COMPARTIMIENTOS INTRACELULARES.

CLASIFICACIÓN Y TRANSPORTE INTRACELULAR DE PROTEÍNAS.

Material preparado con el apoyo de CSE para el curso de Biología Celular y Molecular mediante el
Llamado “Confección de Manuales Didácticos” 2010 – Dr. Julio C. Siciliano.

Part of the secret of life is the immense internal surface of the cell.
Ch. S. Sherrington (1857 – 1952)

1. OBJETIVOS.

Conocer y utilizar el lenguaje adecuado propio de la disciplina para definir, describir y analizar
la organización estructural de los compartimientos intracelulares, la arquitectura molecular de
sus constituyentes y los mecanismos moleculares básicos de su fisiología.

Conocer, explicar y fundamentar los principios básicos de las principales técnicas de análisis
estructural y molecular utilizadas en BCM y conocer su importancia y aplicaciones.

Conocer los fundamentos, aplicaciones y limitaciones de la microscopía óptica y electrónica.

Conocer y describir la estructura, ultraestructura y arquitectura molecular de las células y

organelos intracelulares, y describir los procesos bioquímicos y fisiológicos fundamentales que
se desarrollan en los distintos compartimientos intracelulares.

Conocer, analizar y describir el papel funcional de los compartimientos celulares en la fisiología

celular normal y las principales consecuencias patológicas de sus alteraciones.

Comprender y describir las relaciones dinámicas que existen entre los distintos compartimientos
intracelulares limitados por membrana y sus consecuencias en la fisiología celular.

Comprender, conocer y analizar los principales mecanismos moleculares implicados en el flujo

intracelular de membranas y su regulación y las principales consecuencias funcionales de sus
alteraciones.

1
2. TEMAS A ESTUDIAR

Compartimientos intracelulares.
Retículo endoplásmico. Ribosomas.
Complejo de Golgi.
Lisosomas.
Endosomas.
Fagosomas.
Secreción.
Endocitosis y fagocitosis.
Autofagia.
Mecanismos moleculares y regulación del transporte intracelular mediado por vesículas.
Flujo de membranas y tráfico de materiales en la célula.

Bibliografía:
Biología Celular y Molecular. Lodish H., Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M,
Scott MP, Zipursky SL, Darnell J. 6a. Edición. Editorial Panamericana (y ediciones
anteriores).
La Célula. G. Cooper, 5a. Ed., Marbán.
Molecular Biology of the Cell. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K y
Walter P. 5th Edition, 2006. Garland Publishers (y ediciones anteriores).

3. GUÍA INTRODUCTORIA.

3.1 SINOPSIS

Retículo endoplásmico.
retículo endoplásmico (RE), RE liso, RE rugoso, vesículas secretorias, vía secretora
El retículo endoplásmico es la primera encrucijada en la clasificación de proteínas en la
vía biosintética. En las células de mamífero, las proteínas destinadas a lisosomas,
membrana plasmática y la secreción son sintetizadas en ribosomas adheridos a las
membranas del retículo endoplásmico rugoso y se transfieren a este organelo mientras
están siendo traducidas (en forma co-traduccional).
2
Secuencia señal
secuencia señal, microsomas, partícula de reconocimiento de señal, peptidasa de señal

Las proteínas pueden ser transferidas al RE mientras están siendo traducidas o luego de
finalizada su traducción. En los mamíferos son transferidas mientras se traducen. Los
ribosomas que portan las secuencias polipeptídicas nacientes se adhieren a las
membranas del retículo endoplásmico por el reconocimiento de una secuencia en el
extremo N terminal de la proteína que está siendo sintetizada.

Inserción de proteínas en la membrana del RE

cotraduccional, post-traduccional, traslocón

Las proteínas integrales de membrana o del RE, del aparato de Golgi y los lisosomas se
insertan en la membrana del RE al inicio de su síntesis. En lugar de ser translocadas a la
luz del RE están proteínas se anclan a la membrana y permanecen como proteínas
integrales.

Plegamiento y procesamiento de proteínas

chaperonas, estrés del RE, glicosilación, GPI

Las cadenas polipeptídicas se pliegan en su conformación tridimensional correcta en el

RE. Aquí también tiene lugar la glicosilación y unión de glicosilfosfatidilinositol (GPI).
En la luz del RE las proteínas se pliegan y oligomerizan, se forman puentes disulfuro, y
se adicionan oligosacáridos (N-glicosilación). La N-glicosilación es utilizada como
indicador del estado de plegado de las proteínas, de modo que sólo dejan el RE las
proteínas correctamente plegadas. Aquellas que no lo están son devueltas al citosol,
donde son desglicosiladas, ubiquitinizadas y degradadas en proteasomas. Si las
proteínas mal plegadas se acumulan excesivamente en el RE gatillan una respuesta
adaptativa que activa la transcripción nuclear de chaperonas y proteasas para contribuir
a dar cuenta del conflicto.

3
Retículo endoplásmico liso
flippasa, biosíntesis de lípidos

Es el principal sitio de síntesis de lípidos en las células eucariotas. El RE liso abunda en

células con un metabolismo lipídico activo y en las que realizan la detoxificación de
fármacos liposolubles.
Clasificación y exportación de proteínas y lípidos
vesículas de transporte, COP II, COP I

Las proteínas y lípidos son exportados al aparato de Golgi en vesículas de transporte.

Las proteínas residentes del RE poseen señales que permiten traerlas de regreso desde el
aparato de Golgi cuando llegan allí de modo inespecífico.

Organización del aparato de Golgi

aparato de Golgi, cara cis, cara trans, maduración cisternal, transporte vesicular,
tabicamiento rápido

Participa en el procesamiento y clasificación de proteínas y en la síntesis de lípidos y

glicoproteínas. Las proteínas se transportan del RE al Golgi en vesículas. De la cara cis
a la trans los materiales se transportan dentro de las cisternas del Golgi a medida que
van siendo procesados. Vesículas de transporte retrógrado permiten relocalizar en los
compartimientos específicos a las enzimas de procesamiento.

Glicosilación de proteinas
M6P, proteínas lisosomales, N- y O-glicosilación

Los N-oligosacáridos agregados a las proteínas en el RE son modificados en el Golgi.

También tiene lugar la O-glicosilación. Las proteínas de destino lisosomal son
fosforiladas en residuos manosa, y la manosa-6-fosfato así formada actúa como señal
para el transporte de estas proteínas al compartimiento endolisosomal.

4
Distribución de proteínas
secreción constitutiva, secreción regulada, compartimiento endolisosomal

Desde la cara trans del Golgi brotan vesículas de transporte que transfieren proteínas al
espacio extracelular por los procesos de secreción constitutiva y regulada.

Brotamiento de vesículas de transporte

proteínas de cubierta, vesículas cubiertas proteínas G, clatrina, COP I, COP II,
La superficie citosólica de las vesículas está recubierta de proteínas citosólicas de
cubierta que dirigen el brotamiento y seleccionan las moléculas específicas que serán
transportadas.

Fusión de vesículas con el compartimiento blanco y transferencia de la carga

SNAREs, NSF, SNAPs, Rab

La selección del blanco adecuado y la fusión de las vesículas de transporte con la

membrana blanco está mediada por interacciones específicas entre proteínas de
membrana vesicular y blanco.

Lisosomas
hidrolasas ácidas, lisosomas

Los lisosomas contienen una serie de hidrolasas que degradan proteínas, ácidos
nucleicos, polisacáridos y lípidos y que funcionan de modo óptimo al pH ácido
intralisosomal.

Endocitosis
endosoma temprano, cuerpo multivesicular, endosoma tardío, lisosoma, cuerpo
residual

Las moléculas extracelulares captadas son transportadas a los endosomas, que dan lugar
a lisosomas al incorporar hidrolasas provenientes del aparato de Golgi

5
Fagocitosis, autofagia.
fagocitosis, fagosoma, autofagia, autofagosoma

Los lisosomas son responsables de la degradación de partículas grandes ingeridas

mediante fagocitosis y de la digestión de los propios componentes de la célula mediante
la autofagia.

