Practicas-todas.

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Bioquímica II

1º Grado en Medicina

Facultad de Medicina y Odontología

Universidad de Santiago de Compostela

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 PRÁCTICAS BIOQUÍMICA
Se estudia el genotipado de ratones Cre-lox y se le extrae ADN de los tejidos, el cuál es
amplificado por PCR y visualizado posteriormente en gel de agarosa.
RATONES TRANSGÉNICOS
El término fue acuñado por Gordon y Ruddle. Se trata de animales que han sufrido
modificaciones genéticas en su ADN a través de la deleción de genes o adición de genes
exógenos.
Se utiliza para modelar los animales para que se asemejen a la condición humana.
Producción de fármacos: Las proteínas recombinantes se expresan en promotores específicos
de las glándulas mamarias (para ser secretadas en la leche) o en promotores específicos de
riñón y vejiga (para ser secretadas en la orina). Esto permite obtener las proteínas
recombinantes durante toda la vida del animal transgénico.
Xenotrasplante: Trasplante de órganos vascularizados entre personas. Al principio se hacía con
primates y presentaban la misma barrera inmunológica que un alotrasplante.
Cerdo transgénico: Animal adecuado para la donación de órganos vascularizados. Son
transgénicos porque presentan una barrera primaria significativa de normal.
SISTEMA CRE-LOXP
Escisión irreversible de ADN. Las secuencias loxP (34 pares de bases) se unen a ambos lados
del gen y la Cre recombinasa corta el gen como un círculo de ADN. Sistema derivado del
bacteriófago P1. las secuencias de ADN flanqueadas por loxP se dice que están “floxeadas”.
Ideal para manipulación genética in vivo, mayoritariamente se usa en ratones y pueden darse
muchos experimentos diferentes en el mismo ratón (tan solo cambiando el gen floxed). Se hace
uso de un promotor específico de tejidos para expresar la Cre recombinasa y para modular
donde se expresará el gen floxed.
CÁNCER
Gen p53: Supresor de tumores.
Síndrome de Li-Fraumeni: Cuando un individuo hereda una sola copia funcional del gen p53,
siendo susceptible al cáncer y desarrollando tumores independientes en tejidos distintos del
cuerpo.
En esta práctica se cruzan ratones AlbCre (expresan la Cre recombinasa en hepatocitos) y
ratones flox de p53 (exones del gen p53 flanqueados). El entrecruzamiento da lugar a la
deleción del gen p53 en el hígado, pudiendo estudiar el cáncer hepático in vivo.
REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA
La PCR ha logrado finalizar el Proyecto Genoma Humano así como dar por sentado las bases
de la ingeniería genética. Técnica in vitro que permite la replicación y amplificación de ADN
fuera de la célula (millones de veces). Creada por Kary Banks Mullis y Michael Smith que
recibieron premio Nobel por esta invención.

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 En esta práctica se utiliza para determinar si el descendiente del cruzamiento anterior de
ratones es homocigoto (2 copias de gen p53 flox), heterocigoto (una copia de gen p53 flox) o
fenotipo Wildtype (ninguna copia p53 flox).
Etapas:
1. Desnaturalización: 95 grados y 2 minutos. Las hebras de ADN se separan.

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2. Hibridación: 52-58 grados y 30 segundos. Los cebadores se hibridan (se unen) a
secuencias complementarias en las hebras de ADN.
3. Extensión: 70-80 grados y 1-2 minutos. La ADN polimerasa se une a los cebadores
hibridados y sintetiza otra hebra complementaria (amplificando la cadena molde).
PIPETEO
La punta de la pipeta se suelta justo antes de soltar el botón (después de la segunda parada)
tras expulsar todo el líquido. Los líquidos viscosos tardan más en entrar en la punta de la
pipeta. Al aspirar la muestra, la pipeta tiene que estar en posición vertical y sumergir la punta
ligeramente*. Para dispensar el líquido, apoyarse en la pared lateral en un ángulo de 45 grados.
Hay que valorar la viscosidad de la muestra.
Digestión del tejido: Se corta un trozo pequeño de la cola del ratón y se introduce en un tubo
de eppendorf al que se le añade buffer de digestión y proteinasa K. Se incuba la muestra y
tras el tiempo de lisado se centrífuga. El sobrenadante resultante se transfiere a un nuevo
tubo de eppendorf y se congela, listo para su uso.
Azul de Coomassie: tinción de proteínas
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE TEJIDO CONGELADO
1. Se añade buffer RIPA (lisado de proteínas)
2. Se homogeniza la muestra
3. Se centrifuga
4. Se elimina el pellet y restos celulares y se guarda el sobrenadante
ELECTROFORESIS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
1. Polimerización del gel de agarosa
2. Cargar la muestra en el gel (añadir buffer de carga)
3. Electroforesis (colocar gel en transiluminador)
4. Análisis de resultados
Método de Bradford: Colorea las proteínas para cuantificarlas con la tinción de Azul de
Coomasie Consiste en el cambio de color de este colorante en función de la concentración de
proteínas. Primero se determina la concentración de proteínas con Bradford, luego se mide la
absorbancia y por último se calcula la concentración de proteínas a través de una recta patrón
constituida con los valores de absorbancia.
FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Cuando se separan proteínas por un gel de electroforesis, estas lo hacen según la resistencia
que soportan al desplazarse por el gel y esta viene determinada por la estructura, carga y

