UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
ANTEPROYECTO
TEMA:
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Bacillus spp. Y SU EFECTO
COMO RIZOBACTERIA PROMOTORA DE CRECIMIENTO EN
Capsicum annuum L.
AUTOR:
______________________________________
DOCENTE:
PERIODO:
ENERO 2023
INTRODUCCIÓN
Las rizobacterias promotoras de crecimiento (RPCV) son bacterias que normalmente
habitan en el suelo y que tienen la capacidad de colonizar activamente el sistema radicular
de la planta para favorecer o mejorar su crecimiento y rendimiento (Moreno et al., 2018).
Su uso en la agricultura tiene mucha importancia, específicamente en la seguridad
alimentaria y la producción sostenible de cultivos debido a su capacidad de incremento en
el rendimiento cuando se usan en combinación con la fertilización, además de tener costos
bajos y no es dañino para el medio ambiente.Existen géneros de bacterias que han sido
reportados como RPCV: Agrobacterium, Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum,
Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium, Enterobacter,
Erwinia, Flavobacterium, Klebsiella, Micrococcous, Pantoea, Pseudomonas, Rhizobium y
Serratia (Ahemad y Khan 2011).
Existen varias investigaciones realizadas, demostrando el potencial de las bacterias del
género Pseudomonas y Bacillus (Grover et al., 2011). Existen mecanismos directos e
indirectos que tienen las RPCV en las plantas. Los directos ocurren cuando las bacterias
sintetizan metabolitos que solubilizan los fosfatos, producción de hormonas reguladoras del
crecimiento vegetal, fijación biológica del nitrógeno y los indirectos cuando producen
sustancias que actúan como antagonistas de patógenos, lo cual mejora la calidad de los
cultivos (Esquivel et al., 2013).
El cultivo de pimiento es uno de los vegetal más cultivados y consumidos alrededor del
mundo, ya sea en su forma natural o industrializado. Actualmente su producción ha ido en
aumento en los últimos años, obteniendo así 8113.67 toneladas (FAOSTAT, 2021). La
producción en aumento crea importancia económica y hace que los pequeños y medianos
productores creen intereses por nuevos sistemas de producción que tengan como resultado
una mayor producción, calidad del fruto y bajo costo (Espinosa et al., 2017).
Las RPCV al disminuir o sustituir la fertilización química, tienen como finalidad
incrementar rendimiento, obtener calidad y evitar la contaminación del medio ambiente. En
este contexto, este trabajo tiene como objetivo la caracterización de cepas de Bacillus spp. y
utilización como rizobacteria promotora de crecimiento en Capsicum annuum L.
Planteamiento del problema
¿Cómo identificar las cepas de Bacillus spp. y su efecto en el crecimiento del Capsicum
annuum L.?
ANTESCEDENTES
Vásconez (2020) en un trabajo realizado en tomate, mencionó que la aplicación de bacterias
rizosféricas promotoras del crecimiento vegetal (RPCV) constituye una práctica ecológica
que ayuda a optimizar los sistemas de producción agrícola y se propone como una opción
para reducir el uso de fertilizantes. Los tomates rojos tienen una gran demanda en todas
partes La producción de todo el mundo requiere una nutrición de alta eficiencia para
satisfacer las demandas del mercado en cuanto a cantidad y calidad, por lo tanto, en esta
investigación se evaluaron dos cepas Bacterias: Bacillus licheniformis (IB10) y Bacillus
megaterium (CT11) se utilizaron como promotores del crecimiento de plántulas de tomate
riñón a través de experimentos en semillero. Las diferentes variables evaluadas
demostraron diferencias estadísticas, la aplicación de Bacillus licheniformis solo en la
siembra resultó en un aumento del 10% en el diámetro del tallo y un aumento del 100% en
la biomasa seca, la aplicación semanal de Bacillus licheniformis aumentó en un 11%. Los
resultados generados nos permitieron determinar que ambas cepas bacterianas podrían
utilizarse como sustitutos fertilizantes quimicos.