3.2 TOPOLOGIA DE LOS COMPARTIMIENTOS INTRACELULARES.

Los sistemas de membranas intracelulares característicos de las células eucariotas

proveen el sustrato físico para el desarrollo muchas funciones celulares a la vez que
crean compartimientos acuosos funcionalmente especializados y separados del citosol.
Dado que las membranas son impermeables a la mayoría de las moléculas hidrofílicas,
las membranas deben tener sistemas transportadores para la importación y exportación
de metabolitos específicos. Además cada organelo debe tener un mecanismo para
importar e incorporar en el organelo las proteínas específicas que le confieren identidad
y especificidad a ese compartimiento.

En las células eucariotas se encuentran cuatro grupos de compartimientos intracelulares:

(1) el núcleo y el citosol, los cuales se comunican a través de los complejos de poros
nucleares y son por lo tanto continuos desde el punto de vista topológico (aunque son
funcionalmente distintos); (2) todos los organelos que intervienen en las vías secretoria
y endocítica (retículo endoplásmico, aparato de Golgi, endosomas, lisosomas, vesículas
de transporte); (3) mitocondrias; y (4) plastos (únicamente en las células vegetales).

Todas las proteínas (excepto las pocas sintetizadas en las mitocondrias) comienzan su
síntesis en el citosol. Para alcanzar su destino final en la célula deben moverse y fluir a
través de distintos compartimientos. Este destino depende de su propia secuencia
aminoacídica, la cual pueden contener señales de clasificación que la dirigen fuera del
citosol. Muchas proteínas carecen de señales de clasificación, y consecuentemente
permanecen como residentes permanentes en el citosol. Muchas otras sin embargo
poseen señales de clasificación que dirigen su transporte desde el citosol hacia el
núcleo, el retículo endoplásmico, mitocondrias o peroxisomas. El tránsito desde el
6
retículo endoplásmico hacia otros compartimientos es dirigido por otras señales de
clasificación. Para entender los principios generales de las señales de clasificación es
importante distinguir tres vías distintas por las cuales las proteínas pueden moverse
entre compartimientos (Fig 3.2.1).

Figura 3.2.1. Compartimientos intracelulares.

A) En gris se muestran compartimientos intracelulares topológicamente equivalentes
(retículo endoplásmico, aparato de Golgi, vesículas de transporte) al espacio
extracelular. El transporte de materiales entre núcleo y citoplasma se produce por un
mecanismo controlado por los poros nucleares (1). El traslocamiento de proteínas a
través del espesor de las membranas, entre compartimientos no equivalentes desde el
punto de vista topológico se ilustra en (2). Las proteínas puede ser transferidas por
este mecanismo al retículo endoplásmio, peroxisomas, mitocondrias y en células
vegetales los plastos. En mamíferos, la traslocación de proteínas al retículo
endoplásmico por este mecanismo se produce mientras la proteína se está traduciendo
(traslocación cotraduccional). B) A lo largo de su trayecto en la vía secretoria la
topología de los dominios proteicos se conserva, de modo que el dominio intraluminal
en el retículo endoplásmico, se encontrará expuesto al exterior celular en la membrana
plasmática.

7
(1) Transporte controlado a través de los complejos de poros nucleares. El tráfico de
proteínas ocurre entre espacios equivalentes desde el punto de vista topológico (citosol
y núcleo), los cuales se encuentran en continuidad a través de los poros nucleares. El
complejo de poro funciona como una compuerta selectiva que transporta
macromoléculas y ensamblados macromoleculares en forma activa. También permiten
la difusión libre de moléculas más pequeñas.

(2) En el transporte transmembrana, traslocadores de proteínas unidos a membranas

transportan directamente proteínas específicas a través de una membrana desde el
citosol hacia un espacio topológicamente diferente. La proteínas transportada
usualmente debe encontrarse desplegada para pasar a través del traslocador. El
transporte inicial cotraduccional de las proteínas desde el citosol hacia la luz del retículo
endoplásmico ocurre de esta manera. Muchas proteínas mitocondriales son traslocadas
hacia la mitocondria en forma post-traduccional de esta forma. Este mecanismo de
traslocación post-traduccional también es común en el pasaje de proteínas del citosol al
retículo endoplásmico en las levaduras, y también puede observarse ocasionalmente en
células de organismos superiores.

(3) En el transporte mediado por vesículas, vesículas intermediarias rodeadas de

membrana transportan proteínas de un compartimiento a otro. Las vesículas poseen
moléculas de carga, derivadas de la luz del compartimiento del cual han brotado
(compartimiento dador), y las descargan en un segundo compartimiento
(compartimiento aceptor o blanco) fusionándose con él. Dado que las proteínas
transportadas no atraviesan una membrana, el transporte vesicular puede mover
proteínas únicamente entre compartimientos que son equivalentes desde el punto de
vista topológico.

Cada uno de los tres tipos de mecanismo implicado en el tráfico intracelular de

proteínas es guiado y dirigido por señales de clasificación presentes en la proteína
transportada que son reconocidas por sistemas receptores complementarios. Si una
proteína debe ser importada al núcleo debe poseer una señal de clasificación que será
reconocida por proteínas receptoras que la guían a través del complejo de poro nuclear.
Si una proteína debe ser transferida a través de una membrana, debe poseer una señal de
8
clasificación que es reconocida por el translocador presente en la membrana que debe
cruzar. Si una proteína es cargada en un cierto tipo de vesícula de transporte, o por el
contrario es retenida en un determinado organelo, dependerá de que su señal de
clasificación sea reconocida por un sistema receptor complementario en la membrana
apropiada.

Una conclusión que puede extraerse de este concepto sobre las proteínas de la superficie
celular es que dado que las luces del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi son
equivalentes desde el punto de vista topológico al exterior celular, las porciones de la
cadena polipeptídica expuestas a la luz del retículo endoplásmico estarán expuestas al
exterior celular luego de finalizado su transporte intracelular.

Figura 3.2.2 Relaciones topológicas entre compartimientos intracelulares.

Las proteínas comienzan su síntesis en el citosol. Desde este compartimiento pueden
ser transferidas al núcleo, a través de los poros nucleares (1); o a plastos,
mitocondrias, peroxisomas y retículo endoplásmico rugoso. La translocación al retículo
endoplásmico se realiza mientras la proteína se está traduciendo (translocación
cotraduccional) (2). Desde el retículo endoplásmico las proteínas siguen la ruta
secretoria, pasando por el aparato de Golgi para luego ser empaquetadas en vesículas
de secreción, o dirigirse al compartimiento endolisosomal. Este mecanismo de
transporte de proteínas entre compartimientos se realiza mediante vesículas de
trasnporte (3). Las flechas ilustran las relaciones de estos compartimientos
intracelulares entre ellos y con el exterior celular.
9
3.3 RETÍCULO ENDOPLÁSMICO

El retículo endoplásmico es un organelo especializado en el cual una variedad de

señales y vías metabólicas se integran para regular el metabolismo de lípidos, glucosa,
colesterol y proteínas, y puede considerarse el principal sitio de regulación de la
homeostasis celular. El retículo endoplásmico rugoso es el principal sitio de síntesis
proteica, y junto con el aparato de Golgi interviene en el transporte y secreción de
proteínas correctamente plegadas. Los ribosomas adheridos a la membrana del retículo
endoplásmico traducen péptidos de novo en el espacio luminal, mientras en la luz,
chaperonas como BiP, calnexina y calreticulina intervienen en el plegado de los
péptidos recién sintetizados y previenen la agregación de precursores sin plegar o
incorrectamente plegados.

Además del retículo endoplásmico rugoso, las células contienen túbulos ramificados y
anastomosados desprovistos de ribosomas que forman redes densas. Los elementos
tubulares de este retículo endoplásmico liso son continuos en muchos sitios con las
cisternas del retículo endoplásmico rugoso. El retículo endoplásmico es por lo tanto un
sistema continuo de túbulos y cisternas limitados por membrana, el cual en algunas
regiones tiene ribosomas asociados y participa en la síntesis y transporte de proteínas,
mientras otras regiones, desprovistas de ribosomas, se especializan en las otras
funciones ya mencionadas relacionadas con el metaboliso lipídico y glucídico.

