pueden definir cinco componentes (cuadro 3):
Cuadro 3. Organización genética del plásmido Ti.

Región T o ADNT
REGIÓN vir
LOCI tra y trb
REGIÓN rep
ADQUISICIÓN Y CATABOLISMO DE OPINAS
Fuente: (Madigan, et al., 2009)
3.10.1. Región T o ADN-T
Según Chilton et al., (1977), la región T, que codifica las secuencias específicas
tumorales de la planta huésped, es el segmento de ADN que se transfiere desde
la bacteria a la célula vegetal. Según Leemans et al., (1982), a diferencia de los
elementos transponibles que pueden moverse repetidamente, el ADN-T una vez
transferido permanece estable, y no codifica por sí mismo los productos que media
su transferencia. El tamaño del ADN-T varía según el tipo de plásmidos, pero sólo
los extremos, llamados bordes, se reconocen durante el proceso de transferencia
(Wang et al., 1984). Estos bordes están formados por 25 pb que flanquean la
región del ADN-T como repeticiones directas (Zambryski et al., 1982). Estas
secuencias borde dirigen la transferencia de forma polar, en dirección derecha-
izquierda, determinada por la orientación de los extremos repetidos, siendo el
borde derecho imprescindible para la formación del tumor (Wang et al., 1984).
3.10.2. Región vir
De acuerdo con Ying et al., 2008, la región vir consta de aproximadamente 10

operones (dependiendo plásmido Ti o Ri plásmido) que cumplen cuatro funciones
principales: (1) Detección compuestos fenólicos de las plantas para inducir la
expresión de los genes vir (vir A y virG). (2) procesamiento de T-ADN en el Ti o Ri
plásmido (vir D1 y vir D2), donde Vir D1 es una helicasa y vir D2 es una
endonucleasa. (3) Secretor T-ADN y vir proteínas para la bacteria a través de un
sistema de secreción tipo IV (virB operón y virD4). (4) eventos dentro de la célula
huésped con la participación del TDNA citoplasmático, la orientación nuclear, y la
integración en el genoma del huésped (virD2, virD5, virE2, virE3 y VirF).
3.10.3. Genes vir
Los genes de virulencia o región vir codificada por el plásmido Ti en una región
de 35 kb localizada fuera del T-DNA, pueden llegar a 25 genes vir diferentes
reunidos en 7 operones. Sin embargo, para que este proceso de transferencia
tenga lugar es necesario que, además de contar con una herida en la planta, ésta
sintetice una serie de compuestos que induzcan su expresión (Bolton et al., 1986)
Dentro de estos, Stachel et al en 1986, trabajando con Nicotiana tabacum,
identificaron de un grupo de compuestos que inducían la expresión de los genes
vir al añadir Agrobacterium a exudados de heridas practicadas a esta planta. Una
de las sustancias más activas, identificada como acetosiringona la cual puede
constituirse, dada su importancia, en un factor de estudio para al abordaje de
procesos infecciosos en plantas, derivados del grupo de las agrobacterias.
La inducción de los genes vir de Agrobacterium implica que el sistema de

reconocimiento de la bacteria detecte los compuestos fenólicos producidos por la
planta y transmita la información al interior de la célula bacteriana. Este proceso es
mediado por el producto de los genes vir A y vir G. Los inductores como la glucosa
o la acetosiringona son reconocidos por Vir A. Según Jin et al., (1990), la señal
percibida por Vir A provoca su autofosforilación en un residuo de histidina
específico y esta es transmitida posteriormente a Vir G por la fosforilación del
ácido aspártico 52 del dominio receptor de este.
3.10.4. LOCI tra y trb
Tra y trb dirigen la transferencia conjugativa del plásmido Ti, los dos loci
conforman el sistema de transferencia conjugativa. Basándose en la similitud con
otros sistemas de conjugación, el grupo de genes tra se necesita, probablemente,
para la transferencia y replicación del ADN, mientras que el trb forma el par de
apareamiento y dirige la síntesis del PILUS conjugativo (Hooykaas et al., 1980).
3.10.5. Región rep
Se requiere para la replicación del plásmido Ti. Para la replicación estable del
plásmido Ti en Agrobacterium se requieren tres genes. RepA y repB se encargan
de que durante la división celular, cada célula hija herede al menos una copia del
plásmido. El único imprescindible para la replicación vegetativa del plásmido es
repC. Las funciones de incompatibilidad entre plásmidos también están reguladas
por esta región. Se define como incompatibilidad la incapacidad de heredar dos
plásmidos determinados de forma estable, pudiendo coexistir dentro de la misma
célula antes de su replicación, así, los plásmidos del tipo Octopina son
incompatibles con los de Nopalina (Hooykaas et al., 1980).
3.10.6. Catabolismo de opinas
Según Llop (2003), los tumores tienen la característica de poseer un metabolismo

nitrogenado particular, debido a la posibilidad que tienen de sintetizar las opinas.
De modo que todas aquellas células de las plantas que secretan opinas como
resultado de la infección, son utilizadas por la bacteria como fuente de carbono
para su crecimiento y reproducción.
3.11. PROCESO DE INDUCCION TUMORAL
Los descubrimientos más importantes del proceso tumoral se basan en las

siguientes características: la tumorogénesis requiere la transferencia de
fragmentos de ADN oncogénico a células de la planta infectadas los cuales se
encuentran en la región ADN-T de plásmido TI; este proceso evolucionó a partir de
un sistema de transferencia conjugativa; los genes que dirigen este proceso se
expresan en respuesta a señales químicas que libera el huésped (Sheng y
Citovsky, 1996). Este proceso consta de los siguientes puntos:
1. Unión de las bacterias en la superficie de la célula huésped.
2. La inducción de los genes vir por las señales de la planta.
3. Producción de una copia de ADN-T.
4. Exportación y transporte al núcleo de la célula vegetal.
5. Integración de T-ADN en un cromosoma del huésped.
3.12. UNION DE LA BACTERIA A LA CÉLULA VEGETAL
Una vez que Agrobacterium llega a la herida se produce una débil unión inicial, de
forma polar y que es reversible según Matthysse (1983). Posteriormente, las
bacterias elaboran fibrillas de celulosa que las anclan firmemente a la superficie
del huésped (Matthysse et al .,1981) (ver ilustración 7).
Ilustración 7. Unión de Agrobacterium tumefaciens a la célula vegetal

Fuente: Recuperado en https://www.gettyimages.in/detail/photo/agrobacterium-tumefaciens-on-a-
tobacco-leaf-high-res-stock-photography/128562511
3.13. PRODUCCION DE UNA COPIA TRANSFERIBLE DE T-DNA
Según Yanofsky et al., (1986), una vez que los operones vir empiezan a
transcribirse se produce el proceso de síntesis de la cadena-T, las proteínas
codificadas por el operón virD reconocen las secuencias terminales que delimitan
el ADN-T. La proteína VirD1 pasa el ADN superenrollado a la forma desplegada
de acuerdo con Ghai y Das (1989) y, a continuación, VirD2 corta la cadena de
ADN inferior por los extremos repetidos en el plásmido del tipo Octopina cada
borde es cortado exactamente a cuatro nucleótidos de su extremo izquierdo y se
une covalentemente, a través de un residuo de tirosina 29, al extremo 5’ de cada
cadena rota (Ward y Barnes, 1988; Vogel y Das 1992). Mientras la cadena
superior permanece en forma de dúplex, aproximadamente la mitad de las
inferiores están en forma lineal de cadena simple y se denominan cadena-T
(Stachel et al., 1986). Se piensa que la cadena-T se forma por desplazamiento
durante la síntesis del ADN mediante el mecanismo de círculo giratorio “rolling-
circle” que se inicia a partir del extremo 3’ de cada borde derecho. La proteína
VirD2, que está fuertemente unida a la cadena-T, le confiere polaridad asegurando
que el extremo 5’ sea el que entre primero en el núcleo de la célula vegetal (Ver
ilustración 8). Este complejo ácido nucleico / proteína está compuesto por una
única molécula VirD2 que actúa de piloto gracias a sus secuencias tipo NLS unida
a un ADN de cadena simple que se denomina complejo-T (Howard et al., 1992;
Narasimhulu et al., 1996 y Zupan et al., 2000).
3.14. TRANSFERENCIA DEL COMPLEJO T A LA CELULA VEGETAL
En este proceso un segmento de ADN específico, el complejo-T, es reconocido y

movilizado, hasta la membrana bacteriana, para esto debe atravesar en primer
lugar la membrana y pared bacteriana y, posteriormente, la pared celular y la
membrana de la célula vegetal. Una vez en la célula vegetal debe moverse a
través del citoplasma y cruzar la membrana nuclear hasta llegar al núcleo de la
célula vegetal. VirD2 guía a la cadena-T a través del pilus compuesto por las
proteínas VirB y la proteína VirD4. Aunque se sabe que la formación del pilus es
imprescindible para la transformación, no se sabe si el complejo pasa a través de
él o si el pilus simplemente serviría como un gancho para acercar la bacteria a la

célula vegetal (Gelvin, 2000).
En el transporte hacia el núcleo también están implicadas diferentes proteínas de

las plantas como la carioferina según Ballas y Citovsky (1997) o la ciclofilina (Deng
et al., 1998 citado por Llop 2003) que interactúan con las secuencias NLS de las
proteínas Vir. Las ciclofilinas parece que mantienen a la proteína VirD2 en una
conformación adecuada para la transferencia, mientras el complejo-T se mueve
por el citoplasma (Ver ilustración 8).
Ilustración 8. Mecanismo de transformación de Agrobacterium tumefaciens.

