Fosfatos

UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACIA
TRABAJO DE DIPLOMA
EN OPCIÓN AL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA
Título:
VALIDACIÓN PARCIAL
DEL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
DEL ÁCIDO VANADOMOLIBDOFOSFÓRICO
PARA LA DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO
DE FÓSFORO TOTAL
EN PRODUCTOS DE FERMENTACIÓN DE
MICROORGANISMOS EFICIENTES
Autora:
ELIZABETH GONZÁLEZ MARTÍNEZ
Tutoras:
DRA. PETRA G. VELAZCO PEDROSO
DRA. DANIELLYS ALEJO SÁNCHEZ
2016
“Año 58 de la Revolución”
Índice
Resumen
Abstract
Introducción ................................................................................................................. 1
Capítulo 1. Revisión bibliográfica ................................................................................ 4
1.1 Microorganismos eficientes ................................................................................ 4

1.2 Propiedades de los EM ...................................................................................... 5
1.3 Aplicaciones ....................................................................................................... 6
1.3.1 Aplicaciones en la agricultura ...................................................................... 6

1.3.2 Aplicaciones en el medio ambiente.............................................................. 7
1.3.3 Aplicaciones en la producción animal .......................................................... 8
1.3.4 Aplicaciones en la cría de aves de corral ..................................................... 9
1.3.5 Aplicaciones en la actividad pesquera ......................................................... 9
1.3.6 Aplicaciones en la industria ....................................................................... 10
1.4 Composición química de los EM ...................................................................... 10

1.5 El fósforo .......................................................................................................... 11
1.6 Determinación del contenido de fósforo ........................................................... 12
1.7 Parámetros estadísticos ................................................................................... 14
1.7.1 Linealidad .................................................................................................. 14

1.7.2 Precisión .................................................................................................... 16
1.7.3 Límites de detección y cuantificación......................................................... 16
1.7.4 Veracidad ................................................................................................... 17
1.8 Fundamento teórico del análisis por Espectrofotometría UV-VIS .................... 18
Capítulo 2. Materiales y métodos .............................................................................. 20
2.1 Reactivos, materiales, equipos y disoluciones de trabajo ................................ 20
2.1.1 Reactivos empleados................................................................................. 20

2.1.2 Instrumentos, equipos y materiales empleados ......................................... 21
2.1.3 Preparación de disoluciones y del material para el ensayo ....................... 21
2.2 Descripción de la técnica espectrofotométrica del ácido vanadomolibdofosfórico

para la determinación del fósforo total en la muestra............................................. 22
2.3 Preparación de la curva de calibración con fosfatos ........................................ 23
2.4 Procedimiento para la determinación del contenido de fósforo total en la muestra
de EM..................................................................................................................... 24
2.4.1 Preparación preliminar de la muestra ........................................................ 24
2.4.2 Pre-tratamiento de la muestra por digestión .............................................. 24
2.4.3 Desarrollo de color en la muestra .............................................................. 25
2.5 Determinación de los parámetros estadísticos ................................................ 26
2.5.1 Linealidad .................................................................................................. 26

2.5.2 Precisión .................................................................................................... 27
2.5.3 Límites de detección y cuantificación......................................................... 27
2.5.4 Veracidad ................................................................................................... 30
2.6 Determinación de la concentración de fósforo total en la muestra ................... 31
2.6.1 Cálculo de la concentración de fósforo aplicando el método de la curva de

calibración........................................................................................................... 31
2.6.2 Cálculo de la concentración de fósforo aplicando el método de adición de
estándar .............................................................................................................. 31
Capítulo 3. Análisis y discusión de los resultados ..................................................... 32
3.1 Corroboración de la longitud de onda de trabajo ............................................. 32

3.2 Análisis de los resultados obtenidos en la validación del método .................... 33
3.2.1 Análisis de la linealidad del método ........................................................... 33

3.2.2 Análisis de la precisión del método ............................................................ 35
3.2.3 Análisis de la determinación de los límites de detección y cuantificación .. 37
3.2.4 Análisis de la veracidad del método........................................................... 39
3.3 Determinación de fósforo total por el método espectrofotométrico del ácido

vanadomolibdofosfórico en la muestra de los EM .................................................. 41
3.3.1 Método de la curva de calibración ............................................................. 41

3.3.2 Método de adición de estándar .................................................................. 42
Conclusiones ............................................................................................................. 45
Recomendaciones..................................................................................................... 46
Bibliografía
Anexos
Resumen
En Cuba, la tecnología de los productos de fermentación de Microorganismos

Eficientes (EM) se encuentra en su fase inicial, sin embargo los resultados alcanzados
en el desarrollo del proceso han demostrado un alto nivel en la calidad de sus
aplicaciones en la agricultura y en otros campos de la ciencia. A pesar de esto, poco
se conoce sobre la composición química de estos productos; por tanto, se hace
necesario desarrollar las técnicas analíticas para dicha determinación. Este trabajo
tiene como objetivo realizar la validación parcial de la técnica analítica seleccionada
previamente para la determinación del contenido de fósforo en productos de
fermentación de Microorganismos Eficientes. En el proceso de validación se estudia la
linealidad, precisión en términos de repetibilidad y reproducibilidad intermedia, así
como la exactitud y el límite de detección y cuantificación. Además se estudia el efecto
matriz, por el método de adición del estándar. Para el procesamiento estadístico de
los datos se utilizaron los programas Statgraphic Centurion XV y Excel 2013. El método
resultó ser lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentración analizada. El
contenido de fosforo total presente en las muestra de EM CBQ-VTC, lote: Investigación
200 L analizadas tiene un valor en el rango de 135,00 a 136,50 mg/L.
Palabras clave: Microorganismos Eficientes, fósforo, método espectrofotométrico,

técnica analítica.
Abstract
In Cuba, the technology of Effective Microorganisms (EM) products fermentation is in

the first phase, however the reached results in the development of its process have
demonstrated a high level in the quality of its applications, specifically in agriculture and
in other fields of the science. Despite of these facts, the chemical composition of the
fermentation products of effective microorganisms is poorly known, that is why it is
necessary to develop the analytical techniques in order to perform these
determinations. This work aimed to set analytical techniques for the determination of
the phosphorous content in samples of EM. The validation process includes the
linearity, precision within the repeatability and intermediate reproducibility terms, also
the exactitude and the detection limit and quantification limit. Moreover the matrix effect
is studied through the standard addition method as well. For the statistics processing
of data were used the following software: Statgraphic Centurion XV and Excel 2013.
The method came up to be lineal, precise and exact within the range of analyzed
concentrations. The phosphorus total contained in the analyzed EM samples (CBQ-
VTC, lote: Investigación 200 L) have a value within the range between 135,00 and
136,50 mg/L.
Keywords: Effective microorganisms, phosphorus, spectrophotometric method,
analytical technics.
Introducción
En el mundo actual se han incrementado considerablemente la contaminación y

aparejado a esto, el uso excesivo de sustancias químicas sintéticas, lo que ha causado
la proliferación de especies de microorganismos considerados degeneradores, los que
a grandes rasgos, son causantes de enfermedades en plantas y animales y generan
malos olores y gases nocivos al descomponer residuos orgánicos. Por otra parte
existen microorganismos que resultan beneficiosos al hombre por sus propiedades de
fermentación, producción de sustancias bioactivas y competencia y antagonismos con
otros que son patógenos para mantener el equilibrio entre los microorganismos que
conviven en el entorno; tal es el caso de las bacterias fotosintéticas, bacterias lácticas,
levaduras y en menor cantidad, los hongos de fermentación y actinomicetos
(Szymanski and Patterson 2003).
La mezcla de estos microorganismos, todos benéficos, ha constituido la base de lo

que es hoy la tecnología de los productos de fermentación de microorganismos
eficientes1. Se presenta esta tecnología como una alternativa útil para contribuir en la
solución de problemas que están amenazando a la humanidad; problemas como la
contaminación del medio ambiente y la producción de alimentos (Higa 1991).
Inicialmente, esta tecnología fue desarrollada como alternativa para obtener
fertilizantes químicos y pesticidas de alta calidad y no muy costosos, con parámetros
orgánicos y biológicos que no afectaran el medio ambiente. Se ha encontrado que los
microorganismos eficientes actúan como inoculante microbiano incrementando la
diversidad microbiana del suelo, mejorando sus condiciones físico-químicas y
aumentando a su vez la producción de los cultivos y su protección; además conservan
los recursos naturales generando así una agricultura sostenible. Sus aplicaciones en
las dos últimas décadas se han expandido a otras áreas para solucionar problemas
ambientales, de producción animal, de salud humana y de diversos tratamientos
1 Conocidos como EM por sus siglas en inglés de Effective Microorganisms.
1
Introducción
industriales siendo utilizada en más de 180 países del mundo para tales fines (Higa
1993, Namsivayam et al. 2011).
En Cuba, el desarrollo de la tecnología de los microorganismos eficientes se encuentra

en su fase inicial. Los resultados de sus aplicaciones en la agricultura y en la solución
de problemas ambientales como el saneamiento, tratamiento de aguas residuales y
control de malos olores han sido exitosos y han conllevado a extender su uso en otras
áreas. Tal es el caso, de su aplicación como plastificantes en el cemento.
A pesar de que las aplicaciones de esta tecnología en los diversos campos es un tema
actual pocos trabajos han sido realizados sobre el estudio de la composición química
de los productos de fermentación de microorganismos eficientes y teniendo en cuenta
la variedad de la materia prima a través de la cual se obtienen estos productos es
esencial llevar a cabo el control de la calidad del proceso de obtención para lo cual se
hace necesario la aplicación de técnicas analíticas que permitan cuantificar los
constituyentes principales.
El fósforo pertenece al número de los elementos más o menos abundantes. Es

importante destacar que los seres humanos obtienen fósforo de los alimentos, del
mismo modo, la ganadería obtiene fósforo del alimento ya sea natural, de pastos o
como complemento a la absorción natural, las plantas en vez obtener fósforo del suelo,
sus raíces absorben fósforo de la disolución del suelo. La importancia del fósforo para
la vida se hizo evidente en el mundo occidental cuando Liebig declaró que el fósforo
es un nutriente limitante en el crecimiento de las plantas. En el siglo XX, el fósforo se
convirtió en uno de los tres nutrientes esenciales: nitrógeno, fósforo y potasio,
ingredientes de los fertilizantes comerciales a nivel mundial (Valdiviezo 2008, Cordell
2010).
En una investigación previa se seleccionó para la determinación del contenido de

fósforo y sus derivados en muestras de productos de fermentación de
microorganismos eficientes la técnica espectrofotométrica del ácido
vanadomolibdofosfórico pero se han encontrado algunas incongruencias que son
necesarias corregir en aras de obtener resultados confiables.
2
Introducción
Por lo tanto se propone el siguiente problema científico:
¿Ofrece resultados confiables la técnica analítica seleccionada para la

determinación del contenido de fósforo total en productos de fermentación de
microorganismos eficientes?
Para contribuir a la solución de este problema, se plantea el siguiente objetivo

general:
Realizar la validación parcial de la técnica espectrofotométrica del ácido

vanadomolibdofosfórico para la determinación del contenido de fósforo total en
productos de fermentación de microorganismos eficientes.
Para alcanzar el objetivo planteado se proponen los siguientes Objetivos