Por otro lado, Calvo y Zuñiga (2010) detallaron que, Bacillus es un género altamente
presente en la rizósfera de diversos cultivos debido a su capacidad de formación de esporas
que le da una ventaja de supervivencia en la rizósfera vegetal. Este estudio tuvo como
objetivo una descripción morfológica de las colonias, caracterización fisiológica y
bioquímica a 43 aislamientos de Bacillus spp. provenientes de la rizósfera del cultivo de
papa de dos zonas altoandinas en Perú. Los resultados demostraron que la mayoría de estos
aislamientos pertenecían al grupo de "Bacillus subtilis". Por otra parte, las pruebas
fisiológicas de crecimiento a bajas temperaturas (4ºC, 10 ºC, 15ºC y 20ºC), de las 43 cepas
probadas solo una creció a 4ºC, sin embargo, el 98% creció a 10ºC y el 100% a 15 ºC y a
20ºC. Además, con respecto al pH, se observó que 100% de las cepas, crecieron bien en
ambos pHs (4 y 5.5), lo que indica una buena adaptación del crecimiento a pH ácidos. La
evaluación de los niveles de crecimiento tanto a bajo pH y temperatura baja en el tiempo,
revelan un patrón bifásico que se explicaría por pequeños periodos de retraso del
crecimiento en condiciones de estrés. Debido a las diferencias de adaptación fisiológica
entre cepas de la misma especie se puede sugerir la existencia de una gran diversidad
intraespecifica de los Bacillus aislados.
JUSTIFICACIÓN
El cultivo de pimiento en la actualidad tiene una alta demanda que impulsa a los
productores a generar interés por nuevas alternativas que permitan una mayor producción y
así poder cubrir su demanda en el mercado. La fertilización es importante en todos los
cultivos agrícolas y más cuando se trata del pimiento, requiriéndolo durante todo su ciclo
fenológico. Las consecuencias de las aplicaciones excesivas de fertilizantes al suelo
aplicaciones excesivas tienen un impacto negativo en la maduración, el rendimiento y la
calidad del fruto. La aplicación excesiva de nitrógeno produce plantas vigorosas, pero se
reduce el cuaje de frutos y el rendimiento total. Además, se convierten en pérdidas
económicas para el agricultor ocasionando serios problemas de contaminación.
Por estas razones, es necesario, la identificación de cepas del genero Bacillus spp. y su uso
para el crecimiento del Capsicum annuum L. para poder brindarle al productor la
alternativa de aplicar bioestimulantes a base de Rizobacterias que permitan el buen
desarrollo de la planta, un mayor rendimiento, calidad de fruta y que sea más amigable con
el medio ambiente.
Actualmente, son pocos los estudios realizados en Ecuador y es escaso el conocimiento de
estas rizobacterias promotoras de crecimiento y su papel en la fisiología de la planta.
OBJETIVOS
Objetivo general
Indentificar las cepas de Bacillus spp. y su efecto como rizobacteria promotora de
crecimiento en Capsicum annuum L.
Objetivos específicos
Determinar molecularmente las cepas aisladas.
Evaluar los efectos de la rizobacteria sobre las características agronómicas del C.
annuum.
MARCO TEORICO
Generalidad del pimiento
El Capsicum annuum (pimiento) es un cultivo importante de hortalizas que se cultiva en
todo el mundo. Capsicum pertenece a la familia Solanaceae y es nativo de las regiones
tropicales y subtropicales de América (Borbor & Suarez, 2010). El pimiento ha sido
utilizado por años como vegetal, colorante natural y medicina tradicional; y está entre las
primeras plantas domesticadas en el subcontinente mesoamericano (Hernández-pérez y
Gómez-García, 2020).
La planta se caracteriza por ser herbácea de tallo erecto y ramificado, de diversa altura,
entre 0.5 a 1 m; consta de una raíz pivotante, hojas ovales, alargadas, verde – oscuras y con
bordes enteros. Además, tiene flores solitarias, rara vez agrupadas en 2 o 3; su cáliz tiene
forma enredada y está provista de 5 sépalos verdes soldados entre sí; tiene la corola
enredada con 5 pétalos soldados de color blanco, raramente de color violeta pálida. Sus
estambres en número de 5, tienen anteras alargadas y dehiscencia longitudinal.