Fuente: Recuperado en https://www.agromatica.es/agrobacterium-tumefaciens/
3.15. INTEGRACION DEL COMPLEJO T EN EL GENOMA NUCLEAR DE LA

PLANTA
La importación al núcleo del complejo VirD2- complejoT se da en conjunto con el

transporte de las proteínas VirE2, VirF y VirE3 (Schrammeijer et al., 2003). Las
proteínas VirD2 y VirE2 son las que median directamente el proceso de importe
nuclear del complejo-T (Citovsky; Warnick y Zambryski, 1994). En la célula
vegetal, VirD2 y VirE2 pueden interactuar con proteínas chaperonas que permiten
el importe nuclear del complejo-T y su integración. Las proteínas chaperonas
RocA, Roc4 y CypA al parecer mantienen la conformación de VirD2 durante el
importe nuclear del complejo-T y su integración (Deng et al., 1998). El importe
nuclear del complejo T es asistido por proteínas celulares del hospedero como
VIP1 que interactúa específicamente con VirE2. Elevados niveles de VIP1 en el
hospedero lo hacen más susceptible a la transformación con Agrobacterium
(Tzfira; Vaidya y Citovsky, 2002). También se ha encontrado que VirE3 puede
simular la función de VIP1, actuando como un adaptador entre VirE2 y la
Karioferina  celular asistiendo el importe nuclear del complejo TDNAVirE2.
Debido a que VIP1 no es una proteína abundante y representa un factor limitante
para la transformación, Agrobacterium puede haber desarrollado un sistema para
complementar, al menos parcialmente, la función de VIP1 (Lacroix et al., 2005).
3.16. FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA TRANSFORMACIÓN MEDIADA

POR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
La transferencia del ADN-T de A. tumefaciens y su integración en el genoma de la

planta durante el evento de transformación, está influenciada por varios factores.
Estos incluyen el tipo de explante, la edad del explante, el tiempo de cocultivo, la
concentración de la suspensión bacteriana, de la cepa de Agrobacterium que se
emplee, de la infiltración por vacío, los regímenes de selección y el cultivar
empleado (Alimohammadi y Bagherieh-Najjar, 2009; Karami et al., 2009).
3.16.1. Tipo de explante
El tipo de explante a utilizar en un evento de transformación depende del protocolo

de regeneración establecido para el cultivo. En este sentido, han sido utilizados
como explantes blancos: hojas, raíces, hipocótilos, callos y nudos cotiledonales,

con los cuales se han obtenido altas eficiencias de transformación (George et al.,
2008).
En estudios de transformación genética de Pentalinon andrieuxii mediante A.

tumefaciens se han empleado explantes de raíz, hipocótilo y hoja, obteniéndose
una frecuencia de transformación de 28% a 33% (Burgos, 2015).
3.16.2. Cepas de Agrobacterium tumefaciens
La eficiencia de la transformación genética depende de la cepa de A. tumefaciens

que sea utilizada. Entre estas, se encuentran diferencias que afectan su capacidad
de infección, tales como la virulencia, las diferencias en la estructura y
organización del ADN-T y los genes vir (Grant et al., 2003). Dicha respuesta está
relacionada con la probabilidad de aparición de diferentes genes de resistencia en
el hospedante susceptible (Martirena-Ramírez y Veitía, 2013).
3.16.3. Suspensión bacteriana
La concentración óptima de la suspensión de células de A. tumefaciens, es un

parámetro importante a tener en cuenta en la transformación. Cuando se utilizan
concentraciones bajas de la suspensión bacteriana puede disminuir la
transferencia de ADN, mientras que concentraciones altas pueden causar la
muerte del explante blanco (Martirena-Ramírez y Veitía, 2013).
3.16.4. Infiltración por vacío
La infiltración por vacío favorece la eficiencia de la transformación en plantas por

lo que ha sido muy utilizada en un gran número de especies (Wang y Pijut, 2014).
Mediante este proceder, el explante en contacto con una suspensión de A.
tumefaciens es sometido a una reducción de la presión de vacío. Esto facilita que
se introduzca la bacteria en el interior de la célula. La aplicación de vacío provoca
que los gases que se encuentran en el interior del explante salgan por los estomas
o las lesiones. Cuando se interrumpe el vacío y la presión es incrementada
rápidamente, la suspensión celular penetra al interior del explante y reemplaza los
gases. El vacío aumenta la exposición de las células de la planta a A. tumefaciens,

haciéndolas más susceptibles a la transformación (Sivanandhan et al., 2012).
3.16.5. Tiempo de precultivo
La eficiencia de transformación también se ve considerablemente afecta por el

período de precultvio y el cultivo conjunto. El precultivo induce la división celular
en el explante y los hace más receptivos a Agrobacterium y depende en gran
medida del momento de precultivo. Se ha informado que el precultivo de explantes
es un procedimiento útil en la transformación mediada por Agrobacterium de
varias especies de plantas (Kumar et al., 2009).
3.16.6. Condiciones de cocultivo
Las condiciones de cocultivo establecidas para un evento de transformación

influyen directamente en la eficiencia alcanzada en el proceso. De esta forma, fijar
parámetros como la duración y la temperatura en correspondencia con la cepa de
A. tumefaciens utilizada, contribuirá a la obtención de resultados satisfactorios.
La prolongación del tiempo de cocultivo por más de tres días incrementa la

frecuencia de transformación transitoria y subsecuentemente los incrementos en el
tiempo de cocultivo provocan un decrecimiento de la frecuencia de transformación
(Tazeen y Mirza, 2004). Por esta razón, se debe considerar que los períodos
largos de cocultivo disminuyen la supervivencia y regeneración de los explantes
(Naranjo et al., 2002).
3.16.7. Antibióticos
La transformación exitosa utilizando Agrobacterium no sólo depende de la

eficiencia de los sistemas de regeneración de la planta, sino también de la
eliminación subsiguiente de esta bacteria de las células transformadas. La
eliminación de Agrobacterium generalmente se logra agregando uno o más
antibióticos al medio de cultivo y es muy importante porque la presencia continua
de Agrobacterium puede presentar un problema para identificar transformantes o
interferir con el crecimiento y desarrollo de las células de plantas transformada o
causar la muerte al cultivo (Kamari, 2008). Los antibióticos como la cefotaxima., la
carbenicilina y la timentina se han utilizado regularmente en la transformación de

cultivos mediada por Agrobacterium después del cocultivo para suprimir o eliminar
Agrobacterium (Cheng et al., 2004).
3.17. MARCADORES GENÉTICOS
Los marcadores genéticos están agrupados en dos categorías: los marcadores de

selección y los detectables.
Los genes marcadores de selección son una herramienta indispensable en la

transformación genética puesto que permite seleccionar aquellas células, tejidos y
plantas que han sido transformados. Junto con el gen de interés que se quiere
introducir en las plantas, es necesario introducir a la par un gen marcador de
selección, normalmente de resistencia a un antibiótico, de manera que, si los
tejidos vegetales se desarrollan sobre un medio que contiene dicho antibiótico,
proliferarán aquellas células que han sido transformadas (López, 2011).
Los genes marcadores detectables son genes que, como su nombre indica,
codifican un producto que puede ser detectado rápidamente. En las células
vegetales, la actividad transcripcional puede variar e interactuar con cambios
ambientales, esto permite ejecutar pruebas rápidas para las funciones de
regulación transcripcional de los promotores y potenciadores de la incorporación
de un marcador genético que permite la detección histoquímica de la actividad
enzimática de los tejidos vegetales. Estos genes son llamados indicadores, ya que
pueden reportar la actividad bioquímica de ciertos elementos ubicados en las
células, tejidos o plantas enteras. Estos genes pueden marcar las células
transformadas con el propósito de investigar la expresión génica transitoria o para
establecer la transformación y plantas transgénicas. Un ejemplo es el gen GUS de
E. coli codifica la enzima β-glucuronidasa que se descompone en sustratos
histoquímicos como el 5-bromo-4-cloro-3-indol ~-0-glucurónido, en un compuesto
de color azul. Los genes de la luciferasa (LUC) codifican una enzima que cataliza
una reacción que produce luz en presencia de ATP, oxígeno y luciferina. Otras
alternativas son el gen Cat bacteriano que codifica la cloranfenicol
acetiltransferasa (CA T) y el gen LacZ que codifica para la 13-galactosidasa

(Wong, 2006).
3.18. GEN GUS
Es uno de los genes reporteros más utilizados el cual es obtenido de la bacteria

Escherichia coli. Este gen permite el monitoreo a corto plazo del resultado de la
transformación genética a partir de la producción de color azul en los explantes
transformados debido a la acción de la enzima β-glucuronidasa (codificada por
dicho gen) sobre el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolylglucurónico, más conocido
como X-Gluc. Una fusión del gen GUS con el promotor permite la visualización
espacial de la expresión génica y, por lo tanto, un análisis detallado de la
expresión específica de la célula dirigida por las actividades de la transcripción de
promotores individuales. Esta prueba de expresión transitoria se realiza con la
reacción histoquímica GUS (ilustracion 9), empleada como base para la
estandarización de protocolos de transformación eficiente (De Guglielmo, 2009).
Ilustración 9. Esquema de la reacción histoquímica GUS.

