Informe De Laboratorio

Bioquímica Grupo 1

Presentado por los (as) estudiantes:

1. Anthony Flores Riveira
2. Astrid Carolina Sierra
3. Angelica Ávila Quintero
4. Pierina Mejía Moscote
5. Jesús Manuel Orozco Viloria
6. Maritza Arias Cárdenas
7. Lueidy Ortega Cuadros.

Universidad Nacional Abierta Y A Distancia - UNAD

Escuela Ciencias Básicas Tecnología E Ingeniería - ECBTI
201103_22: Bioquímica
Docente: Iván Darío Mora Vergara
Ingeniería De Alimentos, Regencia De Farmacia, Tecnología En Calidad
Alimentaria
Noviembre 2023.
 Introducción
El componente práctico del curso de bioquímica comprende el espacio académico para afianzar

y consolidar las competencias adquiridas por el estudiante en el componente de formación

básica de estudiantes de los programas de ingeniería de alimentos y regencia de farmacia. A

través del desarrollo de las prácticas el estudiante aplicará conceptos de la bioquímica,

relacionados con biomoléculas, enzimología y metabolismo celular, tales como estructura, pH,

reacciones de óxido-reducción, cinética e inhibición enzimática y catabolismo celular. De igual

manera, el componente práctico favorece en los estudiantes el desarrollo de habilidades

observacionales, analíticas y experimentales en el área de la bioquímica.

Durante el desarrollo de las prácticas favorecerá afianzar conceptos y competencias adquiridas

en cursos previos como biología y química orgánica, para así lograr la aprehensión de las

competencias necesarias en la formación en ciencias básicas para el óptimo desarrollo de sus

programas académicos.

El diseño de este manual de laboratorio se realizó con el propósito de complementar y

correlacionar los conceptos teóricos con los resultados experimentales del curso de bioquímica

de la cadena de ciencias básicas, tecnología e ingeniería de la Universidad Nacional Abierta y

a Distancia. Este protocolo consta de 5 prácticas que integran los temas de las tres unidades

temáticas del curso.

Los contenidos de las prácticas fueron seleccionados, teniendo en cuenta el tiempo y las

competencias metodológicas mínimas que se esperaría debe alcanzar un estudiante de la

Universidad en el campo de la bioquímicacción.

 Objetivo General

Desarrollar en el estudiante la capacidad analítica para relacionar las medidas experimentales del

laboratorio de bioquímica, con los conceptos teóricos aprendidos.

Objetivos específicos

 Reconocer los factores primordiales sobre el concepto de biomoléculas.

 Aplicar procedimientos en el laboratorio sobre bioenergética.

 Desarrollar las temáticas de metabolismo a través de ensayos experimentales.

 Práctica No. 1. Bioseguridad

Propósito. Desarrollar en el estudiante la competencia de comportamiento bioseguro en el

laboratorio de bioquímica.

Objetivo general. Conocer y aplicar las principales normas de seguridad e higiene que se

deben seguir en el laboratorio.

Marco Teórico

Las normas de seguridad en el laboratorio son protocolos establecidos internacionalmente, que

permiten hacer de la actividad de práctica de laboratorio, una actividad segura con el

conocimiento previo del manejo de los reactivos a través de la consulta de la hoja de seguridad,

la cual describe los peligros de una sustancia o producto químico.

Procedimiento.

1. Para el desarrollo de esta práctica el estudiante debe observar las video normas de seguridad

en el laboratorio

2. Se hará la discusión sobre las normas de seguridad antes descritas y las que se encuentran

en la Reglamentación y Normas de Bioseguridad en los Laboratorios de la UNAD y Otras

Disposiciones.

3. Realice las siguientes actividades

a. Identifique la señalización que encuentra en el laboratorio, fotografíe o dibuje los

pictogramas y elementos de seguridad que encuentre (Duchas, extintores, cámaras extractoras,

etc.) describa en el informe de laboratorio su significado o uso según corresponda.

 En el laboratorio hay unos responsables de seguridad que son

encargados que las medidas de seguridad instaladas funcionen correctamente

 lavaojos esta señalización indica el manejo adecuado de este

 Encargados dan a conocer las señalizaciones de emergencia

 Esta señalización indica el lugar en donde se encuentran los equipos de

luchas contra incendios como extintores, mangueras y otros.

 los laboratorios deben contar con un botiquín para en caso de que se

presente una emergencia, poder prestar los primeros auxilios

 Al laboratorio de debe ingresar con zapatos planos y serrados

 vitrina de extracción de gases hay que verificar su funcionamiento y

evitar que se convierta en un almacén de sustancias

 Llave de paso de gas, debe estar cerrada y solo se abre cuando se ha

necesario
 Durante el laboratorio se deben llevar puestas las gafas integrales sin

exenciones

 Durante el laboratorio hay que lavarse las manos al comenzar y al

terminar el laboratorio

 No hay que pipetear con la boca se deben usar los utensilios correctos

como en este caso la pipeta

 Hay que utilizar los guantes indicados de acuerdo con los riesgos y

reactivos que se manipulan

 Se debe utilizar un encendedor eléctrico, no encendedores de gas

 Siempre hay que mantener los envases de las sustancias químicas bien

serrados para prevenir las evaporizaciones de estas

 Cuadro de compatibilidad de almacenamiento de sustancias químicas

 Peligro materias Toxicas

 Pictogramas de irritación al inhalar y muta génica, cancerígeno.

  Pictograma de sustancias toxicas y comburentes separadas de las

sustancias corrosivas.

