Practica N1 Microbiologia

MICROBIOLOGIA
INSTITUTO TECNOLÓGICO “SAN IGNACIO DE LOYOLA”

TARIJA -BOLIVIA
PRACTICA N° 1
MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES
FECALES Y ESCHERICHIA COLI POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE
(NÚMERO MÁS PROBABLE O NMP)
1.- OBJETIVOS
 . Determinar la calidad microbiológica de muestras de agua o alimentos
mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes
fecales y Escherichia coli. .
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
2.- GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces de
desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente
intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y
casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación
fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo
se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que
mientras mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad
de estar frente a una contaminación reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
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distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios

han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.),
estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.
3.- FUNDAMENTO TEÓRICO
Las bacterias del grupo coliformes se utilizan desde el inicio del siglo XX como
indicadoras de contaminación fecal. Fueron definidas siempre como bastoncillos
gram negativos, no formadoras de esporas, que pueden crecer en presencia de
sales biliares o de otros agentes tensoactivos y que fermentan la lactosa a 37°C,
con producción de ácido (ácidos orgánicos y aldehidos) y gas en 24 horas.
En las heces, están en la concentración de 10 8-1010 microorganismos por gramo.
Tradicionalmente los coliformes son clasificados en un grupo denominado
coliformes totales y dentro de este existe un subgrupo conocido como Coliformes
Fecales.
Los coliformes totales son clasificados como bacilos gram negativos aerobios y
anaerobios facultativos no esporulados que fermentan la lactosa con producción
de ácido y gas después de incubación durante 24-48 horas a 35°C. Incluye los
géneros Citrobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., en este último se
encuentra la E. coli, exclusiva de heces animales homeotérmicos.
Los coliformes fecales constituyen un subgrupo de los coliformes totales, y se
diferencian de los anteriores por ser tolerantes a temperaturas más altas,
creciendo a 44.5°C, (APHA, 1995). Se denominan termotolerantes por su habilidad
de soportar temperaturas más elevadas.
4.- FUNDAMENTO DE LA TECNICA NMP
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
37°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.
Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.
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En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo

lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos
dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar
a la lactosa como fuente de carbono.
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado
bilis verde brillante (para determinar coliformes totales) el cual es selectivo y solo
permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante, a una temperatura de 35°C
Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos

de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos, y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 por un periodo de 24 a 48 h.
5.- REACTIVOS
• Caldo lactosado o caldo lauril sulfato de sodio
• Caldo verde brillante y bilis al 2 %.
• Caldo Medio EC
• Agua de dilución
• Agua peptona
6.- EQUIPOS Y MATERIALES

 Mechero Bunsen
 Propipeta
 Gradillas
 Matras de 250 ml
 Vidrio de reloj
 Vasos precipitados de 250 ml
 Espátulas
 Probetas de 50 y 100 ml
 Tubos durham (tubo de vidrio con tapa rosca)
 Campanas de Durham
 Pipetas de 10.0 mL estériles
 Pipetas de 5.0 ml esteriles
 Pipetas de 1.0 mL estériles
 Asa bacteriológica
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 Incubadora a 35° y 45° ± 2,0ºCa.

 Estufa para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
 Autoclave
7.- PROCEDIMIENTO
7.1.- PREPARACION DE LAS DILUCIONES
 Prueba presuntiva: caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado, se
disuelve la cantidad indicada en las instrucciones del medio deshidratado
(según sea concentración simple 35,6 g o 71,2 g (doble) en 1000 ml de agua
destilada. Mezclar muy bien y calentar, sólo si es necesario, para disolver.
 Distribuir en volúmenes de 10 mL en 6 tubos de cultivo con campana
Durham en su interior.
 Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
 Prueba confirmativa:
Preparar los tubos necesarios de acuerdo a la confirmación de las pruebas
presuntivas.
 Caldo Bilis verde brillante (para coliformes totales)
Se disuelve la cantidad indicada en las instrucciones del medio
deshidratado en agua destilada. Mezclar muy bien y calentar, si es
necesario, para disolver.
 Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de cultivo con campana Durham
en su interior.
 Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
 Caldo Medio EC (para coliformes fecales Escherichia coli)
se disuelve la cantidad de 37 g. del medio deshidratado en 1000ml agua
destilada. Mezclar muy bien para disolver.
- Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de cultivo con tubos
Durham en su interior.
- Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
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7.2.- ENSAYO PRESUNTIVO

