Evaluación experimental de las variables con mayor impacto en el proceso de

producción de bioetanol de segunda generación

Arturo Figueroa Arcos *. Víctor M. Alvarado*
Guadalupe López López *

* Centro Nacional de Investigación y Desarrollo Tecnológico,

Cuernavaca, Morelos, CP 62460.

[email protected], [email protected],
[email protected]

Abstract: La producción de biocombustibles ha cobrado gran importancia en los últimos años debido a la
búsqueda de fuentes alternativas de combustibles. En este artículo se presenta la producción de bioetanol a
partir del residuo agrícola de la caña (Biomasa lignocelulósica) y sus etapas que intervienen durante una
configuración separada (SHF) y una configuración simultánea (SSF). En el análisis de variables del proceso se
determinó gran importancia en la temperatura y pH durante el proceso de hidrólisis enzimática, durante una
etapa de hidrólisis separa se pudo obtener una producción de etanol del 16 % en un volumen de 100 ml,
manteniendo las condiciones de 50 °C y pH 5 siendo las condiciones óptimas reportadas y al ser manipuladas
fuera del rango determinado se observa una reducción importante en el producto final, así como en una etapa
simultánea cobra importancia la temperatura de operación donde se pudo obtener una producción del 15 % en
volumen, usando 43° C y una reducción del tiempo de operación. A través de esta investigación se busca
proponer alternativas en producción de biocombustibles y establecer las variables de interés que intervienen en
el proceso, para temas de aplicación de control en estas etapas cruciales.
Palabras clave: Biomasa lignocelulósica, hidrólisis enzimática, fermentación, pretratamiento.

realizaron para obtener las características y condiciones de

1. INTRODUCCION
operación de cada etapa (pretratamiento, hidrólisis y
fermentación), así como también el análisis de las principales
La producción de combustibles de las últimas décadas ha sido
variables que afectan el rendimiento en el porcentaje de etanol
proveniente de fuentes no renovables o fósiles para cubrir la
obtenido.
demanda energética. Como consecuencia se tiene una sobre
explotación y su uso contribuye al calentamiento global, por lo
2. PRODUCCION DE BIOETANOL DE SEGUNDA
que actualmente se buscan energías alternativas y/o renovables
GENERACIÓN.
(Willem et al., 2009). Debido a la problemática mencionada
anteriormente, se han desarrollado investigaciones de energías
El bioetanol de segunda generación es uno de los
alternativas que tienen un menor impacto en el medioambiente,
biocombustibles con mayor alcance debido a que implica el uso
como es la producción de biocombustibles a partir del
de desechos agrícolas, residuos vegetales secos provenientes de
aprovechamiento de los residuos (Manrique et al., 2015).
podas, cascara de alimentos, entre otros. A este tipo de materia
se le conoce como biomasa lignocelulósica, por su composición
El principal biocombustible es el bioetanol, este es un tipo de
de hemicelulosa y lignina (estructura rígida), y celulosa
alcohol que se obtiene por medio de la fermentación de los
(carbohidrato) el cual es fermentado para obtener bioetanol
azúcares que contiene la materia prima (biomasa), es
(Hernández, 2012).
considerado biocombustible debido a que proviene de residuos
agrícolas generalmente y por una baja emisión de CO₂ (Castro
2.1 Biomasa lignocelulósica
Martínez et al., 2012).
El bagazo generado de la caña de azúcar es uno de los principales
En este documento se presenta el proceso de producción de
residuos lignocelulósicos, por cada tonelada de azúcar producida
bioetanol de segunda generación, usando el bagazo de caña de
se obtiene de 0.7 a 0.3 toneladas de bagazo (Albernas et al.,
azúcar en las pruebas experimentales. Dichas pruebas se
2016). La composición del bagazo de caña de azúcar es
aproximadamente 20 % de lignina, 25 % de hemicelulosa, 50 % 3.2 Pretratamiento con hidróxido de sodio diluido
celulosa y 5 % otros componentes. Debido a su composición no
es posible acceder directamente a la celulosa debido a la fuerte El pretratamiento con NaOH se realizó tomando como base las
protección de la lignina y hemicelulosa, por lo que se aplican condiciones de operación y metodología de (González et al.,
pretratamientos para degradar la biomasa a azúcares 2019), se preparó la solución añadiendo hidróxido de sodio
fermentables (Oliva et al., 2004). (NaOH al 2 % p/v) en un vaso de precipitado de 1 L utilizando
un volumen de agua destilada de 600 ml como se muestra en la
2.2 Pretratamiento figura 2.