 Prohibido fumar

 Prohibido hablar por celular

 Prohibido comer y beber

b. Defina Riesgo biológico y Riesgo químico

 El riesgo biológico es la posibilidad de que un trabajador sufra un daño como

consecuencia de la exposición o contacto con agentes biológicos durante la realización

de su actividad laboral

 Riesgo químico es aquel que se deriva del uso o la presencia de sustancias químicas

peligrosas. Una sustancia es peligrosa cuando presenta una o varias de las

características siguientes: • Es peligrosa para la salud. Cuando una sustancia química

es peligrosa para la salud de las personas hablamos de riesgo tóxico

c. Escoja uno de los reactivos utilizados en el componente práctico y conteste las siguientes

preguntas: NaCl (Cloruro de sodio)

i. Escriba las propiedades físicas y químicas de la sustancia.

Estado físico: Sólido cristalino

Color: Blanco
Olor: Inodoro.

Umbral olfativo: N/D

pH: 6,7 - 7,3 (solución acuosa)

Punto de fusión / de congelación: 801°C (1473°F)

Punto / intervalo de ebullición: 1465°C (2669°F)

Tasa de evaporación: N/D

Inflamabilidad: El producto no es inflamable ni combustible.

Densidad (20°C): 2,165 g/cm³

Solubilidad (20°C): 36 g / 100 ml, en agua.

Soluble en glicerol; muy poco soluble en alcohol.

Propiedades explosivas: No explosivo

ii. Mencione posibles riesgos que representa la sustancia para la salud.

La inhalación de partículas finas puede causar irritación leve de las membranas mucosas, nariz

y garganta. Los síntomas pueden incluir tos, sed y sequedad en la garganta

 Contacto con la piel: Puede causar irritación leve.

 Contacto con los ojos: Puede causar irritación.

 Ingestión: La ingestión de grandes cantidades puede causar irritación gastrointestinal,

náuseas, vómitos y diarrea. La exposición constante puede causar deshidratación y

congestión de los órganos internos.

  Visión general de los peligros: Gránulos o polvo blanco, inodoro, No se quema. Puede

desarrollar presión si se expone al agua. Puede causar irritación a los ojos.

 Inhalación: La Inhalación del polvo o niebla puede causar daños al Sistema

respiratorio y al tejido pulmonar lo cual puede producir desde una irritación a las vías

respiratorias superiores hasta la neumonía química

 Ingestión: Es usado como terapéutico y en las comidas. En grandes dosis (280 –340 g)

por más de 5 días, puede causar diarrea, mareo, vómito, y dolor abdominal.

 Contacto con la Piel: El contacto prolongado causa irritación a la piel con

enrojecimiento y formación de ampollas, lo cual puede agravarse en personas con

lesiones previas a la piel. La severidad del ataque a la piel va en relación directa y

proporcional a la concentración y tiempo del contacto

iii. Indique cual es el equipo o la vestimenta de seguridad necesaria para manipular la sustancia

Medidas de protección individual, como equipo de protección personal (EPP). Protección

cara/ojos Se debe usar equipo protector ocular que cumpla con las normas correspondientes

cuando una evaluación del riesgo indique que es necesario evitar toda exposición a

salpicaduras del líquido, lloviznas, gases o polvos

Referentes bibliográficos.

Social, M. d. (07 de 2021). Obtenido de

https://www.minsalud.gov.co/Ministerio/Institucional/Procesos%20y%20procedimientos/GT

HS02.pdf
 SURATEP, C... (27 de 07 de 2007). Obtenido de

https://www.arlsura.com/index.php?option=com_content&view=article&id=739

Práctica No. 2. Identificación de Lípidos

Propósito. Relacionar los conceptos de los lípidos a partir de procedimientos de laboratorio que

describen el comportamiento químico de los estos.

Objetivo general. Identificar propiedades de los lípidos

Marco Teórico

Los lípidos son biomoléculas se encuentran en todos los tejidos de los animales, vegetales y en la

flora y fauna microscópicas. Todos los lípidos contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, y algunos

nitrógeno, fósforo y azufre. El metabolismo intermedio de los lípidos en animales superiores está

íntimamente relacionado con el de los glúcidos y con algunas degradaciones de las proteínas, pues

sus vías metabólicas tienen diversos puntos en común; forman la parte principal de los

combustibles productores de energía del cuerpo.

Los lípidos son:

a-Sustancias insolubles en agua, pero solubles en los disolventes (de las grasas) como éter,

cloroformo, éter de petróleo, etc.

b.-Son ésteres reales o potenciales de los ácidos grasos.

Procedimiento.

Parte I. Emulsificación.
a. Tome dos tubos de ensayo y agregue a cada uno 5 ml de agua. Posteriormente, en uno de los

tubos agregue 10 gotas de aceite vegetal de cocina y en el otro tubo 10 gotas de aceite de oliva.

b. Agitar fuertemente, observar y registrar cuánto tiempo dura la emulsión.

c. De acuerdo con el tiempo estimado, definir cuál permite obtener una emulsión más estable.

Resultados

Evidencias Análisis de Resultados

Se logra visualizar en el aceite de oliva una
tonalidad del líquido más oscuro que la de
aceite vegetal, donde se refleja diferencia en
las tonalidades

La emulsificacion de las grasas permite obtener partículas pequeñas de aceites unidos a otros

líquidos en forma de micelas. Los agentes emulsificantes son una clase diversa de compuestos los

cuales son capaces de dispersar la grasa en el agua bajo la forma de pequeñas gotas.