Fuente: González y Barrero, 2008
3.19. PLÁSMIDO PCAMBIA 2301
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se

encuentran naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos
genéticos extracromosomales se replican de manera independiente del
cromosoma bacteriano y codifican para una gran variedad de enzimas que

confieren resistencia a antibióticos y metales pesados, degradan complejos
orgánicos y/o producen toxinas, etc. Los plásmidos han sido empleados como
vectores o vehículos de clonación de moléculas de ADN foráneas que permiten el
transporte y manipulación del mismo. La estructura modular de todo plásmido
comprende básicamente de un origen de replicación autónomo que permite un alto
número de copias; genes de resistencia a antibióticos; marcadores de selección y
un sitio múltiple de clonación (Puerta et al., 2005).
Ilustración 10. Esquema del plásmido pCAMBIA 2301

Fuente: Recuperado en www.cambia.org/daisy/cambia/2067.htm
El plásmido pCAMBIA 2301 (ilustración 10), de 11633 pb, tiene su sitio de origen,
una región que le confiere resistencia a la kanamicina a la bacteria. Dentro de los
bordes izquierdo y derecho, se encuentra la región del ADN-T que es la parte que
se inserta en el genoma de la planta. En esta región está insertado el gen GUS
(UidA) que codifica para la enzima 13-glucuronidasa. El gen GUS posee el intrón
de la catalasa, el cual permite la expresión de la 13-glucuronidasa en células
eucariotas, de tal forma que al momento de realizar la prueba histoquímica se
asegura que no haya falsos positivos y realmente se esté observando un evento
de transformación transitoria del tejido vegetal. También dentro del ADN-T se
encuentra insertado el gen NPT/1, el cual codifica a la enzima neomicina
fosfotransferasa, que le confiere a la planta resistencia a la kanamicina. Ambos
genes están bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.
CAPÍTULO 4.
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para lograr los objetivos propuestos de este trabajo se diseñó una estrategia
experimental (ilustración 11) donde se describe de forma ordenada y resumida las
etapas del proyecto.
Ilustración 11.Estrategia metodológica.

Fuente: Elaboración propia.
4.2. LOCALIZACIÓN
La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio 26 de la unidad de Bioquímica y

Biología molecular de plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán.
4.3. OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
Los folículos de P. andrieuxii fueron colectados el 10 de abril del 2016 en Mérida,

Yucatán, México; las semillas fueron extraídas de los folículos secos, con vainas
de entre 20-35 cm, conteniendo entre 50-70 semillas cada una.
4.4. CEPA BACTERIANA
La cepa bacteriana de A. tumefaciens (LBA4404) utilizada para este trabajo fue

transformada con el plásmido pCAMBIA 2301 (resistencia a kanamicina) y fue
obtenida de Yam Puc (2009).
4.5. MEDIOS DE CULTIVO
Para el cultivo de Agrobacterium Tumefaciens se utilizó el medio (YEB), este

medio se basa en la fórmula descrita por Tianayan et al., (2004) El medio YEB se
usa ampliamente para el cultivo de especies de Agrobacterium y otros
microorganismos del suelo. El extracto de levadura y la peptona proporcionan
compuestos nitrogenados, complejo de vitamina B y otros nutrientes para el
crecimiento de Agrobacterium. El sulfato de magnesio mantiene el equilibrio
osmótico del medio. La composición de este medio se encuentra en el anexo 1.
Para el cultivo in vitro de tejidos vegetales se utilizará el medio PC que contiene

los micronutrientes y macronutrientes necesarios para el cultivo de tejidos
vegetales descritos por Phillips y Collins (1979) durante sus investigaciones de
nuevos reguladores del desarrollo vegetal. La composición de este medio se
encuentra en el anexo 2.
4.6. ASEPSIA Y GERMINACION DE SEMILLAS DE Pentalinon andrieuxii
El protocolo de asepsia empleado fue el propuesto por Yam Puc (2009) con
modificaciones de Yeseña Burgos (2015).
Primeramente se escogieron 100 semillas (aproximadamente 0.5 gr) utilizando la

prueba de flotación en agua, descartándose las semillas que flotaron, ya que
representan semillas vanas o secas. Estas se lavaron con extrán al 5% (v/v)
durante 5 minutos en agitación constante. Posteriormente se lavaron con etanol al
70 % (v/v) por 10 minutos. Después de este lavado se colocaron en una solución
de hipoclorito de sodio comercial a una concentración de 60%(v/v) durante 20
minutos y se volvieron a lavar con hipoclorito de sodio comercial al 50% por 10
minutos. Se hicieron 3 lavados con agua destilada estéril en agitación por un
minuto después de cada desinfectante y todo el proceso de desinfección se realizó
dentro de la campana de flujo laminar.
Antes de colocarse en los medios de cultivo para su germinación las semillas se

dejaron embebidas en agua estéril durante una hora. Para la germinación se
colocaron cinco semillas de P. andrieuxii en frascos de vidrio conteniendo 20 mL
de medio PC (Phillips y Collins, 1979) al 50 % de su concentración de sales y a un
pH de 5.5. Los frascos se incubaron durante 14 días en obscuridad a 25 °C y
posteriormente se pasaron a luz contínua a 25°C.
4.7. TRANSFORMACIÓN DE Pentalinon andrieuxii VIA Agrobacterium

tumefaciens
El protocolo de transformación base empleado fue el propuesto por Yeseña

Burgos (2015).
Primeramente se picó con un palillo estéril una colonia de la cepa Agrobacterium

tumefaciens a utilizar y se inoculó en un matraz de 50 ml conteniendo 20 mL de
medio YEB con antibióticos (Rifampicina 100μg/mL, Estreptomicina 100μg/mL y
Kanamicina 50 μg/mL) a pH 7.2, el cultivo se puso en un orbitador Labnet 211DS
durante 48 horas. Al terminar las 48 horas se tomó 2 mL del cultivo bacteriano y se
inoculó en un matraz de 250 mL estéril con 40 mL del medio YEB con antibióticos,
el cultivo se incubó en el orbitador por 24 horas. Al cultivo bacteriano de 24 horas

se le agregó 40 mL del medio YEB con una concentración final de Acetosiringona
de 100 μM y se colocó en el orbitador aproximadamente 4 horas. Después de 4
horas, se tomaron 2 ml del cultivo bacteriano y del medio YEB para medir la D.O.
en un espectrofotómetro Genesys 10 UV Thermo spectronic a una longitud de
onda de 600 nm. Cada muestra se depositó en una celda de cuarzo y se leyó por
separado. La D.O. utilizada fue de 0.6, si la densidad óptica se encontraba por
arriba de 0.6 era ajustada utilizando medio YEB.
Antes de las últimas 2 horas del cultivo de A. tumefaciens se cortaron los

explantes de hipocotílo y raíz y se separaron en frascos estériles. Los explantes
fueron cortados de aproximadamente 1 cm de longitud en cajas de Petri de vidrio
haciendo 3 ligeras heridas a lo largo del explante. Una vez cortados los explantes
se añadió el cultivo bacteriano y se les aplicó vacío dentro de un desecador por 15
minutos. Al concluir los 15 minutos se eliminó el excedente de cultivo bacteriano
con papel estéril y posteriormente los explantes se colocaron en cajas de Petri con
medio PC con TDZ (6.25 μΜ), se sellaron y se incubaron en un cuarto de cultivo
de oscuridad a una temperatura de 25°C± 2° por 3 días. Pasados los 3 días de
cocultivo se eliminó la bacteria de los explantes mediante un lavado con medio PC
líquido con 100 μg/ml de cefotaxima y agitación dentro de un matraz estéril de 250
ml durante 30 minutos, se le realizó un segundo lavado con medio PC líquido
durante 20 minutos. Posteriormente lo explantes se secaron con papel absorbente
estéril y se depositaron en medio PC semisólido de selección descrito en la cuadro
4. De los explantes totales se incubaron 50% en cuartos de fotoperíodo y 50% luz
continua (para la evaluación del efecto de exposición de luz en la formación de
brotes). Los testigos para este experimento pasaron por el mismo daño mecánico
y fueron sembrados en medio PC con agente de selección (Km) y sin agente de
selección para verificar el efecto inhibitorio del agente de selección en explantes
no transformados. Las resiembras se realizaron cada 30 días para el
mantenimiento de los explantes.
Cuadro 4. Concentración de antibióticos y reguladores de crecimiento en medio

de selección
Antibióticos y reguladores Hipocotílo Raíz

de crecimiento
TDZ (μM) 13.5 6.25
Kanamicina (Antibiótico de 12.5 7.5

selección) (μg/ml)
Cefotaxima (μg/ml) 50 50
Fuente: Acosta (2012); Burgos (2015)
PRUEBA HISTOQUÍMICA GUS PARA EVALUAR LA EXPRESIÓN TRANSITORIA
Pasados los días de cocultivo se procedió a analizar la expresión transitoria del

gen Gus en los explantes transformados de acuerdo a la metodología usada por
Stomp (1992).
Los explantes se lavaron con agua estéril y se colocaron en tubos Eppendorf de