Específicos:
 Seleccionar las condiciones de trabajo adecuadas para el correcto desempeño

del método.
 Verificar parámetros estadísticos del método tales como: linealidad, precisión,

límites de detección y cuantificación y veracidad.
 Determinar el contenido de fósforo total en muestras de productos de

fermentación de microorganismos eficientes
3
Capítulo 1. Revisión bibliográfica
En el presente capítulo se describirá brevemente lo que se conoce como

microorganismos eficientes, sus propiedades, aplicaciones e importancia. Se hablará
del fósforo, uno de sus constituyentes principales y de interés en este trabajo por la
importancia que este tiene para la agricultura ya que es un nutriente limitante en el
crecimiento de las plantas. Además se enuncian diversos métodos establecidos para
la determinación del contenido de fósforo y los conceptos de los parámetros
estadísticos a evaluar para realizar la validación del método seleccionado.
1.1 Microorganismos eficientes

Los Microorganismos Eficientes son inoculantes microbianos de origen natural
compuestos por bacterias fotosintéticas, bacterias lácticas, levaduras y en menor
cantidad, los hongos de fermentación y actinomicetos. Estas especies pueden coexistir
en un medio líquido a un pH inferior a 3,5. La base tecnológica de los microorganismos
eficientes (EM en lo adelante) es la mezcla de diferentes tipos de microorganismos
todos ellos benéficos que poseen propiedades de fermentación, producción de
sustancias bioactivas y competencia y antagonismo con otros que son patógenos para
mantener un equilibrio natural entre los microorganismos que conviven en el entorno
(Balan and Maldonado 2007, Mayer et al. 2010).
Estos microorganismos son eficientes cuando actúan en condiciones convenientes y

óptimas para metabolizar sus substratos, incluyendo entre estos el agua disponible, el
oxígeno (dependiendo si los microorganismos son aeróbicos o anaeróbicos del tipo
facultativos), el pH y la temperatura de su medio ambiente (Higa and Parr 1994).
Los productos de fermentación de los microorganismos eficientes parten de una madre

sólida que consiste en una fermentación anaerobia preferentemente láctica realizada
a partir de un “pool” conformado por hojarasca colectada de suelos que contienen una
combinación de microorganismos beneficiosos de origen natural.
Esta tecnología inicialmente fue desarrollada como alternativa para los fertilizantes
químicos y pesticidas dentro de los parámetros orgánicos y biológicos para no afectar
el medio ambiente, así como, para lograr productos de alta calidad con bajos costos.
4
Sin embargo, sus aplicaciones en las dos últimas décadas se han expandido a otras
áreas para solucionar problemas ambientales, de producción animal, de salud humana
y de diversos tratamientos industriales siendo utilizada en más de 180 países del
mundo (Eco-Tecnologías Accedido en 2013).
1.2 Propiedades de los EM
Los EM actúan en dos vías primarias: por exclusión competitiva de otros

microorganismos que son nocivos y, por la producción de subproductos beneficiosos
que promueven la salud del medio ambiente como: enzimas, ácidos orgánicos,
aminoácidos, hormonas y antioxidantes. Además, los EM son facultativos, lo que
permite extender sus beneficios a ambientes anaeróbicos y aeróbicos. Los EM
provocan a que la materia orgánica se descomponga rápidamente por la vía de la
fermentación y no de la putrefacción. Sus propiedades están dadas por los
microorganismos que conforman la mezcla.
 Bacterias fotosintéticas: Estas especies son autosuficientes e independientes,

sintetizan sustancias útiles a partir de secreciones de raíces, materia orgánica
y gases dañinos, usando la luz solar y el calor del suelo como fuentes de
energía. Las sustancias sintetizadas comprenden aminoácidos, ácidos
nucléicos, sustancias bioactivas y azúcares, promoviendo el crecimiento y
desarrollo de las plantas. Estos productos metabólicos pueden ser asimilados
directamente por las plantas y también actúan como sustratos que apoyan la
multiplicación de las bacterias. De esta manera las bacterias fotosintéticas
aumentan la cantidad de otros microorganismos deseables, confiriendo a los
EM la propiedad de neutralizar los malos olores y prevenirlos.
 Bacterias lácticas: Estas especies producen ácido láctico a partir de azúcares y
otros carbohidratos provenientes de las bacterias fotosintéticas y levaduras. El
ácido láctico es un potente esterilizador, como tal combate microorganismos
5
prejudiciales a los cultivos y acelera la descomposición de la materia orgánica

reduciendo el tiempo de compostaje2.
 Levaduras: Estas especies sintetizan y utilizan las sustancias antimicrobianas
que intervienen en el crecimiento de las plantas a partir de los aminoácidos y
azúcares producidos por las bacterias fotosintéticas así como, las de la materia
orgánica y de las raíces de las plantas.
 Sustancias bioactivas: Estas comprenden las hormonas y enzimas producidas
por las levaduras, incrementan la actividad celular y el número de raíces. Sus
secreciones son sustratos útiles para ciertos microorganismos efectivos tales
como, las bacterias lácticas y los actinomicetos.
 Hongos: A través de estas especies se forman fermentos activos y con estos el
material orgánico se desintegra más rápido produciendo alcohol, éster y
sustancias antimicrobianas que suprimen los malos olores y evitan la presencia
de insectos indeseables.
 Actinomicetos: Su estructura intermedia entre la de las bacterias y hongos,
produce sustancias antimicrobianas a partir de los aminoácidos y azúcares
producidos por las bacterias fotosintéticas y por la materia orgánica. Las
sustancias antimicrobianas suprimen hongos dañinos y bacterias patógenas.
(BID 2009, Higa and Parr Accedido en 2013).
1.3 Aplicaciones
1.3.1 Aplicaciones en la agricultura

La aplicación de la tecnología EM en la agricultura depende de varios factores como
son: el clima, la calidad de la tierra y método de cultivo, entre otros. Los EM como
inoculantes microbianos restablecen el equilibrio microbiológico del suelo mejorando
sus características físicas, químicas y microbiológicas, por lo cual favorecen el
2 Compostaje: es un proceso dirigido y controlado de mineralización y pre-humificación de la materia

orgánica, a través de un conjunto de técnicas que permiten el manejo de las variables del proceso; y
que tienen como objetivo la obtención de un abono orgánico de alta calidad físico-química y
microbiológica.
6
incremento de la producción de los cultivos y su protección. Además conservan los

recursos naturales, generando una agricultura y medio ambiente más sostenible.
El uso de estos productos mejora la estructura y agregación de las partículas del suelo,
reduce su compactación, incrementa los espacios porosos y por consiguiente la
infiltración del agua. De esta manera se disminuye la frecuencia de riego, tornando los
suelos capaces de absorber 24 veces más las aguas de lluvia, evitando la erosión por
el arrastre de las partículas (Higa and Parr 1995, APROLAB 2007).
La aplicación de EM también favorece la disponibilidad de nutrientes en el suelo,

solubilizándolos, separando las moléculas que los mantienen fijos, dejando los
elementos disgregados en forma simple para facilitar su absorción por el sistema
radical. Suprime y controla las poblaciones de microorganismos patógenos que se
desarrollan en el suelo por competencia e incrementa la biodiversidad microbiana
generando las condiciones necesarias para que los microorganismos benéficos
nativos prosperen (Tovar and Erazo 2009).
Por lo tanto, cuando se emplea EM en el suelo, en un cultivo o en cualquier otro medio,

debe tenerse en cuenta que los microorganismos eficientes entran en competencia
con otros microbios autóctonos del medio por lo cual, a medida que se refuerza su
aplicación a través de un uso integral y repetido se logran mejores resultados ya que
son una población mayor de microorganismos benéficos actuando (BID 2009, Higa
and Parr Accedido en 2013).
1.3.2 Aplicaciones en el medio ambiente

Los EM tienen una amplia gama de aplicaciones para solucionar problemas
ambientales que van desde el tratamiento de aguas residuales, su uso en baños
secos3, el tratamiento de los residuos sólidos orgánicos hasta su aplicación en los
vertederos de residuos sólidos urbanos. Así, pues, los EM son aplicados para eliminar
3 El baño seco es un sistema de tratamiento basado en procesos naturales donde se separan las aguas
cloacales y las materias fecales. En este proceso, las aguas cloacales se depuran mediante filtros de
pedregullo y plantas acuáticas y las materias fecales se compostan. Los microorganismos eficientes
intervienen disminuyendo las moscas, los malos olores y acelerando el compostaje de las heces.
7
los malos olores generados por el metano, mercaptano, ácido sulfhídrico, sustancias
amoniacales, etc. producto de la descomposición de los materiales orgánicos, por otra
parte aceleran el compostaje y evitan la presencia de insectos indeseables (Higa
2003). También el uso de estos productos ayuda al aprovechamiento eficiente de los
desechos animales como subproductos enriquecidos y seguros, eliminando
microorganismos patógenos y semillas de malezas, promueve la transformación
aeróbica de compuestos orgánicos, evitando la descomposición de la materia orgánica
por oxidación; evita la proliferación de insectos vectores, como moscas, ya que estas
no encuentran un medio adecuado para su desarrollo; incrementa la eficiencia de la
materia orgánica como fertilizante. Durante el proceso de fermentación se liberan y
sintetizan sustancias y compuestos como: aminoácidos, enzimas, vitaminas,
sustancias bioactivas, hormonas y minerales solubles, que al ser incorporados al suelo
a través del abono orgánico mejoran sus características físicas, químicas y
microbiológicas. Acelera el proceso de compostaje a una tercera parte del tiempo de
un proceso convencional (Bernal 2012).
1.3.3 Aplicaciones en la producción animal

Debido a la capacidad de los EM de reprimir patógenos y crear un ambiente
antioxidante su aplicación en diferentes áreas de la producción animal permite mejorar
las condiciones ambientales del medio de crecimiento y desarrollo de los animales
(Yépez et al. 2002); disminuye la oxidación y formación de óxido en las superficies
metálicas de las instalaciones para el alojamiento de los animales; permite la supresión
de malos olores y la reducción de insectos nocivos y molestos, así como la reducción
de la tasa de mortalidad y la mejora de la calidad del alimento y del agua lo cual
promueve a la ganancia de peso, la reducción de la incidencia de enfermedades y
estrés en el animal, mejora el aspecto físico de los animales y disminuye el
requerimiento de desinfectantes y antibióticos. El uso de estos productos contribuye
significativamente a la reducción de las emanaciones provocadas por el estiércol y la
orina, amplía la calidad del compost, ayuda a la elaboración rápida del abono y
optimiza el tratamiento de lagunas de oxidación y aguas negras permitiendo
oxigenación y clarificación de las mismas; incrementa la producción de pastos y
forrajes con pasturas, heno y ensilaje de mejor calidad (Javaid and Bajwa 2011).
8
Además, la aplicación de los EM en la producción animal permite la reducción de los

costos de producción por la disminución en el requerimiento de productos químicos.
1.3.4 Aplicaciones en la cría de aves de corral
Los EM se han vuelto muy popular en la industria avícola. Los alimentos se fermentan
con EM antes de suministrarlos a las aves. También son usados en el agua de beber,
lo que ayuda a acentuar microbiológicamente la calidad de la misma, además de
enriquecerlas con sustancias benéficas (ALA 2007).
Según Bernal (2012) las formas más utilizadas de EM están enfocadas hacia tres
componentes principales:
 Agua de bebida: Ayuda a mejorar microbiológicamente la calidad de la misma,

además de enriquecerla con sustancias benéficas (aminoácidos, vitaminas,
minerales, etc.), incrementa la digestibilidad y asimilación de nutrientes.
Además, al hacer más eficiente el proceso digestivo, los EM ayudan a reducir
la producción de gases nocivos desde el intestino mismo.
 Tratamiento de excretas: Las aspersiones a los corrales o lugares donde se
mantienen las aves buscan establecer las poblaciones de microorganismos en
las excretas, impidiendo la proliferación de otros microorganismos que pudren
la materia orgánica. De esta manera, los EM por fermentación del material
reduce la generación de malos olores y la presencia de insectos plaga.
 Fermentación para alimentación animal: Por medio de la fermentación de
componentes dietarios, los EM mejoran la disponibilidad de nutrientes
(aminoácidos) de los materiales y hacen más eficiente la nutrición de los
animales. Una porción de concentrado comercial fermentado con EM en la
ración total de los animales mejora sustancialmente los índices productivos de
las aves.
1.3.5 Aplicaciones en la actividad pesquera