Parte II. Saponificación

En un tubo de ensayo adicionar 10 gotas de aceite de oliva, en otro tubo adicionar 10 gotas de

aceite vegetal, y en otro adicionar manteca.

b. A cada tubo adicionar 3 ml de NaOH al 20%

c. Llevar a calentamiento en un baño maría durante 3-5 minutos. Sumergiendo el tubo de ensayo

con ayuda de las pinzas para tubo de ensayo.

d. Separar el precipitado formado, decantando la solución sobrante en otro tubo de ensayo, lo cual

representa el exceso de hidróxido de sodio que no reaccionó.

e. Agregar a cada uno de los tubos con el precipitado 3 ml de agua destilada. Agitar y observar.

f. Agregar a cada uno de los tubos cloruro de sodio (NaCl) a saturación, aproximadamente lo que

se mida con la punta de la espátula.

g. Dejar en reposo 3 min. Observar la formación de un precipitado que se aglomera en la parte

inferior del tubo.

h. Decantar el líquido y observar el precipitado en el mismo tubo.

i. Agregar 3 ml de agua destilada, agitar y observar si se disuelve y forma espuma jabonosa.

Resultados

Luego de colocar el hidróxido, en cada tubo de ensayo, se le agrego a cada tubo 10 gotas de aceite

de oliva y manteca y se le adiciono 3ml de Hidróxido de sodio, luego se llevó a baño de maría,

durante 5 min, luego separamos el precipitado formado, lo cual presenta el exceso de hidróxido de

sodio que no reacciono, se le agrega a cada uno de los tubos con el precipitado 3 ml de agua

destilada, agitamos y observamos.

Evidencias Análisis de Resultados

Se disolvió y tiene un olor a Jabón y forma
espuma jabonosa

Aceite Vegetal
 Hace mucha espuma, precipitado Jabonoso
superior y hace espuma

Aceite de Manteca
Se observa que si disuelve y forma espuma
jabonosa

Aceite de Oliva
 Aceite vegetal: superior

 Manteca: precipitado

 Aceite de Oliva: Inferior

Parte III. Índice de Yodo

a. Tomar 3 tubos de ensayo y colocar a cada uno de ellos 2 ml de etanol y 0,5 g de una

muestra de lípido si es sólida, o 0.5mL si es líquida (muestra de lípido: manteca, aceite de

cocina y aceite de oliva).

b. Someter a calentamiento en baño maría por un minuto cada tubo y dejar enfriar.

c. Agregar 5 gotas de lugol a cada tubo de ensayo y mezclar.

d. Agitar y observar el resultado anotando cuáles son los cambios para cada una de las

muestras. Se debe observar el cambio de color del lugol de un azul oscuro a un color café

oscuro

e. Clasifique los tubos de ensayo de menor a mayor coloración o tonalidad. Esto le

permitirá identificar la presencia de ácidos grasos con mayor instauración en cada una de

las muestras.
 Resultados

Evidencias Análisis de resultados

-3 tubos de ensayos
-2ml etanol

0,5 g de muestra de líquido

-Manteca
-Aceite de cocina
-Aceite de oliva
Resultado 120
3-5 minutos baño María (Parte II)
Resultado 150

Cloruro de sodio
Evidencia final
No hubo reacción en las mezclas
El índice de yodo es un parámetro de suma importante para evaluar la calidad de los aceites

y grasas comestibles. Proporciona información cuantitativa sobre la presencia de grasas y

aceites insaturados.

Práctica No. 3. Extracción y cuantificación espectrofotométrica de ADN

Propósito

Relacionar los conceptos de los ácidos nucleicos a partir de procedimientos de laboratorio que

describen el comportamiento químico de los mismos.

Objetivo general

Analizar el ácido nucleico ADN obtenido a partir de células vegetales.

Fundamentación Teórica

El ácido desoxirribonucleico (ADN) está conformado por un azúcar, llamado desoxirribosa, bases

nitrogenadas adenina A, timina T, citosina C o guanina G y un grupo fosfato. En el ADN se

presenta una doble cadena, una hebra de ADN está formada por unidades alternas de grupos fosfato

y azúcar. Los bases nitrogenados, se unen a la desoxirribosa y se forman dos hebras, unidas entre

sí por puentes de hidrógeno. El genoma de las células eucarióticas se encuentra organizado en

cromosomas, que son estructuras de DNA relacionadas con proteínas básicas, a las que se les

denomina histonas, y proteínas no histonas; las histonas tienen carga positiva a pH fisiológico y

neutralizan las cargas negativas del fosfato de los nucleótidos, lo que confiere estabilidad y permite

que el DNA que mide casi 2 metros de longitud se empaquete en un núcleo de 10 µm de diámetro.

El genoma humano está constituido por 46 cromosomas y contiene 5 × 106 kpb en su totalidad. El

ácido ribonucleico (ARN) es una molécula similar al ADN. El ARN difiere en que es

monocatenario, es decir, presenta una hebra de ARN; tiene un esqueleto formado por grupos

alternantes de azúcar ribosa y fosfato. Se adjunta a cada azúcar una de las cuatro bases: adenina

A, uracilo U, citosina C o guanina G. Visualice el siguiente video como parte de la fundamentación

teórica sobre la técnica espectrofotométrica utilizada en la práctica.

Descripción de la práctica

Esta práctica realizará la extracción del ácido desoxirribonucleico de células vegetales de Kiwi,

fresa o espinaca. Utilizando un método de extracción químico.

Equipos

Espectrofotómetro UV-VIS
Materiales

● Vasos de precipitado de 250 y 100 mL.

● Probetas de 250, 100 y 50 mL.

● Mortero.

● Espátulas o cucharas de tamaño pequeño.

● Pipetas graduadas de 5, 10 mL.

● Pipetas pasteur.

● Tubos de ensayo.

● Embudos

● Papel de filtro

● bisturí

Reactivos

● Agua destilada.

