TÉCNICAS INSTRUMENTALES

Guión de PRÁCTICAS
Nombre y Apellidos: Mireya Martínez Gándara, Paloma Martínez -Reboredo Lamela
GRUPO: CURSO ACADÉMICO: 2023 - 24

PRACTICA Nº 1
ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE-ULTRAVIOLETA

Los métodos fotométricos y espectrofotométricos basados en la absorción de radiación visible-ultravioleta

son los más frecuentemente utilizados de todos los métodos en análisis instrumental. Estos métodos
miden la "cantidad" de radiación absorbida por una muestra.
La Ley de Lambert-Beer relaciona la disminución de la intensidad luminosa (o potencia luminosa) de una
radiación que atraviesa una sustancia absorbente con el espesor de sustancia atravesada y con su
concentración.

Si un haz de radiación monocromática (de una

determinada longitud de onda) pasa a través de un
medio absorbente, una parte de la radiación es absorbida y otra es transmitida sin
ser absorbida.
En tales circunstancias se cumple que:

Siendo I0 y I la intensidad de radiación incidente

y transmitida respectivamente, b, el espesor, c,
la concentración de la especie absorbente y a un
coeficiente denominado absortividad (o
absorbabilidad), característico de cada sustancia
que que depende de la longitud de onda, del
disolvente y, en menor medida, de la temperatura.
Si la concentración la expresamos mol/L la constante recibe el nombre de absortividad molar y suele
representarse por la letra ε.
La transmitancia varía entre los valores de cero (se produce la absorción total) y uno (la sustancia no
absorbe nada y deja pasar la radiación totalmente). El logaritmo del inverso de la transmitancia por
definición se denomina Absorbancia:

Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes medibles directamente en el

espectrofotómetro.
De la definición de absorbancia, ecuación [4], y de las ecuaciones anteriores [1] y [2] nos queda entonces:
A = a·b·c[5]
A= ε ·b·c [6]

Estas últimas ecuaciones son la base fundamental del análisis espectrofotométrico cuantitativo, pues
relaciona la absorbancia (magnitud medible en el espectrofotómetro) con la concentración de la sustancia
absorbente en la muestra.
Existen sin embargo factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a
concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar
experimentalmente el intervalo de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo las curvas de
calibrado representando la absorbancia frente a la concentración.

DETERMINACIÓN DE SALICILATOS EN ORINA

Los salicilatos se metabolizan en el organismo excretándose en forma de ácido salicílico. El ácido
salicílico no absorbe apenas radiación visible, pero en presencia de Fe3+ forma un complejo coloreado que
absorbe en dicha región y cuya absorbancia es directamente proporcional a la concentración según las
ecuaciones [5] y [6].

El PROCEDIMIENTO es el siguiente:
Se preparan una serie de disoluciones de concentración creciente, a partir de un estándar de salicilato de
concentración equivalente a 0,4 mg/mL en ácido salicílico, según la tabla adjunta:
TUBO Nº Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Concentr. 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360

(mg/L)

Estandar 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
(mL)

Agua 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
destilada
(mL)

Trinder (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

El reactivo de Trinder, en cuya composición entra el (NO3)3Fe, aporta el ión Fe3+ que forma el complejo
coloreado con los salicilatos.
 La figura muestra el espectro de absorción del complejo
donde se observa un máximo de absorción centrado a
530 nm.
Una vez conocida la longitud de onda a la que se produce
el máximo de absorción del complejo se trabaja en el
espectrofotómetro a dicha longitud de onda (longitud de
onda de trabajo) y se construye una curva de calibrado
que consiste en lo siguiente:

Se miden las absorbancias de las disoluciones de salicilato de

concentración conocida a la longitud de onda de trabajo
A (λ)y se representan frente a las concentraciones obteniéndose una gráfica de forma aproximada a la de
la figura.
En dicha figura se observa que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración en el intervalo de concentraciones
estudiado. A continuación tomamos 1 mL de orina y le añadimos
5 mL del reactivo Trinder. Si existen salicilatos en la orina se
formará el complejo coloreado y le medimos la absorbancia (Ax ).
A esta absorbancia según la recta de calibrado le corresponderá
una determinada concentración (cx) , que es la concentración de
salicilatos en la orina.
Normalmente la concentración de salicilatos en orina es muy
grande y la absorbancia medida cae fuera de la recta de
calibrado. Lo procedente en estos casos es diluir la muestra de orina: En un experimento típico se pueden
tomar 0,25 mL de orina y añadirle 0,75 mL de agua y 5 mL del reactivo Trinder. Medimos la absorbancia y
por la recta de calibrado obtenemos la concentración. Como la orina ha sido diluída a la cuarta parte, la
concentración real de salicilatos en la misma será cuatro veces mayor que la obtenida por la curva de
calibrado. Otras diluciones son posibles.

RESULTADOS:

TUBO Nº Conc.(mg/L) Absorbancia

1 40 0,081

2 80 0,154

3 120 0,242

4 160 0,321

5 200 0,400

6 240 0,474

7 280 0,550

8 320 0,630
 9 360 0,714

Regresión ( Y = A + B · X ) A =2,1388888 x10-3 B = 1,9704166 x 10-3 r = 0,99

Dilución: Se tomaron 0,25 mL de orina y se le añadieron 0,75 mL de agua.
Absorbancia: 0,226
Concentración de salicilatos en la muestra diluida:
A= 1,9704166 x 10-3C + 2,1388888 x10-3
0,226 - 2,1388888 x10-3= 1,9704166 x 10-3C
C = 114 mg/L
Concentración de salicilatos en la muestra original de orina:
114 mg/l x 4
C= 454 mg/L
 PRÁCTICA Nº 2
MEDIDAS POTENCIOMÉTRICAS Y SUS APLICACIONES

Las determinaciones del pH se realizan potenciométricamente con el pH-metro. Un pH-metro es un

potenciómetro que mide la f.e.m. de una pila formada por un electrodo indicador, generalmente de
membrana de vidrio, sensible a los iones hidrógeno, y un electrodo de referencia, que presenta un
potencial constante.
El pH-metro permite la determinación del pH de las disoluciones, debido a que el potencial desarrollado a
través de la membrana es proporcional a la concentración de iones hidrógeno (más bien a la actividad de
los iones hidrógeno). El potencial del electrodo de vidrio viene relacionado con el pH de la disolución
externa a 25 oC por:
E = Q − 0,059 ⋅ pH [1]
Donde Q es un término constante para cada electrodo que agrupa diversas diferencias de potencial que
se establecen en el mismo, pero que para uno dado es constante. La f.e.m. de la pila formada por ambos
electrodos (el de vidrio, que varía su potencial con el pH de acuerdo con la ecuación [1] y el de referencia
de potencial constante) es:
ε PILA = K + 0,059 ⋅ pH [2]
Donde K es una nueva constante que engloba la Q, de la ecuación [1], el potencial de unión líquida y el
potencial del electrodo de referencia. De esta manera tenemos:

Esta ecuación muestra que el pH de una disolución es directamente proporcional a la f.e.m. de la pila
formada por los dos electrodos del pH-metro. Para conocer el pH de una disolución calibramos
previamente el aparato con una disolución patrón de pH conocido (disolución tampón o "buffer"), con lo
cual se obtiene la medida del pH de la disolución problema en la escala del pH-metro por comparación
con el pH de la disolución patrón.

