Trichoderma
Trichoderma
Trichoderma
pathogens”
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Autor para correspondencia: Luz María Samaniego-Fernández. E-mail: [email protected]
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Recibido: 03/10/2017
Aceptado: 26/03/2018
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Revista de Protección Vegetal, Vol. 33, No. 3, 2018, E-ISSN: 2224-4697
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provincia Matanzas. La presente investigación marzo hasta junio. Para la prospección de nuevos
tuvo como objetivo ampliar la disponibilidad y la aislamientos de Trichoderma spp., a partir de
diversidad de cepas autóctonas de Trichoderma muestras de suelo, se utilizó la metodología de
spp. mediante su aislamiento, identificación y Bateman (17).
evaluación in vitro a partir de dos Del bosque del agroecosistema Matanzas, se
agroecosistemas de la provincia. tomaron tres muestras de suelo. Del
agroecosistema San Miguel de los Baños se
MATERIALES Y MÉTODOS tomaron dos muestras de pino (P. cubensis) y una
La investigación se desarrolló en dos etapas: I) de marabú (D. cinerea).
toma de muestras del suelo, aislamiento e Todas las muestras se tomaron a tres
identificación de los aislados; II) evaluación del profundidades: (a) en la superficie, (b) entre 0 y
efecto in vitro de los aislados de Trichoderma 10 cm y (c) entre 10 y 15 cm; sumaron en total
autóctonos de la zona muestreada sobre 18.
aislamientos de hongos fitopatógenos R. solani, En el momento del muestreo, las áreas del
S. rolfsii y Fusarium spp. agroecosistema Matanzas presentaban 37 % de la
Las muestras de suelo se extrajeron de dos capacidad de campo; 4,5 % de materia orgánica y
agroecosistemas de los municipios Matanzas y suficiente iluminación; mientras que, en el
San Miguel de los Baños, de la provincia agroecosistema San Miguel de los Baños, la
Matanzas; ambos con suelo ferralítico rojo (15) capacidad de campo fue de 40 %, el por ciento de
que no recibieron, históricamente, aplicaciones materia orgánica de 4,2 y la iluminación fue
de medios químicos ni biológicos. Estos fueron: suficiente; todos estos valores fueron cercanos a
Agroecosistema Matanzas, consistente en un los informados por otros investigadores (18,19).
área boscosa de vegetación muy variada ubicado Los muestreos se realizaron mediante el método
al norte de la provincia, a 1 km de distancia del de “Bandera Inglesa”. Las muestras tomadas se
río Buey Vaca, 400 m del Ferrocarril Central y vertieron, individualmente, en bolsas de nylon, se
300 m de la Carretera Central (Figura 1) (16). La sellaron y se llevaron al Laboratorio Provincial
zona presenta un promedio anual de de Sanidad Vegetal y al Laboratorio de Sanidad
precipitaciones de 1181 mm. La dirección del Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias
viento es de Norte a Oeste. de la Universidad de Matanzas para su
Agroecosistema San Miguel de los Baños, con conservación en frío, a una temperatura
dos áreas, una sembrada de pinos (Pinus cubensis aproximada de 18°C, hasta el momento de su
Griseb) y otra cubierta de marabú (Dichrostachis procesamiento, después de registrar todos los
cinerea L.). Esta zona se caracteriza por presentar datos pertinentes.
precipitaciones variables, con incrementos desde
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Las muestras de suelo se procesaron mediante todos los aislamientos realizados y de las cepas
la metodología de Sandoval y Stefanova (20), de referencia en el centro de placas Petri con
con el empleo de las diluciones decimales PDA (24). Posteriormente, las placas se
seriadas. Se pesó 1 g de suelo y se diluyó en 9 ml incubaron a 25 ± 2oC bajo un régimen de luz/
de agua destilada estéril para preparar una oscuridad y se midió diariamente (en cm) el radio
solución madre, agitando durante varios minutos. de crecimiento de cada colonia durante siete días.
A partir de esta se realizaron cuatro diluciones Evaluación del antagonismo in vitro
decimales seriadas sucesivas hasta el valor 10-4. mediante la técnica de cultivo dual.
De cada dilución (entre 10-1 y 10-4) se tomó 0,1 Competencia por espacio y nutrientes
ml para realizar la siembra en placas Petri de 10 Se utilizaron cepas de los hongos
cm de diámetro con medio Papa Dextrosa Agar fitopatógenos R. solani, S. rolfsii y Fusarium spp.