● Cloruro de sodio.

● Alcohol Isopropílico frío (-20)

Materiales suministrados por el estudiante

● Jabón líquido para lavar platos

● Zumo de piña fresco

● Kiwi, fresa o espinaca

● Gasa

Procedimiento.

Parte I. Extracción de ADN

1. En un vaso de precipitado prepare una solución de Lisis, a partir de la mezcla de 50ml de agua

destilada 1ml de jabón líquido y 2 gramos de cloruro de sodio (NaCl).

2. Para ello debe pesar los gramos de NaCl, adicionar el agua y agitar con ayuda de la varilla de

agitación hasta disolver completamente el sólido.

3. Luego adicione el jabón líquido y agite sin formar burbujas hasta que se disuelva

homogéneamente.

4. Una vez preparada la solución de Lisis. Con el bisturí pele y corte el Kiwi en pequeños trozos.

5. Coloque los trozos del Kiwi, fresa o espinaca en un mortero, y macere el Kiwi adicionando
poco a poco la solución de Lisis preparada anteriormente. Macerar suavemente evitando la

formación de burbujas.

6. Realice este procedimiento durante 10 minutos.

7. Filtre la solución obtenida hasta obtener aproximadamente 5mL de filtrado en un tubo de

ensayo, y con la ayuda del embudo de filtración de gravedad y papel de filtro.

8. Transfiera 3mL del filtrado anterior a otro tubo de ensayo y adicione 1mL de zumo de piña

(recién obtenido y filtrado).

9. Agite suavemente el tubo de ensayo, evitando que las paredes del tubo se impregnen de la

solución.

10. Incline el tubo de ensayo 45° y con ayuda de una pipeta Pasteur adicione lentamente

alcohol isopropílico frío hasta formar una capa sobre la muestra, aproximadamente 1.5 mL.

11. Observar la formación de las hebras del ADN, las cuales tienen un aspecto blanco.
Parte II. Cuantificación espectrofotométrica

1. Retire el botón de ADN y rehidrátelo en 2mL de agua destilada en un tubo de ensayo, agite

suavemente hasta que no observe el botón obtenido de la muestra de ADN vegetal.

2. Programe el espectrofotómetro para realizar la lectura a una absorbancia de 260 nm

3. Llene una cubeta para medición espectrofotométrica con agua destilada, tenga en cuenta que

debe ser la misma utilizada para la rehidratación del ADN.

4. Utilice esta muestra como muestra blanco, introdúzcala en el espectrofotómetro y realice el

blanqueamiento del equipo.

5. Transfiera la solución de ADN a otra cubeta para medición espectrofotométrica.

6. Realice la medición de la muestra a la absorbancia de 260 nm, registre los datos de

absorbancia.

7. Retire la cubeta con la muestra, y cambie la longitud de onda de medición a 280nm.

8. Realice nuevamente el blanqueamiento del espectrofotómetro,

9. Retire la muestra blanca e introduzca la cubeta con la muestra de ADN y realice la lectura.

10. Obtenga con sus compañeros los datos de 4 muestras adicionales.

11. Realice los cálculos para obtener la relación A260/A280 para cada muestra.

12. Consulte el significado de la relación A260/A280 e interprete los resultados obtenidos en

las 5 muestras.
Preguntas

En el desarrollo del informe debe dar respuesta a las siguientes preguntas:

1. ¿Cuál es la función de los componentes de la solución de Lisis?

R/ La lisis se lleva a cabo mediante una solución salina que suele contener detergentes que

desnaturalizan las proteínas o proteasas. Una vez separados los ácidos nucleicos de las

proteínas y lípidos se lleva a cabo su purificación.

2. ¿Para qué se usa el zumo de kiwi, ¿cuál es el compuesto clave y su función durante el

proceso de extracción de ADN?

R/ El zumo de kiwi contiene una enzima que contribuye a eliminar las proteínas que puedan

contaminar o degradar el ADN.

3. Explique las diferencias de solubilidad del ADN en medio salino y alcohólico.

R/ La diferencia que existe en la solubilidad del ADN en medio salino y alcohólico es que

ambos tienen diferentes factores alterados que hacen cambiar su ADN. Por ejemplo, una

precipitación salina afecta en algunos productos y proteína mientras que en alcohólico afecta

al sodio por medio de una carga negativa de los grupos de los fosfatos.

4. ¿Qué significa la relación A260/A280 en la cuantificación de muestras de ADN?

R/ La relación A260/A280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene

un valor entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación

A260/A280> 1.6, un valor A260/A280<1.6 indica una posible contaminación por compuestos

aromáticos como fenoles y proteínas.

 5. ¿Qué procedimientos se pueden utilizar para purificar el ADN?

R/ Enfoques habituales: Extracción alcalina, extracción en fenol-cloroformo, centrifugación

en gradiente de densidad de cloruro de cesio (CsCl).

6. Consulte dos métodos de extracción de ADN.

R/ Incubación del lisado para su uso

Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90

– 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es

de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las

pérdidas de ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en

contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los

contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN.

Uso de resinas de intercambio iónico

Para la extracción del ADN también se han diseñado resinas que son capaces de formar complejos

con el ADN. El uso de resinas hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres dimensiones permite

que la superficie se encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede

protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona con los grupos

fosfatos del ADN. Esto es un método directo, que puede realizarse en un solo tubo y relativamente

rápido, pero tiene como inconveniente que se aíslan cadenas sencillas de ADN, y este no puede

ser utilizado por ejemplo para el análisis de la variación de polimorfismos en fragmentos de

restricción (RFLP).
 Práctica No. 4. Extracción de la caseína, determinación del punto isoeléctrico y

precipitación salina de proteínas.