VALORACIÓN POTENCIOMÉTRICA DE UN ÁCIDO DÉBIL

CÁLCULO DEL VALOR APROXIMADO DE SU PK
Cuando una disolución de un ácido débil es valorada con cantidades crecientes de álcali se produce la
siguiente reacción:

Con las primeras adiciones de álcali se obtiene una mezcla acético-acetato, que constituye una disolución
reguladora o tampón, lo que se traduce en una ligera variación del pH con el volumen de álcali añadido. Al
continuar la adición de álcali, disminuye la capacidad reguladora con el consiguiente aumento del pH.
Este aumento es muy brusco en las proximidades del punto de neutralización o equivalencia, en el que la
base, es decir, un fuerte aumento del pH. El valor de éste se estaciona finalmente con las sucesivas
adiciones de álcali.
La curva de valoración potenciométrica ácido-base presenta pues, en este caso, la forma de la figura:
De lo indicado anteriormente se deduce que el punto de inflexión de la curva es el punto de equivalencia,
siendo pues sencillo calcular la concentración del ácido débil valorado.
Al mismo tiempo es posible calcular el pK del ácido. La disociación del ácido acético viene dada por el
equilibrio:

Y su constante de equilibrio de disociación en función de las concentraciones:

Manipulando convenientemente esta ecuación se llega a:

En el punto de semiequivalencia o de semineutralización [A-c ] =[Ac H] y por consiguiente en ese punto el

pH pK .

El PROCEDIMIENTO es el siguiente:
1.- Calibrar o ajustar el pH-metro mediante la disolución tampón
2.- Colocar en un vaso de precipitados 50 mL del ácido y determinar el pH.
3.- Con la ayuda de una bureta o micropipeta añadir a la disolución pequeños volúmenes de NaOH 0,5 M
agitando la disolución después de cada adición y determinando el pH.
Cuidar especialmente de que en las inmediaciones del punto de equivalencia los volúmenes de sosa
añadidos sean tan pequeños como sea posible.
Anotar los datos experimentales en la siguiente tabla:
 NaOH añadido (ml) pH

0 2,91

0,5 3,67

1 4,01

1,5 4,23

2 4,42

2,5 4,58

3 4,75

3,5 4,93

4 5,16

4,5 5,43

5 6,02

5,1 6,30

5,2 7,16

5,3 10,60

5,4 11,17

5,5 11,41

5,6 11,58

5,7 11,70

5,8 11,78

6,3 12,05

6,8 12,21

En primer lugar, ponemos 50 ml de ácido acético en un vaso de precipitados y con el pH-metro medimos
su pH. Posteriormente, vamos añadiendo poco a poco NaOH 0,5M en el vaso y midiendo su pH.
Obtenemos así la siguiente tabla y gráfica de datos:
Para calcular el volumen de NaOH en el punto de equivalencia hacemos la primera derivada para conocer
el punto de inflexión, obteniendo:
7,16 - 6,30/5,2-5,1= 8,6
10,6- 7,16/ 5,3 -5, 2= 34,4
11,17 -10,6/5,4-5,3= 5,7
Observamos que el máximo de la primera derivada es 34,4, que se encuentra en un punto situado entre
los volúmenes 5.2 y 5.3. Por tanto, un valor aproximado sería 5,24 mL. Para mayor precisión hacemos la
segunda derivada.
34,4 - 8,6/5,3-5,2= 258
5,7- 34,4/ 5,4-5,3= -287

Sustituimos en nuestra ecuación y calculamos el punto de corte con el eje X.

-5450X +28598 = 0 → X = 5,24 ml
Por tanto, con mayor precisión podemos decir que nuestro volumen de NaOH en el punto de equivalencia
es de 5,24 mL.
La molaridad del ácido acético es: C1xM1= C2xM2 → 5,24 mL x 0,5M = 50 mL x M2 → M (ácido acético) =
0,0524 M
Para calcular el pK aproximado hay que tener en cuenta que en el punto de semiequivalencia la
concentración de acetato es igual a la de ácido acético y por eso el pH = pK
Como nuestro punto de equivalencia es 5,24 el punto de semiequivalencia será 5,24/2 = 2,62
Hacemos una línea recta con los primeros puntos y despejamos de la ecuación de esa recta sustituyendo
la X por 2,62 y despejando la Y que es el pH.