(PDA) (pH = 5,6 ± 0,2) y se sembraron tres provenientes de papa, soya y tomate,
réplicas por dilución por muestra de suelo. respectivamente, identificadas morfológicamente
Las placas se incubaron a 25 ± 1oC por siete en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal y
días para realizar observaciones diarias. De las depositadas en el cepario de esta institución. De
placas que mostraron mayor crecimiento, al igual modo, se usaron las cepas de referencia de
séptimo día se tomó una porción superficial de Trichoderma 1 [T. harzianum 3(A-34)2] y 2 [T.
esporas de las colonias con características viride 5(TS-3)1], del Laboratorio Provincial de
similares a Trichoderma spp.; se preparó una Sanidad Vegetal de Matanzas, empleadas en
suspensión de estas y se realizó la siembra en Cuba para el control de Fusarium, Phytophthora,
placas con medio Agar Agua. A partir del Pythium y Rhizoctonia (25). La capacidad
crecimiento en este medio se tomó, de cada antagónica de los aislamientos seleccionados e
placa, una espora germinada bajo el Microscopio identificados de Trichoderma, procedentes del
Estereoscópico para lograr los aislados agroecosistema Matanzas y ubicados en los
monospóricos que garantizaron la pureza de las Grupos 1 (T. harzianum 6(A-53)2), 2 (T. viride
cepas. Las colonias puras se pasaron a tubos de 4(TS-3)1) y 3 (Trichoderma 2T-aislado), se
ensayos que contenían PDA para su verificó mediante enfrentamientos duales entre
conservación. La identificación de las especies de estos y los hongos fitopatógenos antes
Trichoderma aisladas se realizó según los mencionados, según procedimiento de Morton y
criterios de Rifai (21), Samuels (22) y Barnett y Stroube (26). También se enfrentaron contra estos
Hunter (23). Para ello, se prepararon fitopatógenos las cepas de referencia 1 [T.
microcultivos de cada muestra y se realizaron harzianum 3(A-34)2] y 2 [T. viride 5(TS-3)1].
observaciones microscópicas con lente objetivo Para ello, se realizaron con antelación siembras
100X, para un aumento total de 1000 y así por dispersión sobre PDA de todos los
apreciar con calidad las características aislamientos de los potenciales antagonistas, de
morfológicas de micelio, fiálides, conidióforos, las cepas de referencia y de los fitopatógenos, los
conidios y clamidosporas. Para todos los que se incubaron a 25 ± 2o C bajo un régimen de
aislamientos, las cepas obtenidas se separaron en luz/oscuridad durante 8-16 horas, con el fin de
los Grupos 1, 2 y 3, sobre la base de las obtener discos de crecimiento de todas las
características morfológicas de las estructuras colonias de las diferentes cepas. Posteriormente,
observadas, la coloración de las colonias, su se sembró un disco de crecimiento de cada
textura y el mayor o menor diámetro de antagonista potencial y de cada cepa de
crecimiento lineal alcanzado en igual tiempo. referencia en un lado de las placas, mientras que
Crecimiento lineal micelial de las cepas el lado opuesto se colocaba cada uno de los
potencialmente antagonistas de hongos fitopatógenos, de modo que estos
Trichoderma spp. quedaran próximos a los bordes de las placas y
Para determinar el crecimiento lineal micelial equidistantes de antagonistas y cepas de
de las cepas antagonistas se realizaron siembras referencia. El esquema general de los
por punción de las colonias puras obtenidas de enfrentamientos duales se presenta en la Figura 2.
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FIGURA 2. Esquema general de los enfrentamientos duales entre las cepas antagonistas del
Agroecosistema Matanzas, las cepas de referencia y los hongos fitopatógenos. / General scheme of the
dual clashes between the antagonistic strains from Matanzas Agroecosystem, the reference strains and
the phytopatogenic fungi.
TABLA 1. Escala de Elías et al. (27) para la evaluación del antagonismo in vitro./ Elías et al. (27)
scale for the evaluation of in vitro antagonism.