Mongkolporn & Taylor (2011).
Requerimientos edafoclimáticos
El rango de temperatura ideal para el desarrollo de la planta de pimiento está entre 18 y 28
°C. El aborto o muerte de tallos florales y flores, así como la reducción de la capacidad del
polen para la fecundidad floral, son causados por temperaturas superiores a 32 ºC y baja
humedad relativa o ambiental. Todas las flores y plantas con flores pueden ser destruidas
por temperaturas nocturnas superiores a 30 °C, pero cuando las temperaturas diurnas
descienden por debajo de 20 °C, que es la temperatura ideal para un buen cuaje, la
polinización aumenta (DANE 2015).
La humedad relativa o del ambiente óptima oscila entre el 50 % y el 70 %. El exceso de
humedad se puede reducir mediante ventilación, aumento de la temperatura, regulación del
riego y construcción de zanjas de drenaje (DANE 2015).
El pimento es una planta exigente en luminosidad, especialmente en los primeros estados
de reproducción. Cuando el cultivo se encuentra en estado de floración y fructificación y la
intensidad de la radiación solar es demasiado alta, se puede producir rajadura de frutos,
golpe de sol y coloración irregular en la madurez. En estado de plántula, el pimentón es un
cultivo relativamente tolerante a la sombra; en el semillero, la aplicación de hasta un 55 %
de sombra aumenta el tamaño de las plantas, favoreciendo posteriormente la producción de
más frutos y de tamaño más grande (Segnou, et al., 2013).
Suelo: Los suelos más apropiados para el cultivo del pimentón son aquellos que presentan:
textura media franco o franca arenosa, estructura suelta, buen drenaje, buena fertilidad
natural y pH ligeramente ácido a neutro (5,8 a 7,0) (Segnou et al., 2013).
Manejo del cultivo
Densidad de siembra. el más frecuentemente empleado en los invernaderos es de 1 metro
entre líneas y 0,5 metros entre plantas (InfoAgro, 2022).
Poda de formación. se delimita el número de tallos con los que se desarrollará la planta
(normalmente 2 ó 3). En los casos necesarios se realizará una limpieza de las hojas y brotes
que se desarrollen bajo la “cruz” (InfoAgro, 2022).
Aporcado. consiste en cubrir con tierra o arena parte del tronco de la planta para reforzar
su base y favorecer el desarrollo radicular (InfoAgro, 2022).
Tutorado. es una práctica imprescindible para mantener la planta erguida, ya que los tallos
del pimiento se parten con mucha facilidad (InfoAgro, 2022).
Riego. mediante riego por goteo y va ser función del estado fenólogico de la planta, así
como del ambiente en que ésta se desarrolla (tipo de suelo, condiciones climáticas, calidad
del agua de riego, etc.) (InfoAgro, 2022).
Abonado
Se proporcionara 50kg/1000 m2 de un abono complejo tipo 12-12-17, libre de cloro, y de
ser posible con la potasa en forma de sulfato (INTIA, 2012).
Rizobacterias promotoras de crecimiento (PRCV)
Las bacterias que están en asocio con la rizósfera de las plantas son capaces de generar
distintos mecanismos que tienen como efecto positivo el crecimiento y desarrollo (Camelo
2011). Las PGPR influyen en el desarrollo de las plantas mediante mecanismos directos
como la fijación de nitrógeno, la solubilización de minerales y la producción o cambio en la
concentración de hormonas vegetales; y por mecanismos indirectos como producción de
metabolitos antifúngicos, sideróforos, actividad lítica, inducción de resistencia sistémica,
competencia y desplazamiento. Las bacterias tienen la capacidad de interactuar con las
raíces de las plantas y así son atraídas por sustancias excretadas por la raíz, que ocasionan
el movimiento de la bacteria hacia el rizoplano de la planta y de esta forma dar inicio a una
relación de beneficie mutuo (Castaño et al., 2021).