La caseína es una de las proteínas más importante en la leche y los productos derivados de esta,

desempeña una función importante en la nutrición de los mamíferos y brinda los aminoácidos

necesarios para el excelente funcionamiento del sistema. Básicamente la leche está constituida

por tres tipos de caseínas ∝ 𝛽 𝑦 𝑘𝑎𝑝𝑝𝑎 𝑐𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛𝑎 de las cueles la kappa está directamente

relacionado con la coagulación ya que a ciertos valores de pH cambia su solubilidad.

Durante la primera parte de esta práctica se realizó la extracción de la caseína de la leche

adicionando ácido acético 1M gota a gota hasta lograr que las proteínas se vuelvan insolubles

y precipiten, luego de seguir cada uno de los pasos de la marcha analítica se aplicó la técnica

instrumental de espectrometría de adsorción atómica para determinar en función al pH el punto

isoeléctrico de la proteína predominante en la leche.

En 10 tubos de ensayo con valores de pH experimental definidos se realizó la curva de

calibración obteniendo la absorbancia a una longitud de onda 640 nm obteniendo los siguientes

resultados:

tubo pH A
1 3,59 0,021
2 3,7 0,015
3 3,83 0,006
4 3,98 0,017
5 4,15 0,012
6 4,27 0,021
7 4,46 0,023
8 4,88 0,015
9 5,28 0,028
10 5,27 0,011
Una vez tabulados los datos se procedió a encontrar la gráfica que representa a los valores de

absorbancia en función del pH.

¿Qué sucedería si se representa la transmitancia vs pH en lugar de absorbancia?

Al representar la absorbancia en lugar la transmitancia tendríamos un comportamiento

diferente en la gráfica de la función, para pasar de absorbancia a transmitancia aplicaremos la

1
siguiente ecuación 𝑇 = donde T es la transmitancia y A la absorbancia obteniendo los
10𝐴

siguientes resultados de transmitancia para cada tubo.

 tubo pH A T
1 3,59 0,021 0,952
2 3,7 0,015 0,966
3 3,83 0,006 0,986
4 3,98 0,017 0,961
5 4,15 0,012 0,972
6 4,27 0,021 0,952
7 4,46 0,023 0,948
8 4,88 0,015 0,966
9 5,28 0,028 0,937
10 5,27 0,011 0,974

Este cambio de absorbancia a transmitancia se ve reflejado en el punto isoeléctrico de la

caseína teniendo en cuenta que este se determina con el valor de pH que arroja mayor

absorbancia durante la ejecución de la técnica instrumental, sin embrago al convertir la

absorbancia a transmitancia el punto isoeléctrico vendría a ser el valor de pH que registro la

menor transmitancia haciendo que la recta de regresión lineal pase de ser ascendente a

descendente en el gráfico.
¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?

Teniendo en cuenta los resultados de la práctica se determina que el punto isoeléctrico al que

la caseína logra la neutralidad de cargas volviéndose insoluble y precipitando de esta muestra

de leche, está en un pH de 5,20 debido a que la absorbancia de la caseína a este valor de pH es

mayor. Según Padilla, D.J. zambrano, J.C. cada caseína en la leche posee un punto isoeléctrico

sin embargo este valor oscila entre 4.4 y 5.8, confirmándonos la veracidad de los resultados.

¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en la pI?

En general las proteínas son moléculas cargadas eléctricamente y esto le confiere

características especiales como solubilidad, viscosidad, etc. En este caso particular la kappa

caseína que es la proteína más importante tecnológica y nutricionalmente en la leche a un pH

de 6.6 es soluble como sal cálcica y su carga eléctrica es negativa.

Al añadir acido a la leche aumentamos el número de protones con carga positiva lo que hace

que la superficie de la micela de caseína se empiece a neutralizar y perder solubilidad hasta el

punto de que al estar totalmente neutralizada esta se hace totalmente insoluble y precipita. A

este punto en el que la carga de la molécula de caseína es neutra se le denomina punto

isoeléctrico (pI).

Explique cuál es el fundamento de la precipitación salina y por qué aparece un

precipitado en el filtrado obtenido durante la extracción de la caseína.

La precipitación de las proteínas en soluciones altamente concentradas de sales se debe al

aumento de los enlaces hidrófobos que rechazan la unión con las moléculas de agua debido a
la fuerza iónica del soluto, esta separación induce a que las proteínas se acumulen en una zona

específica y luego puedan ser filtradas con facilidad.

Cuando la proteína está cerca a su punto isoeléctrico se requiere de soluciones con baja

concentración de sales para precipitarlas. (Torres, G.M. 2013)

 Práctica No. 5. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford

Propósito Relacionar las propiedades estructurales y químicas de los aminoácidos y proteínas, a

partir de procedimientos de laboratorio que describen su comportamiento bioquímico.

Objetivo general. Conocer métodos de cuantificación de proteínas y aplicar los conceptos de

curva de calibración.

Descripción de la práctica

En esta práctica se va a evaluar la concentración de proteínas en una muestra mediante la

cuantificación por métodos espectrofotométricos.