1.5 ml y se agregó 1 ml de buffer de tinción [NaH2PO4 100 mM, EDTA 10 mM,
K3Fe(CN)6 0.5 mM, K4Fe(CN)6. 3H2O 0.5 mM y Triton X-100 0.2% a pH 7) y 25 µl
de sustrato X-Gluc (40mg/mL). Las muestras se incubaron a 37°C por 24 horas.
Transcurrido este tiempo se eliminó la solución de los tubos y se agregó 1 ml de

una solución de metanol-acetona (3:1) y se mantuvo por 48 horas a temperatura
ambiente o hasta que quedaron translúcidos. Los explantes se colocaron en porta
objetos para ser observados con ayuda del estereoscopio y se contaron cuantos
explantes presentaban coloración azul y el número de eventos de transformación
por explante.
Como controles negativos se utilizaron explantes a los cuales no se les aplicó el

proceso de transformación con Agrobacterium tumefaciens.
4.8. EVALUACIÓN DE D.O. Y DÍAS DE COCULTIVO
Se realizó la transformación utilizando dos tipos de explantes de Pentalinon

andrieuxii evaluando los días de cocultivo y D.O. descritos en la cuadro 5 para
encontrar las condiciones óptimas que favorecieran el proceso de transformación.
Las otras condiciones de transformación se mantuvieron de acuerdo al protocolo
descrito por Burgos, 2015.
Cuadro 5. Parámetros evaluados de días de cocultivo y densidad óptica.
Tipo de explante Densidad óptica Días de cocultivo

(600nm) evaluados
0.4. 1,2,3,4,5
0.6 1,2,3,4,5
Hipocotílo 0.8 1,2,3,4,5
1.0 1,2,3,4,5
0.4 1,2,3,4,5
0.6 1,2,3,4,5
Raíz 0.8 1,2,3,4,5
1.0 1,2,3,4,5
La prueba histoquímica de GUS se realizó cada uno de los días monitoreados

para evaluar la expresión transitoria del gen reportero y realizar el análisis
estadístico con los datos obtenidos.
4.9. EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA Y TIEMPO

DE VACÍO
Con base a los resultados obtenidos en la evaluación de densidad óptica y días de

cocultivo, se procedió a evaluar diferentes concentraciones de acetosiringona y
tiempos de vacío (cuadro 6) empleando estas nuevas condiciones. Las otras
condiciones de transformación se mantuvieron de acuerdo al protocolo descrito
por Burgos, 2015.
Cuadro 6. Concentraciones evaluadas de acetosiringona y tiempos de vacío.
acetosiringona (μM)
80 0
Concentración de
Tiempo de vacio
100 10
120 15
140 20
(min)
160 25
*En el tiempo de vacío cero se aplicaron 15 min de infección sin aplicar vacío
*El experimento fue evaluado en explantes de Hipocotílo y raíz
Pasado el tiempo de cocultivo se precedió a realizar la prueba histoquímica de

GUS para evaluar la expresión transitoria del gen reportero y realizar el análisis
estadístico con los datos recabados.
4.10. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL pH EN EL TIEMPO DE

COCULTIVO
En este experimento se evaluaron los efectos del pH y el estado físico del medio
de cocultivo después de la infección de los explantes. El experimento factorial
(5 × 3 × 3) tuvo cinco valores de pH, tres estados físicos del medio y tres tipos de
explantes evaluados (ver cuadro 7). Cada tratamiento consistió en
aproximadamente 50 explantes, siendo 10 explantes de control (no inoculados) y
el resto inoculado con A. tumefaciens. Se utilizaron 10 explantes inoculados para
pruebas histoquímicas, y el resto procedió a las etapas posteriores del protocolo
de evaluación.
Cuadro 7. Modelo experimental de los efectos del pH en el tiempo de cocultivo
Tipo de explante Estado físico del medio pH evaluado por medio de cocultivo
Semisólido} 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

Líquido agitado 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Hipocótilo Líquido sin agitar 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Semisólido 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Raíz Líquido sin agitar 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Semisólido 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Hoja Líquido sin agitar 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
Para el medio de cocultivo líquido los explantes se colocaron en matraces

Erlenmeyer de 125 mL con 25 mL de medio PC y TDZ (6.25 μΜ), se sellaron y se
incubaron en un orbitador Labnet 211DS durante 72 horas a 50 rpm (Líquido
agitado) a una temperatura de 25°C± 2° en condiciones de oscuridad, en el caso
de el cocultivo líquido sin agitar los matraces fueron puestos con las cajas de
cocultivo semisólido en una incubadora a las mismas condiciones de temperatura
y oscuridad.
Pasado el tiempo de cocultivo se precedió a realizar la prueba histoquímica de

Gus para evaluar la presencia del gen reportero. Los explantes restantes fueron
sembrados en relación 1:1 en medio de selección (ver cuadro 4) y en medio de
recuperación (Anexo 3) para visualizar si este último es necesario debido al daño
realizado al explante. Las muestras se incubaron a 25°C en condiciones de luz
continua.
4.11. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos obtenidos se procesaron estadísticamente mediante un análisis de

varianza simple (ANOVA). La determinación de grupos homogéneos y
significativamente diferentes se llevó a cabo mediante la prueba de Múltiples
Rangos con un nivel de confianza del 95 % Tukey HSD, usando el programa
Statgraphics 5 plus. Todos los experimentos realizados se hicieron con 3 réplicas
y 3 repeticiones.
CAPÍTULO 5.
5. RESULTADOS
5.1. OBTENCIÓN DE PLANTULAS in vitro DE Pentalinon andrieuxii
En los 5 lotes de semillas sembradas pertenecientes al lote colectado el 10 de

abril del 2016 en Mérida se obtuvieron valores similares entre los porcentajes de
germinación como se muestra en la cuadro 8.
Cuadro 8. Resultados de germinación de semillas de Pentalinon andrieuxii
Lote Número de % Germinación % Contaminación

semillas
sembradas
1 100 100 16
2 100 100 0
3 100 95 0
4 100 100 8
5 100 98 0
5.2. EVALUACIÓN DE CONDICIONES DE ILUMINACIÓN
Los explantes de Pentalinon andrieuxii transformados con el protocolo de Yeseña

Burgos 2015, iniciaron la formación de callos a partir de la cuarta semana de
incubación en medio selectivo. Estos callos presentaron distinta coloración y
tamaño a las 8 semanas después de la transformación como se puede observar
en la ilustración 12. También podemos observar que los explantes testigos
cultivados en medio con agente selectivo aún presentan formación de callo a
pesar de ser explantes no transformados, lo que posteriormente puede presentar
una fuga y generar brotes no transformados.
1 2 A B
3 4 C D
5 6 E F
Ilustración 12. Desarrollo de callos a las 8 semanas en fotoperiodo y luz continua. Los números
son en condiciones de fotoperiodo y las letras en luz continua. 1,A)Testigo hipocótilo en medio sin
antibiotico 2,B)Testigo raíz en medio sin antibiotico 3,C)Testigo hipocótilo en medio con antibiotico
4,D)Testigo raíz en medio con antibiotico 5,E) Explante transformado de hipocótilo y 6,F) Explante
transformado de raíz.
En cuanto al desarrollo de los callos los que presentaron mayor tamaño fueron los
callos de hipocótilo en condiciones de fotoperiodo y los de raíz en condiciones de
luz continúa como se puede apreciar en la cuadro 9.
Cuadro 9. Desarrollo de callos en condiciones de fotoperiodo y luz continúa
Tiempo de Explante % Color Consistencia Diámetro

exposición Formación Verde Amarillo Fenólico (cm)
a la luz de callos (%) (%) (%)
Fotoperiodo Hipocotílo 70 23.8 52.3 23.9 Compactos 2.71±0.69
Raíz 46.6 0 28.5 71.5 Friables 1.21±0.19
Luz Hipocotílo 36.6 0 9 91 Compactos 1.38±0.27
continua Raíz 86.6 46.1 38.4 15.5 Friables 1.97±0.43
5.3. PRUEBA HISTOQUÍMICA DE GUS
La prueba de GUS se utilizó para verificar la transformación transitoria de los

explantes empleados (ver ilustración 13). Primeramente se realizó la tinción en los
explantes transformados con el protocolo descrito por Burgos (2015) después de
los días de cocultivo para obtener el porcentaje de frecuencia de infección.
A B C D
Ilustración 13. Prueba histoquímica de GUS a explantes transformados con el protocolo descrito
por Burgos, 2015 A) Testigo hipocótilo, B) Testigo Raíz, C) Explante de hipocótilo transformado y
D) Explante de raíz transformado
En los explantes evaluados se obtuvieron valores similares de porcentajes de

infección para explantes de hipocótilo a los reportados por Burgos (2015). A
diferencia de los explantes de hipocótilo los explantes de raíz presentaron un
incremento significativo en el porcentaje de frecuencia de infección (ver cuadro
10), lo cual puede ser atribuido a que el proceso de transformación mediada por
Agrobacterium es muy susceptible a cualquier tipo de variable como la edad o la
forma de herir el explante.
Cuadro 10. Frecuencia de infección protocolo Burgos, 2015
Explante % frecuencia de % frecuencia de