La extensión y desarrollo de las variedades rugoso y liso en un tipo celular determinado

dependen de la importancia de la síntesis proteica en relación a las otras funciones
llevadas a cabo por los constituyentes de sus membranas.

Visto en microfotografías electrónicas de células intactas, el retículo endoplásmico

rugoso es una red continua formada por un sistema canalicular limitado por una
membrana. Sin embargo en las secciones delgadas se aprecia como perfiles circulares o
elongados independientes entre si. Estos perfiles circulares y elípticos son secciones
transversas u oblicuas de elementos tubulares, y los perfiles elongados son secciones a
través de dilataciones amplias y planas del sistema canalicular denominadas cisternas.
Estas últimas tienden a ordenarse en filas paralelas. La estructura en vesículas que
también se observa en la figura 3.3 corresponde a un artefacto inducido por ciertos tipos
de fijación. Este tipo de retículo, caracterizado por estar tachonado por ribosomas
10
adheridos es designado granular o rugoso, para distinguirlo de las áreas que carecen de
ribosomas y se denominan retículo endoplásmico liso o agranular. El gran número de
ribosomas asociados, los cuales son organelos ricos en ácidos nucleicos, hace que estos
agregados de cisternas paralelas, observados en preparaciones para microscopía óptica
aparezcan como acúmulos intensamente basófilos, los cuales en la literatura clásica se
refieren como cuerpos basófilos, cromidia, sustancia cromófila o ergastoplasma,
términos que se encuentran en desuso.

Las cisternas son más abundantes en las células que sintetizan grandes cantidades de
proteína de exportación como producto de secreción. Pueden en general disponerse en
pilas paralelas de 2 a 4 µm de largo, o cuando son muy largas pueden formar extensos
sistemas concéntricos. La luz de las cisternas suele ser estrecha, aunque en los
márgenes donde se continúan con elementos tubulares del retículo la luz se amplía
ligeramente.

El contenido del retículo endoplásmico rugoso usualmente es extraído durante la

preparación del espécimen, de modo que la luz suele ser de densidad electrónica más
baja que la matriz citosólica observada entre las cisternas. Sin embargo, con ciertos
métodos de fijación puede preservarse un precipitado floculento pálido en el interior de
la luz, que representa una solución diluída de las proteínas recién sintetizadas, las cuales
serán subsecuentemente transportadas al complejo de Golgi para ser concentradas y
empaquetadas en gránulos secretorios.

Figura 3.3. Retículo endoplásmico rugoso (dibujo modificado del clásico original
publicado en The Cell, 2nd ed. D.W. Fawcett, Saunders, PA, 1981) .

11
Las neuronas, observadas con microscopio óptico y coloreadas con anilinas básicas se
caracterizan por la presencia de grandes bloques angulares de material basófilo en su
citoplasma, denominados cuerpos o grumos de Nissl. Cuando son analizados con el
microscopio electrónico, se observa que están formados por una disposición ordenada
de cisternas de retículo endoplásmico. A diferencia de las pilas de cisternas observadas
en células epiteliales, las cisternas son fenestradas y están separadas por intervalos de
0,2 a 0,5 µm, en los cuales se observa una gran cantidad de poliribosomas libres.
Además se observan numerosos poliribosomas adheridos a las membranas cisternales.
Los grumos de Nissl de las neuronas difieren del ergastoplasma de las células
glandulares en la separación mayor de las cisternas paralelas y en la gran cantidad de
poliribosomas libres asociados. Mientras que ambos son centros de activa síntesis
proteica, las diferencias en la arquitectura del retículo está indudablemente relacionada
con el destino distinto de las proteínas sintetizadas. En las células glandulares, la
síntesis proteica se asocia fundamentalmente con la secreción, y la mayoría de los
ribosomas se asocian a la membrana del retículo endoplásmico rugoso. En las
neuronas, una gran parte de las proteínas sintetizadas se destinan a la utilización en el
mantenimiento y renovación de los componentes del citoplasma, incluyendo la
membrana plasmática y el pericarion, las dendritas y el usualmente largo axón. Rara vez
puede observarse contenido en la luz del retículo endolásmico.

En los plasmocitos se observa una configuración especial. Estas células, activamente

comprometidas con la síntesis de inmunoglobulinas, presentan un extenso retículo
endoplásmico rugoso. El producto de síntesis se acumula en la luz del retículo, donde
puede observarse como un precipitado amorfo. A diferencia de las células glandulares,
en estas células el producto de secreción no se concentra en el aparato de Golgi, sino
que el almacenamiento tiene lugar en las cisternas del retículo endoplásmico, las cuales
pueden llegar a distenderse mucho.

Los estudios tempranos en el retículo endoplásmico se concentraron en el retículo

endoplásmico rugoso, y en su correspondencia con el ergastoplasma de la citología
clásica. Sin embargo pronto fue evidente que la mayoría de las células contenía un
sistema de túbulos limitados por membrana sin ribosomas adheridos, y que este retículo
endoplásmico liso estaba vinculado a funciones celulares diferentes. Su riqueza en las
glándulas de Meibomio y en el epitelio intestinal luego de la absorción de grasas
12
sugirieron un papel en el metabolismo lipídico. Su enorme desarrollo en la corteza
adrenal, las células intersticiales del testículo y el cuerpo lúteo del ovario sugirieron su
relación con la biosíntesis de hormonas esteroideas. Su asociación con el glucógeno en
el hígado permitió vincularlo con la glucogenolisis. Se observó además una hipertrofia
del retículo endoplásmico liso con un aumento concomitante de ciertas oxidasas
hepáticas, implicando una función importante de detoxificación en el metabolismo de
ciertas drogas.

El retículo endoplásmico liso es un organelo dinámico capaz de responder a una veridad

de estímulos endógenos y exógenos. Por ejemplo, la administración de fenobarbital y
otros barbitúricos, insecticidas orgánicos halogenados y otras drogas y compuestos
resulta en una hipertrofia selectiva del retículo endoplásmico liso en los hepatocitos, la
cual se acompaña de un aumento en la actividad de diversas enzimas relacionadas con el
metabolismo de drogas. Es el organelo más prominente en las células de las glándulas
que secretan esteroides, como las células interticiales del testículo, células del cuerpo
lúteo del ovario y de la corteza adrenal, donde muestra una configuración general
similar.

3.4 HIPÓTESIS DE LA SEÑAL

La hipótesis fue propuesta en 1975 por Blobel y Dobberstein para explicar el

mecanismo por el cual las proteínas pueden ser translocadas a través de la membrana
del retículo endoplásmico: en la translocación cotraduccional secuencias señal en el
polipéptido naciente son reconocidas por factores conservados en el citosol y membrana
para mediar su fijación al blanco, su translocación y/o su inserción en la membrana.
Actualmente sabemos que este proceso es iniciado cuando el core hidrófobo de una
secuencia señal emerge del ribosoma y es reconocido por la partícula de reconocimiento
de señal (SRP). El complejo ribosoma-péptido naciente-SRP es dirigido al retículo
endoplásmico por una interacción con el receptor de SRP. Posteriormente el complejo
es transferido a un translocón y el complejo se disocia.

13
3.5 MICROSOMAS

Cuando las células se homogenizan se produce la disrupción del retículo endoplásmico

rugoso en vesículas pequeñas denominadas microsomas. Los microsomas purificados
se tratan con una proteasa en presencia o ausencia de detergente. Las proteínas
secretorias asociadas con los microsomas son digeridas por la proteasa agregada si la
barrera de permeabilidad de la membrana del microsoma se destruye previamente con el
detergente. Esto indica que las proteínas recién sintetizadas se encuentran dentro de los
microsomas, que equivalen a la luz del retículo endoplásmico rugoso. El carácter
cotraduccional de la translocación puede demostrarse con el análisis de la síntesis de
proteínas en sistemas libres de células. Los microsomas desprovistos de ribosomas
asociados (por tratamientos con agentes quelantes) son equivalentes a las membranas
del retículo endoplásmico. La síntesis de una proteína secretoria se lleva a cabo in vitro.
La secuencia señal sólo es removida de la proteína si los microsomas están presentes
durante la síntesis (fig 3-4).