El género Bacillus spp. al brindar la capacidad fijadora de nitrógeno y solubilizadora de
fosfato, ha creado el interés de investigadores por conocer sobre los procesos metabólicos
por medio de los cuales estos microorganismos brindan sus beneficios a la agricultura y al
ambiente. La capacidad de estos microorganismos para producir compuestos orgánicos,
realizar fijación biológica de nitrógeno (FBN) y solubilizar fosfatos (SF), son actividades
que efectúan mediante enzimas como nitrogenasas y fitasas, con un efecto positivo en la
promoción del crecimiento vegetal y en el aumento del potencial productivo. Sumado a
estos beneficios se destaca la capacidad de degradación de sustratos de plantas y animales,
la producción de antibióticos, la capacidad de sobrevivir en múltiples condiciones
ambientales y la actividad antagónica e inhibidora entre otras, pone al género Bacillus en
un lugar destacado para su uso en la agricultura sostenible (Corrales 2017).
En un trabajo realizado por Calvo y Zúñija (2010) mencionaron que en el cultivo de papa la
especie de Bacillus subtilis es un habitante bastante común en la rizósfera del cultivo y ha
demostrado una gran diversidad intraespecífica que se confirma con las diferentes
capacidades de crecimiento, tanto a temperaturas bajas como a pH ácidos.
DISEÑO METODOLÓGICO
Ubicación
El presente estudio se llevará a cabo en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de
Ingeniería Agronómica de la universidad Técnica de Manabí, ubicada en la vía Lodana-
Santa Ana.
Aislamiento de microorganismos
Inicialmente se tomarán muestras de suelo rizosférico de plantas de Capsicum annuum L.
de un sitio en particular de zonas productoras de Rocafuerte. La muestra se tomará a 15 cm
de profundidad de varias plantas, estableciendo una muestra compuesta. A partir de las
muestras de suelo se aplicará el procedimiento expuesto por Serrano et al., (2021), donde
inicialmente se realizará diluciones seriadas (10-1 a 10-7) y se cultivaran en placas con
medio Ashby para microorganismos fijadores de nitrógeno (sacarosa, 10 g; NaCl, 0,2 g;
KH2PO4, 0,2 g; MgSO4 ·7H2O, 0,2 g; CaSO4·2H2O, 0,1 g; CaCO3, 5 g; agar 15 g; pH
7,0 por cada litro) y se incubaron a 30 °C durante 5 días. Posteriormente, se aislarán
colonias puras y se cultivarán en medio NBRIP (National Botanical Research Institute's
phosphate growth medium) constituido por: glucosa, 10 g; Ca3PO4, 5 g; MgCl2·6H2O, 5
g; KCl, 0,2 g; (NH4)2 SO4, 0,1 g; agar, 20 g; H2O destilada, 1L; azul de bromofenol, 0,025
g/l para evaluar la capacidad de solubilizar fosfato, luego se les realizara una coloración
Gram y se describiran microscópicamente.
Identificación molecular.
Se utilizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el gen que
codifica para la subunidad 16S del ARNr y se utilizaran cebadores de genes específicos que
sirven para identificar especies bacterianas del género Bacillus, procedimiento descritos
Madslien et al. (2013) y Nayak et al. (2013). El producto de amplificación (1600 pb) será
secuenciado completamente y comparado con el banco de datos del NCBI (National Center
for Biotechnology Information) mediante el programa Blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), para buscar homología con secuencias de bacterias
antes reportadas (Luna-Martinez 2013).
Efecto de biofertilizantes en el crecimiento vegetal
Se sembrarán semillas del hibrido quetzal en bandejas de germinación. A los 10 días de
germinación cuando tenga sus dos primeras hojas formadas, se transplantaran a macetas de
4 kg con sustrato. Se definieran cuatro tratamientos que consistieron en suelo puro,
compost de residuos, más cuatro de las cepas aisladas; Asimismo, se incluirán dos
tratamientos control sin inocular, uno con suelo solo y otro con la mezcla de suelo y
compost (Serrano et al., 2021).