De acuerdo a los estudios y experimentos, los EM son extremadamente beneficiosos
para la actividad pesquera, la comida de los peces se fermenta con EM antes de
9
alimentarlos. Una variedad de alimentos hechos con EM incluyen aquellos

excrementos de animales desechos sólidos con Bokashi y alimento comercial.
1.3.6 Aplicaciones en la industria

Los EM contienen sustancias y enzimas antioxidantes que evitan la oxidación de los
materiales de construcción proporcionándoles mayor dureza y duración. Así, pues, los
EM son aplicados como aditivo en hormigón, permitiendo un fraguado y un secado del
mismo mucho más rápido.
También son aplicados en la pintura de edificios, se sustituye el agua por los EM, no
afecta el color de la pintura ni la calidad, previene las emanaciones tóxicas de
formaldehídos, tolueno y xileno presente en algunos materiales usados en
contrachapado, empapelados, pegamentos o colas de parquets, entre otros (Earth-
Ecuador Accedido en 2013).
1.4 Composición química de los EM

Las aplicaciones de la tecnología EM en los diversos campos es un tema actual a nivel
mundial sin embargo, pocos trabajos se han realizado sobre la composición química
de los EM. Diferentes fuentes reportan la composición química de EM siendo marcada
la coincidencia en la presencia de algunos elementos químicos como se presenta en
la tabla 1.1 sacada de los estudios realizados por Balan y Maldonado en el 2007.
Tabla 1.1. Análisis químico de elementos contenidos en los EM
Cond. Concentración (mg/L)

pH Elec. -
(dSm/m)
P K Ca Mg Fe Cu Zn Mn NO3
EM 3,45 2,94 13,0 1897 550 192 13,1 4,1 0,1 1 35,3
Esta información permite tener un criterio sobre los posibles valores del contenido de
fósforo que pueden presentar los EM, no obstante en esta revisión no se hace
referencia a los métodos de análisis empleados para realizar estas determinaciones.
10
1.5 El fósforo
El fósforo es un elemento químico, su número atómico es 15 y su símbolo, P. Es un

no metal multivalente perteneciente al grupo del nitrógeno (Grupo 15) que se
encuentra en la naturaleza combinado en fosfatos inorgánicos y en organismos vivos
pero nunca en estado nativo. Es muy reactivo y se oxida espontáneamente en contacto
con el oxígeno atmosférico emitiendo luz (Oliveira 2007).
La importancia del fósforo para la vida se hizo evidente en el mundo occidental cuando
Liebig declaró que el fósforo es un nutriente limitante en el crecimiento de las plantas.
En el siglo XX, el fósforo se convirtió en uno de los tres nutrientes esenciales:
nitrógeno, fósforo y potasio, ingredientes de los fertilizantes comerciales a nivel
mundial. En las plantas una porción de 0,2 % de su masa es fósforo.
El fósforo es tan importante para la agricultura como el agua. Pero la falta de

disponibilidad y accesibilidad de fósforo para las plantas resulta ser un serio problema
emergente que amenaza la capacidad de abastecer los alimentos que demanda una
población mundial en incesante crecimiento. Como el nitrógeno y el potasio, es un
nutriente que las plantas absorben del suelo, siendo crucial para su fertilidad y el
crecimiento de los cultivos. Favorece el desarrollo de las raíces de las plantas, lo que
se conoce como proceso radicular, agilizándolo y mejorando el amarre de las raíces a
la tierra, esto beneficia la absorción de elementos y nutrientes que ayudan al correcto
desarrollo de las plantas (Lopes et al. 2002).
En los frutos, las semillas y las flores, el fósforo propicia un alto nivel de maduración y
evita el proceso conocido como “aborto”, este se refiere a la pérdida prematura de
flores y frutos de las plantas.
El fósforo existe en las aguas en varias formas: inorgánica, que incluyen los
ortofosfatos y polifosfatos (pirofosfatos, tripolifosfatos y metafosfatos) y fosfatos
orgánicos. La presencia de fósforo inorgánico se debe a una variedad de fuentes tales
como: uso de fertilizantes, los cuales pueden ser arrastrados por el agua de lluvia hacia
los cuerpos de agua superficiales; productos de limpieza, ya que los fosfatos son los
principales constituyentes de los detergentes y compuestos utilizados en el
acondicionamiento de aguas para calderas y potabilización de aguas, entre otros. El
11
fósforo orgánico se forma principalmente por procesos biológicos. Su presencia en

aguas residuales se debe a las heces fecales y residuos de alimentos, así como
también al formado a partir de los ortofosfatos utilizados en el tratamiento biológico o
el proveniente de la biota acuática (Standard 2005). La química de los compuestos
orgánicos de fósforo es muy compleja, se sabe que, su descomposición conduce a
ortofosfatos. La mejor forma de controlar el fósforo es mediante el ensayo de fósforo
total (Salazar 2011).
1.6 Determinación del contenido de fósforo

La determinación del contenido de fósforo puede ser realizada empleando métodos
clásicos e instrumentales. Dentro de los métodos clásicos, en el gravimétrico, los
ortofosfatos se pueden precipitar como fosfato amónico magnésico, MgNH4PO4 x
6H2O, con cloruro de magnesio y cloruro de amonio en disolución amoniacal (mezcla
magnesiana) mientras que en el método volumétrico se titula el fosfomolibdato de
amonio con solución estandarizada de hidróxido de sodio, empleando fenolftaleína
como indicador y como valorante permanganato de potasio 0,1 mol/L, o solución
estandarizada de bromato de potasio (Petrucci et al. 2003, Colectivo de autores 2013).
Los métodos gravimétricos presentan la ventaja de ser muy precisos sin embargo, la
determinación necesita mucho tiempo realizándose largas operaciones (precipitación,
filtración, lavado, calcinación del crisol vacío y con el precipitado, etc.). Por su parte
los métodos volumétricos presentan gran exactitud y se realiza una sola operación: la
titulación, que con cierta práctica del analista se realiza en algunos minutos, pero
suelen ser menos precisos que los métodos gravimétricos (Harris 2001).
Debido a estos inconvenientes, los métodos instrumentales han sido ampliamente

difundidos y utilizados para la determinación cuantitativa de fósforo. Estos métodos
encuentran cada día mayor aplicación por las siguientes razones: son más rápidos,
son mucho más sensibles pues mientras que para el análisis químico clásico la
concentración más pequeña a determinar es 10 -5 mol/L para el análisis instrumental
puede ser de 10-10 mol/L, son métodos muy selectivos pudiéndose determinar un
elemento en presencia de otros sin necesidad de aislarlos, se pueden determinar
varios elementos simultáneamente con gran exactitud (Rodriguez and Monzon 1998).
12
Los métodos instrumentales más utilizados para la determinación de fósforo pueden

ser divididos en dos grupos: los métodos basados en las técnicas electroanalíticas
como son la potenciometría, la voltametría y la amperometría y, aquellos basados en
técnicas ópticas como son la espectrometría ultravioleta-visible, la espectrometría de
absorción atómica, la espectrometría de emisión atómica con plasma inductivamente
acoplado, la espectrofluorimetría y quimioluminiscencia (Neto 2006).
En este trabajo se selecciona el método espectrofotométrico del ácido

vanadomolibdofosfórico teniendo en cuenta fundamentalmente el nivel de
concentración esperado en el analito y que se encuentra establecido en normas
Nacionales e internacionales (COVENIN 1993, Standard Methods 2005, NMX-AA-029-
SCFI 2001, ME-IIT-367 2007, NCh 2009). El método espectrofotométrico del ácido
vanadomolibdofosfórico consiste en la reacción del ortofosfato con molibdato de
amonio bajo condiciones ácidas, para formar un heteropoliácido, el ácido
molibdofosfórico que en presencia del ion vanadato da lugar al ácido
vanadomolibdofosfórico de color amarillo, cuya intensidad es proporcional a la
concentración de fosfatos presentes en la muestra. Algunas sustancias pueden causar
interferencias como el hierro ferroso produciendo un color azul, pero no afecta los
resultados si su concentración es menor a 100 mg/L, valor que es mucho mayor que
el contenido en la matriz de estudio. El ion férrico causa interferencias cuando la
longitud de onda a la cual se mide la intensidad del color es baja, particularmente a
400 nm.
La longitud de onda a la cual es medido el color, depende de la sensibilidad deseada.
Debido a que en esta técnica, la sensibilidad varía 10 veces, con la longitud de onda
entre 400 y 490 nm, los intervalos de acuerdo con las concentraciones esperadas se
muestran en la tabla 1.2.
Tabla 1.2. Longitud de onda para diferentes intervalos de concentración de P.
Intervalos de P (mg/L) Longitud de onda (nm)

1,0 – 5,0 400
2,0 – 10 420
4,0 – 18 470
13
En el presente trabajo se determina el contenido de fósforo total, siendo este el de

importancia e implicaciones en las diferentes ramas donde se aplica, en una mezcla
de EM mediante el método seleccionado.
1.7 Parámetros estadísticos