Marco Teórico elaborado en un mapa conceptual

Procedimiento de cada práctica elaborado en un diagrama de flujo

Link del diagrama: https://lucid.app/lucidchart/5714a900-6b41-4b5f-bde7-

28001b2627ad/edit?viewport_loc=-

1312%2C100%2C4440%2C2052%2C0_0&invitationId=inv_e25a911b-5323-4d0a-8ef9-

6206a6039042

Recursos para utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Equipos

● Espectrofotómetro

● Incubadora

● Agitador

Materiales

● Matraz aforado de 50 mL

● pipeta graduada de 1,0 mL o micropipetas

● Tubos de ensayo

● Gradilla

● Termómetro

Reactivos

● Reactivo de Bradford

● Solución de Albúmina sérica Bovina (10 mg/mL)

● Caseína y sobrenadante (obtenidos en la práctica anterior)

● Leche

● NaCl al 1%

● NaOH 1N

Procedimiento:
 a. Pesar 0.1 g de caseína y colocarla en un vaso de precipitado de 100 mL. Añadir 30 mL de

solución de NaCl al 1%, agregar gota a gota una disolución concentrada de NaOH 1N hasta

completar la disolución de la proteína.

Imagen 1. Peso caseína

Imagen 2. vaso de precipitado de 100 mL

b. Pasar la disolución anterior a un matraz aforado de 50 mL y aforar. Esta es la disolución

problema y de estas se tomarán alícuotas para el desarrollo de la prueba, Este volumen es suficiente

para todo el grupo de estudiantes presentes en el laboratorio.

Imagen 3. Matriz aforada de 50 ml

Imagen 4. Disolución problema

c. Para la preparación de la muestra problema de leche; tomar 0.1 mL de leche y realizar una

dilución de 1:10 (Vol. Final: 1 mL). Si la concentración de proteína no se encuentra dentro del

rango de absorbancia preparar diluciones de 1:20, 1:100 y 1:1000 de la solución inicial.

Imagen 5. Dilución de 1:10

d. A continuación, separe los tubos de ensayo en dos grupos, los seis primeros se utilizaron para

obtener la curva patrón y los otros seis para analizar las muestras problema.
 Imagen 6. Tubos separados

e. Adicione a cada tubo el mismo volumen del reactivo de Bradford (2 mL), homogenice la

solución por medio de un agitador tipo vortex. (Tenga presente, solamente al tubo 1 se le

agregaron 2 ml de reactivo de Bradford y 2 ml de NaCl).

Imagen 7. Tubos de reactivos de Barford, adicione dos (2 mL)

f. Posteriormente, llevar los tubos a 70 °C durante 10 minutos hasta la formación del complejo.

Dejar reposar las soluciones hasta alcanzar la temperatura ambiente.

g. Finalmente, realizar la cuantificación de la solución por medio de un espectrofotómetro a 595

nm para el reactivo de Bradford, entre cada medición lavar las celdas; al tener todas las mediciones

realizar la curva de calibración.

Imagen 8. Tubos llevados a 70°C

G. Por último, llevar a cabo la cuantificación de la solución por medio espectofometro a 595 nm

para el reactivo de Bradford, entre cada medición lavar las celdas; al tener las mediciones realizar

la curva de calibración.

H. Realice y grafique la regresión lineal a partir de los datos de la curva de calibración realizada

con la albúmina de suero bovino y halle las concentraciones de las muestras problema.

Tubo Solución * Absorbancia Proteína (mg)

No.
1 2 ml NaCl al 1%, 0.524 Blanco
2 0.1 ml BSA y 1.9 ml NaCl al 1%, 2.223 Albumina de huevo,
color azul claro
3 0.2 ml BSA y 1.8 ml NaCl al 1%, 2.427 Albumina de huevo,
color azul claro
4 0.4 ml BSA y 1.6 ml NaCl al 1%, 2.409 Albumina de huevo,
color azul claro
5 0.8 ml BSA y 1.2 ml NaCl al 1%, 2.688 Albumina de huevo,
color azul claro
6 1 ml BSA y 1 ml NaCl al 1%, 2.663 Albumina de huevo,
color azul claro
 7 0.25 ml caseína y 35 1.75 ml 1.693 Caseína, color azul
NaCl al 1%, claro
8 0.5 ml caseína y 1.5 ml NaCl al 2.232 Caseína, color azul
1%, claro
9 0.25 ml sobrenadante y 1.75 ml 0.519 Sobre sedante de
NaCl al 1%, caseína, color verde
claro
10 0.5 ml sobrenadante y 1.5 ml 0.637 Sobre sedante de
NaCl caseína, color verde
claro
11 0.25 ml leche diluida y 1.75 ml 0.563 Leche, color azul
NaCl al 1%, claro
12 0.5 ml leche diluida y 1.5 ml NaCl 0.560 Leche, color azul
al 1%, claro

Análisis y resultados:

Por medio del espectrómetro se midió a 595 mm para el reactivo Bradford.

Estos fueron los resultados:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

0.524 2.223 2.427 2.409 2.688 2.663
Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10 Tubo 11 Tubo 12
1.693 2.232 0.519 0.637 0.563 0.560
Al tener estas medidas se realiza la curva de calibración:

solución Absorbancia
0 0,524

0,1 2,223

0,2 2,427

0,4 2,409

0,8 2,688

1 2,663
 0,25 1,693

0,5 2,232

0,25 0,519

0,5 0,637

0,25 0,563
En la anterior grafica se observa, la falta de
0,5 0,560
cuantificación de proteínas.

Preguntas

En el desarrollo del informe debe dar respuesta a las siguientes preguntas:

1. Explique la ley de Beer-Lambert

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional

a la concentración de una sustancia presente en dicha solución y a la longitud del camino óptico

recorrido por la luz a través de la solución. Matemáticamente, se expresa como A = εcl, donde A

es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es la longitud del

camino óptico.

Conclusiones

La práctica de laboratorio permitió conocer los procedimientos para la cuantificación de proteínas

en una muestra mediante métodos espectrofotométricos.