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Bioquímica II
Banco de apuntes de la
 tamaño de las proteínas. La finalidad de la electroforesis es que las proteínas se desplacen
según su tamaño y esto se conseguirá gracias a SDS, agente reductor (mercaptoetanol) y calor
(95 grados). Las proteínas son cadenas de aminoácidos y cada aminoácido posee una carga
positiva o negativa según el pH en el que se encuentren. Las proteínas antes de ser
desnaturalizadas se sumergen en un buffer con mercaptoetanol que romperá los puentes

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disulfuro (estos puentes contribuyen al plegamiento de la proteína) y posteriormente en otro
buffer con SDS que le conferirá carga negativa a la proteína para igualar la carga. La proteína
se linealiza recubierta por SDS que le confiere carga negativa lo que le permite separarse en
función de su tamaño y está lista para ser desnaturalizada (95 grados y 5 minutos).
Antes de polimerizar el gel hay que ver que porcentaje de poliacrilamida se le mete y el buffer
de carrera apropiado según las necesidades de resolución y el peso molecular de las proteínas:
● Proteínas de pequeño peso molecular (0-30 kDa) necesitan un gel de separación con
alto porcentaje de poliacrilamida (15-20%)
● Proteínas de gran peso molecular (75-200 kDa) necesitan un gel de separación con bajo
porcentaje de poliacrilamida (8-12%)
● Proteínas de peso intermedio (30-150 kDa) necesitan un gel de separación con un
intermedio porcentaje de poliacrilamida (10-12%)
TRIS-GLYCINE SDS PAGE
Se trata de un mecanismo de electroforesis discontinuo ya que consta de dos tipos de geles:
gel de compactación (compuesto por iones, menos pH y menos poliacrilamida) y gel de
separación. Las proteínas entran en el gen de compactación y van avanzando haciendo frente
entre ion de baja movilidad (glicina) e ion de alta movilidad (cloro). Esto provoca que las
proteínas se apilen en una banda e inhibe la agregación proteica. Cuando entran al gel de
separación, las propiedades químicas de las proteínas se asemejan más al gel, las proteínas
migran según los principios de la electroforesis.
Las bandas son teñidas con azul de Coomassie. Las proteínas pequeñas requieren un protocolo
de fijación previo porque si no se escapan del gel. La tinción puede ser reutilizada hasta tres
veces y antes de que se de la tinción hay que meter a las proteínas a un lavado para quitar el
SDS (dodecil sulfato de sodio) que puede interferir en la tinción.
Isopropanol: hace que la superficie del gel se quede recta.
APS y TEMED: inician la polimerización del gel.

Tipo de gel Donde se prepara Componentes

Gel de Tubo de Falcon Agua destilada, SDS, solución

compactación acrilamida/bis-acrilamida y solución de Tris

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 Tipo de gel Donde se prepara Componentes

Gel de separación Vaso de precipitados Agua destilada, SDS, solución

acrilamida/bis-acrilamida y solución de Tris

ELECTROFORESIS
1. Retirar el peine del gel
2. Colocar el gen en la cámara de electroforesis
3. Llenar la cámara de electroforesis con la solución tampón
4. Cargar cada muestra en los pocillos del gel de poliacrilamida
5. Añadir marcador de peso molecular al primer pocillo
6. Tapar cámara de electroforesis y aplicarle corriente eléctrica durante 45 minutos a
200V
7. Dejar correr la electroforesis para que las proteínas migren
8. Retirar el gel de la cámara de electroforesis
INSTANT BLUE
Tinción de Azul Coomassie que tiñe proteínas dejando un fondo claro y así no hace falta previo
lavado, distinción o fijación.
1. Se mete el gel en la tinción de Coomassie (se necesitan 20 ml de solución). El gel debe
moverse libremente para que haya una fácil difusión.
2. Las bandas de proteínas se tiñen inmediatamente pero requieren una intensidad que se
logra tras 15 minutos de incubación a temperatura ambiente.
3. Los geles se pueden guardar en solución de tinción pero deben estar totalmente
cubiertos. Sino también pueden guardarse en agua ultrapura durante una hora.

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