Metodologia Analitica Clorhexidina

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
A
IC
M
UI
Q
TESIS II
O
BI
Validación de un método analítico por cromatografía líquida
de alta resolución para la cuantificación de gluconato de Y
I A
clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica en un
AC
laboratorio nacional
RM
FA
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE BACHILLER EN

DE
FARMACIA Y BIOQUÍMICA
CA
TE
AUTORES:
IO
NUÑEZ HERNANDEZ, Jordy Michael

BL
BI
RODRIGUEZ TORRES, George Gustavo Armando
ASESOR:
Dr. CASTILLO SAAVEDRA, Ericson Felix
Trujillo – Perú
2019
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
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DEDICATORIA
A Dios por iluminarnos y

bendecirnos, por guiarnos
siempre por el buen camino y
darnos la fuerza necesaria para
seguir adelante y ser la mejor
A
versión de nosotros mismos.
IC
M
UI
A nuestros padres, por su
Q
confianza y apoyo incondicional,
O
por educarnos y enseñarnos a ser
BI
grandes personas; con
Y
sentimientos humanitarios,
A
emocionalmente felices y con
I
AC
muchas metas por lograr.

RM
FA
A nuestros hermanos por

brindarnos siempre sus ánimos y
DE
motivación.
CA
TE
A nuestros abuelos por cuidarnos

IO
siempre, por enseñarnos e

BL
inculcarnos los buenos valores.

BI
A nuestra familia por guiarnos y

apoyarnos en los buenos y malos
momentos de nuestra vida.
Jordy Michael Nuñez Hernandez
George Gustavo Armando Rodríguez Torres
A
IC
M
UI
AGRADECIMIENTO
Q
O
BI
A los distinguidos miembros de este jurado por sus sugerencias, aportes y
Y
A
exigencias demandadas para el presente informe en busca de mejora continua y
I
AC
superación constante.
RM
FA
A nuestro asesor, el Dr. Ericson Felix Castillo Saavedra, por su amistad, su apoyo,
DE
sus enseñanzas y dedicación brindada al desarrollo de este informe.

CA
TE
IO
BL
BI
PRESENTACIÓN
Señores miembros del jurado:
En cumplimiento con lo dispuesto al reglamento de Grados y Títulos de la
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de La Libertad –
A
Trujillo, presentamos a vuestra consideración y elevado criterio, el informe de Tesis
IC
M
II, intitulado: Validación de un método analítico por cromatografía líquida de alta
UI
resolución para la cuantificación de gluconato de clorhexidina en Hipromelosa
Q
O
BI
0,3% solución oftálmica, en un laboratorio nacional, con lo cual aspiramos a
obtener el grado de Bachiller en Farmacia y Bioquímica. Y

I A
AC
Aprovechamos esta oportunidad para expresar nuestro sincero

RM
agradecimiento y gratitud a los señores miembros del jurado, quienes con su

FA
capacidad y dedicación han contribuido a nuestra formación universitaria.

DE
CA
TE
IO
BL
JORDY M. NUÑEZ H. GEORGE G. A. RODRÍGUEZ T.

BI
JURADO DICTAMINADOR
____________________________________
A
Mg. ROGER RENGIFO PENADILLOS
IC
(PRESIDENTE)
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
___________________________________
RM
Dr. ERICSON CASTILLO SAAVEDRA

FA
(MIEMBRO)
DE
CA
TE
IO
BL
BI
__________________________________
Mg. RUBEN JESUS ARO DÍAZ
(MIEMBRO)
ii
RESUMEN
El presente informe tuvo como objetivo presentar evidencia documentada,
que los resultados producidos son confiables, consistentes y reproducibles en las
condiciones establecidas; teniendo en cuenta que la validación es un requisito
imprescindible para el cumplimiento de las buenas prácticas de Laboratorio. Se
realizó la validación del método analítico por cromatografía líquida de alta
A
IC
resolución para la cuantificación de gluconato de clorhexidina en Hipromelosa
M
UI
0,3% solución oftálmica, para lo cual se evaluaron los parámetros de desempeño
Q
O
como: selectividad, linealidad, precisión, exactitud, robustez y rango. Definidas las
BI
condiciones de trabajo, se realizaron los análisis para la evaluación de los
Y
A
parámetros de validación y se demostró que la metodología analítica es selectiva
I
AC
dado que no se evidenció interferencia de productos degradados o de los excipientes

