NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 571

1988-11-02

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS.
GRASAS Y ACEITES. IDENTIFICACIÓN DE ACEITES
DE PESCADO

E: ALIMENTARY INDUSTRIES. FATS AND OILS. IDENTIFICATION

OF FISH OIL.

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES: grasas y aceites vegetales-identificación

de aceite de pescado; identificación de
aceite de pescado-métodos.

I.C.S.: 67.200.10

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Segunda actualización

Editada 2004-08-10
 PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 571 (Segunda actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 1988-11-02.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico C10.3 Productos grasos comestibles.

ACEGRASAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES

FÁBRICAS UNIDAS DE ACEITES Y TECNOLÓGICAS
GRASAS VEGETALES INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
GRASAS S.A. LLOREDA GRASAS

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 571 (Segunda actualización)

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS.
GRASAS Y ACEITES. IDENTIFICACIÓN DE
ACEITE DE PESCADO

1. OBJETO

Esta norma tiene por objeto establecer los métodos para identificar la presencia de aceites de
pescado y de otros animales marinos, en aceites y grasas vegetales.

6. ENSAYOS

6.1 MÉTODO A

Método cualitativo que consiste en la determinación de bromuros insolubles.

6.1.1 Reactivos.

- Cloroformo.

- Solución Wijs.

- Solución de bromo de ácido acético 1:3.

6.1.2 Procedimiento.

a) En un vaso de precipitados se mezclan 30 gotas de la muestra, 8 cm3 de

cloroformo y 10 cm3 de solución de Wijs. Se adiciona con una bureta y agitación
constante, solución de bromo en ácido acético 1:3 hasta el punto en el cual la
solución se clarifica o blanquea. Luego se adiciona un ligero exceso.

b) Se mezcla y se vierte inmediatamente en un balón, se deja en reposo de 1 h a 3 h

hasta que se obtenga una superficie clara.

c) Se mide la altura del precipitado con una regla graduada y se compara con los
patrones preparados con cantidades conocidas de aceites de pescado y aceite
vegetal puro.

6.1.3 Interpretación de los resultados. La cantidad de bromuros insolubles es proporcional a

la cantidad de aceite de pescado. Cuando este análisis dé negativo se debe proceder a realizar
el Método B.

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6.2 MÉTODO B

Determinación de ácidos grasos por cromatografía de gases. Método cuantitativo.

6.2.1 Principio del método

El método es aplicable a ésteres metílicos de ácidos grasos que tengan de 8 átomos a 24 átomos
de carbono y para grasas animales, aceites vegetales, aceites marinos y ácidos grasos después de
su conversión a ésteres metílicos. El método permite cuantificar la separación de mezclas que
contienen ésteres metílicos saturados e insaturados. Las condiciones específicas en este método
no son adecuadas para determinar compuesto tipo "epoxy" u oxidación en ácidos grasos o ácidos
grasos que hayan sido polimerizados.

6.2.2 Aparatos

a) Cromatográfo de gases comercial que tenga como mínimo las siguientes

características.

- Horno para columna, capaz de calentar mínimo a 220 °C y con una

precisión de ± 1 °C.

- Inyector con programa de temperatura entre 20 °C y 50 °C superior a la

temperatura de la columna.

- Detectores de conductividad térmica o de ionización de llama (F.D.I)

termostatados a una temperatura superior a la de la columna.

b) Registrador. Se requiere un registrador de alta precisión porque a partir de la

curva registrada se va a calcular la composición de la mezcla analizada. Las
características del registrador deben ser:

- Velocidad de respuesta inferior a 1,0 (la velocidad de respuesta es el

tiempo tomado por la pluma del registrador de 0 % a 90 % siguiendo la
introducción momentánea de una señal de 100 %).

- Ancho de papel, 25 cm (10 pulgadas) mínimo.

- Velocidad del papel, 25 cm/h - 100 cm/h (10 pulgadas/h).

c) Integrador o calculador (opcional). Un cálculo rápido y exacto puede ser hecho

con la ayuda de un integrador o calculador electrónico. Este debe dar una
respuesta lineal con adecuada sensibilidad y la corrección de la línea base debe
ser consistente con una buena práctica en cromatografía. Horizontal, no
horizontal y tangencial la corrección de la línea base deberá ser controlada por
un seleccionador electrónico de pico.

d) Jeringas con capacidad máxima de 10 mm3, graduadas en décimas de mm3.

e) Columna cromatográfica. La columna debe estar construida en un material inerte

a las sustancias que se van a analizar, puede ser de vidrio o, en su reemplazo,
de acero inoxidable (véase el numeral 9.1.1). Longitud 1 mm a 3 mm, diámetro
interno 2 mm a 4 mm. Además, el empaque debe estar constituido por :

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- Soporte. Tierra diatomácea con sílice lavada en ácido u otro soporte inerte
apropiado con un tamaño de partícula que pase por un tamiz ICONTEC 250 µ
(No.60) y se retenga en un tamiz ICONTEC 125 µ (No.120).