Figura 3.4. Estudios in vitro de síntesis de proteínas.

A) Los microsomas pueden obtenerse por homogeneización del tejido, e incubarse in
vitro en condiciones que permitan la progresión de la síntesis de proteínas. Si al medio
de incubación se adicionan proteasas, estas no afectarán las proteínas recién
sintetizadas, pues estas se encuentran dentro del compartimiento membranoso. En
14
cambio, si la membrana microsomal es alterada por pretratamiento con detergente, las
proteasas podrán acceder a las proteínas recién sintetizadas y degradarlas. B) Cuando
se adicionan microsomas a un sistema de traducción in vitro una vez comenzada la
traducción, las proteínas no serán incorporadas al microsoma, sino que permanecerán
en el compartimiento soluble y conservarán la secuencia señal N-terminal. Si en
cambio la traducción de la proteína se realiza en ribosomas adheridos a microsomas,
las proteínas quedarán contenidas en el compartimiento membranoso y la secuencia
señal será removida por las peptidasas de señal, presentes en la luz del microsoma.

3.6 APARATO DE GOLGI

El complejo de Golgi es la estación central de procesamiento y clasificación de la vía

secretoria. Su función es asegurar que las proteínas sintetizadas en el retículo
endoplásmico sean apropiadamente glicosiladas y empaquetadas en vesículas que las
transportarán a sus destinos finales.

Cuando se examina en micrografías electrónicas de secciones finas de tejido se observa

que el organelo está foramdo por una estructura lamelar. A estas resoluciones, se
observa constituído por sáculos o cisternas aplanadas limitadas por membrana,
íntimamente apiladas formando patrones paralelos. Las membranas son de contorno
liso, y el número de cisternas asociadas en cada pila varía con el tipo celular y su estado
fisiológico, siendo por lo general de 2 a 8, aunque en ciertos casos se ven patrones
mucho más complejos. La luz de cada cisterna es relativamente estrecha en su porción
central y algo más expandida en sus extremos. En las células de mamíferos el complejo
de Golgi consiste en pilas de cisternas conectadas por regiones túbulo-vesiculares. Estas
regiones se ha denominado zona “compacta” y “no-compacta” respectivamente, y se
considera que están conectadas formando una estructura continua en forma de cinta
(“Golgi ribbon”). Las cisternas usualmente están ligeramente curvadas, de modo que
en la pila puede reconocerse una superficie convexa y una cóncava (cara cis y trans
respectivamente). En las células glandulares, donde el aparato de Golgi ha sido más
intensamente estudiado, se localiza entre el polo apical del núcleo y la superficie
luminal. En células libres, el complejo de Golgi y los centriolos ocupan una concavidad
estrecha en el núcleo. En las neuronas, donde el organelo es muy grande y extenso,
15
existen numerosas pilas de cisternas que están interconectadas formando un sistema
reticular continuo que se extiende por todo el pericarion.

Existe una polaridad funcional y asimetría estructural en la organización del aparato de

Golgi que puede ponerse en evidencia incluso en estudios estructurales. La luz de las
cisternas es usualmente más estrecha en el lado convexo de la pila y se vuelve
progresivamente más amplia en cisternas más próximas al lado cóncavo. En células en
activo proceso de secreción, la densidad del contenido de las cisternas se incrementa
progresivamente desde la cara convexa hacia la cara cóncava. Cuando el espécimen es
sometido a postfijación con osmio, éste se deposita en la cisternas de la cara trans.
Cuando en el tejido se realiza una reacción histoquímica para demostrar la presencia de
tiamina pirofosfatasa el producto de reacción se encuentra confinado a las cisternas de
la cara convexa. La reacción histoquímica para fosfatasa ácida ocurre en las cisternas
más internas.

3.6.1 Organización
A causa de su complejidad estructural y su naturaleza altamente dinámica, los
mecanismos que regulan el tráfico de materiales y membranas a través del complejo de
Golgi todavía no han sido totalmente comprendidos. En la vía secretoria este organelo
asegura las modificaciones post-traduccionales de las proteínas de carga por distintas
enzimas de procesamiento que actúan en determinada secuencia. Por lo tanto debe
coordinar el movimiento de la carga en un sentido junto con la disponibilidad de una
línea secuencial de enzimas de procesamiento que actúan modificando la carga a
medida que se desplaza. La mayoría de los procesos de transferencia de materiales
ocurren mediante el brotamiento de vesículas pequeñas desde un compartimiento dador,
seguido por la selección y posterior fusión con un compartimiento aceptor de la carga.
Sin embargo, los mecanismos de transporte vesicular en el complejo de Golgi aún son
objeto de debate. Un concepto importante que ilustra la complejidad del proceso es que
mientras un flujo incesante y a veces masivo de materiales pasa a través del aparato de
Golgi, y tienen lugar las transformaciones de dichos materiales, el aparato de Golgi
mismo debe mantener su integridad como organelo. El concepto de auto-organización
permite formular modelos para comprender los mecanismos que regulan el tráfico de
membranas en este organelo.
16
BOX:
[Existen tres mecanismos básicos por los cuales se pueden formar las
estructuras celulares: (i) utilización de un molde previo, el cual es tomado como
modelo de estructura (por ejemplo la doble hélice de ADN); (ii) el auto-
ensamblado, en el que la interacción de las partes componentes de una
estructura lleva a su formación, de modo que el producto final es estable y se
encuentra en equilibrio una vez formado (por ejemplo cápsides virales); (iii)
auto-organización, similar a la anterior pero el producto final no se encuentra
en equilibrio sino que requiere de un aporte constante de energía para
mantenerse ensamblado (el complejo de Golgi y los microtúbulos son buenos
ejemplos de auto-organización)].

Fig 3.6.1 Organización estructural del aparato de Golgi en células de mamíferos.

(dibujo adaptado y modificado de Jackson, CL., 2009 J Cell Science, 122:443). Se
representan las zonas compactas y no compactas que alternan formando estructuras
alargadas y continuas (“Golgi ribbon”) características de este organelo en células de
mamíferos.

3.6.2. Mecanismos de transporte de materiales en el aparato de Golgi.

El modelo de tráfico vesicular anterógrado postula que las vesículas transportan carga
desde un compartimiento hacia el siguiente. Este modelo sencillo y directo es
sustentado por evidencia experimental para el tráfico de materiales que se produce

17
desde el retículo endoplásmico hasta el primer compartimiento del Golgi y es mediado
por vesículas con cubierta COP II. Este modelo no se aplica con la misma simplicidad a
los intercambios de materiales entre distintos compartimientos del Golgi.

El modelo de maduración cisternal es mucho más adecuado para explicar el tráfico de

materiales dentro del Golgi. Este modelo postula la maduración de las membranas en el
aparato de Golgi, que permite que un set de proteínas residentes sea cambiado por otro,
y en consecuencia los materiales contenidos en la luz vayan procesándose
secuencialmente. A medida que las cisternas maduran (modifican sus proteínas
residentes y se produce la maduración de las proteínas de carga) se van desplazando en
la pila de cisternas del Golgi en dirección cis a trans. A la vez, las enzimas de
procesamiento van siendo transportadas por vesículas de transporte retrógrado en
dirección trans a cis, para modificar la carga en las cisternas más jóvenes.

