INFORMES TÉCNICOS BREVES Un Método Rápido para la Extracción detergente catiónico desnaturalizante,

de ADN Genómico de Alta Calidad de dodeciltrimetilamonio bromuro (DTAB),

La sección de Informes Técnicos Breves Sangre Humana Entera en una solución salina concentrada (1 M
de BioFeedback acepta manuscritos con de NaCl), con una posterior
referencias que describen técnicas o precipitación selectiva del ADN
protocolos de cierta complejidad técnica mediante el detergente catiónico
y profundidad, pero que pueden ser RESUMEN
cetiltrimetilamonio bromuro (CTAB).
demasiado breves para constituir Mostramos que el ADN genómico
Se describe un protocolo simple y rápido
informes de investigación completos o obtenido con este método puede
para la purificación de ADN genómico a
revisiones. Escriba al Editor de utilizarse para todas las aplicaciones
partir de 0.3 ml de sangre humana
BioFeedback, BioTechniques, 154 E. relevantes (digestión con enzimas de
entera. La recuperación del ADN es
Central Street, Natick, MA 01760. restricción, PCR, etc.): su calidad y
cuantitativa y reproducible; la calidad es
tal que se puede utilizar para todas las rendimiento son comparables o incluso
técnicas relevantes de biología mejores que todos los demás métodos
molecular. reportados, a pesar de que todo el
procedimiento lleva menos de una hora.

INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
La difusión de las tecnologías actuales
en genética molecular suele verse Extracción de ADN Genómico de la
obstaculizada por pasos limitantes Sangre
asociados con protocolos complejos y,
Paso 1: Lisis/desnaturalización de la
por lo tanto, laboriosos. Un ejemplo
sangre.
claro es el aislamiento de ADN
genómico de sangre humana entera. Trescientos microlitros de sangre
anticoagulada con EDTA se mezclan con
Los protocolos de rutina en uso
600 µl de "buffer de lisis de sangre" (8%
actualmente requieren al menos un
de DTAB [Sigma Chemical, St. Louis,
aislamiento crudo de leucocitos.
MO]), 1.5 M de NaCl y 100 mM de
Además, después de obtener las
Tris-HCl, pH 8.0.
"preparaciones nucleares" respectivas, la
mayoría de los protocolos (1) implican
largas digestiones con proteinasas
seguidas de extracción con
fenol/cloroformo y diálisis. Debido a las
limitaciones inherentes (se necesitan
muchas manipulaciones cuidadosas de
las muestras), se han desarrollado
métodos alternativos para optimizar la
calidad y el rendimiento del ADN y al
mismo tiempo minimizar el tiempo y el
número de manipulaciones (2,3,6). Estos
métodos se basan generalmente en el uso
de reactivos caotrópicos para lisar
"preparaciones nucleares" derivadas de
"capas de buffy” y generalmente
incorporan pasos de digestión con
proteinasas.
No hemos encontrado referencias a
métodos que comiencen la preparación a
partir de sangre entera, minimizando así
el riesgo de exposición accidental a virus
peligrosos durante los pasos necesarios Figura 1. Electroforesis en gel de
para obtener las preparaciones nucleares. agarosa al 0.8% de ADN genómico. El
ADN genómico humano extraído con el
Aquí describimos un método alternativo
método descrito se digirió con diferentes
basado en un enfoque diferente cuya
enzimas de restricción y se corrió en un
eficacia química ha sido previamente
gel de agarosa TAE al 0.8%: carril 1,
bien establecida para la purificación de
Bg/II; carril 2, EcoRl; carril 3, Mindlll;
ADN derivado de otras fuentes: ADN
carril 4, Psrl; carril 5, Xbal. Los
plasmídico y lambda (4). Para extraer
marcadores de peso molecular son
directamente el ADN de la sangre
DRIgest III de Pharmacia LKB
entera, desde la sangre de ballena,
Biotechnology (M).
hemos introducido el uso de un potente
 de 6.7 kb, la flecha del medio es de 3.3 carril 5, HindIII. (La flecha superior es
kb y la flecha inferior es de 2.2 kb). de 6.7 kb, la flecha del medio es de 3.3
50 mM EDTA) in a 2-ml Eppendorf kb y la flecha inferior es de 2.2 kb).
tubey se incuban a 68°C durante 5 CTAB se resuspende en 300 μl de NaCl
minutos en un tubo Eppendorf de 2 ml 1.2 M para intercambiar el detergente. 0.8% TAE (Tris-acetato-EDTA), se
(Fremont, CA). Después de la resuspensión del pellet, el realizó la transferencia a una membrana
ADN se recupera mediante precipitación GeneScreen™ Plus (Du Pont de
Paso 2: Desproteinización: Luego se con etanol: se agregan 750 μl de etanol Nemours GmbH, Bad Homburg, FRG)
agrega inmediatamente cloroformo (900 y, después de mezclar mediante mediante una técnica de transferencia
μl) y, después de mezclar mediante inversión, las muestras se centrifugan alcalina (0.4 N de NaOH) (11). La
inversión (2-3 veces), la muestra se durante 10 minutos a 10000 rpm (todo a membrana, después de la neutralización
centrifuga a 10000 rpm durante 2 temperatura ambiente). y un horneado a 80°C durante 2 horas,
minutos en una centrífuga de mesa se hibridó con un fragmento de cDNA
Eppendorf. Se forma un tapón sólido en El sobrenadante se descarta vertiéndolo, del gen de alfa-antitripsina marcado con
la capa entre la fase orgánica y acuosa, y el pellet se enjuaga con una solución una actividad específica de 10^8/μg de
lo que permite verter la fase acuosa de 70% de etanol y 30% de agua. ADN utilizando un kit de iniciadores
superior que contiene el ADN genómico Después de retirar el lavado con etanol aleatorios. La hibridación y el lavado se
en un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml. al 70%, el ADN se disuelve realizaron según lo descrito (7).
completamente en 300 µl de TE, pH 7.5
Paso 3: Precipitación y resuspensión (10 mM de Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM de
del ADN:La muestra está lista para el EDTA) en un plazo de 10 minutos a
paso de precipitación del ADN: se 55°C o en un volumen inferior. Para amplificar un fragmento específico
agregan 900 μl de ddH2O y 100 μl de del gen de alfa-antitripsina, se utilizaron
CTAB (Sigma Chemical) de una las siguientes oligonucleótidos: 5'
solución al 5% preparada en 0.4 M de d(TGT
NaCl. La concentración final de CTAB Análisis de Southern Blot — CCACGTGAGCCTTGCTCGAGGCCT
será de 0.3%. Después de mezclar Amplificación-secuenciación por PCR GGG) (A1) y 5'
suavemente mediante inversión a de fragmentos amplificados d(GAGACTTGGTATTTTGTTCAATC
temperatura ambiente, las muestras se ATTAG) (A2), que abarcan las
Los ADN genómicos se digirieron
centrifugan a 10000 rpm en una posiciones 9890 dentro del intrón IV a
utilizando diversas enzimas de
centrífuga de mesa Eppendorf durante 2 10109 dentro del exón V,
restricción. Después de la electroforesis
minutos: el pellet de ADN- respectivamente. Los números de
durante la noche en gel de agarosa al
posición se miden desde el sitio de inicio
de la transcripción propuesto del gen