- Fase estacionaria. Tipo de poliéster con un líquido polar (dietilen glicol

polisuccinato, butanodiol polisuccionato, etilenglico poliadipato...) o
cualquier líquido (por ejemplo, cianosoliconas). La fase estacionaria debe
tener de 5 % a 20 % del empaque. Una fase estacionaria no polar tal
como metil silicona, puede ser usada para separar materiales
completamente saturados.

6.2.3 Reactivos

a) Gases

- Gas de arrastre. Para el detector de conductividad térmica: helio, pureza

mínimo 99,95 mol %. Para el detector de ionización de llama: helio,
nitrógeno o argón, pureza mínima: 99,95 mol %.

- Para el detector del aparato. Hidrógeno, pureza mínima 99,95 mol %. aire
seco, a -60 °C máximo, libre de hidrocarburos.

b) Patrones de referencia

Una mezcla de ésteres metílicos o el éster metílico de un aceite cuya

composición sea conocida, preferiblemente similar a la materia grasa que se va
a analizar. (Véase el numeral 9.1.2).

6.2.4 Procedimiento.

6.2.4.1 Preparación de la muestra. Metilación

a) Aparatos.

- Erlenmeyeres de 50 cm3, 125 cm3 y 200 cm3 para remoción del solvente.

- Condensador de agua diseño Liebig o West o equivalente.

- Embudos de separación de 250 cm3.

- Perlas de vidrio - libres de grasa.

b) Reactivos.

- Solución de trifluoruro de boro en metanol. Se prepara disolviendo 125 g

del gas en 1 dm3 de metanol.

- Solución de hidróxido de sodio 0,5 N en metanol.

- Solución saturada de cloruro de sodio en agua.

- Éter de petróleo redestilado con punto de ebullición entre 3 °C y 60 °C.

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- Heptano, grado cromatográfico.

- Sulfato de sodio anhidro, reactivo analítico.

- Indicador de rojo de metilo, 0,1 % en etanol de 60 %.

- Nitrógeno, de alta pureza.

Nota. El tamaño de la muestra debe ser conocido solamente para determinar el tamaño del erlenmeyer y la cantidad
de reactivos de acuerdo con las indicaciones dadas en la Tabla 1.

Tabla 1. Guía para la preparación de la muestra

Muestra en mg Capacidad del NaOH 0,5 N Solución de trifluoruro de

3 3 3
balón en cm en cm boro en metanol, en cm
100 - 250 50 4 5
250 - 500 50 6 7
500 - 750 125 8 9
750 - 1 000 125 10 12

c) Procedimiento.

Se coloca la muestra dentro de un erlenmeyer de 50 cm3 ó 125 cm3. Se adiciona

la cantidad especificada de hidróxido de sodio metanólico 0,5 N y se agregan las
perlas de vidrio, se conecta a un condensador y calienta la mezcla en un baño
de vapor hasta que los glóbulos de grasas se disuelvan. Este paso debe tomar
de 5 min a 10 min.

Se adiciona la cantidad especificada de trifluoruro de boro en metanol, se

conecta a un condensador y se deja en ebullición con un reflujo durante 2 min.
Se adiciona 2 cm3 ó 5 cm3 de heptano a través del condensador y se deja en
ebullición con reflujo por 1 min más.

Se retira del calor y se remueve el condensador, se adiciona suficiente solución

saturada de hidróxido de sodio para que sobrenade la solución de los ésteres
metílicos en heptano hacia el cuello del erlenmeyer. Se transfiere cerca de 1 cm3
de solución a un tubo de ensayo. Se adiciona una pequeña cantidad de sulfato
de sodio anhidro. La solución de heptano seco puede ser inyectada directamente
al cromatógrafo de gases.

Para recobrar los ésteres secos se transfiere la solución salina y la fase de

heptano a un embudo de separación de 250 cm3, se extrae 2 veces con
porciones de 50 cm3 de éter de petróleo redestilado. Se unen los estractos y se
lavan con porciones de 20 cm3 de agua hasta que esté libre de ácidos (prueba
del agua con el indicador rojo de metilo), se seca con sulfato de sodio y se
evapora el solvente bajo una corriente de nitrógeno en un baño de vapor
(véanse los numerales 9.1.3 y 9.1.4).