Y= 0,37 x 2,62 + 3,66→ Y= pH = pK= 4,6294. Aproximadamente 4,6

Lo que se quiere determinar con precisión es el volumen correspondiente al punto de inflexión de una
curva pH función del V:

En el punto de inflexión de una curva la primera derivada dY /dX es un máximo

y la segunda derivada tiene un valor de cero.

Como la curva no es contínua en vez de diferenciales tomaremos incrementos tan pequeños como sea
posible (en nuestro caso volúmenes de 0,1 mL) y la primera derivada la consideraremos

y la segunda .

Para unos valores arbitrarios en las inmediaciones del punto de equivalencia tenemos:
Se observa que el máximo de la primera derivada (+29,5) se encuentra en un punto situado entre los
volúmenes 5,10 y 5,20.
Por lo tanto un valor aproximado sería 5,15 mL
Más precisión se obtiene con la segunda derivada. Se observa que la segunda derivada cambia de signo
entre 5,10 mL (+270) y 5,20 mL (−125).
Donde la segunda derivada valga cero, ese volumen corresponderá al punto de inflexión de la curva. Será
por lo tanto el volumen del punto final.
Para ello se hace una representación como la de la figura:

En el eje de ordenadas se representa el valor de la segunda derivada frente al volumen de reactivo en el

eje de abscisas. Donde la recta que une los dos puntos corte al eje de las X ese será el volumen de
reactivo del punto final.
En nuestro caso un volumen de 5,17 mL
La Molaridad del ácido será por lo tanto 0,0517 M
 PRÁCTICA Nº 3
CROMATOGRAFÍA GASEOSA

La cromatografía es un método usado principalmente para la separación y análisis de los componentes de

una muestra. Dichos componentes, debido a sus distintas propiedades, interaccionan de manera diferente
con dos fases: Una móvil (que puede ser un gas o un líquido) y otra que permanece estacionaria (que
puede ser un sólido o un líquido). Las cromatografías se denominan según la naturaleza de la fase móvil.
En la cromatografía gaseosa la fase móvil es un gas inerte (en nuestro caso Helio). La fase estacionaria
es un líquido adsorbido sobre un soporte sólido inerte. Además, el dispositivo utilizado para conseguir el
contacto entre las fases móvil y estacionaria, es una especie de cilindro enrrollado para ocupar menos
espacio —llamado columna— en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar
la fase móvil. Tenemos por tanto un tipo de cromatografía gaseosa denominada gas-líquido (La
cromatografía gaseosa sólo puede desarrollarse en columna. Las cromatografías con fase móvil líquido
—cromatografías líquidas— pueden desarrollarse tanto en columna como en papel o capa fina).
La figura muestra un esquema de un cromatógrafo de gases.

El detector utilizado es de conductividad térmica (también llamado catarómetro o de hilo caliente). El

flujo de gas portador se mide por medio de un caudalímetro de burbuja.
El registro gráfico de una cromatografía se denomina cromatograma.

En la figura se muestra un cromatograma del tipo que se obtendrá en la

práctica, indicando los tiempos de retención de dos compuestos,
parámetros medibles directamente sobre el cromatograma y que sirven
para la identificación de los mismos
La eficacia de la columna cromatográfica viene dada por el Número de
platos teóricos (N) de dicha columna: cuanto mayor sea N mayor será la
eficacia de la misma.
El número de platos teóricos para cada pico viene dado por la expresión:

Donde tR es el tiempo de retención del soluto y w la anchura en la base de dicho pico.

La Resolución (RS) entre dos picos nos informa de la separación conseguida para esos dos compuestos.
Una buena resolución debe ser mayor de 1,5 (Con esta resolución se logra casi la total separación de los
dos compuestos).
La resolución se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:

Entre las aplicaciones de la cromatografía de gases destaca el análisis cuantitativo.