El pretratamiento ayuda a romper los enlaces de la lignocelulosa,

lo que facilita la separación de celulosa, hemicelulosa y lignina
entre sí. Actualmente, existen diferentes métodos de
pretratamiento disponibles, como lo son el pretratamiento
biológico, mecánico, químico y fisicoquímico, el objetivo del
proceso de pretratamiento es facilitar la fragmentación de los
polímeros lignocelulósicos, modificar la estructura y ampliar el
área superficial de la biomasa para un mayor rendimiento de
azúcares fermentables durante la hidrólisis enzimática.

2.3 Hidrólisis enzimática

La aplicación de la hidrólisis enzimática se realiza con la Fig. 2. Preparación de solución de 600 ml con NaOH al 2%
utilización de enzimas celulasas y hemicelulosas con el fin de (p/v).
descomponer carbohidratos e hidrolizar la biomasa
lignocelulósica, de esta manera obtener azúcares fermentables La solución se colocó en un agitador magnético hasta disolver el
(García, 2020). hidróxido de sodio, posteriormente se incorporó el bagazo
previamente pesado correspondiente al 4 % (p/v), la temperatura
2.4 fermentación alcohólica interna se elevó hasta alcanzar 97 °C la cual se censó con una
sonda de acero inoxidable (figura 3). La reacción se mantuvo
La etapa de fermentación es la transformación de los azúcares durante el tiempo determinado que se muestra en la tabla 1, así
liberados en la etapa de hidrólisis enzimática en etanol y dióxido como las condiciones generales de la etapa de pretratamiento.
de carbono por medio de microorganismos conocidos como
levaduras.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Materia prima

El bagazo de caña de azúcar usado en este trabajo fue

proporcionado por el Ingenio San Francisco en Ameca, Jalisco,
México. Fue secado en un horno con aire caliente a 40 °C durante
12 horas, posteriormente fue molido en un molino manual y
tamizado en partículas inferiores a 5 mm (figura 1).

Fig. 3. Incorporación de biomasa y censado de temperatura.

Tabla 1. Condiciones de operación utilizadas en

pretratamiento

Carga de Tamaño Carga

Volumen bagazo de de de Temperatura Tiempo
caña partícula NaOH

600 ml 24 g 5 mm 12 g 97 °C 90 min
Fig. 1. Secado y reducción de tamaño de bagazo de caña.
La biomasa pretratada fue separada con filtración al vacío fueron determinadas (tabla 2) empleando la hoja de datos de las
utilizando un embudo büchner, Kitasato y bomba de succión enzimas comerciales, ya que establece un rango óptimo de pH,
(figura 4). La parte sólida fue enjuagada secuencialmente con temperatura y tiempo para la liberación de azúcares
agua destilada para eliminar rastros del reactivo usado y filtrada fermentables.
nuevamente, posteriormente la biomasa es colocada en un horno
de secado a 40 °C durante 12 horas y reservada para la siguiente
etapa de hidrólisis enzimática (figura 5).

Fig. 6. Acondicionamiento de pH y temperatura antes de la

incorporación de enzimas.
Fig. 4. Filtrado y enjuagado de biomasa posterior al
pretratamiento. Al obtener las condiciones de pH y temperatura en la solución,
se procedió a incorporar la mezcla enzimática usando una
micropipeta, se muestra en la figura 7 a) y posteriormente en la
figura 7 b), se observa el proceso en una cámara de incubación
para mantener constante la temperatura durante el proceso.

a) b)

Fig. 5. Secado en horno con aire a 45 °C antes de hidrolisis

enzimática.
Fig. 7. a) Incorporación de enzimas, b) hidrolisis en cámara de
3.3 Hidrólisis enzimática incubación.

La hidrólisis enzimática se realizó con una mezcla de enzimas Tabla 2. Condiciones de operación en hidrolisis enzimática
celulasas y hemicelulosas Cellic Ctec 2 de Sigma Aldrich con
una carga enzimática de 25 mg por gramo de bagazo seco Volumen
Carga de
Carga
pretratado, se determinó en mililitros usando la ecuación (1) bagazo pH Temperatura Tiempo
de trabajo enzimática
pretratado
donde  representa la densidad con valor de 1.15mg cm3 (Baral et
al., 2019). 200 ml 10 g 217 µL 5 50 °C 72 h.

mg
ml = (1) 3.4 Fermentación alcohólica
(  )
3.4.1 Inoculo de levadura
El bagazo pretratado fue pesado al 5 % (p/v) y se añadió en un
matraz de 250 ml, usando un volumen de 200 ml, inicialmente Él inoculó, se realizó en un matraz de 1000 ml con medio YPD
con agua destilada y después utilizando una solución buffer para (composición de 10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de
mantener las condiciones de pH (Figura 6) sin variación hasta el peptona y 20 g/L de glucosa). Una vez preparado se esterilizó en
término del tiempo establecido. Las condiciones de operación autoclave durante 20 min a temperatura de 121 °C (figura 8).
La levadura utilizada es un ejemplar de Saccharomyces 3C la
cual fue proporcionada por el Centro universitario de Ciencias
Biológico-Agropecuarias (CUCBA), se inoculó tomando una
muestra de levadura con micropipeta y se añadió en el matraz
con medio YPD, para el crecimiento de la levadura se utilizó una
incubadora a 30 °C durante 12 horas.