6.2.4.2 Acondicionamiento de la columna. Se coloca la columna desconectada del detector y

se mantiene a una temperatura de 10 °C por encima de la temperatura de operación con un
flujo de entrada de gas entre 20-60 cm3/min durante aproximadamente 16 h y luego 2 h
adicionales a 20 °C por encima de la temperatura de operación. En ningún caso puede
excederse la temperatura máxima recomendada por el fabricante.

4
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6.2.4.3 Determinación de condiciones óptimas de operación.

a) Al seleccionar las condiciones del análisis deben ser tomadas en cuenta las
siguientes variables.

- Largo y diámetro de la columna.

- Temperatura de la columna.

- Flujo del gas de arrastre.

- Resolución requerida.

- Tamaño de muestra que va a ser analizada.

- Tiempo de análisis.

b) El tamaño de la muestra debe ser de tal magnitud que el conjunto de detector y

electrómetro dé una respuesta lineal.

c) Se dan como guía los datos consignados en las Tablas 2 y 3.

d) El inyector debe estar a una temperatura de 250 °C - 275 °C y el detector a una

temperatura igual o más alta que la de la columna.

e) El flujo de hidrógeno para el detector de ionización de llama es, como regla,

alrededor de 0,5 a 1 vez el del gas de arrastre y el flujo de aire entre 5 veces y
10 veces el del hidrógeno.

Tabla 2. Guía para la determinación de las condiciones

óptimas de operación

Diámetro interno para Velocidad del gas de

la columna arrastre
3 3
2 mm 15 cm /min - 25 cm /min
3 3
3 mm 20 cm / min - 40 cm /mín
3 3
4 mm 40 cm / min - 60 cm /min

Tabla 3. Guía para la determinación de las

condiciones óptimas de operación

Concentración de fase Temperatura

estacionaria
5 por ciento 175 ºC
10 por ciento 180 ºC
15 por ciento 185 ºC
20 por ciento 185 ºC

6.2.4.4 Determinación de la eficiencia y la resolución. Se analiza una mezcla de metil estearato

y oleato aproximadamente en iguales proporciones (por ejemplo, ésteres metílicos de manteca
de cacao). Se escoge el tamaño de la muestra, la temperatura de la columna y el flujo del gas
de arrastre tal que el máximo pico del éster metílico del metil estearato se registre
aproximadamente 15 min después del pico solvente y se eleve a 3/4 partes del total de la
escala. Se calcula la eficiencia por la fórmula siguiente:
5
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n = 16 ( dR1 / w1 )2

y la resolución "R" por la fórmula:

R = 2 ∆ /( w1 + w 2 )

Donde:

dR1 = distancia de retención, medida en milímetros desde el comienzo al

máximo del pico para metil estearato.

w1 y w2 = los anchos, en milímetros, de los picos para metil estearato y metil oleato
medidos entre los puntos de intersección de las tangentes al punto de
inflexión con la línea base.

∆ = es la distancia entre el máximo de los picos del metil estearato y metil

oleato.

Notas:

1) Se consideran condiciones óptimas cuando la eficiencia es de 2 000 y la resolución de 1,25.

2) Se puede trabajar a una temperatura más baja cuando se determinan ácidos grasos por debajo de 12
átomos de carbono y a una temperatura más alta cuando se determinan ácidos grasos con más de 20
átomos de carbono.
3 3
3) La muestra que se va a analizar debe ser 0,1 mm - 2 mm de la solución de metil ésteres obtenidos de
acuerdo con lo indicado en el numeral 6.4.2.1. En el caso de no tener en solución, se prepara una solución
3 3
aproximada de 1 % - 10 % y se inyecta 0,1 mm - 1 mm de esta solución.

6.2.4.5 Cálculos

a) Identificación de picos. Se analiza la mezcla patrón de composición conocida

bajo las mismas condiciones de operación empleadas para la muestra y se
miden los tiempos de retención de los ésteres constituyentes. Se construye una
gráfica colocando en el eje de las abscisas el logaritmo del tiempo de retención y
en las ordenadas el número de átomos de carbono de los ácidos, la gráfica debe
ser una línea recta.

b) Análisis cuantitativo. Se usan valores obtenidos del integrador o se determina el

área bajo cada pico multiplicando la altura por el ancho a la mitad de la altura del
pico donde sea necesario, se deben tener en cuenta las diferentes atenuaciones
usadas durante el registro.