Infección (Burgos, Infección (reproducción del
2015) protocolo Burgos, 2015)
Raíz 36.36 66.6
Hipocótilo 54.16 54.3
*%Frecuencia de infección: # de explantes (+) a la prueba de Gus / # total de explantes por 100
Posteriormente se realizó la tinción a los callos generados de los explantes

después de dos meses en medio de selección para confirmar la transformación,
pudiéndose observar callos positivos y negativos a la prueba de GUS para ambos

tipos de explante como se puede observar en la ilustración 14.
A B C
D E F
Ilustración 14. Prueba histoquímica de GUS a callos transformados con el protocolo descrito por
Burgos, 2015 a 2 meses después de la transformación. A) Testigo hipocótilo, B) Testigo Raíz, C)
Callo de hipocótilo positivo a GUS, D) Callo de hipocótilo negativo a GUS, E) Callo de raíz positivo
a GUS Y F) Callo de raíz negativo a GUS.
En los testigos evaluados (ver ilustración 12) se puede apreciar que los explantes
de ambos tejidos (raíz e hipocótilo) aún presentaron formación de callos en medio
de selección, esto es debido a que la concentración de kanamicina en el medio no
es letal para tejido no transformado. A este suceso se le puede atribuir el hecho de
que exista tejido no transformado que sobreviva al medio de selección.
Cuatro meses después de la transformación se realizó la prueba histoquímica de

GUS a los brotes regenerados con el protocolo de Burgos, 2015 (ver figura 15).
Los porcentajes de transformación obtenidos fueron similares a los resultados
previamente reportados (ver cuadro 11).
Cuadro 11. Frecuencia de transformación protocolo Burgos, 2015.
Explante % frecuencia de % frecuencia de

Transformación (Burgos, 2015) Transformación (reproducción)
Raíz 28.66 20
Hipocótilo 33.33 40
*%Frecuencia de transformación: # de brotes (+) a la prueba de Gus / # total de brotes por 100
Ilustración 15. Prueba histoquímica de GUS a brotes regenerados.T) Testigo; A) brote antes de la
prueba; B) brote regenerado positivo a GUS
5.4. MONITOREO DE DÍAS DE COCULTIVO Y DENSIDAD OPTICA
Los eventos de transformación en explantes de hipocótilo fueron aumentando

considerablemente al paso de los días de cocultivo, los mejores resultados se
obtuvieron de tres a cinco días usando una densidad óptica de 0.8 a 1.0 abs a 600
nm, entre estos rangos tanto de tiempo de cocultivo como densidad óptica no se
encontró diferencia estadísticamente significativa (ver grafico 1), por lo que se
consideraron otros factores como la eficiencia o la disminución de probabilidad de
contaminación para determinar el día y la densidad idónea para el proceso.
TRANSFORMACIÓN EN HIPOCOTÍLO
a DMS= 9.70008
TRANSFORMACIÓN/EXPLANTE
30
a ab
25 a
abc ab
20
EVENTOS DE
abcd abc abcd

abcd abcd abcd
15 abcd bcd
10 cd cd cd cd
d cd
5
0
D1 D2 D3 T D4 D5
DÍAS DE COCULTIVO
Densidad 0.4 Densidad 0.6 T Densidad 0.8 Densidad 1.0
Gráfico 1. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de hipocótilo.

*Como testigos se toman los valores establecidos por Burgos, 2015 (3 días de cocultivo y 0.6 D.O.)
El conteo de eventos de transformación en explantes de raíz se dividió en raíces

primarias y secundarias debido al difícil manejo de las raíces secundarias. En caso
de no presentar eventos de transformación, estas se descartarían. El
comportamiento observado en explantes de RP Y RS reflejó un comportamiento
similar a los explantes de hipocótilo (ver grafico 2 y 3).
TRANSFORMACÍON EN RAÍZ PRIMARIA DMS= 10.406

45
a a
a a
40 ab ab
35
30 efgh bc
EVENTOS DE
cd
25 cde
20
cdef defg
efgh
15 fgh
efgh
10 gh gh gh
5 h
h
0
D1 D2 D3 T D4 D5
DÍAS DE COCULTIVO
Gráfico 2. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de raíces primarias.

50
TRANSFORMACIÓN EN
a
RAÍZ SECUNDARIA
DMS=8.1819
a
ab ab
40 ab abc
abc bcd bcd
bcd bcde
30
EVENTOS DE
bcde
cdefcdef
20
def
10 ef ef
f f f
0
D1 D2 D3 T D4 D5
-10 DIAS DE COCULTIVO
Gráfico 3. Monitoreo de días de cocultivo y D.O. en explantes de raíces secundarias.
Los mejores resultados se obtuvieron de tres a cinco días usando una densidad
óptica de 0.8 a 1.0 abs a 600 nm en los dos tipos de explantes evaluados, por lo
que tomando en cuenta la eficiencia del proceso y la falta de una diferencia
estadística significativa entre estos rangos, se opto por 3 días de cocultivo y 0.8
abs a 600 nm, considerando que los períodos largos de cocultivo disminuyen la
supervivencia y regeneración de los explantes (Naranjo et al., 2002) y que
exposiciones altas de la bacteria con el explante puede dar como resultado la
muerte de este (Martirena-Ramírez y Veitía, 2013).
5.5. EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA Y TIEMPO

DE VACÍO
5.5.1. Concentración de acetosiringona
La acetosiringona es un compuesto fenólico producido cuando ocurre un daño

mecánico en células vegetales que induce la transcripción de los genes de
virulencia de Agrobacterium tumefaciens (Stachel et al., 1985). El incremento en la
concentración de acetosiringona mejoró claramente el número de eventos de
transformación por explante comparado con la concentración testigo del protocolo
establecido por Burgos, 2015. Los mejores resultados fueron obtenidos con
concentraciones de 140 μM y 160 μM presentando diferencia estadísticamente
significativa con las otras concentraciones evaluadas y un incremento del 100% en
el número de eventos de transformación por explante de hipocótilo en la
concentración testigo (ver gráfico 4).
TRANSFORMACIÓN EN HIPOCOTÍLO
DMS=7.5418
50
a
TRANSFORMACION/EXPLAN
40 a
30 b b
EVENTOS DE
20 b
TE
10
0
80 Μμ 100 μΜ T 120 μΜ 140 μΜ 160 μΜ
CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA
Gráfico 4. Efectos de la concentración de acetosiringona en transformación de explantes de

hipocótilo.
*Como testigos se toman los valores establecidos por Burgos, 2015 (100 μM de Acetosiringona).
Con respecto a los explantes de raíz ambos presentaron el mismo

comportamiento estadístico, pero el incremento en el número de eventos de
transformación con respecto al testigo no fue tan significativo como en explantes
de hipocótilo teniendo un incremento de 43% en RP y 31% en RS (Ver gráfico 5 y
6).
TRANSFORMACIÓN EN RAÍZ PRIMARIA DMS=10.312

80
TRANSFORMACION/EXPLANTE
a
60 a
b b
b
EVENTOS DE
40
20
0
80 Μμ 100 μΜ T 120 μΜ 140 μΜ 160 μΜ

raíces primarias.
RAÍZ SECUNDARIA
DMS= 9.8916
70 a
TRANSFORMACION/EXPLANT
a
60
50 b b b
40
EVENTOS DE
30
E
20
10
0
80 Μμ 100 μΜ T 120 μΜ 140 μΜ 160 μΜ
raíces secundarias.
En los tres tipos de explantes evaluados se puede observar que las

concentraciones de de 140 μM y 160 μM son diferentes estadísticamente a las
demás concentraciones evaluadas con el mayor número de eventos de
transformación por explante, por lo que para decidir entre ambas se consideró el
factor económico dando preferencia a la concentración de 140 μM.
Ha sido demostrado el papel beneficioso de la acetosiringona en la transformación

genética de diferentes especies, desde Arabidopsis (Sheikholeslam y Weeks,
1987) hasta citrange (Cervera et al., 1998) o manzano (James et al., 1993),
aunque cabe recalcar que todas las especies se comportan de diferente manera,
en el caso de Pentalinon andrieuxii la concentración de acetosiringona en el medio
de cultivo de la bacteria contribuye en gran manera a la transcripción de los genes
de virulencia de Agrobacterium tumefaciens.
5.5.2. Tiempo de vacío
La infiltración con vacío durante la incubación con la suspensión bacteriana tiene

como fin facilitar la penetración de Agrobacterium en las heridas realizadas al
explante, para elevar así el porcentaje de frecuencia de transformación. En este
experimento se probaron diferentes tiempos de vacío para evaluar el efecto de
este en los eventos de transformación por explante. Los ensayos histoquímicos
mostraron mejores resultados a 20 y 25 min, siendo diferentes estadísticamente a
los otros tiempos de vacio restantes y al testigo en explantes de RP y RS (ver
gráfico 8 y 9). En explantes de hipocótilo el comportamiento fue distinto ya que
solo hubo diferencia significativa con el tratamiento a 0 min de vacío, aún cuando
la DMS del explante es la menor del tratamiento (ver gráfico 7).
HIPOCÓTILO DMS= 5.48511

25 a a a
20
a
15
EVENTOS DE
b
10
5
0
0 min 10 min 15 min T 20 min 25 min
TIEMPO DE VACIO
Gráfico 7. Efectos de los tiempos de vacío en transformación de explantes de hipocótilo.