RM
en el análisis del ingrediente farmacéutico activo, es lineal porque se obtuvo un

FA
coeficiente de correlación r = 0,9996; es preciso ya que presento valores aceptables

DE
de desviación estándar relativa, todos menores al 2%, es exacta con una

CA
TE
recuperación global de 100,02 %, es robusto por obtener un C.V. dentro del 2% de

IO
variación aceptable y que estos parámetros están dentro del rango establecido. Se
BL
concluye que el método analítico por cromatografía liquida de alta resolución

BI
demuestra ser selectivo, lineal, exacto, preciso y robusto para la cuantificación de
gluconato de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.
Palabras clave: validación, gluconato de clorhexidina, cromatografía.
iii
ABSTRACT
The objective of this report was to present documented evidence that the results
produced are reliable, consistent and reproducible under the established conditions;
taking into account that validation is an essential requirement for compliance with
good laboratory practices. The validation of the analytical method by high
performance liquid chromatography was performed for the quantification of
A
IC
chlorhexidine gluconate in Hipromelose 0.3% ophthalmic solution, for which the
M
UI
performance parameters were evaluated as: selectivity, linearity, precision,
Q
O
accuracy, robustness and rank. Once the working conditions were defined, the
BI
analyzes for the evaluation of the validation parameters were carried out and it was
Y
A
demonstrated that the analytical methodology is selective given that there was no
I
AC
evidence of interference of degraded products or excipients in the analysis of the

RM
active pharmaceutical ingredient, it is linear because a correlation coefficient r =

FA
0.9996 was obtained; it is necessary since I present acceptable values of relative

DE
standard deviation, all less than 2%, it is accurate with an overall recovery of
CA
TE
100.02%, it is robust to obtain a C.V. within 2% of acceptable variation and that

IO
these parameters are within the established range. It is concluded that the analytical
BL
method by liquid chromatography of high resolution proves to be selective, linear,

BI
exact, precise and robust for the quantification of chlorhexidine gluconate in
Hipromelose 0.3% ophthalmic solution.
Keywords: Validation, clorhexidine gluconate, chromatography.
iv
ÍNDICE
Jurado Dictaminador………………………………………………...…..i
A
IC
M
Presentación ………………………………………………………….....ii
UI
Q
Resumen …………………………………………………….…….……iii
O
BI
Abstract…………………………………………………………………iv
Y
I A
AC
I. INTRODUCCIÓN………………...……………………………..1
RM
II. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………….9

FA
III. RESULTADOS…………………………………………………35
DE
IV. DISCUSIÓN………………………………………………….…43
CA
V. CONCLUSIONES……………………………………………....48
TE
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFIAS……………………………49

IO
BL
VII. ANEXOS…………………………..............................................54
BI
I. INTRODUCCIÓN
La cromatografía liquida de alta performance (HPLC), es una técnica de separación

constituida por una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida. Las
separaciones se logran por partición, adsorción o procesos de intercambio iónico,
según el tipo de fase estacionaria empleada.9,12
El análisis por HPLC, de productos farmacéuticos son una necesidad y de uso
A
rutinario. Esta técnica evita errores que conllevan a situaciones de riesgo al usuario,
IC
garantizando que la dosis prescrita llegue al paciente en la cantidad apropiada. Esta
M
UI
técnica es bastante rápida y no requiere de preparación extensa de la muetsra.3, 10
Q
O
En la rutina de laboratorio reduce repeticiones analíticas y facilita mayor rapidez
BI
en los análisis que adecuadamente validadas dan confiabilidad a los resultados. Las
Y
farmacopeas vigentes contemplan en la mayoría de los casos análisis por HPLC
I A
AC
para monofármacos o asociaciones de dos o más principios activos por separado lo

cual demanda un mayor tiempo de análisis y un mayor costo.3
RM
FA
Por ello el aseguramiento de la calidad en los distintos productos que desarrolla la

industria farmacéutica es una característica muy importante, es indispensable
DE
realizar una inspección completa al proceso de la producción, aplicando normas