La validación es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que
se han cumplido los requisitos del método para una utilización o aplicación específica
prevista. La validación examina las características de desempeño de un método para
identificar y establecer cualquier limitación que pueda esperarse del método, así como
identificar los factores que pueden influir en el cambio de dichos parámetros y
limitaciones; permite demostrar que el método es adecuado para el propósito, esto es,
para resolver un problema analítico particular y persigue conocer si la técnica de
análisis empleada es correcta y suficiente para la determinación de las
concentraciones del analito en cuestión. Entre los parámetros analíticos más utilizados
se encuentran: veracidad, precisión, linealidad, límite de detección y de cuantificación,
entre otros (IDEAM 2006, Regulación 2007, Rodríguez 2010, Rodriguez 2011).
1.7.1 Linealidad
La linealidad se define como la capacidad de un método analítico dentro de un intervalo
establecido, de dar resultados instrumentales linealmente proporcionales a la
concentración de analito en la muestra. Esta característica puede expresarse como la
pendiente de la línea de regresión y su varianza o como el coeficiente de determinación
R2 y el coeficiente de correlación R (Regulación 2007, Castellanos 2008).
La pendiente b es una medida de la sensibilidad, mientras mayor es la respuesta del

instrumento a un cambio en la concentración del analito, mayor es la sensibilidad. En
los gráficos de calibración, normalmente los valores del coeficiente de determinación
R2 son cercanos a 1. Cuando R2 es menor a 0,99 es una advertencia de que la relación
no es lineal o que, debe repetirse o revisarse el procedimiento. Por otra parte, un valor
de R2 alto no siempre significa linealidad (Zagal and Sadzawka 2007).
Dentro del término linealidad se incluye la proporcionalidad entre la concentración de

analito y la respuesta así como, el intervalo de concentraciones de analito para los
14
cuales el método es satisfactorio. Debe definirse la linealidad para concentraciones

que cubran el ámbito total de interés. Este estudio se efectúa tanto sobre disoluciones
de patrones del analito como sobre muestras problemas que contengan
concentraciones crecientes del analito. El número de disoluciones de patrón o de
muestra puede estar comprendido entre (3 – 10) y el intervalo de concentraciones se
selecciona de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. El
experimento debe repetirse al menos una vez. Los resultados pueden presentarse
gráficamente, se debe dar la ecuación de la regresión lineal así como el coeficiente de
correlación que indica el grado de relación entre la absorbancia y la concentración (NC
2010).
Por lo tanto para verificar la linealidad y proporcionalidad se evalúan los datos

estadísticamente según se describe a continuación:
1. Significación de la regresión: se determinará el coeficiente de correlación (R ≥

0,990) y el de determinación (R2 ≥ 0,980).
2. Verificación de linealidad: se evalúa la desviación estándar de la pendiente Sb
cuyo criterio de aceptación es Sb ≤ 2 %.
Se desea probar si existe entonces una correlación significativa entre
absorbancia y concentración:
La hipótesis nula, H0 es b = 0, indicando que no existe correlación entre la

absorbancia y la concentración.
La hipótesis alternativa, H1 es b ≠ 0.
Si fuera b = 0 significa que la recta es paralela al eje de las abscisas y no existiría

regresión.
Si b ≠ 0, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa

con la probabilidad calculada.
3. Verificación de proporcionalidad: se evalúa el intervalo de confianza del

intercepto (a). Los resultados de este ensayo deben incluir el cero para el grado
de probabilidad definido.
15
Los límites de confianza del término del intercepto son: a ± t × Sa, siendo t el valor de
la distribución de Student para n – 2 grados de libertad a la probabilidad escogida
(generalmente ρ = 0,05). Si estos límites incluyen al cero, se cumple la condición de
proporcionalidad (Nazaré 2013).
1.7.2 Precisión
La precisión es el grado de concordancia entre los resultados de análisis
independientes obtenidos bajo condiciones específicas. Normalmente se expresa
como la desviación estándar de los resultados analíticos. Menores valores de
desviación estándar equivalen a una elevada o buena precisión y valores mayores
equivalen a una baja o pobre precisión. La precisión podrá establecerse en términos
de repetibilidad y reproducibilidad (Instituto de Salud Pública 2010, López 2010, NC
2010). La reproducibilidad también puede determinarse como reproducibilidad
intermedia que corresponde a aquella en que se varían dos o más factores (excepto
la muestra) y como reproducibilidad teórica calculada por la expresión de Horwitz.
Para determinar la precisión utilizando el diseño experimental basado en la evaluación

de la repetibilidad se preparan muestras patrones de 3 concentraciones diferentes (una
inferior, media y superior) del intervalo especificado y se realizan 3 réplicas de cada
una bajo las mismas condiciones (mismo laboratorio, mismo método, mismo operador,
utilizando el mismo equipamiento, dentro de intervalos cortos de tiempo). Se calcula la
desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV%). Los resultados de los
estudios de precisión se expresarán en términos de CV, el cual debe ser CV ≤ 3 %
para los métodos espectrofotométricos (Regulación 2007, Instituto de Salud Pública
2010).
1.7.3 Límites de detección y cuantificación
Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un

resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.
El límite de detección (LD) es la cantidad de un analito que corresponde a la señal de

medición más baja que con cierta confianza estrictamente definida puede ser
16
interpretada como un indicador de que el analito está presente en la disolución, pero

no necesariamente permitiendo su exacta cuantificación mientras que, el límite de
cuantificación (LC) es la menor cantidad de un analito presente en la muestra que
puede ser determinada cuantitativamente con una confianza estrechamente definida
(López 2010, NC 2010).
Se determinarán el LD y el LQ a partir de todo el conjunto de datos utilizado para la

realización de la curva de calibración y el análisis de la regresión lineal.
1.7.4 Veracidad
Se define la veracidad como el grado de concordancia entre el resultado de un ensayo

y el valor de referencia. El término veracidad, está aplicado a un conjunto de resultados
de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente
común de error sistemático o sesgo. Se define la veracidad como el grado de
concordancia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un
valor de referencia aceptado. La veracidad puede ser determinada por sesgo o
recuperación.
El sesgo se refiere a la diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un

ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de
cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático total en
contraposición al error aleatorio. Para determinar el sesgo puede utilizarse material de
referencia, material fortificado, material control, material ensayo de aptitud. Para este
fin, se debe medir un analito de concentración conocido y se determina la diferencia
en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una diferencia
sistemática importante en relación al valor de referencia aceptado se refleja en un
mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el
método.
La recuperación es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra

fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La
recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso
17
de extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original, por lo cual, la

recuperación está intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la
muestra. El porciento de recuperación se refiere a la proporción de la cantidad de
analito, presente o añadido al material de ensayo, el cual es extraído y cuantificado
(Canetti 2012).
1.8 Fundamento teórico del análisis por Espectrofotometría UV-VIS

La determinación de los componentes químicos en la región UV del espectro
electromagnético se fundamenta en la ley de Bouguer – Lambert – Beer, la que se
basa en 2 postulados fundamentales.
Cuando un haz de luz, cuyos rayos son paralelos y monocromáticos incide

perpendicularmente sobre una superficie en un medio homogéneo, cada capa o
segmento infinitesimal de ese medio hace decrecer la intensidad de la radiación
incidente en una fracción constante.
Io I
Rayo Rayo
Incidente Transmitido
Fig 1.1. Atenuación de un rayo de luz monocromática al pasar a través de una celda
de espesor b
El decrecimiento infinitesimal dI con el espesor del medio absorbente también

infinitesimal db, puede ser denotado mediante la expresión:
-dI = K × db (1.1)
Donde:
K es una constante que depende de la longitud de onda y de la naturaleza del medio,
18
I es la intensidad de la radiación incidente y
b es el camino óptico.
El incremento de la concentración del medio absorbente también disminuye la

intensidad de la radiación, en condiciones similares a las anteriormente citadas, lo que
se expresa según la siguiente ecuación:
−dl⁄ = K × dc (1.2)
I0
La combinación de las expresiones 1.1 y 1.2 integrada y expresada en forma

logarítmica es conocida clásicamente como ley de Bouguer – Lambert – Beer:
A= − log10 (I⁄I ) = a × b × c (1.3)

0
Donde:
I e I0 representan las intensidades de la luz incidente y transmitida por el disolvente

puro y la solución con la sustancia que absorbe,
c representa la concentración de la sustancia que absorbe,
b es el espesor del paso óptico de luz incidente sobre la muestra, y
a es el coeficiente de absortividad, también se conoce como el coeficiente de extinción

molar (ε) de la especie que absorbe, que es una constante de proporcionalidad
característica de cada sustancia.
El valor de a depende de la longitud de onda de la radiación utilizada para irradiar la

muestra y es característica para cada especie química. Por lo tanto, la función de
absortividad identifica la sustancia que absorbe.
La expresión 1.3 establece la relación lineal de la absorbancia en función de la

concentración de la solución, para un valor fijado del camino óptico. La construcción
de una curva de calibración empleando soluciones de diferentes concentraciones,
obtenidas a partir de un patrón, permite determinar la concentración de una muestra
problema (Skoog et al. 2001, Parra 2013).
19
Capítulo 2. Materiales y métodos
En el presente capítulo se describirán los materiales y métodos empleados para la

determinación de fósforo total en las muestras de productos de fermentación de
microorganismos eficientes, así como los reactivos y las disoluciones preparadas y los
métodos de cálculo de los parámetros estadísticos a evaluar, también se describe el
procedimiento para la determinación de la concentración de fósforo en la muestra.
2.1 Reactivos, materiales, equipos y disoluciones de trabajo
2.1.1 Reactivos empleados

Tabla 2.1. Reactivos empleados
Reactivos Firma Origen

Ácido sulfúrico (H2SO4)
concentrado p.a (95 - 98 UNI-CHEM China
%)
Ácido nítrico (HNO3)
UNI-CHEM China
concentrado p.a (56 %)
Ácido clorhídrico (HCl)
concentrado p.a (35 - UNI-CHEM China
37%)
Hidróxido de sodio
UNI-CHEM China
(NaOH), p.a
Reactivo Vanadato-
Preparado –
molibdato p.a
Dihidrógeno fosfato de
UNI-CHEM China
potasio, (KH2 PO4 ) p.a
Fenolftaleína p.a UNI-CHEM China
Alcohol etílico p.a UNI-CHEM China
Agua destilada p.a – Cuba
Carbón activado p.a UNI-CHEM China
20
2.1.2 Instrumentos, equipos y materiales empleados

Tabla 2.2. Instrumentos, equipos y materiales
Instrumento Firma Origen

Espectrofotómetro UV-vis.
– China
Modelo: Genesys 10UV
Bloc Digest, 6 plazas P-Selecta España
Estufa P-Selecta España
Plancha de calentamiento Raypa España
Balanza Analítica Sartorius China
Agitador magnético. MC – 8 Bunsen, S.A España
Agitador mecánico – –
Papel indicador – China
Papel de filtro – –
2.1.3 Preparación de disoluciones y del material para el ensayo

 Disolución Patrón de fosfatos (50 mg/L):
Se disuelven en agua destilada 219,5 mg de KH2PO4 anhidro, previamente

secado durante 1 hora a 105 0C y se diluye a 1000 mL con agua destilada (1,0
3-
mL = 50,0 mg/L de P como PO4 ).
 Disolución de hidróxido de sodio (NaOH) 10 mol/L:
Pesar 400 g de NaOH al 98 % de pureza y diluir en 500 mL de agua destilada.