Se utilizó el reactivo de Bradford, que se basa en la interacción entre el colorante azul de

Coomassie y las proteínas.
La concentración de proteínas se determinó midiendo la absorbancia de la solución a 595 nm en
un espectrofotómetro.

Los resultados obtenidos fueron satisfactorios, lo que indica que el reactivo de Bradford es un
método confiable para la cuantificación de proteínas.

Práctica No. 6. Hidrólisis del Almidón

Marco Teórico elaborado en un mapa conceptual

Procedimiento de cada práctica elaborado en un diagrama de flujo

Tablas de registro de datos para las prácticas de laboratorio

Parte I hidrólisis de almidón en medio ácido

Tubos Tubo de ensayo grande Prueba de yodo Prueba de benedict

insumos 10 ml de almidón al 1% 2 ml agua destilada 0,5 mL solución de

almidón hidrolizado
1 mL de HCl 2 gota de solución de 1 mL de NaOH
yodo
0,5 ml de la 2 mL de reactivo de Benedict
solución de almidón
Parte II hidrólisis enzimática del almidón
Tubos e Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Insumos
almidón al 1% 2 ml 2 ml 2 ml x
Saliva 1 ml x x x
Lugol x 2 gotas x x
Reactivo de x x 2 ml 2 ml
Benedict
Del tubo 1 x x x 1,5

Parte I hidrólisis de almidón en medio ácido

tubos Contenido Reacción Observación
Tubo 1 2 ml de agua destilada, + 2 gota de Positiva Se pudo observar un color negro, indicando una
yodo + 0,5 ml reacción positiva para la presencia de almidón.
de almidón
Tubo 2 0,5 ml de solución de No No se observó un cambio de color significativo
almidón hidrolizado, 1 ml de NaOH en la solución. Ya que mantuvo su color azul,
0,4 M + 2 ml de reactivo de Benedict esto nos deja decir que no hubo la presencia de
azúcares reductores en la muestra. Y como no
hubo azúcares reductores, que además la
concentración fue muy baja, es posible que no se
 observó un cambio de color significativo en la
solución.

Parte II hidrólisis enzimática del almidón

Tubos Contenidos Reacción observación

Tubo 1 Almidón + saliva x No hubo cambio de color se mantuvo transparente, aunque si en
el fondo se formó un precipitado de color violeta.
Tubo 2 Almidón + Lugol √ En este experimento si hubo reacción, se pudo observar un
cambio de color amarillo o naranja
Tubo 3 Almidón + x Aquí se pudo observar un color azul celeste, esto indica que el
Reactivo de almidón no es reductor.
Benedict
Tubo 4 Reactivo de √ En este experimento hubo reacción, debido a que cambio de un
Benedict + la color azul claro, con precipitado transparente en la parte superior,
mitad del tubo 1 a un color azul oscuro. Este experimento demuestra la capacidad
de la saliva para iniciar la digestión del almidón, mostrando un
cambio químico observable que indica la presencia de azúcares
liberados durante la hidrólisis del almidón por la amilasa salival.

En el desarrollo del informe debe dar respuesta a las siguientes preguntas:

Compare los resultados entre los dos ensayos de hidrólisis del almidón.

Resultados y evidencia fotográficas

Hidrólisis de almidón en medio ácido Análisis
 Al hacer una comparación de los resultados en los dos
ensayos se puede observar que ambos procesos
contribuyen a la descomposición del almidón, sin
embargo, utilizan mecanismos bioquímicos diferentes
para lograrlo.
Si bien es cierto que guardan relación en la
descomposición del almidón. Sin embargo, estas son
menos específicos. Ya que el ácido rompe los enlaces
glucosídicos de manera menos selectiva, generando una
mezcla de productos de almidón más pequeños.
Por otro lado, producen una variedad de productos más
pequeños de almidón.
Ya que sus condiciones ocurren en un ambiente ácido.
Hidrolisis enzimática del almidón Análisis
En este análisis se puede observar que la Hidrolisis
enzimática del almidón es altamente específico. Debido
a que las amilasas rompen enlaces glucosídicos
específicos en el almidón, produciendo azúcares más
simples como glucosa y maltosa.
Y esto se da en condiciones: que se llevan acaba bajo
temperaturas moderadas y en un medio ligeramente
alcalino.

Explique bioquímicamente las diferencias en el tiempo de hidrólisis entre los dos

ensayos

En cada ensayo se puede observar que cada sustancia tuvo una reacción distinta, reflejado en
los cambios de colores. Otra de las diferencias es en la hidrólisis enzimática del almidón, el
proceso se facilita mediante la acción de enzimas, específicamente la amilasa. La amilasa actúa
como una especie de cuchillo molecular, rompiendo los enlaces glucosídicos que mantienen
unidas las moléculas de almidón. Al ser altamente específicas, las enzimas pueden apuntar con
precisión a los lugares correctos, acelerando significativamente el procesamiento del almidón
en sus componentes básicos, como la glucosa.

A diferencia, en la hidrólisis de almidón en medio ácido, se emplea la acción de ácidos para

descomponer el almidón. Aquí, el ácido juega un papel menos específico y más general en la

ruptura de los enlaces químicos. Los iones de hidrógeno del ácido atacan los enlaces

glucosídicos, provocando una reacción que fragmenta el almidón en productos más simples.

La diferencia temporal entre ambos procesos radica en la eficiencia y especificidad de los

agentes catalizadores. Las enzimas en la hidrólisis enzimática son como productores

especializados que descomponen el almidón de manera rápida y precisa. Por otro lado, el ácido

en la hidrólisis ácida es más como un ejército genérico que, aunque efectivo, puede tomar más

tiempo y ser menos selectivo en su acción.