Los métodos cuantitativos se basan en la determinación del área de los picos
cromatográficos, o de su altura, y en relacionar estas magnitudes con la cantidad o la
concentración de las
sustancias de la muestra. El método más sencillo para la determinación del área de
los distintos picos
consiste (véase figura) en trazar dos tangentes por los puntos de inflexión del pico
hasta que se corten
aproximadamente igual al área del pico. (Esto es una aproximación válida para picos
con perfil
gaussiano, y no siempre es aplicable).

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ALCOHOL EN PLASMA

Se utilizará el método del Patrón Interno (= Estándar Interno). El patrón interno es una sustancia de
estructura parecida a la del compuesto o compuestos a analizar. Debe responder a las fluctuaciones del
instrumento de la misma manera que el compuesto a determinar y no debe estar presente en la muestra
problema. En esta práctica para la determinación de etanol se utilizará como patrón interno el 1-propanol.
El método del patrón interno es especialmente útil cuando la cantidad de muestra analizada o la
respuesta del instrumento varían algo de experiencia a experiencia por razones que son difíciles de
controlar.
Por ejemplo si la señal del patrón aumenta un 4% porque se inyectó más muestra o por una variación en
la temperatura, el analito también aumentará la señal en un 4%. La relación entre el área del analito
(etanol) AS y la del patrón (propanol) AP es constante, aunque varíe alguna condición instrumental.
Para construir la curva de calibrado se preparan disoluciones de concentración creciente en el analito a
las que se le añaden la misma cantidad a todas de patrón. Se cromatografían y se mide el área de los
picos de la sustancia AS y del patrón AP.
Una representación de la relación As/ Ap frente a la concentración de analito CS dará una recta. A la
muestra problema se le añade la misma cantidad de patrón interno y se cromatografía. La relación de
áreas As (X)/Ap se lleva a la recta obteniéndose la concentración desconocida tal como se muestra en la
figura.
El PROCEDIMIENTO es el siguiente:
Se preparan tres disoluciones de etanol en cantidades crecientes y se le añaden a las tres disoluciones el
mismo volumen de 1-propanol.

Un volumen de aproximadamente 1 L de cada disolución se cromatografía en

las mismas condiciones obteniéndose tres cromatogramas parecidos al de la
figura. Los cromatogramas se realizarán con temperatura programada, que
consiste en ir aumentando la temperatura a medida que se realiza el
cromatograma. Debemos primeramente identificar los picos del
cromatograma: el primer pico es el correspondiente al agua que es el
compuesto que sale primero y no tiene interés a efectos analíticos. El
siguiente pico es el del etanol y por último sale el propanol (en las series
homólogas sale antes el de menor peso molecular y por consiguiente el de
menor temperatura de ebullición) Se miden las áreas de los picos del etanol y
del propanol y se representa la relación de áreas frente a la concentración de
etanol, obteniéndose una recta de calibrado. Se cromatografía un volumen
aproximado de 1 L de la muestra de plasma y una vez obtenido el
cromatograma se lleva la relación de áreas a la gráfica y se determina la concentración de etanol en
plasma.
RESULTADOS:
Programación de temperatura → Temperatura inicial: 110º C tiempo: 1 min
Gradiente: 50ºC/ min
Temperatura final: 160º C tiempo: 8 min
Flujo del gas portador: a 160ºC 20 mL/min
a 110ºC 25 mL/min Volumen de muestra inyectada: 1μL
Matraz Concentración Área del pico del Área del pico del Relación de Áreas
de Etanol Etanol Propanol (AS / AP)
(g/L) (AS) (AP)

1 0,2 1,954 4,882 0,400

2 0,6 13,824 10,453 1,323

3 1,0 14,063 4,832 2,910

Muestra de plasma 7,166 9,978 0,718

Regresión:(Y = A + B ·X) A= -0,138 B= 2,88 r= 0,976
As/Ap = 2,88C -0,138 → 0,718= 2,88C- 0,138
C= 0,297 g/L
Concentración de etanol en plasma según la recta de calibrado: 0,297 g/L