Este modelo sin embargo no puede explicar satisfactoriamente las evidencias

experimentales más recientes. Por ello se acepta un tercer modelo, algo más complejo,
denominado de tabicamiento rápido, que implica tres conceptos principaels: (i) tráfico
bidireccional de enzimas de procesamiento y de proteínas de carga entre los
compartimientos del Golgi; (ii) separación y clasificación de los lípidos de membrana
(glicerofosfolípidos y esfingolípidos) en cada compartimiento del Golgi; y (iii) las
proteínas de carga y las enzimas de glicosilación se asocian preferentemente con un
determinado entorno lipídico. Las proteínas de carga que se dirigen a la membrana
plasmática se encuentran en dominios ricos en esfingolípidos y pueden salir del Golgi a
partir de cualquier compartimiento.

Si bien este último modelo es el más completo y el que permite explicar la mayoría de
las evidencias experimentales, este tema aún es objeto de intensa investigación y no se
considera totalmente aclarado.

18
Figura 3-6-2 Mecanismos de transporte de materiales en el aparato de Golgi
(esquema adaptado y modificado de Jackson, CL., 2009 J Cell Science, 122:443).
(A) Transporte vesicular. Las vesículas con las proteínas de carga brotan de un
compartimiento dador y se fusionan con el compartimiento siguiente. El transporte
retrógrado vuelve los componentes residentes del Golgi a sus compartimientos
específicos. (B) Maduración cisternal. Las vesículas de transporte retrógrado brotan
desde u compartimiento dador (tardío, trans) hacia un compartimiento aceptor (más
temprano, cis) llevando enzimas de procesamiento residentes del Golgi. La carga
progresa como resultado de la maduración de un compartimiento en otro más maduro,
a la vez que las cisternas se desplazan en dirección trans. (C) Tabicamiento rápido. La
carga, y las enzimas de glicosilación son transportadas al Golgi desde el retículo
endoplásmico en vesículas de transporte. Una vez en el Golgi la carga puede moverse
por transporte vesicular en forma bidireccional, tanto cis a trans como trans a cis. Las
enzimas residentes del Golgi y la carga se clasifican por su asociación preferencial con
distintos entornos lipídicos.

3.7 LISOSOMAS. ENDOSOMAS.

La historia de la mayoría de los organelos celulares ha sido la descripción temprana por
los microscopistas, seguida años más tarde por la caracterización bioquímica. El
lisosoma es una excepción, puesto que se originó como un concepto bioquímico, el cual
fue seguido por la caracterización morfológica. Entre los investigadores que aisalaban
mitocondrias y microsomas existían discrepancias sobre la ubicación en las fracciones
19
de homogenato de la fosfatasa ácida. DeDuve (1955) demostró que existía una fracción
particulada rica en fosfatasa ácida, que contenía además ribonucleasa,
desoxiribonucleasa, glucuronidasa y catepsina, y estas partículas recibieron el nombre
de lisosomas en atención a su riqueza en enzimas hidrolíticas. Otros estudios
bioquímicos permitieron deducir que las enzimas hidrolíticas debían estar encerradas en
un compartimiento limitado por membrana. Posteriormente fueron identificados en
microfotografías electrónicas gracias a las técnicas que permiten evidenciar la
localización de la actividad fosfatasa ácida en el tejido. Estos estudios mostraron que a
diferencia de las mitocondrias por ejemplo, y de otras estructuras fácilmente
identificables y reconocibles, estos organelos donde se localiza la actividad fosfatasa
ácida varían en tamaño y muestran una estructura interna muy heterogénea. Algunos
son esféricos con un contenido de densidad uniforme; otros poseen contorno irregular y
contienen agregados de gránulos muy densos y matriz menos densa. Este extraordinario
pleomorfismo es el que había evitado la identificación anatómica previa, y es el que
explica que estos organelos no puedan ser identificados con seguridad por criterios
exclusivamente morfológicos.

Los lisosomas son organelos citoplásmicos rodeados por membrana que actúan como el
principal compartimiento de degradación en las células eucariotas. Las macromoléculas
endógenas y exógenas pueden ser conducidas a los lisosomas a través de las vías
biosintética y endocítica respectivamente. Además, los lisosomas pueden degradar
proteínas citosólicas, que son transportadas a través de la membrana lisosomal por
carrier específicos.

La función de degradación en estos organelos es llevada a cabo por más de 50

hidrolasas ácidas (proteasas, lipasas, glicosidasas, etc) contenidas en su luz. Su
membrana limitante contiene un repertorio de proteínas de membrana altamente
glicosiladas características, denominadas LAMPs, cuya función aún no ha sido
dilucidada.

Morfológicamente son heterogéneos, y resultan difíciles de diferenciar de otros

compartimientos de las vías endocítica o secretoria. Por ello actualmente se distinguen
de otros organelos de acuerdo a una definición operacional, según la cual los lisosomas
20
son organelos de interior ácido (pH 4,6 – 5.0), rodeados por membrana que contienen
hidrolasas ácidas maduras y LAMPs pero carecen de receptores de manosa-6-fosfato
(M6P-R). La mayoría de estas características los lisosomas las comparten con un grupo
de organelos específicos de determinados tipos celulares que incluyen melanosomas (en
melanocitos), gránulos líticos (linfocitos citotóxicos y natural killers), compartimientos
del complejo de histocompatibilidad clase II (células presentadores de antígenos),
gránulos densos plaquetarios (plaquetas), gránulos basófilos (leucocitos basófilos), y
gránulos azurófilos (leucocitos neutrófilos).

3.8 ENDOCITOSIS

El proceso inicia con la formación de una vesícula de endocitosis. Si se trata de

sustancias no visibles con el microscopio electrónico es una vesícula de pinocitosis. En
la endocitosis de partículas de mayor tamaño el proceso se denomina fagocitosis
(fagocitosis de bacterias por los macrófagos, por ejemplo) y las vesículas formadas se
denominan fagosomas. En ocasiones el material digerido es proveniente de la propia
célula, en cuyo caso la vesícula se denomina autofagosoma.

El endosoma recién constituído pasa a formar parte de una red de túbulos y vesículas
conocida como compartimiento endosómico temprano (o externo, o periférico). El
endosoma temprano es el principal compartimiento de clasificación de la vía endocítica.
Muchos ligandos que han sido endocitados por unión a receptores se disocian de sus
receptores en el endosoma temprando a causa de la acidez de su luz (pH de 6,2) y
muchos de estos receptores son reciclados a la superficie celular.

Desde los endosomas tempranos se emiten vesículas esféricas, algunas con vesículas
más pequeñas en su interior (cuerpos multivesiculares). Estas vesículas se fusionan con
el compartimiento endosómico tardío (o interno, o perinuclear). Este compartimiento
posee un pH de 5,5 y su membrana posee receptores para M6P mediante el cual se fijan
las enzimas lisosomales presentes en este compartimiento. A partir de los endosomas
tardíos se originan los lisosomas (antes denominados lisosomas secundarios),
caracterizados por un pH más ácido (4,6 - 5,0) y la ausencia de receptores para M6P,
por lo que las enzimas lisosomales se encuentran libres en su luz. Por otra parte, la

21
actividad fosfatasa lisosomal suele remover los grupos M6P por lo que las enzimas
quedan “atrapadas” en este compartimiento.

Las enzimas lisosomales son sintetizadas en el aparato de Golgi y emigran desde la cara
trans del organelo en pequeñas vesículas de 0,2 - 0,5 µm (antes llamadas lisosomas
primarios). Estas vesículas se unen al compartimiento endosomal tardío (en ocasiones a
los cuerpos multivesiculares), y los receptores de M6P son reciclados al complejo de
Golgi o a la superficie celular.

En ocasiones los residuos de la digestión intralisosomal se acumulan en el lisosoma y

permanecen allí durante el resto de la vida de la célula, formando los denominados
cuerpos residuales o telolisosomas. Un ejemplo son los gránulos de lipofucsina,
resultantes de la degradación incompleta de lípidos que pueden observarse con
frecuencia en células de larga vida, como los hepatocitos y las neuronas.

Los lisosomas no sólo degradan sustancias provenientes del exterior celular, sino que
también pueden digerir organelos y porciones del citoplasma de la propia célula en
vesículas grandes denominadas autofagosomas (autolisosomas, citolisosomas) que se
forman con membranas provenientes probablemente del retículo endoplásmico.