Fig. 10. Fermentación alcohólica en cámara de incubación.

3.5 Configuración de Sacarificación y Fermentación

Simultaneas (SSF)

Se consideró una configuración de sacarificación y fermentación

Fig. 8. Esterilización de medio en autoclave. simultáneas (SSF) para pruebas adicionales usando el
pretratamiento con NaOH, esta configuración permite llevar a
3.4.2 Fermentación de hidrolizado cabo la etapa de hidrólisis y fermentación en un mismo proceso,
posterior al pretratamiento de la biomasa, con el fin de reducir el
La fermentación del hidrolizado se realizó en frascos de 150 ml, tiempo e instrumentación para obtener etanol.
se añadió el hidrolizado resultante y una muestra del inoculo
(figura 9). Posteriormente, los frascos se sellaron Los experimentos se realizaron tomando la metodología de
acondicionando para un medio anaerobio con trampa de aire para (Sinche et al., 2022), se utilizó un matraz de 250 ml donde se
expulsar los gases producidos durante la fermentación, los añadió la carga de bagazo pretratado 5% (p/v) y se acondicionó
frascos se mantuvieron en cámara de incubación (figura 10) con en un volumen de 100 ml con solución buffer para mantener las
las condiciones que se muestran en la tabla 3. condiciones de pH, posteriormente se añadió una carga
enzimática de 18.5 µL por gramo de bagazo seco pretratado y
Tabla 3. Condiciones de operación de fermentación una muestra de inoculo de levadura (figura 11).
alcohólica

Volumen a) b)
Hidrolizado Inoculo Temperatura Tiempo
de trabajo

100 ml 90 ml 10 ml 30°C 7 días.

Fig. 11. a) Incorporación de carga enzimática, b) inoculo para

proceso SSF.

La temperatura usada es un equilibrio entre la temperatura

óptima de operación de las enzimas que es de 50 °C y la
temperatura de las levaduras de 30 °C, ya que la mayoría de las
levaduras no presentan características termo tolerantes. En la
Fig. 9. Toma de muestras de hidrolizado e inoculo para tabla 4 se muestra las condiciones que se mantuvieron durante el
fermentación alcohólica de azucares liberados. proceso de la configuración SSF, el cual se llevó a cabo en
cámara de incubación y condiciones anaerobias (figura 12).
 valor 4 y al usar la solución buffer que mantiene el pH deseado
en 5.

Tabla 5. Influencia de la variable pH en hidrolisis

enzimática

Porcentaje en
Etapa Solución pH inicial pH final volumen de
etanol

Agua
5 4 9%
destilada
Hidrolisis
enzimática
Fig. 12. Proceso de sacarificación y fermentación simultaneas
Buffer 5 5 15%
en cámara de incubación.

Tabla 4. Condiciones de operación de configuración SSF

4.2. Efecto en la manipulación de variable pH en hidrolisis
Volumen
Bagazo Carga
enzimática
de pH Inoculo Temperatura tiempo
pretratado enzimática
trabajo
A partir de los primeros resultados obtenidos se pudo analizar
que la etapa de hidrólisis necesita de una solución que controle
100 ml 5g 93 µL 5 10 ml 37 °C 48 h
la variable pH debido a que en esta etapa se tienen cambios que
modifican el rendimiento final de etanol. Para poder determinar
que esta variable afecta directamente en el producto final se
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN propuso mantener el pH dos valores arriba y dos valores abajo,
del óptimo reportado. En la tabla 6 se muestra la influencia del
4.1 Toma de muestras de etanol producido. cambio en esta variable.

La medición del etanol obtenido posterior a la fermentación e Tabla 6. Pruebas de variable pH en hidrolisis
hidrólisis y fermentación simultánea se llevó a cabo con un
refractómetro de alcohol (figura 13), el cual es usado para medir Porcentaje en
el contenido en porcentaje en soluciones alcohólicas o alcoholes Etapa Solución pH inicial pH final volumen de
etanol
de todo tipo.
3 3 5%

4 4 9%

Hidrolisis 5 5 15%
Buffer
enzimática

6 6 10%

7 7 8%

Fig. 13. refractómetro usado en la medición de las pruebas 4.3 Resultados de sacarificación y fermentación simultaneas
experimentales. (SSF)