Cada aislado bacteriano se cultivará en caldo Luria Bertani a 30 °C hasta obtener una
densidad celular de 107 UFC/mL. Los días 5 y 10 se inocularán las plantas añadiendo 10
mL de la suspensión bacteriana a la matriz. Por otro lado, agregaremos 10 mL de medio
libre de bacterias a los dos controles. Después de la inoculación, las plantas se deben
mantener en cultivo hasta los 87 días y se deberán realizar mediciones de variables en 10
plantas por tratamiento para estimar el crecimiento de las plantas. En cada planta se
evaluará: longitud de tallo, longitud de raíz, peso fresco y seco de tallo, peso fresco y seco
de raíz, número de flores, número y peso total de frutos. Finalmente, se realizará un análisis
foliar de cada tratamiento por un laboratorio comercial certificado (Serrano et al., 2021).
Análisis de datos
Se realizará un análisis de varianza, con nivel de significancia α = 0,01 F (0,99;5/54).
Además, se realizará una Prueba de comparación de Tukey (α=0,05) para determinar
diferencias significativas entre tratamientos para cada variable.
Resultados esperados
Se espera poder identificar las cepas de Bacillus spp. existentes en dicha zona y constatar su
efecto sobre el crecimiento de las plantas de pimiento, para que así esta información pueda
ser aportada al sector productor, mediante actividades de capacitación con la sociedad.
PRESUPUESTO
Tipo de Valor
Descripción Cantidad Total
recurso Unitario
JERIA Paquete
(500 unidades)
$20.99 $20.99
macetas de 1
plástico
Placas petri 20 $2.20 $44.00
Caldo Ashby 6 $13.37 $80.22
Caldo Luria
3 $130.20 $390.6
Bertani
Sacarosa 2 $19.99 $39.98
Tinción Gram 1 $54.55 $54.55
Cinta parafilm 2 $8.40 $109.1
Kit para PCR 2 $404.42 $808.84
Materiales
Semillas Hibrido
1 $55.55 $55.55
quetzal
Kit de
1 $142.50 $142.50
herramientas
Centrofugador 1 $890.00 $890.00
Tubos eppendorf
1 $16.80 $16.50
(500 Unidades)
Gradilla Tubos
10 $29.44 $249.4
eppendorf
Okulab
1 $28.00 $28.00
Micropipeta
Termociclador 1 $4223,58 $4,223.58
Total $7,153.81
Fuente: Fisher Scientific y Amazon
Tipo de Cantida
Descripción Valor por mes Total
recurso d
Investigador
1 $1600.00 $9600.00
profesional
Humano
Servicios
2 $500.00 $3000.00
generales
Total $12,600.00
Fuente: (Sales 2011)
PLAN DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES. MESES
Marz Abril May Junio Julio Agosto Septiembre Noviembre Diciembre
o o
Equipos, kits de x x x x
reactivos, medios de
cultivos y
herramientas para
laboratorio
Aislamiento de x
microorganismos
Identificación x
molecular
Siembra de semilla x
en bandejas
germinadoras
Trasplante a x x
macetas
Aplicación de x x
tratamientos
Recolección de datos x x
Resultados x
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
Ahemad, M., & Khan, M. S. (2011). Functional aspects of plant growth promoting
rhizobacteria: recent advancements. Insight Microbiol, 1(3), 39-54.
Borbor, A., & Suarez, G. (2010). Producción de tres híbridos de pimiento (Capsicum
annuum) a partir de semillas sometidas a imbibición e imbibición más campo
magnético en el campo experimental Río Verde, cantón Santa Elena. [Tesis de
pregrado, Universidad Estatal Peninsula De Santa Elena].
http://repositorio.upse.edu.ec/bitstream/46000/901/1/BORBOR NEIRA ALBERTO
Y SUÁREZ SUÁREZ GARDENIA.pdf.