En muchas células de diferentes organismos se han encontrado estructuras constituídas

por una membrana que en su interior contienen numerosas vesículas conocidas como
cuerpos multivesiculares. Su contenido en fosfatasa ácida hizo que se les considerara un
tipo especial de lisosoma. Actualmente se acepta que forman parte del sistema vesicular
que transporta materiales desde el compartimiento endosomal temprano al tardío. Los
cuerpos multivesiculares pueden fusionarse con las vesículas que transportan enzimas
lisosomales provenientes del Golgi, lo que explica su contenido en fosfatasa ácida.

22
3.9 TRANSPORTE INTRACELULAR MEDIADO POR VESÍCULAS.
El transporte mediado por vesículas permite transportar proteínas entre compartimientos
equivalentes desde el punto de vista topológico.

3.9.1. Brotamiento de las vesículas.

El brotamiento de vesículas depende de la fijación de proteínas de cubierta al lado
citosólico de la membrana del compartimiento dador. El ensamblado de las proteínas de
cubierta en determinados patrones geométricos determina la deformación de la
membrana. La fijación de proteínas de cubierta a la membrana es regulada por proteínas
G monoméricas (familia Sar o ARF). Existen distintos tipos de proteínas de cubierta, los
cuales pueden requerir o no proteínas adaptadoras que medien su interacción con la
membrana. La hidrólisis del GTP unido a la proteína G determina su unión a GDP y su
pasaje a una forma inactiva, desencadenando la pérdida de la cubierta y la formación de
una vesícula desnuda.

3.9.2. Selección de carga.

Una proteína que se encuentra en un determinado en la luz o formando parte integral de
la membrana de un compartimiento puede permanecer como residente en ese
compartimiento o pasar a integrar una vesícula de transporte con otro destino celular. La
elección del destino de cada proteína depende de señales presentes en la propia
estructura de la proteína (por ejemplo secuencias aminoacidícas particulares).

3.9.3. Fusión con la membrana blanco.

Una vez que las vesículas han brotado del compartimiento dador deben encontrar su
compartimiento de destino. El tránsito de vesículas está parcialmente regulado y
asistido por relaciones con el citoesqueleto microtubular. El reconocimiento y fusión de
una vesícula con su membrana blanco está determinado por la especificidad de otra
familia de proteínas G monoméricas (Rab) y por el reconocimiento y afinidad de una
serie de proteínas presentes en la vesícula (SNARE-v) y en la membrana blanco
(SNARE-t). Cuando estas proteínas interactúan y se asocian forman un complejo
(complejo core) junto a proteínas citosólicas (NSF, SNAPs) altamente estable y muy
difícil de desarmar. La formación del complejo es un paso necesario para que se
produzca la fusión. Sin embargo, una vez formado, el complejo debe desarmarse para
23
que la fusión tenga lugar, lo cual se logra por la energía liberada de la hidrólisis de ATP
provocada por la actividad ATPasa de una de las proteínas del complejo (NSF). La
hidrólisis de ATP por NSF es seguida por la fusión de las membranas. El contenido de
la vesícula es descargado en el compartimiento aceptor, y la membrana vesicular pasa a
formar parte de la membrana aceptora. Estos componentes podrán ser reciclados y
volver al compartimiento de origen, o quedar formando parte del compartimiento
aceptor.
BOX:
[En sistemas in vitro se observó que la fusión de vesículas era inhibida por la
susceptibilidad de una proteína presente en el citosol al agregado de la droga
N-etil-maleimida. Dicha proteína, necesaria para la fusión y aún no
caracterizada, se llamó “proteína de fusión sensible a la N-etil-maleimida” o
NSF (N-ethyl-maleimide Sensitive Fusion protein). Posteriormente se
describieron otras proteínas solubles citosólicas capaces de fijarse a NSF
formando un complejo las cuales se denominaron “proteínas Solubles asociadas
a NSF”, o SNAPs por la sigla de su nombre en inglés (Soluble NSF-Attachment
Proteins). Finalmente, se describieron proteínas en la membrana vesicular y en
la membrana blanco, capaces de interactuar específicamente con estas
proteínas, y se denominaron “receptores de SNAPs” o SNAREs por su nombre
en inglés (SNAps REceptors).]

24
3.10 VISIÓN GENERAL DEL FLUJO DE MATERIALES EN LOS
COMPARTIMIENTOS INTRACELULARES.

Fig 3.10
1. Las proteínas con una secuencia de importación al retículo endoplásmico (como la
proteínas secretoria de la figura) son sintetizadas hacia la luz del organelo (o pueden
permanecer formando parte de la membrana del RE y ser posteriormente transportadas a
otro compartimiento o a la superficie celular).
2. Las proteínas secretorias son transportadas hacia la cara cis del aparato de Golgi por
vesículas de transporte que brotan del RE revestidas por una cubierta de proteínas COP
II. En esas vesículas viajan proteínas solubles que deben ser secretadas, proteínas de
membrana que se dirigen a otros compartimientos de esta vía, receptores de proteínas
solubles y también proteínas que entran a la vesícula de transporte por error.
3. Las proteínas residentes del RE que han sido transportadas por error al aparato de
Golgi retornan al RE por vesículas de transporte retrógrado que brotan del aparato de
Golgi con cubierta COP I. Estas proteínas poseen la secuencia KDEL distintiva de los
componentes residentes del RE. El receptor de KDEL reconoce la secuencia en el
aparato de Golgi y fija estas proteínas, permitiendo su retorno al RE. La fina
25
sensibilidad del receptor KDEL al pH permite que las pequeñas diferencias de pH entre
el aparato de Golgi y el RE expliquen que el receptor fije la proteína en el Golgi y la
libere en el RE.
4. Las cisternas del aparato de Golgi se desplazan físicamente hacia la cara trans del
organelo mediante un proceso denominado maduración cisternal. A medida que las
cisternas se desplazan su contenido va siendo procesado enzimáticamente.
5. Vesículas de transporte retrógrado con cubierta COP I brotan desde los
compartimientos del Golgi hacia otros compartimientos más tempranos permitiendo el
retorno de las enzimas características de ese sector del organelo. Ello permite el trabajo
secuencial de las enzimas y el mantenimiento de la identidad de cada sector.
6. En todas las células brotan vesículas de la cara trans del aparato de Golgi hacia la
superficie celular. Ello permite liberar proteínas al espacio extracelular e incorporar en
la membrana plasmática nuevas proteínas de membrana. El fenómeno se produce en
forma espontánea, por lo cual se denomina secreción constitutiva.
7. En algunos tipos celulares, se sintetizan productos de secreción que son almacenados
en vesículas de transporte en el citoplasma (vesículas secretorias o gránulos secretorios).
Esas vesículas podrán fusionarse con la membrana plasmática luego de la llegada de
una señal apropiada a la célula (hormona, neurotransmisor). El proceso se denomina
secreción regulada.
8. Desde el trans Golgi brotan vesículas con cubierta de clatrina y receptores de M6P
que transportan las hidrolasas lisosomales hacia el compartimiento endosomal tardío.
(Antes estas vesículas se denominaban lisosmas primarios).
9. El proceso de endocitosis, mediante el brotamiento de vesículas con cubierta de
clatrina, determina la formación de un compartimiento endosomal temprano, el cual
constituye el principal compartimiento de clasificación de materiales de esta vía. A
partir de aquí algunos componentes serán reciclados a la membrana plasmática o el
exterior celular y otros pasarán al compartimiento endosomal tardío. En ocasiones el
brotamiento hacia la luz de la membrana de los endosomas tempranos conduce a la
formación de cuerpos multivesiculares, los cuales pueden recibir vesículas con
hidrolasas ácidas provenientes del Golgi por lo que se consideraron antes un tipo
especial de lisosoma.
10. En el endosoma tardío los receptores de M6P se separan de las hidrolasas a causa
del pH más ácido en este compartimiento.
26
11. Los receptores son reciclados hacia la cara trans del Golgi o la membrana
plasmática. Las enzimas son transferidas al lisosoma, donde se lleva a cabo el proceso
de digestión y degradación enzimática (antes eran denominados lisosomas secundarios).
Cuando persiste un residuo en el interior que no puede ser digerido y se acumula
durante toda la vida de la célula, los organelos se denominan cuerpo residuales, o
telolisosomas. En el lisosoma no existen receptores de M6P. Además al pH lisosomal
estos receptores no pueden fijar su ligando. Por otra parte, las mismas fosfatasas
lisosomales remueven el dominio M6P de las enzimas.
12. En ocasiones un compartimiento membranoso en forma de medialuna
probablemente derivado del RE rodea un organelo o porción de citoplasma de la propia
célula, y termina incluyéndolo por completo en una vesícula (autofagosoma) que se
fusionará con el lisosoma llevando a la digestión de material de la propia célula.