CA
establecidas a fin de garantizar al consumidor que los productos que recibe tengan
TE
un óptimo efecto terapéutico.1

IO
Una parte importante de esta seguridad, radica en que la producción del

BL
medicamento se realice cumpliendo altísimos estándares de calidad, para lo cual se

BI
lleva a cabo una serie de procesos, antes, durante y después del proceso de
fabricación. Ante esto, entidades internacionales como la Organización Mundial de
la Salud (OMS), la Food and Drug Administration (FDA), la Asociación Española
de Farmacéuticos de la Industria (AEFI) y la Internacional Conference on
Harmonisation (ICH); respaldan los procesos de validación como un factor
determinante en la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las
especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos. En nuestro país,
tenemos a la Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas (DIGEMID),

quienes a través de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y las Buenas
Prácticas de Laboratorio aseguran la calidad de los medicamentos.1, 2
La validación de un método analítico consiste en el proceso por el cual, queda

establecido por estudios experimentales y/o de laboratorio, que la capacidad del
método y características de desempeño cumple con los requisitos para la aplicación
analítica deseada.3
A
En todo el proceso de validación es esencial la utilización de documentación, como:
IC
M
el protocolo de validación, realización de la validación, evaluación de los resultados
UI
analíticos y el informe de validación.4,5
Q
O
Cabe mencionar que la validación de un método analítico puede darse de manera
BI
prospectiva, retrospectiva, simultánea y revalidarse. La validación prospectiva se
Y
A
da sobre un proceso antes que sea implementado, para la fabricación de nuevos
I
AC
productos o cuando surgen cambios fundamentales en el proceso, además se puede

RM
elegir y controlar las variables a ensayar en el proceso; sin embargo la validación

retrospectiva analiza ensayos ya elaborados, no debiendo existir cambios en la
FA
formulación, modificaciones sustanciales de equipos o instalaciones, ni cambios en

DE
el método de ensayo.3,5
CA
Por otro lado, la validación simultánea se produce cuando es imposible completar

TE
la validación antes de la puesta del mercado del producto farmacéutico o se haya

IO
producido un número limitado de lotes; en cambio la revalidación se lleva a cabo

BL
en métodos que ya han sido previamente validados y que hayan sufrido alguna
BI
modificación en su procedimiento, tanto en los instrumentos o en los reactivos de

la matriz que contiene la muestra.5,6
La validación se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se

aplican de acuerdo con la categoría de ensayo a la que pertenezcan. Estas categorías
se hacen necesarias debido a la información que se requiere para la validación de
un método analítico, según la clasificación de la United States Pharmacopeia 41°
(USP), estos métodos se dividen en cuatro categorías16:
Categoría I: métodos analíticos para la cuantificación de componentes principales

de sustancias farmacéuticas a granel o ingredientes activos (incluidos conservantes)
en productos farmacéuticos terminados.7, 8
Categoría II: métodos analíticos para la determinación de impurezas en sustancias

farmacéuticas a granel o compuestos de degradación en productos farmacéuticos
terminando, incluyendo ensayos cuantitativos y pruebas límites.7, 8
Categoría III: métodos analíticos para la determinación de las características de
A
rendimiento (por ejemplo, disolución, liberación de fármacos).7, 8
IC
M
Categoría IV: pruebas de identificación.7, 8
UI
Q
En la tabla se indica los elementos o parámetros que normalmente se requiere para
O
BI
una de estas categorías.16
Y
A
Cuadro 1. Elementos de datos requeridos para la validación de ensayo.
I
AC
Parámetros de Categoría Categoría II Categoría Categoría