Como caso general, si no hay cantidades significativas de componentes

menores de 12 átomos de carbono se calcula el contenido de un componente
particular (expresado como porcentaje de ésteres de metilo) se determina el
porcentaje representado por el área del pico correspondiente y relacionado con
la suma de las áreas de todos los picos. El porcentaje del área del compuesto "i"
expresado como éster de metilo está dado por la fórmula:

6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 571 (Segunda actualización)

% = A1 / ∑ A1 x 100
Donde:

A1 = área del pico correspondiente al compuesto "i"

ΣA1 = sumatoria de las áreas bajo todo los picos.

- Uso de factores de corrección. Cuando hay ácidos con menos de 12

átomos de carbono, o con grupos secundarios o cuando se usa un
detector TC, los factores de corrección se deben usar para convertir los
porcentajes de las áreas de los picos o porcentaje de masa de los
componentes. Se determinan los factores de corrección sobre un
cromatograma de la mezcla de referencia de ésteres de metilo de
composición conocida, en condiciones de operación ideáticas a las
usadas para la muestra. El porcentaje de la mezcla de referencia está
dado por la siguiente fórmula:

( B1 / ∑ B1 ) 100

Donde:

B1 = masa del componente "i" en la mezcla de referencia.

ΣB1 = masa total de los componentes de la mezcla de referencia.

El porcentaje en área del componente "i" está dado por la siguiente

fórmula:

(C1 ∑ C1 ) 100
Donde:

C1 = área bajo el pico correspondiente al compuesto "i".

ΣC1 = suma del área bajo todos los picos.

Por lo tanto, el factor de corrección de K1 está dado por la siguiente fórmula:

B1 x ∑ C1
K1 =
C1 x ∑ B1

El contenido de cada componente en la muestra está dado por la fórmula:

K'1 x A1
W =
( )
∑ K'1 x A1 x 100
Donde:

W = porcentaje en masa m/m del componente "i" expresado como éster

metílico.

K'1 = factor de correlación expresado por la siguiente fórmula:

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 571 (Segunda actualización)

K'1 = K1
K C16

Donde:

KC16 = factor de corrección con relación al estándar interno.

Uso del estándar interno. El factor de corrección para el estándar interno está dado por
la siguiente fórmula:

m c13 x K'1 x A1
W = x 100
m x K' c13 x Ac13

Donde:

W = porcentaje en masa (m/m) del componente "i", expresado como éster metilo.

mC13 = masa en miligramos de estándar interno adicionado a la muestra.

m = masa en miligramos de la muestra.

K'C13 = factor de corrección para el estándar interno a Kc16 (véase la Nota).

AC13 = área del pico correspondiente al estándar interno.

Ai = área del pico correspondiente al componente "i".

Ki = factor de corrección del componente "i" relativo a KC16.

K'C13 = KC13 KC16 (véase la Nota).

Nota. Esto es determinado por la adición de una cantidad conocida de C13 como éster de metilo a la mezcla de
referencia y luego siguiendo el procedimiento arriba mencionado para determinar K1.

6.2.4.6 La presencia de aceite de pescado es negativa si la suma de ácidos grasos C20

(araquidónico) y C22 (clupanodónico) es menor a 1,5 %.

6.2.4.7 Precisión. Si los resultados obtenidos de dos determinaciones realizadas en las mismas
condiciones difieren en una cifra relativa del 3 % del valor determinado, se deben repetir.

9. APÉNDICE

9.1 INDICACIONES COMPLEMENTARIAS

9.1.1 Un componente poli-insaturado con más de tres dobles enlaces presentes se puede
descomponer en columna de acero inoxidable.

9.1.2 Los patrones de referencia pueden ser obtenidos en los siguientes laboratorios:

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- Applied Science Laboratories, Inc.

- Supelco, Inc.

- Nu chek prep.

- Analabs, Inc.

- Alltech associates, Inc.

9.1.3 Hay riesgo de perder algunos de los ésteres más volátiles si el paso de remoción del
solvente es prolongado o si la corriente de nitrógeno usada es muy fuerte. El método de
cromatografía líquido-gas puede ser usado para ácidos grasos con 8 átomos de carbono si el
solvente no es completamente removido.

9.1.4 Los ésteres metílicos deben ser analizados lo más pronto posible. Pueden ser
guardados en una atmósfera de nitrógeno en una ampolleta de 2 °C durante 24 h. Para
almacenamiento más prolongado debe ser sellado en una ampolleta de vidrio al vacío y
colocado en un congelador.

9.2 DOCUMENTO DE REFERENCIA

AOAC 28.121, Fish Oil and Marine Animal Oils in Presence of Vegetable Oils and Absense of
Metallic Salts. Edition 1980.

AOCS Official Method C 1-62. edition 1982.