4. GUÍA PARA EL ANÁLISIS DE DATOS EXPERIMENTALES.

4.1 Sistemas in vitro libres de células para estudiar componentes y mecanismos del
transporte vesicular.
El transporte vesicular puede ser reconstituído en sistemas libres de células. Esto fue
logrado primero para el estudio de mecanismos de transporte en el aparato de Golgi.
Las pilas de cisternas del aparato de Golgi pueden ser aisladas e incubadas in vitro en
citosol artificial. Cuando se agrega ATP brotan vesículas de transporte que transfieren
proteínas entre las cisternas. Si se marca un oligosacárido unido a una glicoproteína de
modo que pueda ser detectado fácilmente, es posible seguir el proceso de transporte
vesicular entre compartimientos. Para ello se incuban juntas dos pilas de Golgi
pertenecientes a distintas células. La población de cisternas a partir de la cual brotarán
las vesículas, el compartimiento “dador” en este diseño experimental, se aisla a partir de
células mutantes que carecen de la enzima N-acetilglucosamina (N-AcGlc) transferasa I
y que han sido además infectadas con un virus. Debido a la mutación, la principal
proteína viral, que es una glicoproteína, no puede ser glicosilada con NAcGlc en el
aparato de Golgi de las células mutantes. El compartimiento “aceptor” se aisla a partir
de células de tipo silvestre y no infectadas, que contienen por lo tanto NAcGlc
transferesa I pero no expresan la glicoproteína viral. Cuando se incuban juntas ambas
pilas de cisternas, la glicoproteína viral adquiere NAcGlc, indicando que debe haber
27
sido transportada entre ambas pilas de cisternas, presumiblemente por vesículas que
brotaron del compartimiento cis “dador” y se fusionaron con el compartimiento medial
del Golgi “aceptor”, o por fusión homotípica de cisternas de ambas pilas.

Este diseño experimental sólo funciona cuando los compartimientos subcelulares en

estudio son incubados en citosol y con la adición de ATP. El estudio del citosol ha
permitido identificar proteínas citosólicas requeridas para el brotamiento y fusión de
vesículas de trasnsporte.

Fig 4.1
Sistemas similares se han utilizado para estudiar el transporte desde el compartimiento
medial al trans del aparato de Golgi, de la red trans del Golgi a la membrana plasmática,
desde endosomas a lisosomas, desde el compartimiento trans del Golgi a endosomas
tardíos, y para estudiar la fusión homotípica entre compartimientos tales como
endosomas y vesículas secretorias inmaduras.

4.2 Fraccionamiento subcelular

Este método consiste en homogenizar una muestra de tejido con el propósito de romper
las células y liberar sus componentes en el medio de homogeneización. El homogenato
celular es una mezcla de diferentes componentes que se caracterizan por tener distinto
tamaño y densidad. Esas propiedades pueden utilizarse para separar distintos
compartimientos subcelulares en centrifugaciones sucesivas. La técnica de
centrifugación puede adaptarse además para separar componentes por su densidad, al

28
centrifugar las muestras en tubos conteniendo gradientes de osmolaridades crecientes.
Para poder fraccionar de esta manera los organelos celulares, la ténica de
homogeneización debe preservar la estructura de las membranas y respetar la
osmolaridad celular.

4.3 Análisis de proteínas en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE)

Las proteínas presentes en una muestra se desnaturalizan al rodearlas del detergente
iónico dodecyl-sulfato de sodio (NaDodSO4, SDS). Dado que el SDS posee carga
negativa todas las proteínas quedan con una carga neta negativa, independientemente de
la carga que posean en estado nativo. Esta mezcla se siembra en pocillos labrados en la
parte superior del gel de separación. Este gel es una malla entrecruzada del polímero
acrilamida. Una vez sembrado el gel, el sistema se somete a un campo eléctrico. Al
tener carga negativa, las proteínas migrarán hacia el cátodo, y al hacerlo deberán
atravesar la malla de acrilamida, de modo que las proteínas de masa más grande
quedarán retenidas en el gel, y las más pequeñas podrán continuar su recorrido. Bajo
las condiciones adecuadas de concentración de acrilamida (características de “filtro” de
29
la malla), y diferencia de potencial entre los polos negativo y positivo puede lograrse la
separación de las proteínas presentes en una muestra por su masa molecular relativa
(Mr). Junto con las proteínas de la muestra pueden sembrarse estándares de Mr
conocida para permitir una calibración del gel y la determinación del peso molecular de
las proteínas en estudio. El gel puede colorearse para hacer visibles las bandas de
proteínas.

4.4 Tranferencia electroforética de proteínas (western blot, inmunoblot)

Una vez separadas por su Mr, las proteínas pueden ser transferidas desde el gel de
acrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Para ello se coloca en íntima aposición el
gel y la membrana, y ambos se colocan en un dispositivo que los mantiene firmemente
apuestos. A continuación se crea una diferencia de potencial entre el lado de la cuba de
transferencia que contiene el gel y el lado que contiene la membrana. Las proteínas
migrarán hacia el polo positivo (siguen cargadas por su unión al SDS). Cuando las
proteínas se han transferido desde el gel a la membrana, ésta puede ser incubada con
anticuerpos primarios específicos para una proteína en estudio. Luego que el exceso de
anticuerpo es lavado, la membrana se incuba con un anticuerpo secundario conjugado a
una enzima. Finalmente, la membrana se incuba con un sustrato para la enzima, cuyo
30
producto de reacción pueda ser reconocido fácilmente. Por ejemplo, si el anticuerpo
secundario está conjugado a fosfatasa alcalina, pueden luego utilizarse reactivos de esta
enzima cuya reacción da lugar a un sustrato cromogénico. Por la utilización de
anticuerpos esta técnica es comúnmente referida como inmunoblotting
(inmunoréplicas). El nombre Western blot, también muy utilizado, se debe a una
circunstancia más anecdótica: una técnica similar fue descrita por Southern para
“blotear” ADN (Southern blot, o sea técnica de blot de Southern). Cuando se adaptó
para el estudio de ARN, la técnica se llamó Northern blot, en referencia a los puntos
cardinales. La aparición en tercer lugar de la adaptación a proteínas se llamó Western
blot.

5. LOS TEMAS EN LA LITERATURA: artículos científicos fundamentales en el

desarrollo de los conocimientos en la disciplina.