RM
desempeño analítico I III IV

Análisis Pruebas
FA
cuantitativo de limite
DE
s
CA
Exactitud SI SI * SI** NO
TE
IO
Precisión Repetibilidad SI SI NO SI NO
BL
BI
Precisión SI*** SI*** NO SI*** NO

intermedia
Especificidad SI SI SI SI** SI
Límite de detección NO NO SI * NO
Límite de cuantificación NO SI NO * NO
Linealidad SI SI NO SI** NO
Intervalo SI SI * * NO
Un método analítico desempeña características las cuales se expresan en los

siguientes parámetros:
La selectividad (especificidad) de un método analítico es la capacidad de medir y/o
A
identificar simultanea o separadamente los analitos de interés, de formas
IC
M
inequívocas, en presencias de otras sustancias químicas que pueden estar presentes
UI
en las muestras, por ejemplo: impurezas, productos de degradación y componentes
Q
de la matriz.6
O
BI
La linealidad e intervalo del método, corresponden a la capacidad del método para
Y
A
proporcionar resultados directamente proporcionales a la concentración de la
I
AC
sustancia en examen, dentro de una determinada banda de aplicación. Siempre que

RM
sea posible se buscará una respuesta de tipo lineal que facilitará su trazado,
interpolación e interpretación. Si no se puede lograr la linealidad, se puede utilizar
FA
un modelo no lineal. El objetivo es obtener un modelo que describa con precisión

DE
la relación de concentración en función de la respuesta, ya sea lineal o no lineal. 7,8

CA
La exactitud, describe la proximidad del valor calculado al valor real o nominal del
TE
analito (expresado en porcentaje de error relativo), se calcula como el porcentaje

IO
de recuperación de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de

BL
analito añadido a la muestra, o como la diferencia de la media de la valoración y el

BI
valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza.6,9,11
Los documentos de ICH recomiendan que se evalúe la exactitud utilizando un

mínimo de nueve determinaciones sobre un mínimo de tres niveles concentración,
cubriendo el intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres
determinaciones repetidas de cada concentración).6,12
La precisión de un método analítico describe la cercanía de las medidas

individuales que se hacen en el análisis de un analito, cuyo objetivo es conocer la
variabilidad o el más-menos del método de ensayo. Esta variabilidad es debida a
errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Como consecuencia de la
existencia de estos errores, los análisis efectuados sobre muestras idénticas, en las
mismas circunstancias, no conducen generalmente a resultados idénticos. Los
factores susceptibles de influir sobre los resultados de ensayo no pueden ser
siempre controlados (analistas, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.) de aquí
A
la importancia del estudio de la precisión, la cual se diferencia en tres tipos.6,7
IC
M
La repetibilidad, estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis
UI
Q
sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo
O
analista, con los mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en
BI
un período de tiempo corto, se expresa matemáticamente por el coeficiente de
Y
A
variación (desviación estándar relativa) de una serie de medidas.8
I
AC
La repetibilidad del sistema instrumental, se determina analizando repetidamente

RM
una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces. En el caso que se analice

FA
el principio activo de una materia prima o de una especificación farmacéutica se

DE
prepara la muestra a la concentración nominal.9

CA
La repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una muestra
TE
homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de

IO
la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y mismo

BL
analista. Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: un mínimo de 6

BI
muestras a la concentración nominal.6, 9
En la precisión inmediata, se efectúan una serie de análisis sobre la misma muestra,

pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, entre
otros) y en un mismo laboratorio. El objeto del estudio de precisión inmediata es
determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la
misma muestra, en un mismo laboratorio, pero en condiciones operativas
diferentes.6
En la reproducibilidad se estudia la variedad que se producen en el método, bajo

condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios. La reproducibilidad
de dicho método de análisis se determina analizando una serie de alícuotas
procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes analistas y
utilizando condiciones operativas y ambientales distintas, pero siguiendo el
procedimiento descrito en el método.6,10
El rango se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior de
A
analito para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad
IC
del método descrito en los extremos al igual que dentro del intervalo, por lo que las
M
concentraciones por debajo del intervalo de concentración definido pueden
UI
Q
introducir un error debido a una pobre relación señal-ruido, mientras que las
O
concentraciones que exceden el intervalo de concentración definido pueden
BI
introducir un error debido a dispersiones múltiples.13
Y
I A
La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad de
AC
permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en los