Se enfría la disolución a temperatura ambiente y se diluye a 1000 mL con agua
destilada.
 Disolución de ácido clorhídrico (HCl 1:1):
Medir 50,0 mL de ácido clorhídrico concentrado, añadirlo lentamente y agitando

a 50,0 mL de agua destilada. La concentración del ácido no es crítica para la
determinación, pero se recomienda una concentración final en la muestra de
0,5 mol/L.
 Indicador fenolftaleína:
Se disuelven 0,5 g de fenolftaleína en una mezcla de 50,0 mL de alcohol etílico

y 50,0 mL de agua destilada.
21
 Reactivo Vanadato-Molibdato:
Solución A: Se pesan 12,5 g de NH4Mo7O24 x H2O y se disuelve en

aproximadamente 150 mL de agua destilada.
Solución B: Se calientan hasta ebullición 160 mL de agua destilada

aproximadamente en un beaker de 500 mL y se disuelven 0,625 g de NH4VO3,
se deja enfriar y se añaden 165 mL de HCl (conc), enfriar.
Una vez preparadas las disoluciones, añadir A sobre B, trasvasar a un matraz

de 500 mL y enrasar.
El material para el ensayo debe ser bien lavado con ácido clorhídrico diluido caliente
para evitar la adsorción de fosfatos en la superficie del vidrio. No se deben utilizar
detergentes comerciales que contengan fosfatos. Después de lavado se enjuaga con
agua corriente en forma abundante, luego se enjuaga por lo menos tres veces con
agua destilada. Preferiblemente se reserva esta cristalería sólo para la determinación
de fosfato.
2.2 Descripción de la técnica espectrofotométrica del ácido

vanadomolibdofosfórico para la determinación del fósforo total en la
muestra
El método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico consiste en la

reacción del ortofosfato con molibdato de amonio bajo condiciones ácidas, para formar
un heteropoliácido, el ácido molibdofosfórico que, en presencia del ion vanadato da
lugar al ácido vanadomolibdofosfórico de color amarillo, cuya intensidad es
proporcional a la concentración de fosfatos presentes en la muestra. Algunas
sustancias pueden causar interferencias como el hierro ferroso produciendo un color
azul, pero no afecta los resultados si su concentración es menor a 100 mg/L, valor que
es mucho mayor que el contenido en la matriz de estudio. El ion férrico causa
interferencias cuando la longitud de onda a la cual se mide la intensidad del color es
baja, particularmente a 400 nm.
22
La primera etapa consiste en realizar un barrido del espectro del complejo formado
entre el analito y el reactivo vanadato-molibdato en la región visible (400 – 490nm),
para corroborar lo planteado por las normas revisadas y seleccionar la longitud de
onda de trabajo, para la cual se utiliza la concentración intermedia de la curva de
calibración. Posteriormente se miden las absorbancias de las soluciones patrones
preparadas para la curva de calibración a la longitud de onda seleccionada para
evaluar el comportamiento lineal.
El cumplimiento de la relación lineal entre absorbancia y concentración dada por la ley

de Bouguer – Lambert – Beer depende de determinadas condiciones que deben
satisfacerse: la primera condición es que dicha ley es válida solo para disoluciones
diluidas, lo que evidencia que en la disolución no deben presentarse equilibrios que
dependen de la concentración de las especies. La segunda condición es que debe
utilizarse luz monocromática, lo que se logra cuando la anchura espectral de radiación
que abandona el monocromador sea sensiblemente menor que las anchuras medias
de las bandas de absorción a utilizarse. Por otra parte, la tercera condición es que los
errores en la determinación de absorbancia sean aceptables en el intervalo de 0,2 –
1,0; siendo recomendable trabajar en el intervalo de 0,3 – 0,8 que es la zona de menor
error fotométrico (Martinez and Toro 2010).
Una vez determinada, la longitud de onda es fijada para realizar las determinaciones.
Para el análisis, se miden primeramente las disoluciones de la curva de calibración y
posteriormente las muestras.
2.3 Preparación de la curva de calibración con fosfatos

 A una serie de matraces aforados de 25,0 mL se transfieren alícuotas de 0; 1,0;
2,0; 3,0; 5,0 y 6,0 mL de la disolución patrón de fosfato (50,00 mg/L). Se agregan
5,0 mL de reactivo vanadato-molibdato y se diluye a 25,0 mL con agua destilada
para preparar patrones en el rango de concentraciones de 0 a 12,00 mg/L.
 Dejar desarrollar el color durante 10 minutos.
 Ajustar el espectrofotómetro con el blanco de reactivos y medir la absorbancia a

la longitud de onda seleccionada.
23
 Realizar la curva de calibración llevando a un gráfico la absorbancia de los

patrones vs concentración de fósforo en los mismos.
2.4 Procedimiento para la determinación del contenido de fósforo

total en la muestra de EM
2.4.1 Preparación preliminar de la muestra

Para realizar el ensayo por el método seleccionado es necesario la eliminación del
color con carbón activado antes del tratamiento al blanco analítico y a la muestra. Si
resultara complicado filtrar la muestra se puede diluir previo a la adición de carbón
activado, tomando en cuenta todas las diluciones en el cálculo final de la concentración
de fósforo en la muestra.
Como la muestra de los EM es altamente coloreada se toman 100 mL de muestra y se

trasvasan a un vaso de precipitado de 250 mL donde previamente se pesaron cuatro
gramos de carbón activado, se agita durante cinco minutos y se filtra a través de un
papel de filtro (Filtrak # 45) para remover el carbón. Simultáneamente se toman 100
mL de agua destilada y se realiza el mismo tratamiento. Seguidamente se comprueban
los fosfatos en las muestras de carbón activado. La solución filtrada será la muestra
utilizada para la determinación de fósforo disuelto. Se lava bien el filtrado y se lleva
toda la muestra ya sin color a un matraz adecuado a la cantidad de muestra que se
desee preparar.
2.4.2 Pre-tratamiento de la muestra por digestión

Debido a que el fósforo se puede encontrar en combinación con la materia orgánica,
la determinación de fósforo total debe necesariamente contemplar una oxidación
efectiva de esta para transformar el fósforo a ortofosfato.
Existen tres métodos de digestión:
1. Digestión con ácido perclórico: es el más drástico y prolongado, se recomienda

sólo para muestras complejas, tales como sedimentos.
2. Digestión con ácido sulfúrico y ácido nítrico: es recomendada para la mayoría

de variedades de muestras de aguas.
24
3. Digestión con persulfato: es el método más simple, se recomienda que si es

adoptada, su efectividad de recuperación sea previamente contrastada contra
alguna de las digestiones más fuertes para verificar que sean equivalentes.
Para la conversión de todas las formas fosfóricas a ortofosfato la muestra de EM será

digerida con solución de ácidos fuertes (sulfúrico y nítrico) por ser recomendada para
la mayoría de variedades de muestras de aguas.
Preparar dos balones micro-Kjeldahl de 250 mL. Colocar en uno 50,0 mL de muestra,
previamente filtrada y en otro 50,0 mL de agua destilada sometida al mismo
tratamiento preliminar que la muestra y agregar a cada uno de ellos 1,0 mL de H2SO4
concentrado (95 – 98 % de pureza) y 5,0 mL de HNO3 concentrado (56 % de pureza).
Digestar a 150 0C durante 30 min en un digestor.
Terminada la digestión, se deja enfriar la mezcla y se transfiere a un matraz de 100

mL. Luego se adicionan 0,05 mL (una gota) de indicador fenolftaleína y se neutraliza
hasta desvanecer a un color rosa pálido con la disolución de hidróxido de sodio (NaOH
10 mol/L). Si el pH de la muestra es mayor que diez se debe ajustar agregando 0,05
mL (una gota) de indicador fenolftaleína y varias gotas de solución diluida de ácido
clorhídrico, HCl (1:1) hasta eliminar el color rosado y se enrasa a 100 mL con agua
destilada. A continuación se procede a la determinación espectrofotométrica por el
método seleccionado.
2.4.3 Desarrollo de color en la muestra

 Preparar paralelamente un blanco de reactivos para la lectura en el equipo, en
el cual el volumen de muestra se sustituye por agua destilada sometida al
mismo tratamiento preliminar y se procede de igual forma que con la muestra.
 Medir una alícuota de 10,0 mL de muestra en un matraz de 25,0 mL, adicionar

5,0 mL de reactivo vanadato-molibdato y enrasar a 25,0 mL con agua destilada.
 Dejar desarrollar el color durante diez minutos.
 Ajustar el espectrofotómetro con el blanco de reactivos y medir la absorbancia

de la muestra a la longitud de onda seleccionada.
25
El color es estable durante días y su intensidad no se ve afectada por la variación en

la temperatura ambiente.
2.5 Determinación de los parámetros estadísticos
2.5.1 Linealidad
Para evaluar la linealidad del método se preparan cinco disoluciones de
concentraciones 0; 2,0; 4,0; 6,0; 10,0 y 12,0 mg/L a partir de la solución patrón de
fosfatos de 50,00 mg/L. Según plantea el método, se procede al desarrollo de color de
estas disoluciones para obtener los valores correspondientes de las absorbancias a la
longitud de onda seleccionada y con estos, construir la curva de calibración que
relaciona absorbancia (y) vs. concentración (x), cuya relación debe ser lineal y es
representada por la ecuación 2.1. Se realizan tres réplicas por cada punto de la curva.
3-
A = b × c (PO4 ) + a (2.1)
Donde:
b es la pendiente
a es la ordenada al origen (intercepto)
A es la absorbancia
3- 3-
c(PO4 ) es la concentración de PO4 ( mg⁄L).
A continuación se indican los criterios de aceptación definidos para evaluar la

capacidad del método analítico seleccionado para obtener resultados linealmente
proporcionales a la concentración de fósforo en las muestras de EM dentro del
intervalo de trabajo, a partir de los resultados obtenidos en el estudio de la linealidad:
 Coeficiente de correlación: R ≥ 0,990

 Coeficiente de determinación: R2 ≥ 0,980
 Desviación estándar de la pendiente Sb cuyo criterio de aceptación es Sb ≤ 2%
 Test de significación de la pendiente (test de linealidad): b ≠ 0
26
 Límites de confianza del intercepto (test de proporcionalidad): debe incluir el

cero
2.5.2 Precisión
Para determinar la precisión se preparan, a partir de la solución patrón de fosfato de
50,00 mg/L, muestras patrones de concentraciones 2,00; 10,00 y 12,00 mg/L que
corresponden con un valor bajo, uno medio y uno alto y se procede según el método
seleccionado al desarrollo del color. A cada una de ellas se le realiza tres réplicas bajo
las mismas condiciones y se determina así la precisión en términos de repetibilidad.
Para evaluar la precisión en condiciones de reproducibilidad se preparan las muestras
patrones de 2,00; 10,00 y 12,00 mg/L a partir de la solución patrón de fosfato (50,00
mg/L) y se procede según el método seleccionado para desarrollar color, se realizan
tres réplicas en tres días diferentes. Con los resultados obtenidos se calcula la
desviación estándar y el coeficiente de variación (CV%). Los resultados de los estudios
de precisión, tanto en condiciones de repetibilidad como de reproducibilidad, se
expresan en términos de (CV%), cuyo criterio de aceptación definido para los métodos
espectrofotométricos por las normas es CV ≤ 3%.
2.5.3 Límites de detección y cuantificación

Para determinar el límite de detección y de cuantificación del método
espectrofotométrico empleado se realizaron las determinaciones de la regresión lineal
y se calculó a partir de todo el espectro de datos tomados para la confección de la
curva de calibración. El criterio de aceptación definido para el LD es 0,20 mg/L de
fosfato cuando se usan celdas de 1 cm de paso de luz, la cual se emplea en el
instrumento utilizado (NCh 2009). El método seleccionado puede ser utilizado en el
intervalo de 1,00 – 20,00 mg/L de fosfatos, según las normas (COVENIN 1993, NMX-
AA-029-SCFI 2001).
Varios son los procedimientos que según la literatura consultada pueden utilizarse para
la determinación de los límites de detección y cuantificación (NC 2010).
27
Basado en la evaluación visual:

El límite de detección es determinado por el análisis de muestras con concentraciones
decrecientes conocidas del analito, estimando el nivel mínimo al cual puede ser
detectado. El límite de cuantificación es generalmente determinado por este
procedimiento evaluando la menor cantidad de analito que puede ser cuantificado con
aceptable precisión y exactitud.
Basado en el valor de la ordenada de origen expresado en unidades de

concentración:
Si la recta de calibración del ensayo de linealidad se ha confeccionado con un rango
de concentraciones bajo, se admite utilizar el término independiente b para estimar
aproximadamente el límite de detección. El límite inferior de la respuesta se toma como
3 lbl / m.
Basado en la desviación estándar de la respuesta y en la pendiente:

El límite de cuantificación o detección puede ser expresado como:
Cl = K × Sbl / b (2.2)
Donde:
Cl = Límite de detección o cuantificación.
K es constante (K = 3 para límite de detección y K = 10 para límite de cuantificación)
SmL es la desviación estándar de la respuesta de los n blancos.
m es la pendiente de la recta de calibración.
La pendiente puede ser estimada por la curva de calibración del analito.
Basado en la desviación del blanco

Analizando un número apropiado (al menos 10) de muestras blanco y calculando la
desviación estándar de la respuesta. Este procedimiento es utilizado en métodos con
corrección de lectura. Frente al blanco como por ejemplo la espectrofotometría UV-
VIS, espectrofluorimetría, etc, en los que la lectura de la disolución problema se
obtiene por comparación con un blanco.
28
Basada en la curva de calibración

Realizando una curva de calibración específica para este estudio usando muestras
que contengan al analito en el intervalo del límite de detección y cuantificación. La
desviación estándar residual de una línea de regresión o la desviación estándar del
intercepto y de la línea de regresión pueden ser usadas como desviación estándar
(Pública, Ministerio de Salud Accedido en 2015).
A partir de la curva de calibración y aplicando ecuaciones matemáticas es posible

también calcular el LoD y LoQ del método. Vogelgesang y Hädrich (1998) proponen
ecuaciones matemáticas para el cálculo de estos.
Las ecuaciones son las siguientes:
ycrit - a
LD= (2.3)
b
Donde a representa el intercepto, b la pendiente y Ycrítica representa la señal de

absorbancia crítica la cual se calcula de la siguiente manera:
1 x̅ 2
ycrit = Sy × tf;a × √1+ n + (2.4)
∑ni=1 (x- x̅ )2
Donde
a es el intercepto,
Sy es el error estándar del modelo de regresión,
tf;a es la distribución de t con f = n – 2 dl y α = 0,05,
x̅ es el valor medio de la concentración de todos los análisis y,
n representa el número de determinaciones realizadas.
ydtm-a
LQ= (2.5)
b
Donde ydtm es el punto más bajo de la distribución gaussiana cercana a 2×LoD.
1 2 × LD - x̅ 2
ydtm =y̅+ b × (2 × LD -x̅ )+ Sy⁄ × √1+ + (2.6)
x n ∑ni=1 (x- x̅ )2
29
2.5.4 Veracidad
Para evaluar la veracidad se determina el porciento de recuperación (%R). La
recuperación representa la cantidad de analito añadido y recuperado en el análisis y
para su determinación se utilizará la expresión 2.7:
(ce -c0 )
%R= ×100 (2.7)
ca
Donde:
ce se refiere a la concentración media de la muestra después de la adición del estándar,
c0 se refiere a la concentración media de la muestra original y
ca es la concentración añadida de estándar.
En validación, el porcentaje de recuperación aceptable está entre 85 y 115% (IUPAC

2014).
La veracidad puede ser determinada además por sesgo. Para determinar el sesgo
puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control, material
ensayo de aptitud. Una diferencia sistemática importante en relación al valor de
referencia aceptado se refleja en un mayor valor del sesgo, cuanto más pequeño es el
sesgo, mayor veracidad indica el método. El sesgo se refiere a la diferencia entre la
expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor verdadero
y se puede calcular usando la expresión 2.8:
S = x - xa (2.8)
Donde
S es el sesgo,
x es la lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas y
xa es el valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.
Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual:

(xa -x)
tcalc = (2.9)
S × √n
Si se cumple que tcalc < t tab, entonces, el sesgo obtenido para el método utilizado es
aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable.
30
2.6 Determinación de la concentración de fósforo total en la muestra

de EM
2.6.1 Cálculo de la concentración de fósforo en la muestra de EM aplicando

el método de la curva de calibración
Primeramente se calcula la concentración de fósforo contenida en la muestra por
medio de la ecuación obtenida de la curva de calibración que es representada por la
ecuación 2.10:
y = bx + a (2.10)
Donde:
b es la pendiente,
a es la ordenada al origen (intercepto),
y es la absorbancia y
3-
x es la concentración de PO4 ( mg⁄L)
3-
Se reportan los resultados de la concentración de PO4 con dos décimas. En caso de
haber dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método, aplicar la ley de la
volumetría o utilizar la ecuación 2.11:
3-
mg/L de PO4 = concentración × factor de dilución (2.11)
2.6.2 Cálculo de la concentración de fósforo en la muestra de EM aplicando

el método de adición de estándar
Se añaden a la muestra concentraciones de 2, 4, 6, 10 y 12 mg/L y se construye un

gráfico de A vs c. La concentración será determinada por interpolación en la recta
donde la concentración de fósforo estará dada por la relación entre el intercepto y la
pendiente:
3-
c(PO4 ) = intercepto / pendiente (2.12)
3-
Se reportan los resultados de la concentración de PO4 con dos lugares decimales. En
caso de haber dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método, aplicar la ley
de la volumetría o utilizar la ecuación 2.9.
31
Capítulo 3. Análisis y discusión de los resultados
En el presente capítulo se evaluarán los resultados obtenidos en la validación del

método seleccionado para la determinación de fósforo total en las muestras de
productos de fermentación de microorganismos eficientes, así como los resultados
obtenidos en la determinación del contenido de fósforo total por el método de la curva
de la curva de calibración y el método de adición de estándar.
3.1 Corroboración de la longitud de onda de trabajo

Se realizó el espectro de absorción tomando las soluciones de los patrones de 5,00 y
12,00 mg/L de P, midiendo absorbancia en el rango de longitudes de onda de 400 y
hasta 650 nm (Anexos 3 y 4).
Espectro de absorción
c (P) = 5 mg/L
0,45
0,4
0,35
Absorbancia
0,3
0,25
0,2 Absorbancia de la muestra

Absorbancia del blanco
0,15
0,1
0,05
0
390 410 430 450 470 490 510
Longitud de onda
Fig. 3.1. Espectro de absorción para el patrón de 5 mg/L de P
32
Espectro de absorción
c (P) = 12 mg/L
1
0,9
0,8
0,7
Absorbancia
0,6
0,5 Absorbancia de la
muestra
0,4
Absorbancia del blanco
0,3
0,2
0,1
0
390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510
Longitud de onda
Fig. 3.2. Espectro de absorción para el patrón de 12 mg/L de P
Como se observa, y según lo planteado en las normas revisadas, se puede realizar la

determinación en el rango de longitudes de onda comprendido entre 400 y 470 nm. Se
seleccionó la longitud de onda de 420 nm pues las interferencias no son significativas
existiendo diferencias elevadas entre la absorción del complejo y el reactivo
desarrollador de color, y además para garantizar el intervalo óptimo de absorbancia
requerido para este tipo de análisis, valor comprendido entre 0,2 y 1,0 siendo
recomendable trabajar en la zona de 0,3 a 0,8 que es la zona de menor error
fotométrico.
3.2 Análisis de los resultados obtenidos en la validación del método
3.2.1 Análisis de la linealidad del método
En la tabla 3.1 se indican los valores experimentales de absorbancia y concentración,

que corresponden a la curva de calibración obtenida para la concentración de fosfato
en el intervalo de 0 a 12,00 mg/L, con los cuales se realiza el test de linealidad y de
proporcionalidad.
33
3-
Tabla 3.1. Valores experimentales de la curva de calibración de PO4 mediante el
método espectrofotométrico seleccionado
V c A Desviación
Media Varianza CV %
(mL) (ppm) I II III Estándar
1 2 0,082 0,078 0,080 0,080 0,0020 4,00x10-6 2.50
2 4 0,180 0,180 0,183 0,181 0,0017 3,00x10-6 0,96
3 6 0,295 0,296 0,297 0,296 0,0010 1,00x10-6 0,34
5 10 0,501 0,503 0,505 0,503 0,0020 4,00x10-6 0,40
6 12 0,590 0,588 0,590 0,589 0,0012 1,33x10-6 0,20
A continuación se muestra la curva de calibración de fosfato, en la cual se observa el

cumplimiento de la Ley de Lamber-Beer.
Curva de calibración a 420 nm

0,700
0,600
0,500
0,400
A
0,300
0,200 y = 0,0515x - 0,0207
R² = 0,9988
0,100
0,000
0 2 4 6 8 10 12 14
c (mg/L)
3-
Fig 3.3. Curva de calibración para el PO4 obtenida por el método espectrofotométrico
seleccionado.
3-
Donde y se refiere al valor de la absorbancia y x sería la c (PO4 ) expresada en mg/L.
34
Tabla 3.2. Resultados estadísticos del estudio de la linealidad del método:

(parámetros, resultados y criterio de aceptación)
Parámetros Resultados Criterios de aceptación

Coeficiente de correlación múltiple 0,9993 R ≥ 0,990
Coeficiente de determinación R2 0,9987 R2 ≥ 0,980
Desv. Estándar de la pendiente Sb 1,1 x 10-4 Sb ≤ 2%
ttab (0,05/2, n-2) 4,303 –
texp = b/Sb 446,2918 texp > ttab
a ± t × Sa -0,0167 a 0,0246 Debe incluir el cero
Como se puede observar en la tabla 3.2 el coeficiente de correlación lineal es

significativo (0,9999 > 0,990) pues aplicando la prueba t para n – 2 grados de libertad
el texperimental = 446,2918 > ttabulada = 4,303 lo cual indica que la probabilidad de ser b ≠
0 es muy elevada por lo que se rechaza la hipótesis nula y se concluye que existe una
correlación significativa entre la absorbancia y la concentración. Se cumple la
condición de proporcionalidad pues los límites de confianza del intercepto incluyen el
cero, siendo t el valor de la distribución de Student para n – 2 grados de libertad a la
probabilidad escogida (ρ=0,05). Por lo tanto, los parámetros de linealidad calculados
cumplen con los criterios de aceptación correspondientes, lo que indica que el método
para la determinación de fósforo es lineal en el intervalo de 0 a 12,00 mg/L y no es
necesario trabajar a otras longitudes de onda.
3.2.2 Análisis de la precisión del método
3.2.2.1 Precisión en términos de repetibilidad
En la tabla 3.3 se muestran los resultados de la precisión del método obtenidos del
estudio de la repetibilidad donde, se prepararon muestras patrones de concentraciones
2,00; 6,00 y 12,00 mg/L y a cada una de ellas se realizaron tres réplicas bajo las
mismas condiciones.
35
Tabla 3.3. Resultados de la precisión en términos de repetibilidad para la