Así que, en última instancia, la velocidad de hidrólisis enzimática del almidón suele ser más

rápida debido a la naturaleza específica y eficiente de las enzimas involucradas.

Conclusión

Para terminar, se comprendió que ambos procesos contribuyen a la descomposición del

almidón, aunque hay una pequeña diferencia pues la hidrólisis en medio acido se lleva a cabo

en un ambiente ácido, lo que significa que se utilizan iones de hidrógeno (H⁺) para romper los

enlaces glucosídicos. Esto puede conducir a un análisis menos específico, generando una

mezcla de productos de almidón más pequeños. La hidrólisis enzimática es más específica y

 controlada debido a la acción específica de las amilasas, también comprendimos que las

amilasas suelen estar presentes en la saliva y el jugo pancreático en el sistema digestivo.

Práctica No. 7. Efectos de la temperatura, el pH y la concentración de sustrato sobre la

actividad enzimática

Propósito
Relacionar los conceptos de cinética e inhibición enzimática, a partir de procedimientos de
laboratorio que describen el comportamiento bioquímico de las enzimas.

Objetivo general.
Relacionar los conceptos de la cinética enzimática para determinar la inhibición por factores físicos
y químicos, a partir de procedimientos de laboratorio que describen el comportamiento bioquímico
de las enzimas.

Descripción de la práctica
En la práctica se determinará el efecto de factores físicos y químicos en la cinética enzimática de
la enzima amilasa salival, mediante el análisis de cambios colorimétricos.

Procedimiento:
Parte I. Efecto del pH sobre la actividad amilasa salival.
1. Prepare una solución de amilasa salival diluida, para esto tome 1 mL de saliva y adicione
9 mL de agua destilada, agite cuidadosamente hasta formar una solución homogénea.

1. Tome tres tubos de ensayo y adicione:

● Tubo 1: 2 mL de HCl 0,1N + 2 mL de solución de almidón al 2%

● Tubo 2: 2 mL de NaOH 0,1N + 2 mL de solución de almidón al 2%
● Tubo 3: 2 mL de agua destilada + 2 mL de solución de almidón al 2%
3. Adicione 2 mL de solución de amilasa salival diluida a cada tubo de ensayo.

4. Agite bien y mida rápidamente el pH de cada tubo, para esto utilice cinta indicadora de pH,
compare el color obtenido con el de la escala.

5. Coloque los tres tubos en baño de maría a 37°C durante 15 minutos.

6. Transcurridos los 15 minutos, por cada una de las tres condiciones evaluadas (HCL 0,1N, NaOH
0,1N y Agua destilada) tome dos tubos de ensayo y transfiera 1 mL de la solución.

7. En un tubo, realice el ensayo de yodo, por adición de 2 gotas de Lugol y en el otro adicione 2
mL de reactivo de Benedict y lleve a baño maría a ebullición.

Parte II. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimática

1. Prepare 4 tubos: cuatro de ellos con 2 mL de almidón 2% y los otros cuatro con 2 ml de saliva
diluida.

2. Colocar durante 15 minutos dos tubos, uno conteniendo almidón y la otra saliva, a cada
una de las tres temperaturas siguientes (marque cada pareja de tubos según la temperatura
a la que se ensaya).
 Baño de hielo (0ºC, ponga hielo en un vaso de precipitado y añada un poco de agua, si
dispone de nevera coloque todo el montaje a 4° para garantizar la temperatura durante el
ensayo)
 Temperatura ambiente (20ºC)
 Baño maría a 37ºC B
  Baño maría a ebullición (100ºC).

3. Añadir al tubo que contiene el almidón el contenido del tubo que tiene la saliva, agitar bien
y dejar que siga a su temperatura correspondiente

4. Empiece a contar el tiempo (los tubos deben mantenerse bien inmersos en los respectivos
baños para que la acción de la amilasa tenga lugar a las temperaturas indicadas).
Transcurridos 1, 2, 3,4, 6 y 8 minutos tomar una muestra de 0,5 ml de cada tubo y
transferirlo a un tubo de ensayo y realizar la prueba de yodo.

Practica #1: 96°C

Practica #2: 25°C temperatura ambiente
Practica #3: 0°C temperatura del hielo

5. Analice los cambios de coloración y realice las comparaciones entre las cuatro condiciones
de temperatura evaluadas.
 Conclusión

El componente práctico del curso de bioquímica tiene como objetivo fortalecer y consolidar

las competencias adquiridas por los estudiantes en el área de la bioquímica, a través de la

aplicación de conceptos y prácticas relacionadas con biomoléculas, enzimología y

metabolismo celular. Además, este componente favorece el desarrollo de habilidades

observacionales, analíticas y experimentales en el campo de la bioquímica. El manual de

laboratorio fue diseñado para complementar los conceptos teóricos con los resultados

experimentales y consta de 5 prácticas que abarcan los temas del curso.

 Referencias bibliográficas

(S/N). (2018). Anatomía Aplicada De Amorós Hidrólisis Del Almidón Con Amilasa. ¿Y
Desnaturalizada?

https://anatomiaaplicadaamoros.blogspot.com/2018/06/hidrolisis-del-almidon-con-amilasa-
y.html

Girón, A. (s .f). Generalidades De Las Enzimas https://filadd.com/doc/g1-hoja-de trabajo-de-

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Padilla, D.J. zambrano, J.C. (2022). Medicina Veterinaria Y Zootecnia: Estructura,

Propiedades Y Genética De Las Caseínas De La Leche. Universidad De Navarra.

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Torres, Vargas, G. M. (2013). Bioquímica; proteínas. universidad nacional abierta y a

distancia. Págs. 54-56.

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