RM
parámetros del método (cambios en una o más de las condiciones de trabajo); se

FA
dice que un método es robusto cuando se puede demostrar su invariabilidad durante

DE
el uso normal. 14
CA
Variaciones habituales son el pH de la fase móvil, la composición de la fase móvil,

diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo6.
TE
IO
También comprende la medida en que los analitos se mantengan estables durante

BL
todo el procedimiento de análisis, incluido su almacenamiento antes y después de

BI
éste. En general, la medición se hace comparando patrones recién preparados con

una concentración conocida con patrones similares almacenados durante diferentes
períodos de tiempo y en diferentes condiciones6.
La validación de métodos analíticos en la industria farmacéutica, se considera un

proceso indispensable en el aseguramiento de la calidad de cada producto que se
crea en un laboratorio farmacéutico9.
Cualquier método analítico que se desarrolle debe validarse, es decir, se debe

confirmar y documentar que los resultados por él producidos son confiables. Por lo
que la responsabilidad de un laboratorio farmacéutico es desarrollar métodos de
análisis de materias primas y productos terminados que aún no cuentan con una
técnica de análisis documentada; con el propósito de cumplir con las exigencias
legales que se detallan en las normas de las buenas prácticas de laboratorio y el
registro de especialidades farmacéuticas16.
A
Siendo el producto Hipromelosa 0,3 % solución oftálmica un medicamento con alta
IC
demanda en el mercado, existe la necesidad de establecer un método analítico
M
validado que cumpla con todas las especificaciones establecidas en la USP, con el
UI
Q
fin de poder garantizar la calidad y eficacia del producto farmacéutico.
O
BI
Por todo lo antes expuesto se plantea la siguiente interrogante.
Y
A
¿Cumple el método analítico por cromatografía líquida de alta resolución para la
I
AC
cuantificación de gluconato de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución

RM
oftálmica con los parámetros de validación de selectividad, linealidad del sistema,

linealidad del método, exactitud, precisión, robustez y rango?
FA
DE
Los objetivos fueron:

CA
Objetivo general:
TE

IO
Validar el método analítico por cromatografía líquida de alta

BL
resolución para cuantificar gluconato de clorhexidina en

BI
Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.
Objetivos específicos:
1. Demostrar que el método analítico empleado para la cuantificación

de gluconato de clorhexidina 0,3% en Hipromelosa solución
oftálmica, cumple con los parámetros de validación: selectividad,
linealidad, exactitud, precisión, robustez y rango del método.
2. Evaluar los parámetros de validación para verificar el cumplimiento

de los criterios establecidos por la United States
Pharmacopeia (USP).
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
II. MATERIAL Y MÉTODO
A. MATERIAL
1. MUESTRA
Hipromelosa 0,3% solución oftálmica
2. REACTIVOS
a. Material de producción (Placebo)
- Hipromelosa
A
- Fosfato de sodio dibásico anhidro
IC
M
- Fosfato de sodio monobásico anhidro
UI
- Cloruro de potasio
Q
O
- Edetato disódico
BI
- Gluconato de clorhexidina al 20%
- Agua purificada c.s.p. Y
I A
AC
b. Reactivos químicos
RM
- Agua purificada
FA
- Metanol HPLC
DE
- Ácido clorhídrico
- Hidróxido de sodio
CA
- Peróxido de hidrógeno
TE
- Gluconato de clorhexidina al 20%