3-
determinación de PO4
c (mg/L) 2 6 12
I 0,082 0,295 0,590
A II 0,078 0,296 0,588
III 0,080 0,297 0,590
Media 0,080 0,296 0,589
Varianza 4,0x10-06 1,0x10-6 1,33x10-06
Desv. Estándar 0,002 0,001 0,0011
CV % 2,5 0,3378 0,1959
Como se puede observar en la tabla 3.3, los coeficientes de variación (CV%) de la

repetibilidad del método son inferiores a 3 %, lo cual está acorde con el criterio de
aceptación definido para los métodos espectrofotométricos, por lo que el método es
preciso en el intervalo estudiado.
3.2.2.2 Precisión en términos de reproducibilidad intermedia
En la tabla 3.4 se muestran los resultados de la precisión del método obtenidos del
estudio de la reproducibilidad donde, se prepararon muestras patrones de
concentraciones 2,00; 6,00 y 12,00 mg/L y a cada una de ellas se realizaron tres
réplicas en días diferentes y manteniendo el resto de las condiciones experimentales
sin variación.
Tabla 3.4. Resultados de la precisión en términos de reproducibilidad intermedia para

3-
la determinación de PO4
c(P) Día 1 Día 2 Día3 Varian-
Media DE CV %
mg/L A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 za
2 0,082 0,078 0,080 0,080 0,081 0,083 0,083 0,081 0,084 0,081 0,0019 3,50x10-6 2,300
6 0,295 0,296 0,297 0,292 0,290 0,295 0,293 0,290 0,292 0,293 0,0025 6,50x10-6 0,869
12 0,590 0,588 0,590 0,592 0,591 0,593 0,594 0,601 0,596 0,593 0,0039 1,52x10-5 0,658
Como se puede observar en la tabla 3.4, los coeficientes de variación (CV%) de la

reproducibilidad intermedia del método son inferiores a 3 %, lo cual está acorde con el
criterio de aceptación definido para los métodos espectrofotométricos, por lo que se
36
puede afirmar que el método es preciso en el intervalo estudiado, también en

condiciones de reproducibilidad intermedia.
3.2.3 Análisis de la determinación de los límites de detección y

cuantificación
A partir de los valores (Xn, Yn) de la curva de calibración que se muestran a

continuación:
Tabla 3.5. Datos de la curva de calibración para la determinación de los límites de
detección y cuantificación
Concentración Absorbancia
(mg/L)
2 0,082
2 0,078
2 0,080
4 0,180
4 0,180
4 0,183
6 0,295
6 0,296
6 0,297
10 0,501
10 0,503
10 0,505
12 0,590
12 0,588
12 0,590
Se realizan los cálculos estadísticos de regresión, obteniendo los siguientes

parámetros:
Tabla 3.6. Estadísticas de la regresión
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de correlación multiple 0,999370781
Coeficiente de determinación R2 0,998741957
R2 ajustado 0,998645185
Error típico 0,007289871
Observaciones 15
37
Tabla 3.6. Resultados del análisis de la varianza

ANÁLISIS DE VARIANZA
Suma de Promedio de los Valor
F
cuadrados cuadrados crítico de F
Regresión 0,1828183 0,182818 2477 1,8x10-5
Residuos 0,0002214 7,38x10-5
Total 0,1830397
Estadístico Probabi- Inferior Inferior Superior

Error típico
t lidad 95,0 % 95,0 % 95,0 %
Intercepción 0,0080224 -2,57564 0,08 -0,04619 -0,05 0,005
Variable X 1 0,0010357 49,77227 0 0,04825 0,05 0,055
Calculando otros valores necesarios:

tf:a = 1,77
x̅ = 6,8
(n-1) × Var(x) = 206,40 (sumatoria de los errores cuadráticos de las concentraciones)
y̅ = 0,33
Despejando en la ecuación 2.4 se observa que ycrit = -0,01. Teniendo el valor de ycrit y
los valores a y b, se sustituyen en la ecuación 2.3 y se obtiene el límite de detección:
LD = 0,3.
Ya con todos los parámetros para realizar el cálculo de ydtm se sustituyen en la

ecuación 2.6 los valores y obtenemos que ydtm = 0,02.
A partir de los resultados obtenidos anteriormente se realiza el cálculo del límite de

cuantificación utilizando la ecuación 2.5, sustituyendo los valores de a, b y de ydtm se
obtiene un valor de LQ = 0,85.
LD = 0,30 mg/L
LQ = 0,85 mg/L
Como se observa la concentración mínima detectada por el método seleccionado

corresponde a 0,30 mg/L y el instrumento puede medir con un nivel de confianza
38
definido por el método seleccionado a partir de 0,85 mg/L lo cual se corresponde con
el criterio establecido para el intervalo de trabajo. Se puede apreciar que el LD
calculado es adecuado para los propósitos del análisis.
3.2.4 Análisis de la veracidad del método
3.2.4.1 Cálculo del porciento de recuperación (% R)
Para determinar la veracidad se utiliza el método de adición de estándar y se determina

el porciento de recuperación. En la tabla 3.7 se muestran los resultados de este
análisis.
Tabla 3.7. Resultados del cálculo del porciento de recuperación.
Adiciones de
2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 10 mg/L
estándar
%R 89,70874 92,86408 98,28185 99,42071
Se concluye que el porciento de recuperación se encuentra dentro del rango aceptado

de 85 a 115 %. Se constató así que los efectos provocados por la matriz no son
significativos y esta no influye en la determinación del contenido de fósforo en la
muestra.
3.2.4.2 Cálculo del sesgo

Adición de estándar 2 mg/L
Valor
Muestra Lectura Obtenida Sesgo
esperado
1 6,5184 7,9864 8,5184 0,5320
2 6,4214 8,1417 8,4214 0,2796
3 6,4796 7,8893 8,4796 0,5903
4 6,4796 8,2000 8,4796 0,2796
5 6,4408 8,3359 8,4408 0,1049
6 6,4602 8,2971 8,4602 0,1631
7 6,4796 8,1612 8,4796 0,3184
8 6,5184 8,3165 8,5184 0,2019
9 6,4019 8,3359 8,4019 0,0660
Media 6,4667 8,1849 8,4667 0,2818
Desviación estándar 0,1691
tcalc 0,5553
39

Muestra Lectura obtenida Valor esperado Sesgo
1 6,5184 9,9476 10,5184 0,5709
2 6,4214 10,1029 10,4214 0,3184
3 6,4796 9,6369 10,4796 0,8427
4 6,4796 10,2000 10,4796 0,2796
5 6,4408 10,2777 10,4408 0,1631
6 6,4602 10,0835 10,4602 0,3767
7 6,4796 10,2000 10,4796 0,2796
8 6,5184 10,2777 10,5184 0,2408
9 6,4019 12,2777 10,4019 -1,8757
Media 6,4667 10,3338 10,4667 0,1329
tcalc 0,0567

1 6,5184 12,1223 12,5184 0,3961
2 6,4214 12,5107 12,4214 -0,0893
3 6,4796 12,3553 12,4796 0,1243
4 6,4796 12,4524 12,4796 0,0272
5 6,4408 10,2777 12,4408 2,1631
6 6,4602 12,2777 12,4602 0,1825
7 6,4796 12,4524 12,4796 0,0272
8 6,5184 12,4136 12,5184 0,1049
9 6,4019 12,2777 12,4019 0,1243
Media 6,4667 12,1266 12,4667 0,3400
tcalc 0,1627

1 6,5184 16,3165 16,5184 0,2019
2 6,4214 16,3942 16,4214 0,0272
3 6,4796 16,3359 16,4796 0,1437
4 6,4796 16,3553 16,4796 0,1243
5 6,4408 16,5107 16,4408 -0,0699
6 6,4602 16,4136 16,4602 0,0466
7 6,4796 16,4136 16,4796 0,0660
8 6,5184 16,4913 16,5184 0,0272
9 6,4019 16,4524 16,4019 -0,0505
Media 6,4667 16,4093 16,4667 0,0574
tcalc 0,2161
40
En todos los casos tcalc < ttab, por tanto no hay diferencias significativas, el sesgo
obtenido para el método utilizado es aceptable, y su veracidad es aceptable.
3.3 Determinación de fósforo total por el método espectrofotométrico

del ácido vanadomolibdofosfórico en la muestra de los EM
Para determinar el contenido de fósforo total por el método espectrofotométrico del
ácido vanadomolibdofosfórico se analizaron varias muestras. El procedimiento para el
ensayo (véase el Anexo 5), cuyos resultados se presentan a continuación. Es
importante considerar que para la determinación de fósforo total en esta matriz la
digestión ácida resulta ser eficaz cuando es realizada en un digestor, lo que permite
evitar la pérdidas de analito que se verifican en la digestión en una plancha de
calentamiento.
3.3.1 Método de la curva de calibración
A continuación se presentan los resultados obtenidos en el cálculo de la concentración

de fósforo en las muestras usando el método de la curva de calibración.
Tabla 3.8. Resultados obtenidos en la determinación de fósforo total en la muestra de

EM por el método de la curva de calibración
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4

Réplicas
cf1 cf2 cf3 cf4
I 137,23 136,41 136,41 136,41
Muestra II 135,18 135,59 137,23 136,00
III 136,41 136,00 134,77 135,59
media 136,27 136,00 136,14 136,00
varianza 1,0646 0,1681 1,5689 0,1681
DE 1,0318 0,4100 1,2526 0,4100
CV % 0,7572 0,3015 0,9201 0,3015
¿Existen diferencias entre las medias obtenidas?