Camelo, M., Vera, S. P., & Bonilla, R. R. (2011). Mecanismos de acción de las
rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Ciencia y tecnología
agropecuaria, 12(2), 159-166.
Castaño, A. M. P., Durango, D. P. M., Polanco-Echeverry, D., & Arias, J. A. C. (2021).
Rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR): Una revisión sistemática
1990-2019. Revista de Investigación Agraria y ambiental, 12(2), 161-178.
Calvo, Pamela, & Zúñiga, Doris. (2010). Physiological characterization of Bacillus spp.
strains from potato (Solanum tuberosum) rhizosphere. Ecología Aplicada, 9(1), 31-
39. Recuperado en 29 de enero de 2023, de http://www.scielo.org.pe/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S1726-22162010000100004&lng=es&tlng=en.
Corrales-Ramírez MSc, L. C., Caycedo-Lozano, L., Gómez-Méndez, M. A., Ramos-Rojas,
S. J., & Rodríguez-Torres, J. N. (2017). Bacillus spp: una alternativa para la
promoción vegetal por dos caminos enzimáticos. Nova, 15(27), 46-65.
Esquivel-Cote, R., Gavilanes-Ruiz, M., Cruz-Ortega, R., & Huante, P. (2013). Importancia
agrobiotecnológica de la enzima ACC desaminasa en rizobacterias, una
revisión. Revista fitotecnia mexicana, 36(3), 251-258.
Espinosa Palomeque, B., Moreno Reséndez, A., Cano Ríos, P., Álvarez Reyna, V. D. P.,
Sáenz Mata, J., Sánchez Galván, H., & González Rodríguez, G. (2017). Inoculación
de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal en tomate (Solanum
lycopersicum L.) cv. afrodita en invernadero. Terra Latinoamericana, 35(2), 169-
178.
Faostat. (2021). Datos de cultivos y productos de ganadería.
https://www.fao.org/faostat/es/#data/QCL
Grover, M., Ali, S. Z., Sandhya, V., Rasul, A., & Venkateswarlu, B. (2011). Role of
microorganisms in adaptation of agriculture crops to abiotic stresses. World Journal
of Microbiology and Biotechnology, 27, 1231-1240.
Hernández-pérez, Talía, and María Rocío Gómez-garcía. 2020. “Capsicum annuum ( Hot
Pepper ): An Ancient Latin-American Crop with Outstanding Bioactive Compounds
and Nutraceutical Potential . A Review.” (August):1–22. doi: 10.1111/1541-
4337.12634.
Hernández, M. C. S., Lavalle, L. D. S. P., Estrada-López, H., Benítez, R., & Díaz, Y. C. A.
(2022). Identificación y caracterización de rizobacterias nativas fijadoras de
nitrógeno de Capsicum sp. de la región caribe colombiana. Revista de Investigación
Agraria y Ambiental, 13(2), 81-92.
Luna Martínez, L., Martínez Peniche, R. A., Hernández Iturriaga, M., Arvizu Medrano, S.
M., & Pacheco Aguilar, J. R. (2013). Caracterización de rizobacterias aisladas de
tomate y su efecto en el crecimiento de tomate y pimiento. Revista fitotecnia
mexicana, 36(1), 63-69.
Mongkolporn, O. y Taylor, PW (2011). Pimiento. En parientes de cultivos silvestres:
recursos genómicos y de mejoramiento (págs. 43-57). Springer, Berlín, Heidelberg.
Moreno Reséndez, A., Carda Mendoza, V., Reyes Carrillo, J. L., Vásquez Arroyo, J., &
Cano Ríos, P. (2018). Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal: una
alternativa de biofertilización para la agricultura sustentable. Revista Colombiana
de Biotecnología, 20(1), 68-83.
Segnou, J., Amougou, A., & Youmbi, E. (2013). Effect of Chemical Treatments on Pests
and Diseases of Pepper (Capsicum annuum L.). Greener Journal of Agricultural
Sciences, 3(1), 012–020. https://doi.org/10.15580/gjas.2013.1.110912245