Figura 2. Análisis de Southern blot. El

ADN genómico humano, extraído como AAT.
Figura 2. Análisis de Southern blot. El
se describe, se digirió con diferentes
ADN genómico humano, extraído como
enzimas de restricción, se corrió en un
se describe, se digirió con diferentes
gel de agarosa TAE al 0.8%, se transfirió
enzimas de restricción, se corrió en un
a una membrana de nailon y se hibridó
gel de agarosa TAE al 0.8%, se transfirió
con un fragmento del cDNA de la alfa-
a una membrana de nailon y se hibridó
antitripsina: carril 1, Bg/II; carril 2,
con un fragmento del cDNA de la alfa-
XhaI; carril 3, MspI; carril 4, PvuII; y
antitripsina: carril 1, Bg/II; carril 2,
carril 5, HindIII. (La flecha superior es
XhaI; carril 3, MspI; carril 4, PvuII; y
 En conclusión, describimos un nuevo,
rápido y seguro método para extraer
Todo el proceso lleva menos de una hora ADN genómico de sangre entera: este
para obtener ADN completamente método ha sido automatizado
disuelto: el rendimiento de ADN recientemente (5), lo que disminuye el
genómico a partir de 300 µl de sangre tiempo y el trabajo necesarios para
La mezcla de PCR estaba compuesta por
entera es fiablemente constante: 10.5 realizar el diagnóstico de una
1 µg de ADN genómico, 1.25 mM de
(±1.5) µg de ADN. enfermedad genética.
cada desoxinucleósido trifosfato
(dNTP), 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3 (a
25°C), 50 mM de KCl, 1.5 mM de
MgCl2, 20 pmol de cada iniciador y 2.5 Mediante electroforesis en gel de campo
unidades de la enzima AmpliTaq™ pulsado, hemos estimado un tamaño
(Perkin-Elmer Cetus, Manza, Italia). La promedio de 250 kb. Este tamaño no
solución se calentó inicialmente a 95°C cambia incluso si el ADN se incuba a
durante 5 minutos, y luego se realizaron 37°C en un buffer de enzimas de
30 ciclos de amplificación: 2 minutos a restricción durante 48 horas o más, lo
94°C, 1 minuto a 60°C, 2 minutos a que indica que está completamente libre
72°C (8). Al final, la muestra se incubó a de endonucleasas contaminantes (datos
72°C durante 12 minutos. Los productos no mostrados).
de PCR se analizaron en un gel de
agarosa al 1.5% utilizando tampón TAE.
La banda recuperada se amplificó en
La calidad del ADN es extremadamente
presencia de 65 pmol del iniciador A1 y
satisfactoria. Su relación promedio O.D.
2 pmol del iniciador A2. Después de esta
260/280 es de 2.0 ± 0.1, considerando
amplificación asimétrica, el ADN de
también que no hay evidencia de ARN
cadena sencilla se recuperó de un gel de
según el análisis de electroforesis en gel.
agarosa de bajo punto de fusión, y se
Se puede utilizar fácilmente para
utilizaron 300 ng para realizar el análisis
cualquier aplicación. La Figura 1
de secuencia utilizando el Kit de
muestra el análisis electroforético en gel
Secuenciación de ADN T7 de Pharmacia
de ADN genómico digerido con diversas
Spa (Milán, Italia) (10).
enzimas de restricción. La Figura 2
RESULTADOS Y DISCUSION muestra el patrón de hibridación
obtenido con el uso de una sonda de
Hemos establecido y optimizado un cDNA de alfa-antitripsina en un análisis
protocolo sencillo para la extracción de de Southern blot de ADN genómico de
ADN genómico a partir de 300 µl de diferentes restricciones. También hemos
sangre entera. El método implica un realizado una amplificación por PCR
primer paso en el que se lisa la sangre utilizando oligonucleótidos específicos
entera con el fuertemente denaturante de alfa-antitripsina en el ADN extraído.
detergente catiónico DTAB en una La Figura 3 muestra un ejemplo del
solución salina concentrada a 68°C fragmento específico generado y su
(paso 1). Este paso de secuencia derivada.
lisis/desnaturalización directa evita así el
riesgo inherente en las manipulaciones
de muestras de sangre no
Hemos analizado la mejor manera de
desnaturalizada, comunes a todos los
almacenar la sangre si la extracción no
demás métodos. El detergente, junto con
puede realizarse con sangre recién
las proteínas desnaturalizadas, se
obtenida. De hecho, el rendimiento de
elimina posteriormente mediante una
ADN disminuye en un 30%-40% si la
extracción con cloroformo (paso 2). Las
sangre se guarda a 4°C durante más de
proteínas desnaturalizadas forman un
cuatro días o si se congela a -20°C sin
tapón sólido en la interfase entre las
ningún tratamiento previo.
fases orgánica y acuosa. Esto permite el
Recomendamos el almacenamiento a -
simple vertido de la fase acuosa, que
20°C después de realizar el paso 1.
contiene el ADN genómico, en un nuevo
Cuando esté listo para completar la
tubo. Este paso, al evitar la aspiración
extracción, la muestra se descongela
con pipeta, mantiene la integridad del
directamente a 68°C y se utiliza para los
ADN, aumenta su recuperación y
pasos posteriores: el rendimiento de
finalmente protege al experimentador de
ADN será entonces exactamente el
la exposición al cloroformo. Después de
mismo que se informa en el método
este paso de preaclarado, el ADN
ininterrumpido.
genómico se precipita selectivamente
mediante la adición de CTAB en una
concentración más baja de NaCl (paso
3).