Muestra.
Antes de efectuar los cultivos, la botella con la muestra y las diluciones, deben ser
agitadas vigorosamente, con movimientos hacia arriba y hacia abajo.
Diluciones de las muestras
- Dilución 1:10. Tomar para ello 1 mL de la muestra y depositarla en un tubo de ensayo
con 9 mL de agua de dilución estéril.
- Dilución 1:100. Tomar para ello 1 mL de la dilución 1:10 y depositarla en un tubo de
ensayo con 9 mL de agua de dilución estéril.
- Si se desean más diluciones se efectúan de igual forma, de acuerdo a la cantidad de
microorganismos esperados.
Inoculación:
las muestras se inoculan de acuerdo al siguiente procedimiento:
- Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá
ser flameada con objeto de evitar contaminación.
- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio
concentración simple, con 0,1mL de muestra, (dilución de 0,001 ó 10 -3)
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- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de

sodio concentración simple, con 1 mL de la muestra. (dilución de 0,01 ó 10 -2)
- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio
concentración simple, con 10 ml de la muestra. (dilución de 0,1 ó 10 -1)
Realizar la inoculación como muestra la siguiente figura:
- Incubar todos los tubos a una temperatura de 37 °C durante 24 - 48 h.

- Después de 24 h de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay
tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio presenta turbidez y
producción de gas en la campana Durham. Al hacer esta verificación es importante
asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa en
cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo y no confundir con burbujas de
aire. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las campanas
Durham antes de proceder a la inoculación y desechar aquellos que contengan
burbujas de aire ó de alguna manera eliminar éstas y así poder utilizarlos.
- De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las
pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
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- En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en

el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 h más.
- Después de 48 ± 2h a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
- Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se
toman como negativos.
- Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la
AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
- Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATIVA para
Coliformes Totales y Fecales.
7.3 .- ENSAYO CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES TOTALES
- A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas a
los tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante.
- Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 °C.
- Examinar los tubos a las 18 ± 1 h y 48 ± 3 h de incubación y anotar el número total de
tubos que presenten formación de gas en cualquier cantidad.
- Dentro de 48 ± 3 h constituye un ensayo confirmativo positivo.
- Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo
del NMP.
- Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe
turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del
cálculo del NMP.
7.4.- ENSAYO CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES FECALES
- Someter a ensayo confirmativo todos los tubos que han resultado positivos en la
prueba presuntiva con caldo LST a las 24 y 48 h de incubación a 37°C
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- Homogenizar los tubos positivos del ensayo presuntivo por agitación o

rotación suave. Los tubos con caldo EC deben estar a temperatura ambiente antes de
la inoculación.
- Transferir una asada completa del cultivo viable desde los tubos positivos del ensayo
presuntivo, a un tubo de fermentación con caldo EC.
- Incubar durante 24 horas a 44±0,5°C, observar presencia de turbidez y gas.
- Si se observa turbidez y producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para
posteriormente hacer el cálculo del NMP.
Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la
AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
DILUCIONES DE LA MUESTRA DE ALIMENTO PARA DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN
Cuando se tiene una muestra de alimento líquida y sólida se procede a elaborar una
solución madre que consiste en colocar el material cubierto con el microorganismo en
un recipiente que contiene 100 ml de agua destilada estéril o agua peptona, una
cantidad de 10 gr. cuya suspensión resultante se debe agitar por 1 minuto, para
obtener la suspensión concentrada del inóculo. Luego de esta solución madre
proceder a la inoculación para su incubación en los tubos de prueba presuntiva y
confirmativa.
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos

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- Incubar todos los tubos a una temperatura de 37 °C durante 24 - 48 h.

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