*Como testigos se toman los valores establecidos por Burgos, 2015 (15 min de vacío)
El uso de la agroinfiltración en el protocolo ha sido referido como un método
efectivo en la transformación genética de cultivos como el frijol (Liu et al., 2005),
algodón (Leelavathi et al., 2004) y café (Canche-Moo et al., 2006). Así, al
sumergirse los explantes en una suspensión bacteriana líquida y ser sometida a
una disminución de presión, se logra incrementar la eficiencia en la introducción
de la bacteria al interior del tejido vegetal.
RAÍZ PRIMARIA DMS=6.33654

70
a a
60
50
b b b
40
EVENTOS DE
30
20
10
0
TIEMPO DE VACIO
Gráfico 8. Efectos de los tiempos de vacío en transformación de explantes de raíces primarias

RAÍZ SECUNDARIA
DMS=10.7598
70 a
a
60
50
b
EVENTOS DE
40 b b
30
20
10
0
TIEMPO DE VACIO
Gráfico 9. Efectos de los tiempos de agroinfiltración en transformación de explantes de raíces

secundarias.
Tomando en cuenta los eventos de transformación por explante se optó por un

tiempo de vacío de 20 min debido a que si no hay diferencia significativa entre 20
y 25 min se toma en cuenta la posibilidad de que la técnica de vacío aplicada para
este caso pueda causar una laceración al tejido durante la infiltración, lo cual no
permita una adecuada recuperación del explante.
5.6. EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DEL pH EN EL TIEMPO DE COCULTIVO

Los factores estudiados mostraron una interacción significativa tanto para el
porcentaje de frecuencia de infección como para el número de eventos de
transformación por explante. Los 45 tratamientos evaluados presentaron un 100%
de frecuencia de infección, pero se observaron combinaciones más favorables a la
infección para medios con valores de pH de 7.0 y 7.5 en medio de cocultivo
líquido agitado y líquido sin agitar, logrando en un 80% de los explantes evaluados
la tinción total del explante (ver cuadro 12, 13 y 14).
Entre los medios ajustados a un pH de 5.5, 6.0 y 6.5 las combinaciones más
favorables ocurrieron en medio de cocultivo líquido agitado y líquido sin agitar
presentando tinciones en segmentos largos del explante y por puntos azules.
Las tratamientos con resultados menos favorables fueron los del tratamiento
semisólido, que aunque el porcentaje de infección fue de 100%, la superficie
teñida del explante es mucho menor en comparación con los del tratamiento
líquido, esto puede ser debido a que en medio líquido se tiene mayor interacción
explante- microorganismo.
Cabe recalcar que el crecimiento de A. tumefaciens fue directamente proporcional

al incremento del pH del medio de cocultivo (ver ilustración 16), dado que el pH
optimo de la bacteria es 7.2 se presentó mayor área del explante transformada en
los pH cercanos a ese valor por lo que los resultados pueden ser atribuidos al
crecimiento excesivo de A. tumefaciens durante el tiempo de cocultivo y no por la
propia condición de los medios de cultivo.
Ilustración 16. Efecto del pH en el crecimiento de Agrobacterium tumefaciens.
Dado que el comportamiento de Agrobacterium es similar tanto en pH 7.0 como

pH 7.5 se opta por el pH más cercano al pH óptimo del explante (5.5), procurando
así mantener un balance entre ambos para una mejor interacción.
Para evitar gradientes de concentración de las sales en el medio las cuales son
precipitadas con aumentos de pH, se favorece al coculcultivo en líquido agitado.
Cuadro 12. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes de raíz.
pH Sólido Liquido agitado Liquido sin agitar
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
Cuadro 13. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes hoja.
pH Solido Liquido agitado Liquido sin agitar
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
Cuadro 14. Efectos del pH del medio de cocultivo en explantes de hipocótilo.
pH Solido Liquido agitado Liquido sin agitar
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
5.7. EVALUACIÓN DE MEDIO DE SELECCIÓN Y MEDIO DE RECUPERACIÓN
En este experimento se evaluó la necesidad de un medio de recuperación

posterior al proceso de transformación en los explantes del experimento de pH
dado que con los cambios realizados al protocolo como el incremento en la
densidad de la suspensión bacteriana en el proceso de transformación, el
incremento del tiempo de vacío y el cambio de pH en el medio de cocultivo pueden
ocasionar daños severos a los explantes que dificulten su proceso de
regeneración (Martirena Ramírez y Veitía, 2013; Wang y Pijut, 2014; Tazeen y
Mirza, 2004).
Un mes después de la transformación se evaluaron los efectos del medio de

selección y medio de recuperación en la regeneración de callos. En la cuadro 15
se puede observar el desarrollo de callos en los explantes con mejores y peores
resultados obtenidos de la prueba de GUS (pH 7.0 y 5.5 respectivamente). En la
mayoría de los explantes cultivados en medio de selección se presenta
fenolización total de explantes y un bajo progreso en la generación de callos a
pesar que en pH 7.0 según la prueba de GUS muestra la tinción total en la
mayoría de sus explantes (ver cuadro 12, 13 y 14) por lo que se espera que estos
sobrevivan en su gran mayoría al proceso de selección. En el caso de los
explantes sembrados en medio de recuperación se puede observar una mejor
respuesta a la desdiferenciación celular en los tres tejidos evaluados
observándose una regeneración notoria en los explantes expuestos a pH 5.5 y en
medio semisólido, demostrando así que al incrementar el pH y el área de contacto
del explante con la bacteria se incrementa el daño ocasionado al material vegetal
por lo que aunque este haya sido transformado le será muy difícil poder
regenerarse en un medio con antibióticos.
Tomando en cuenta las observaciones anteriores se sugiere el uso de un periodo

de recuperación previo al de selección.
Cuadro 15. Evaluación de medio de selección y medio de recuperación
pH Explante Medio de selección Medio de recuperación

Semisólido Líquido Liquido sin Semisólido Líquido Liquido
agitado agitar agitado sin agitar
5.5 Raíz
7.0 Raíz
5.5 Hoja
7.0 Hoja
5.5 Hipocótilo
7.0 Hipocótilo
6. CONCLUSIONES
• Se estableció que la densidad óptica 0.8 a 600 nm de la suspensión de A.

tumefaciens a tres días de cocultivo son las variables adecuadas para
realizar la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens
en Pentalinon andrieuxii.
• Se determinó que 140 μM es la concentración óptima de acetosiringona a

usar en la suspensión bacteriana con un tiempo de 20 minutos en
agroinfiltración.
• Se delimito que el rango de pH a utilizar en el medio de cocultivo se

encuentra de 7 a 7.5 para favorecer la interacción explante-bacteria.
• Se determinó que el mayor número de eventos de transformación se tiene

en explantes de raíz.
• Se diagnosticó que en condiciones de fotoperiodo existe un mayor

desarrollo de callos de hipocótilo y que en condiciones de luz continua se
favorece a callos de raíz.
Con el protocolo optimizado se obtiene un 100% de frecuencia de infección en

ambos explantes partiendo de un 36.36% en explantes de raíz y un 54.16% en
explantes de de hipocótilo. Cabe recalcar que para la toma de estas decisiones se
consideró únicamente el porcentaje de frecuencia de infección pero es de suma
importancia considerar el porcentaje de transformación y regeneración de brotes
para tomar una decisión con mayor validez.
BIBLIOGRAFÍA
1. BURGOS M. (2015) Transformación genética de Pentalinon andrieuxii con

el gen truncado de la HMGR de Arabidopsis thaliana. Disponible desde
Internet en:
2. CERVERA M., PINA J.A., JUÁREZ J.A., NAVARRO L. Y PEÑA L. (1998)
Agrobacterium-mediated transformation of citrange: factors affecting
transformation and regeneration. Plant Cell Reports, 18: 271-278.
3. CHILTON, M. D., SAIKI, R. K. (1980). T-DNA from Agrobacterium Ti
plasmid is in the nuclear DNA fraction of crown gall tumour cell. Proc Natl
Acad Sci USA 77: 4060-4064. (FAO, 2001).
4. CITOVSKY V., WARNICK D., AND ZAMBRYSKI P. (1994). Nuclear import
of Agrobacterium VirE2 protein with single stranded DNA:implications for the
TDNA transfer process. Proceedings of the National Academy of Sciences
USA. 91: 3210-3214.
5. DANILOVA, S. (2007). The technologies for genetic transformation of
Cereals. Russian J. Plant Physiol. 54(5):569-581.
6. DENG W., CHEN LISHAN., WOOD DEREK W., METCALFE TRACEE,
LIANG XIAOYOU, GORDON MILTON P., COMAI LUCA AND NESTER
EUGENE W. (1998). Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host
cyclophilins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 95:
7040-7045.
7. DENG, CH.; SIELING, F.; PAN, H.; CUI, J. (2004). Ultrasound-Induced Cell
Membrane Porosity. Ultrasound Med. & Biol. (Holanda). 30(4):519-526.
8. DOMÍNGUEZ-CARMONA, D. B., ESCALANTE-EROSA, F., GARCÍA-
SOSA, K., RUIZ-PINELL, G., GUTIERREZ-YAPU, D., CHAN-BACAB, M.
J., Y PEÑA-RODRÍGUEZ, L. M. (2010). Antiprotozoal activity of betulinic
acid derivatives. Phytomedicine : International Journal of Phytotherapy and
Phytopharmacology, 17(5), 379–82.
http://doi.org/10.1016/j.phymed.2009.08.002
9. FOX, M.; ESVELD, D.; VALERO, A.; LUTTGE, R.; MASTWIJK, H.;
BARTELS, P.; VAN DEN BERG, A.; BOOM, R. (2006). Electroporation of
cells in microfluidic devices: a review. Anal Bioanal Chem. (Alemania). 385:

474-485.
10. GLEBA, Y.; MARILLONNET, S.; KLIMYUK, V. (2004). Engineering viral
expression vectors for plants: the ‘full virus’ and the ‘deconstructed virus’
strategies. Curr. Opinion Plant. (Holanda). 7:182-188.
11. GLEBA, Y.; KLIMYUK, V.; MARILLONNET S. (2007). Viral vectors for the
expression of proteins in plants. Curr. Opinion Biotechn. (Holanda). 18:134-
141.
12. GONZÁLEZ, P Y BARRERO, C.(2008).¿Podemos pintar los genes de las
plantas?. Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas. Universidad
Politécnica de Madrid.
13. HARTMAN, H; KESTER, D; DAVIES, F y GENEVE, R . (2002). Plant
Propagation. Principles and Practices. New Yersey, Estados Unidos.
Prentice Hall. 880p.
14. HELLENS, R.; MULLINEAUX, P. (2000). A guide to Agrobacterium binary
Ti vectors. Trends Plant Sci. Rev. 5(10):446-451.
15. HOLM, P.; OLSEN, O.; SCHNORF, M.; BRINCHPEDERSEN, H.;
KNUDSEN, S. (2000). Transformation of barley by microinjection into
isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. (Holanda). 9:21-32.
16. HOOYKAAS, P. J., DEN DULK-RAS, H., OOMS, G., SCHILPEROORT, R.
A. (1980). Interactions between octopine and nopaline plasmids in
Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 143:1295-1306.
17. HOTANI, H.; INABA, T.; NOMURA, F.; TAKEDA, S.; TAKIGUCHI, K.;
ITOH, T.J.; UMEDA, T.; ISHIJIMA, A. (2003). Mechanical analyses of
morphological and topological transformation of liposomes. BioSystems
(Holanda). 71:93-100.
18. JIN, S., PRUSTI, R. K., ROITSCH, T., ANKENBAUER, R. G., NESTER, E.
W. (1990). Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium
tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: essential role in
biological activity of VirG. J Bacteriol 172:4945-4950.
19. JAMES D.J., URATSU S.L., CHENG J., NEGRI P., VISS P. Y DANDEKAR
A.M. (1993) Acetosyringone and osmoprotectans like betaine or proline
synergistically enhance Agrobacterium-mediated transformation of apple.
Plant Cell Reports, 12: 559-563.
20. JUÁREZ-JAIMES V., ALVARADO-CARDENAS L., VILLASEÑOR J.
(2007).La familia Apocynaceae sensu lato en México: diversidad y
distribución. Revista Mexicana de biodiversidad 78: 459-482
21. KAJIYAMA, S.; INOUE, F.; YOSHIKAWA, Y.; SHOJI, T.; FUKUSAKI, E.;
KOBAYASHI, A. (2007). Novel plant transformation system by gene-coated
gold particle introduction into specific cell using ArF excimer laser. Plant
Biotechn. (Japón). 24:315-320
22. KRASSOWSKA, W.; FILEV, P. (2007). Modeling electroporation in a single
cell. Biophys. J. (Estados Unidos). 92:404-417
23. LEEMANS, J., DEBLAERE, R. WILLMITZER, L., DEGREVE, H.,
HERNALSTEENS, J. P., VAN MONTAGU, M.,SCHELL, J. (1982). Genetic
identification of functions of TL-DNA transcripts in octopine crown galls.
EMBO J. 1: 147-152.
24. LACROIX B., LACROIX B., VAIDYA M., TZFIRA T., CITOVSKY V. (2005).
The VirE3 protein of Agrobacterium mimics a host cell function required for
plant genetic transformation. EMBO Journal 24: 428–437.
25. LEZAMA-DÁVILA C., LSAAC-MÁRQUEZ, A. P., ZAMORA-CRESENCIO,
P., UC-ENCALADA, M. R., JUSTINIANO-APOLINAR, S. Y., ANGEL-
ROBLES, R., SATOSKAR, A., HERNÁNDEZ-RIVERO, L. (2007).
Leishmanicidal activity of Pentalinon andrieuxii. Fitoterapia. 78, 255-257.
26. LI L., JIA Y., HOU Q., CHARLES T. C., NESTER E. W., PAN S. Q. (2002).
A global pH sensor: Agrobacterium sensor protein ChvG regulates acid-
inducible genes on its two chromosomes and Ti plasmid. Proceedings of
The Natural Academy of Science. 99(19): 12369–12374.
27. LLOP, P, (2003). Caracterización molecular de la pérdida del poder
patógeno en Agrobacterium tumefaciens. Valencia. Instituto Valenciano de
Investigaciones Agrarias. Pp 3,31.
28. DAVID MADIGAN, PAUL E. STANG, JESSE A. BERLIN, MARTIJN

SCHUEMIE, J. MARC OVERHAGE, MARC A. SUCHARD, BILL
DUMOUCHEL, ABRAHAM G. HARTZEMA, AND PATRICK B. RYAN
(2009). Biología de los microorganismos. Pág 801
29. MARTÍNEZ, M.; CABRERA, J.; HERRERA, L. (2004). Las plantas
transgénicas: una visión integral. e-Gnosis Revista digital. Ciencia y
Tecnología (Méjico). Disponible desde Internet en: www.e-gnosis.udg. mx
(con acceso 08/10/2011).
30. MEHIER-HUMBERTA, S.; BETTINGERB, T.; YANB, F.; GU, R. (2005).
Ultrasound-mediated gene delivery: Kinetics of plasmid internalization and
gene expression. J. Controlled Release. (Holanda). 104:203-211.
31. MELCHOR P., CARBALLO J., HERNÁNDEZ U. (2005). Posible actividad
biológica del extracto de la raíz de Pentalinon andrieuxii. Universidad del
Valle de México. Dirección General Académica. Episteme No.3. Dirección
Institucional de Investigación e Innovación Tecnológica. UVM - Campus
Chapultepec.
32. MOHAN BABUA, R.; SAJEENAB, A.; SEETHARAMANB, K. (2003).
Advances in genetically engineered (transgenic) plants in pest management
an over view. Crop Prot. (Holanda). 22:1071-1086.
33. MOGHADDAM M., AHMAD F., SAMZADEH-KERMANI A. (2012).
Biological activity of betulinicacid: A review. Pharmacology & Pharmacy, 3,
119-123
34. MORIGAKI, K.; WALDE, P. (2007). Fatty acid vesicles. Curr. Opinion
Colloid & Interf. Sci. (Holanda).12:75-80.
35. VASIL, I. (2007). A short history of plant biotechnology. Phytochem. Rev.
(Holanda). 7:387-394.
36. VALENTINE, L. (2003). Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The
David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiol. 33: 948-955.
37. ORDOÑEZ, S. (2003) Evaluación del efecto cicatrizante de las hojas y
raíces de Rauwolfia tetraphylla L. (Chalpupa) en heridas producidas a ratas
albinas. Informe de tesis de grado, pag 6.
38. PULIDO, M.T., SERRALTA, L. (1993), Lista anotada de las plantas