GRADO CAPACIDAD ANTAGÓNICA
0 Ninguna invasión de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno
1 Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno
2 Invasión de ½ de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno
3 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno
4 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo fitopatógeno; esporulación sobre esta
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San Miguel de los Baños no se presentaron unicelulares. Las características culturales de sus
colonias con dichas características. Según sus colonias se observan en la Figura 5.
caracteres morfológicos y culturales, todos los Grupo 3. Identificado como Trichoderma 2T-
aislamientos de Trichoderma se identificaron en aislado, según criterios de Rifai (21), de
tres grupos, que se describen a continuación y se características morfológicas diversas y con
ilustran en las Figuras 3, 4 y 5. tendencia a la incertidumbre, por lo que sus
Grupo 1. Identificado como T. harzianum, integrantes solo pudieron identificarse en la
según criterios de varios autores (21,22,23) y con categoría de género.
las siguientes características morfológicas: Hifas Las cepas con caracteres morfológicos bien
septadas, de 7-10 µm de ancho; conidios definidos y mayor crecimiento radial en medio de
ovalados, unicelulares, de color verde, de 4-5 µm cultivo PDA fueron: T. harzianum 6(A-53)2 en el
de diámetro, en conidióforos hialinos Grupo 1; T. viride 4(TS-3)1 en el Grupo 2 y
ramificados; fiálides sencillas o en grupos; Trichoderma 2T- aislado en el Grupo 3.
clamidosporas unicelulares. Las características Crecimiento lineal micelial de las cepas
culturales de sus colonias se observan en las potencialmente antagonistas de
Figuras 3 y 4. Trichoderma spp.
Grupo 2. Identificado como T. viride, según T. harzianum 3(A-34)2 y Trichoderma 2T-
criterios de varios autores (21,22,23) y con las aislado presentaron las mejores respuestas, con
siguientes características morfológicas: Hifas los mayores crecimientos lineales miceliales
septadas, de 6-9 µm de ancho; conidios promedio (Fig. 6) y un comportamiento similar
unicelulares ovalados, de color verde, de 3-5 µm en cuanto a su crecimiento y desarrollo en medio
de diámetro, en conidióforos hialinos de cultivo PDA. Las diferencias altamente
ramificados; fiálides en grupos; clamidosporas significativas (p≤0,01) de ambas cepas con las
restantes y sus mayores valores de crecimiento
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lineal micelial en PDA (Fig. 6), reafirman la Evaluación del antagonismo in vitro
facilidad de crecimiento y desarrollo de mediante la técnica de cultivo dual.
Trichoderma en medios de cultivo apropiados Competencia por espacio y nutrientes.
(24). Estos valores también se aproximan a los Determinación del PICR
obtenidos para T. harzianum (cepa A-34), del A las 96 horas, Trichoderma 2T-aislado, T.
cepario de mantenimiento del Laboratorio harzianum 6(A-53)2, T. harzianum 3(A-34)2 y T.
Provincial de Sanidad Vegetal de Las Tunas viride 5(TS-3)1 mostraron porcentajes de
(LPSVLT) (29) e indican sus ventajas en la inhibición que no diferían significativamente para
competencia por espacio y nutrientes y para S. rolfsii y Fusarium spp., pero sí con respecto a
ejercer biocontrol por reducción o completa R. solani. Sin embargo, para T. viride 4(TS-3)1
detención del desarrollo micelial de los los PCIR provocados no presentan diferencias
patógenos estudiados (29). significativas entre los tres patógenos (Fig. 7). En
T. viride 4(TS-3)1 ocupó un segundo lugar en general, los mayores PCIR contra los tres
el crecimiento lineal micelial promedio (Fig. 6) y patógenos los mostraron Trichoderma 2T-aislado
presentó diferencias altamente significativas y T. harzianum 3(A-34)2.
(p≤0,01) con el resto de las cepas. T. viride Resultados similares se observaron al evaluar
5(TS-3)1 y T. harzianum 6(A-53)2 mostraron los in vitro diferentes aislados de Trichoderma contra
menores valores de crecimiento lineal micelial R. solani aislada de piña, los que inhibieron el
promedio (Fig. 6), sin diferenciarse crecimiento radial de este patógeno en 40-50 %
significativamente entre ambas, pero sí (p≤0,01) (30) y en el antagonismo de T. harzianum contra
con el resto de las cepas. T. harzianum 6(A-53)2 S. rolfsii (26).
muestra aquí un comportamiento que difiere de la Los enfrentamientos de aislamientos nativos de
cepa T. harzianum A-53 del cepario del LPSVLT T. harzianum contra Fusarium oxysporum, en
(Fig. 6) (29), lo que puede atribuirse a las condiciones in vitro, demostraron la represión del
características propias de los suelos de diferentes crecimiento del patógeno por parte del
procedencias. antagonista (31). Al crecer, el micelio de
Trichoderma spp. compitió por espacio y
nutrientes del medio de cultivo y generó un
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