La prueba t-Student permite comparar las medias de dos grupos de datos y determinar
si entre estos parámetros las diferencias son estadísticamente significativas. Si se
intenta un test de t-Student con estos valores hay que verificar si las varianzas no son
41
significativamente diferentes; porque si son diferentes, el test de t-Student no podrá

ser utilizado, para ello se utiliza la prueba F (Fisher):
Varianza mayor
F= (3.1)
Varianza menor
Por tanto Fcalc = 9,33 < Ftab = 19 y se concluye que las dos varianzas no son
significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t es una decisión legítima.
Día 1 Día 2 xΔ
137,23 136,41 0,82
135,18 135,59 -0,41
136,41 136,00 0,41
Media 0,2733
xΔ se refiere a la diferencia entre las mediciones

x∆
̅̅̅
tcalc = S⁄ (3.2)
√n
Entonces, tcalc = 0,7550 y ttab = 4,303, por tanto: tcalc < ttab y se concluye que no existen
diferencias significativas entre las medias determinadas.
La concentración de Ptotal presente en la muestra de los EM se calculó por medio de

la ecuación obtenida de la curva de calibración, teniendo en cuenta que hubo dilución
de la muestra a lo largo del desarrollo del método se aplicó la ley de la volumetría, y
3-
la concentración de PO4 resultó ser igual a 136,10 ± 0,2045 mg/L. Se puede observar
que el CV% calculado es inferior a 3% en todos los casos, lo cual está acorde con el
criterio de aceptación establecido para los métodos espectrofotométricos.
3.3.2 Método de adición de estándar
A continuación se presentan los resultados obtenidos en el cálculo de la concentración

de fósforo en las muestras usando el método de la adición de estándar.
42
Tabla 3.9. Datos obtenidos para el método de adición de estándar
Adiciones (mg/L) 3-
c (PO4 ) en la
Réplicas muestra
2 4 6 10
(mg/L)
Día 1 0,4455 0,5453 0,6640 0,8645 135,78
Día 2 0,4470 0,5453 0,6583 0,8667 135,21
Día 3 0,4467 0,5497 0,6583 0,8680 135,73
Día 4 0,4447 0,548 0,6577 0,8647 135,84
media 0,4460 0,547 0,6596 0,8660 135,64
varianza 1,16x10 -6 4,65x10-6 8,77x10-6 2,82x10-6 0,0852
DE 0,0011 0,0022 0,0030 0,0017 0,2920
CV % 0,2410 0,3940 0,4489 0,1940 0,2152
Para cada uno de los días en que se analizó la concentración de fósforo en la muestra
utilizando el método de adición de estándar se construye la curva correspondiente y
se determina la concentración expresada en mg/L.
c = intercepto / pendiente
Adición de estándar
Día1 Día 2 Día 3 Día 4
1,000
0,900
0,800 y = 0,0527x + 0,3399
R² = 0,999
0,700
y = 0,0528x + 0,3391
0,600
A
R² = 0,9996
0,500
y = 0,0528x + 0,3404
0,400 R² = 0,9999
0,300 y = 0,0526x + 0,3394
0,200 R² = 0,9999
0 2 4 6 8 10 12
c (mg/L)
Fig 3.4. Curvas para el método de adición de estándar.
43
La concentración de Ptotal presente en la muestra de los EM se calculó por medio de la

ecuación obtenida de la curva de adición de estándar, teniendo en cuenta que hubo
3-
dilución de la muestra a lo largo del desarrollo del método la concentración de PO4
resultó ser igual a 135,64 ± 0,4642 mg/L.
44
Conclusiones
 Se establecen las condiciones de trabajo adecuadas para el correcto

desempeño del método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico
propuesto para la determinación de fósforo total en productos de fermentación
de microorganismos eficientes.
 El proceso de validación demuestra que el método es lineal, preciso en términos

de repetibilidad y reproducibilidad y veraz en el intervalo de concentraciones de
2,00 a 12,00 mg/L. Siendo el límite de detección 0,30 mg/L y el límite de
cuantificación de 0,85 mg/L. Se demuestra que la contribución del efecto matriz
no tiene influencias significativas en la determinación.
 Se aplica el método propuesto a la muestra de microorganismos eficientes

CBQ-VTC, lote: Investigación 200 L siendo la concentración de fósforo total
determinada por el método de la curva de calibración y por el método de adición
del estándar iguales a 136,10 ± 0,2045 mg/L y 135,64 ± 0,4642 mg/L
respectivamente. No existiendo diferencias significativas entre las
concentraciones calculadas por ambos métodos.
45
Recomendaciones
 Aplicar el método espectrofotométrico del ácido vanadomolibdofosfórico

propuesto para la determinación de fósforo total en otras muestras de
microorganismos eficientes.
46
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22.
Anexos
Anexo 1. Bloc digest 6 plazas (equipo utilizado para la digestión de la muestra)
Anexo 2. Espectrofotómetro UV-VISIBLE, Genesys 10UV

Anexos
Anexo 3. Datos para la confección del gráfico, espectro de absorción para la solución
patrón de 5 mg/L.
A Promedio A Promedio
λ (nm) λ (nm)
I II III de A I II III de A
400 0,396 0,402 0,411 0,403 460 0,104 0,103 0,107 0,105
405 0,353 0,357 0,367 0,359 465 0,094 0,094 0,096 0,095
410 0,313 0,315 0,325 0,318 470 0,084 0,082 0,085 0,084
415 0,278 0,279 0,287 0,281 475 0,073 0,076 0,075 0,075
420 0,246 0,247 0,254 0,249 480 0,062 0,062 0,065 0,063
425 0,218 0,218 0,225 0,220 485 0,052 0,052 0,055 0,053
430 0,194 0,194 0,20 0,196 490 0,043 0,043 0,045 0,044
435 0,172 0,173 0,178 0,174 500 0,027 0,027 0,028 0,027
440 0,155 0,155 0,160 0,157 550 0,001 0,002 0,004 0,002
445 0,140 0,138 0,144 0,141 600 0,001 0,003 0,001 0,002
450 0,126 0,126 0,131 0,128 650 0,004 0,001 0,004 0,003
455 0,115 0,115 0,118 0,116
Anexo 4. Datos para la confección del gráfico, espectro de absorción para la solución
patrón de 12 mg/L.
λ A Promedio λ A Promedio
(nm) I II III de A (nm) I II III de A
400 0,970 0,988 0,940 0,966 460 0,258 0,262 0,255 0,258
405 0,870 0,880 0,838 0,863 465 0,232 0,236 0,225 0,231
410 0,774 0,775 0,748 0,766 470 0,207 0,211 0,201 0,206
415 0,682 0,691 0,665 0,679 475 0,182 0,185 0,177 0,181
420 0,605 0,612 0,588 0,602 480 0,157 0,160 0,153 0,157
425 0,540 0,545 0,520 0,535 485 0,132 0,135 0,128 0,132
430 0,478 0,483 0,465 0,475 490 0,109 0,112 0,106 0,109
435 0,428 0,434 0,413 0,425 500 0,069 0,073 0,068 0,070
440 0,383 0,390 0,372 0,382 550 0,001 0,004 0,002 0,002
445 0,346 0,352 0,336 0,345 600 0,000 0,003 0,001 0,001
450 0,314 0,319 0,305 0,313 650 0,001 0,008 0,002 0,004
455 0,285 0,290 0,279 0,285
Anexos
Anexo 5. Diagrama de flujo para la determinación de PTotal:
Tomar 100 mL y añadir 4 g Tomar 500 mL de muestra y diluir a

de carbón activado 1000 mL en un matraz volumétrico
Eliminación de color
Agitar durante 5 minutos
Filtrar a vacío y lavar bien el Preparar

filtrado paralelamente
(Si fuera necesario filtrar más de una
vez pudiera usarse la filtración a
gravedad)
Trasvasar a un matraz de 2 L
todo el contenido inicial de la
Medir 10 mL y llevar a un
muestra ya decolorada matraz
de 25 mL
Tomar 50 mL de muestra en
un block de digestión Añadir 5 mL de la solución
Desarrollador de color
vanadato-molibdato (reactivo
Añadir 5 mL de HNO3(conc) y desarrollador de color)
1 mL de H2SO4(conc)
Enrasar y dejar desarrollar
Digestar por 30 minutos a color durante 10 minutos
Digestión ácida
150ºC
Enfriar Ajustar espectrofotómetro con

el blanco de reactivos a la
longitud de onda
Añadir 0.1 mL (2 gotas) de seleccionada (420 nm)
fenolftaleína
Registrar resultados
Neutralizar con NaOH 10
mol/L hasta que aparezca el
color rosa
Trasvasar a un matraz de
100 mL, enfriar a temperatura
ambiente y enrasar

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UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS

FACULTAD DE QUÍMICA FARMACIA

1.1 Microorganismos eficientes ................................................................................ 4

1.3.1 Aplicaciones en la agricultura ...................................................................... 6

1.4 Composición química de los EM ...................................................................... 10

1.7.1 Linealidad .................................................................................................. 14

1.8 Fundamento teórico del análisis por Espectrofotometría UV-VIS .................... 18

Capítulo 2. Materiales y métodos .............................................................................. 20

2.1 Reactivos, materiales, equipos y disoluciones de trabajo ................................ 20

2.1.1 Reactivos empleados................................................................................. 20

2.2 Descripción de la técnica espectrofotométrica del ácido vanadomolibdofosfórico

2.5 Determinación de los parámetros estadísticos ................................................ 26

2.5.1 Linealidad .................................................................................................. 26

2.6 Determinación de la concentración de fósforo total en la muestra ................... 31

2.6.1 Cálculo de la concentración de fósforo aplicando el método de la curva de

Capítulo 3. Análisis y discusión de los resultados ..................................................... 32

3.1 Corroboración de la longitud de onda de trabajo ............................................. 32

3.2.1 Análisis de la linealidad del método ........................................................... 33

3.3 Determinación de fósforo total por el método espectrofotométrico del ácido

3.3.1 Método de la curva de calibración ............................................................. 41

En Cuba, la tecnología de los productos de fermentación de Microorganismos

Palabras clave: Microorganismos Eficientes, fósforo, método espectrofotométrico,

In Cuba, the technology of Effective Microorganisms (EM) products fermentation is in

En el mundo actual se han incrementado considerablemente la contaminación y

La mezcla de estos microorganismos, todos benéficos, ha constituido la base de lo

1 Conocidos como EM por sus siglas en inglés de Effective Microorganisms.

En Cuba, el desarrollo de la tecnología de los microorganismos eficientes se encuentra

El fósforo pertenece al número de los elementos más o menos abundantes. Es

En una investigación previa se seleccionó para la determinación del contenido de

Por lo tanto se propone el siguiente problema científico:

¿Ofrece resultados confiables la técnica analítica seleccionada para la

Para contribuir a la solución de este problema, se plantea el siguiente objetivo

Realizar la validación parcial de la técnica espectrofotométrica del ácido

Para alcanzar el objetivo planteado se proponen los siguientes Objetivos

 Seleccionar las condiciones de trabajo adecuadas para el correcto desempeño

 Verificar parámetros estadísticos del método tales como: linealidad, precisión,

 Determinar el contenido de fósforo total en muestras de productos de

En el presente capítulo se describirá brevemente lo que se conoce como

1.1 Microorganismos eficientes

Estos microorganismos son eficientes cuando actúan en condiciones convenientes y

Los productos de fermentación de los microorganismos eficientes parten de una madre

1.2 Propiedades de los EM

Los EM actúan en dos vías primarias: por exclusión competitiva de otros

 Bacterias fotosintéticas: Estas especies son autosuficientes e independientes,

prejudiciales a los cultivos y acelera la descomposición de la materia orgánica

1.3.1 Aplicaciones en la agricultura

2 Compostaje: es un proceso dirigido y controlado de mineralización y pre-humificación de la materia

incremento de la producción de los cultivos y su protección. Además conservan los

La aplicación de EM también favorece la disponibilidad de nutrientes en el suelo,

Por lo tanto, cuando se emplea EM en el suelo, en un cultivo o en cualquier otro medio,

1.3.2 Aplicaciones en el medio ambiente

1.3.3 Aplicaciones en la producción animal

Además, la aplicación de los EM en la producción animal permite la reducción de los

1.3.4 Aplicaciones en la cría de aves de corral

 Agua de bebida: Ayuda a mejorar microbiológicamente la calidad de la misma,

1.3.5 Aplicaciones en la actividad pesquera

alimentarlos. Una variedad de alimentos hechos con EM incluyen aquellos

1.3.6 Aplicaciones en la industria