5.1 SEPARACIÓN DE ORGANELOS (Christian de Duve, Premio Nobel Fisiología y

Medicina 1974)
Las células eucariotas poseen una compleja organización de compartimientos
denominados organelos que llevan a cabo funciones específicas. La microscopía
permite describir la localización y características estructurales de los oragnelos, aunque
aporta información limitada respecto a su función. Nuestro conocimiento en esta área
proviene de un método muy utilizado en biología celular conocido comjo
fraccionamiento subcelular. Se produce la disrupción celular por homogenización del
31
tejido, lo cual permite separar los componentes intracelulares en base a sus diferencias
en masa, tamaño y densidad utilizando técnicas de centrifugación. De esta forma,
pueden aislarse diferentes componentes intracelulares de distinta densidad,
denominados “fracciones”. Los procedimientos habituales permiten dividir el
contenido de las células en cuatro fracciones: nuclear, mitocondrial cruda,
microvesicular y soluble. Christian de Duve estaba interesado en determinar la
localización subcelular de diferentes enzimas. Una vez caracterizada la presencia de una
enzima de función conocida en una fracción subcelular, se podía asumir que dicha
enzima se encontraba localizada en los organelos presentes en esa fracción, y por lo
tanto era posible hipotetizar sobre la función de esos organelos. Según de Duve, su
trabajo se basó en el uso de tres herramientas: (i) la hipótesis de la homogenidad
bioquímica (que las enzimas se distribuyen en forma homogénea en una fracción); (ii) la
hipótesis de la localización única (que cada enzima posee una localización definida y
precisa en la célula); y (iii) las técnicas de centrifugación. Esto le permitió subdidivir
la fracción mitocondrial cruda: primero identificó una fracción rica en enzimas
hidrolíticas (lo que llevó a la caracterización del lisosoma), y luego identificó otra
fracción subcelular por sus propiedades bioquímicas llevando al descubrimiento de un
segundo organelo, el peroxisoma.

de Duve estudió la distribución de enzimas en el hígado de rata, mediante la realización

de distintos ensayos para enzimas bien caracterizadas en cada una de las fracciones
subcelulares obtenidas por una técnica de centrifugación diferencial. La separación de
la fracción mitocondrial cruda permitió identificar dos zonas próximas a la parte más
alta del tubo, ricas en citocromo oxidasa y fosfatasa (mitocondrias y lisosomas
respectivamente). Cerca de la base del tubo se observó una tercera fracción rica en
uricasa (correspondiente a peroxisomas).

32
El trabajo de de Duve en fraccionamiento subcelular permitió comprender la función de
muchas estructuras celulares al mapear la localización de enzimas en los distintos
organelos. Su trabajo permitió diferenciar e identificar dos organelos cuyas
características estructurales no habían permitido su caracterización por los
microscopistas: el lisosomas y el peroxisoma, y aportó las principales pistas para el
descubrimiento de su función. En 1974 recibió el Premio Nobel de Fisiología y
Medicina en reconocimiento a su trabajo pionero.

Referencia:
Tissue Fractionation Studies. 18. Resolution of mitochondrial fractions from rat liver
into three distinct populations of cytoplasmic particles by means of density equilibration
in various gradients.
H. Beaufay, P. Jacques, P. Baudhuin, 0. Z. Sellinger, J. Berthet and C. de Duve.
Biochem. J. (1964), 92, 184.
(disponible en http://www.biochemj.org/bj/092/0184/0920184.pdf)

33
5.2 LA RUTA DE LAS PROTEÍNAS HACIA EL EXTERIOR CELULAR (George
Palade, Premio Nobel de Fisiología y Medicina, 1974).

Además de sintetizar las proteínas que requieren para llevar a cabo sus múltiples
funciones, muchas células también producen y segregan proteínas adicionales que
llevan a cabo diferentes funciones en el exterior celular. El mecanismo de la secreción
de proteínas fascinó muchos biólogos celulares, incluyendo a Palade. Los trabajos de
fraccionamiento subcelular habían mostrado que las proteínas secretorias se
encontraban en compartimientos limitados por membrana asociados con el retículo
endoplásmico, donde se sintetizaban. Sin embasrgo las dificultades en obtener
preparaciones claras que permitieran distinguir entre los distintos organelos celulares
hizo imposible definir la ruta hacia el exterior celular. Para resolver el problema Palade
desarrolló una nueva técnica, la autoradiografía de alta resolución, que permite detectar
moléculas marcadas radioactivamente en micrografías electrónicas. Ello le permitió
seguir el recorrido de proteínas secretorias marcadas dentro de la célula, llevando al
hallazgo fundamental de que las proteínas se transportaban desde el retículo
endoplásmico al aparato de Golgi, y de aquí a la membrana plasmática.

Referencia:
Jamieson, J.D. and Palade, G.E. 1967. Intracellular transport of secretory proteins in the
pancreatic exocrine cell. II. Transport to condensing vacuoles and zymogen granules. J.
Cell Biol. 34: 597-615.
(disponible en http://jcb.rupress.org/content/34/2/597.full.pdf+html)

6. LOS TEMAS EN LA MEDICINA: algunos ejemplos interesantes para discutir en

clase.

Las células controlan estrechamente la cantidad de proteínas no plegadas o

incorrectamente plegadas que poseen en sus distintos compartimientos. Una
acumulación de proteínas no plegadas en el citosol desencadena una respuesta
adaptativa conocida como heat-shock response, la cual estimula la transcripción de
genes que codifican chaperonas citosólicas que ayudan a plegar las proteínas. De modo
similar, una acumulación de proteínas no plegadas en el retículo endoplásmico
34
desencadena una respuesta de proteínas no plegadas (unfolded protein response, UPR)
la cual incluye un aumento de la transcripción de genes que codifican chaperonas del
retículo endoplásmico y enzimas implicadas en la degradación de proteínas. La
activación de esta compleja vía puede tener efectos patogénicos en el tejido.

6.1 Retículo endoplásmico y alteraciones metabólicas en la obesidad.

Adipocyte stress: the endoplasmic reticulum and metabolic disease.
MF Gregor and GS Hotamisligil
J. Lipid Res. 2007. 48:1905-1914
(disponible en http://www.jlr.org/cgi/reprint/48/9/1905)

Esta revisión repasa los principales conceptos y mecanismos moleculares implicados en

el estrés del retículo endoplásmico, y analiza la siguiente hipótesis: dado que la
respuesta adaptativa de proteínas incorrectamente plegadas es una fuente de señales de
estrés que median inflamación y activación de algunas vías intracelulares características
de este estado (JNK), y dado que estos dos eventos están fuertemente ligados a la
inhibición de la señalización inducida por insulina, una causa de la resistencia a la
insulina en el paciente obeso podría ser el estrés del RE en el tejido adiposo expandido.

6.2 Estrés del retículo endoplásmico en el contexto celular del cáncer.

Integrated endoplasmic reticulum stress responses in cancer.
M Moenner, O Pluquet, M Bouchecareilh and E Chevet
Cancer Res. 2007. 67(22):10631-10634
(disponible en http://cancerres.aacrjournals.org/content/67/22/10631.full.pdf+html)

Se discute el estado funcional del retículo endoplásmico y el papel jugado por la

respuesta adaptativa de proteínas mal plegadas en el contexto celular del cáncer.
Además se analiza la pérdida de regulación funcional de las proteínas residentes del
retículo endoplásmico y su implicación en la patogenia del cáncer.

6.3 Enfermedades por almacenamiento lisosómico

35
Un grupo de alteraciones genéticas conocidas como enfermedades de almacenamiento
lisosómico son debidas a la ausencia de una o más enzimas lisosómicas. Como
resultado, los glicolípiods y componentes extracelulares normalmente degradados por
los lisosomas se acumulan formando grandes inclusiones intracelulares. La enfermedad
de células I es un tipo particularmente severo debido a la incapacidad de transferir
manosa-6-fosfato a las enzimas de destino lisosómico, por lo cual estas enzimas son
secretadas más que transferidas al compartimiento endolisosomal.

6.4 Plegado inadecuado de proteínas en el RE: forma hereditaria de enfisema

Algunas personas poseen una forma mutante de alfa-1-antitripsina. Esta proteína es

producida en los hepatocitos y secretada a la sangre, donde se comporta como un
inhibidor de las proteasas tripsina y elastasa. La mutación provoca que la enzima no
pueda plegarse correctamente, por lo que no es secretada, sino que se acumula en el
retículo endoplásmico de los hepatocitos. Los bajos niveles de inhibidor circulante en
sangre permiten la actividad de la elastasa, la cual altera la fina trama de fibras elásticas
que componen el tejido conectivo del parénquima pulmonar, provocando la aparición de
una forma hereditaria de enfisema en épocas tempranas de la vida.

36