medicinales de uso actual en el estado de Quintana Roo, México; Centro de
investigaciones de Quintana Roo. Chetumal, Quintana Roo, México, p. 105.
39. RAO, A.; BAKHSH, A.; KIANI, S.; SHAHZAD, K.; SHAHID, A.; HUSNAIN,
T.; RIAZUDDIN, S. (2009). The myth of plant transformation. Biotechn. Adv.
27:753-763. 59. ROMMENS, C. 200.
40. ROCA, W.M. y MROGINSKI L.A. (1991). Cultivo de Tejidos en la
Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. Cali, Colombia. Centro
Internacional de Agricultura Tropical. 969p.
41. ROMMENS, C. (2004). All-native DNA transformation: a new approach to
plant genetic engineering. Trends Plant Sci. 9(9):457-464.
42. RZEDOWSKI J., CALDERON G. (1998). Flora del bajío y regiones
adyacentes. Fascículo 70, 27-28.
43. SANFORD, J. (2000). The development of the biolistic process. In Vitro
Cell. Dev. Biol. Plant. 36:303-308.
44. SCHRAMMEIJER B., DULK-RAS A., ANNETTE C., VERGUNST A. C.,
JURADO J. E., AND HOOYKAASA P. (2003). Analysis of Vir protein
translocation from Agrobacterium tumefaciens using Saccharomyces
cerevisiae as a model: evidence for transport of a novel effector protein
VirE3. Nucleic Acids Research. 31(3): 860- 868.
45. SEEMANN, P. (1993). Utilización de técnicas de micropropagación. In:
Barriga, P. y Neira, M. (eds). Avances en Producción y Sanidad Vegetal.
Valdivia, Chile. Universidad Austral de Chile, Instituto de Producción y
Sanidad Vegetal. pp: 87- 109.
46. SHARMA, K.; SHARMA, H.; SEETHARAMA, N.; ORTIZ, R. (2002).
Development and deployment of transgenic plants: biosafety considerations.
In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. (Holanda). 38:106-115.
47. SHEIKHOLESLAM S.N. Y WEEKS D.P. (1987) Acetosyringone promotes
high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by
Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology, 8: 291-298.
48. STACHEL S.E., MESSENS E., VAN MONTAGU M. Y ZAMBRYSKI P.

(1985) Identification of the signal molecules produced by wounded plant
cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature,
318: 624-629.
49. STACHEL, S.E., Y NESTER, E.W. (1986). The genetic and transcriptional
organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium
tumefaciens. EMBO J. 5: 1445-54.
50. STOMP, A-M (1992) Histochemical localization of B-glucuronidase. In
Gallagher, S.R.., ED “ Gus protocols: Using the GUS gene as a reporter of
gene expression.” pag 102.
51. TIANYAN SONG, CLAUDIA TOMA, NOBORU NAKASONE AND
MASAAKI IWANAGA. (2004). Aerolysin is activated by metalloprotease in
Aeromonas veronii biovar sobria J Med Microbiol 53, 477-482
52. TRINIDAD S. MARTÍN (Junio 2008). Plantas transgénicas.
http://www2.uned.es/expertobiotecnologiaalimentos/TrabajosSelecc/Trinida
dSanchez.pdf. 39.
53. TZFIRA T., AND CITOVSKY V. (2000). From host recognition to T-DNA
integration: the function of bacterial and plant genes in the Agrobacterium -
plant cell interaction. Molecular Plant Pathology. 1(4) 202212.
54. TZFIRA, T.; CITOVSKY, V. (2002). Partners-in-infection: host proteins
involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium. Trends Cell
Biol. (Estados Unidos). 12(3):121-129
55. VASIL, I. (2007). A short history of plant biotechnology. Phytochem. Rev.
(Holanda). 7:387-394
56. VELUTHAMBI, K.; GUPTA, A.; SHARMA, A. (2003). The current status of
plant transformation Technologies. Current Sci. (India). 84:368-380.
57. VERPOORTE R., CONTIN A., MEMELINK J (2002) Biotechnology for the
production of plant secondary metabolites. Phytochem. Rev. 1: 13-25.
58. WANG, K., GENETELLO, C., VAN MONTAGU, M., ZAMBRYSKI, P. C.
(1987). Sequence context of the T-DNA border repeat element determines
its relative activity during T-DNA transfer to plant cells. Mol Gene Genet
210:38-346.
59. YAM-PUC A., ESCALANTE EROSA F., PECH LOPEZ M., CHAN BACAB
J., ATHIMOOLAM ARUNACHALAMPILLAI, OLA F. WENDT, OLOV
STERNER, PEÑA RODRIGUEZ L. M. (2009). Trinorsesquiterpenoids from
the root extracts of Pentalinon andrieuxii. Journal of Natural Products 72:
745-748.
60. ZAMBRYSKI, P., DEPICKER, A., KRUGER, K., GOODMAN, H. M. (1982).
Tumor induction by Agrobacterium tumefaciens: analysis of the boundaries
of T-DNA. J Mol Appl Genet. 1: 361-370.
7. ANEXOS
ANEXO 1 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO YEB
REACTIVO g/L
Extracto de carne 5
Extracto de levadura 1
Peptona 5
Sacarosa 5
Sulfato de Magnesio 0.5
Agar 15
pH 7.2
ANEXO 2 COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MEDIO PC
Solución Macronutrientes gr/L mL de la solución

NH4N03 20
KN03 41
PC1 KH2P04 6.5 50
NaH2P04 1.7
PC1a MgS04 °7H20 8.7 50
PC1b CaCI ° 2H20 12 50
Micronutrientes
KI 0.5
H3B03 2.5
PC2a MnS04° H20 7.5 2
ZnS04° 7H20 2.5
NaMo04° 2H20 0.2
CuS04°5H20 0.05
PC2b COC12°6H20 0.05 2
PC3 Tiamina HCI 0.8 0.5
Piridoxinao HCI 0.2
PC4 Mio-inositol 40 6.25
Nitsch Na2EDTA 7.46
FeS04°7H20 5.56 5
Sacarosa 25
Agar 10
ANEXO 3 MEDIO DE RECUPERACIÓN

Medio PC con la adición de TDZ y cefotaxima
Antibióticos y reguladores Hipocotílo Raíz Hoja
de crecimiento
TDZ (μM) 13.5 6.25 12.5
Cefotaxima (μg/ml) 50 50 50

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TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA

OPTIMIZACIÓN DE UN PROTOCOLO DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

INFORME DE RESIDENCIA PROFESIONAL

PARA OBTENER EL TITULO DE:

KARINA ELIZABETH MARTÍNEZ SILVESTRE

A Dios principalmente por cada momento vivido y por su infinita fidelidad.

A mis hermanas por ser mi inspiración.

Al Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. por darme la oportunidad de realizar mi

El desarrollo de cultivo de tejidos vegetales y técnicas de elicitación de metabolitos

El objetivo de este trabajo fue la optimización del protocolo establecido por

3.10.4. LOCI tra y trb ................................................................................................................. 30

4.9. EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ACETOSIRINGONA Y TIEMPO DE

Ilustración 1.Ubicación geográfica del Centro de Investigación Científica de Yucatán, ... 13

GENERALIDADES DEL PROYECTO

En México, la familia Apocynaceae se ubica entre las 15 familias más diversas,

El sistema de transformación mediado por Agrobacterium es influenciado por

1.1.1. DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA U ORGANIZACIÓN

El Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. (CICY) es una institución

Brinda apoyos a través de procesos, tanto a los investigadores como a las

 Consultoría en temas relacionados con innovación y gestión de tecnología.

El Centro de Investigación Científica de Yucatán se localiza en la calle 43 No. 130

Ilustración 1.Ubicación geográfica del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

1.1.3. GIRO DE LA EMPRESA

Investigación Científica Tecnológica

1.1.4. MISIÓN Y VISIÓN

Misión. Realizamos investigación científica, formamos recursos humanos,

Visión. Ser una institución líder, reconocida local, nacional e internacionalmente,

1.1.5. PRODUCTOS Y CLIENTES

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C (CICY), es un Centro Público

 Aumentar los porcentajes de frecuencia de infección.

2.1.1. Objetivo General

Optimizar el protocolo de transformación genética de Pentalinon andrieuxii

2.1.2. Objetivos específicos

• Obtener plántulas de Pentalinon andrieuxii en condiciones in vitro.

• Establecer la densidad óptica y el tiempo óptimo de cocultivo.

• Definir la concentración optima de acetosiringona usada en la suspensión

• Seleccionar el tiempo de vacío idóneo en la agroinfiltración.

• Delimitar el pH para el tiempo de cocultivo

• Confirmar la presencia del gen reportero GUS mediante la prueba

• Determinar el tipo de explante con mayor porcentaje de transformación.

• Evaluar la influencia de las condiciones de luz en la regeneración de

Pentalinon andrieuxii (Müll. Arg.) es una enredadera nativa de la península de

La transformación genética de plantas es una herramienta que se ha ido

Pentalinon andrieuxii es un modelo susceptible a la transformación, pero los bajos

3.1. PENTALINON ANDRIEUXII

La familia Apocynaceae está conformada por árboles, arbustos, hierbas y muy a

Pentalinon andrieuxii (ilustración 2) es conocida comúnmente como bejuco de

Ilustración 2.Pentalinon andrieuxii

3.2. CLASIFICACIÓN BOTÁNICA

Cuadro 1. Clasificación Taxonómica del género Pentalinon andrieuxii.

3.3. CARACTERISTICAS TAXONÓMICAS

Es una planta trepadora leñosa o semi leñosa de hasta 6 m de largo (Melchor et

Ilustración 3. A) Semillas, B) Vilano, C) Folículo de Pentalinon andrieuxii.

3.4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Esta especie se encuentra distribuida principalmente en Centroamérica y las

Ilustración 4.Distribución geográfica de Pentalinon andrieuxii.

3.5. USOS Y APLICACIONES

Pentalinon andrieuxii es una planta usada en la medicina tradicional maya contra