Los resultados obtenidos usando las condiciones iniciales Los resultados de las pruebas aplicando la configuración SSF
propuestas se muestran en la tabla 5, donde se emplearon las sobre la biomasa pretratada con NaOH se muestran en la tabla 7,
condiciones anteriormente mencionadas en el pretratamiento, comparado con los resultados del proceso de hidrólisis y
hidrólisis y fermentación. Se puede observar el cambio en el fermentación separadas (SHF), uno de los principales cambios,
rendimiento de etanol al no utilizar una solución buffer durante el tiempo de operación es que se reduce de 10 a 2 días con un
la hidrólisis que ayude a controlar el pH final obteniendo un rendimiento 4 % menor.
 Tabla 7. Comparativa de proceso SHF y SSF. Para un análisis más completo se recomienda hacer un
tratamiento estadístico en las diferentes etapas, considerando la
Porcentaje en cinética de los azucares producidos en la hidrolisis y el
Configuración Tiempo pH volumen de rendimiento de etanol en la fermentación.
etanol

SSF 24 horas 5 11%

REFERENCIAS

SHF 10 días 5 15% Willem P., Cooper C. Implications of fossil fuel constraints on
economic growth and global warming. Energy Policy. 2009,
Vol. 37(1). 166-180.
4.4 Efecto de la variable temperatura en SSF
Amarís J., Manrique D., Jaramillo, J. Biocombustibles líquidos
El efecto de la temperatura en el proceso simultáneo es una en Colombia y su impacto en motores de combustión interna.
variable que afecta fuertemente en el rendimiento de etanol Una revisión. El Reventón Energético. 2015, 13, 23–34.
obtenido, esto se muestra en la tabla 7. Debido a las condiciones
óptimas de las enzimas Cellic Ctec 2 y de las levaduras Castro C., Beltrán L., Ortiz J. Producción de Biodiesel y
utilizadas, el porcentaje de etanol muestra un incremento Bioetanol: ¿Una alternativa sustentable a la crisis energética?
importante al usar una temperatura de 43 °C que esta 7° por 2012, Ra Ximhai, 8, 93– 100.
debajo de la temperatura óptima de operación de la mezcla
enzimática, por lo tanto, se tiene mayor liberación de azúcares Hernández, C. Apuesta biotecnológica: Etanol de segunda
fermentables a diferencia de la reducción de temperatura a 31 °C. generación. Revista de Divulgación Científica y Tecnológica de
La Universidad Veracruzana, 2013, 26.
Tabla 7. Efecto de la variable temperatura proceso SSF
Albernas Y., Pedraza J., Corsano G., Rodríguez L., González, E.
Etapa Temperatura Carga pH Porcentaje Primera aproximación a la cinética de la obtención de etanol
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de etanol Afinidad: Revista de química teórica y aplicada. 2016, 73, 191-
196.
31 °C 93 µL 5 9%

Oliva D., Antolín G., Escalada L. Aproximación experimental a

SSF 37 °C 93 µL 5 11%
la combustión del bagazo de caña en lecho fluidizado. CIEMAT.
43 °C 93 µL 5 15% 2004, 1, 2-8.

García Paniagua, A. I. (2020). Degradation of lignocellulosic

material. Evaluation of chemical pretreatment and enzymatic
5. CONCLUSIONES hydrolysis for the obtaining of alcohols by fermentation.
Universidad de Leon.
En una configuración de etapas separas, es más fácil establecer
condiciones de operación sobre las variables como son el pH y González A., Hernández G., Pereda I. Sugarcane bagasse
la temperatura, debido a que cada microorganismo presenta alkaline pretreatment to improve biomethane production. Centro
condiciones óptimas de operación y salir de rango de estas puede Azúcar, 2019, 46, 79-88.
causar la interrupción del proceso por muerte de estos
microorganismos utilizados. Baral P., Lavika J., Kumar A., Kumar V., Agrawal D.
Augmented hydrolysis of acid pretreated sugarcane bagasse
Las variables ubicadas más importantes son el pH durante la by PEG 6000 addition: a case study of Cellic CTec2
conversión de la celulosa en azúcares fermentables haciendo uso with recycling and reuse. Bioprocess and Biosystems
de enzimas comerciales, así como la temperatura, ya que el Engineering. 2020, 43, 473-482.
rendimiento se ve afectado. En la fermentación la variable
temperatura es relevante para garantizar un ambiente propicio Sinche D., Ramírez V., Velalcazar C., Sacarificación y
para las levaduras, la cepa de la levadura Saccharomyces 3C fermentación simultánea de la cáscara de Jatropha curcas
presentó tolerancia al incremento de temperatura por lo que la pretratada hidrotérmicamente para producción de bioetanol,
hace una buena candidata en un proceso simultáneo y obtener 2022, Revista UCR, 2215-2652.
rendimientos superiores en una etapa con menor tiempo de
residencia e instrumentación.