IO
- Ácido acético glacial

BL
- Fosfato monobásico de potasio

BI
- Ácido fosfórico
3. EQUIPOS
a. Equipos de laboratorio
- HPLC HITACHI CHROMASTER
- Balanza analítica OHAUS DISCOVERY
- Balanza analítica ELECTRONIC BALANCE
- Medidor multiparámetro HANNA INSTRUMENTS

- Lámpara UV CAMAG
- Sonicador ULTRASONIC CLEANER VGT
- Equipo de filtración MILLIPORE
- Agitador magnético BIOBASE
- Sistema de purificación de agua SIMPLICITY UV
- Campana extractora BIOBASE
A
IC
4. OTROS
M
- Material de vidrio de uso común
UI
- Piseta
Q
O
- Filtros jeringa de nylon 0,45 µm x 25 mm
BI
- Membrana filtrante de nylon de 0,45 µm
- Jeringas descartables Y
I A
- Magnetos
AC
- Columna cromatográfica L1 de 150mm x 4,6 mm (5µm)

RM
- Viales para HPLC

FA
- Septos y tapas para viales HPLC

DE
- Frascos de vidrio de 1000 mL para fase móvil

- Bombilla
CA
- Espátulas
TE
- Papel Glassine
IO
BL
B. MÉTODO
BI
A. Cuantificación de Gluconato de clorhexidina20,21
A.1 Preparación de la solución amortiguadora de fosfato pH 3,5
Se pesó con exactitud aproximadamente 13,6 g de fosfato monobásico
de potasio, se disolvió en 1000 mL de agua y se ajustó a pH 3,5 con
ácido fosfórico.
10
A.2 Preparación de la fase móvil
Se preparó una mezcla de metanol HPLC y solución amortiguadora
de fosfato pH 3,5 (55:45); filtrada y desgasificada.
A.3 Preparación estándar
Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg de estándar de
A
gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100 mL, se agregó
IC
M
10 mL de diluyente y se llevó a ultrasonido por 1 minuto
UI
aproximadamente, cuando estuvo completamente disuelto, se llevó a
Q
O
BI
volumen con diluyente y se homogeneizó. Se midió 5 mL y se
Y
transfirió a una fiola de 20 mL, se llevó a volumen con diluyente y se
I A
AC
homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm.

RM
Concentración teórica: 0,0125 mg/mL de gluconato de clorhexidina

FA
A.4 Preparación de la muestra

DE
CA
Se midió con exactitud 5 mL de la muestra y se transfirió a una fiola

TE
de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial y se llevó a

IO
ultrasonido por 5 minutos, luego se llevó a volumen con diluyente y

BL
se homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm.

BI
Concentración teórica: 0,0125 mg/mL de gluconato de clorhexidina
A.5 Condiciones cromatográficas
a. Columna: L1 (octadecilsilano – C18) 150 mm x 4,6 mm (5 µm)
b. Detector: Detector de Arreglo de Diodos (DAD)
c. Longitud de onda: 260 nm
11
d. Velocidad de flujo: 1,2 mL/min
e. Temperatura de la columna: 35 °C
f. Volumen de inyección: 50 µL
A.6 Cálculos
𝐴𝑚 𝑊𝑠𝑡 5 20
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑙𝑜𝑟ℎ𝑒𝑥𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑔/𝑚𝐿= 𝑥 𝑥
𝐴𝑠𝑡 100 20
𝑥 𝑃𝑜𝑡 𝑥
𝑉𝑚
A
IC
M
Donde:
UI
𝑊𝑠𝑡 = Peso del estándar en mg.
Q
O
𝑉𝑚 = Volumen de muestra analizada en mL.
BI
𝐴𝑚 = Área de la solución muestra. Y
I A
AC
𝐴𝑠𝑡 = Área de la solución estándar.

RM
Pot. = Potencia del estándar mg/mg

FA
A.7 Aptitud del sistema

DE
a. Desviación Estándar Relativa (DSR): No más de 2,0 %

CA
b. Factor de asimetría: No más de 1,5

TE
IO
B. Desarrollo de los parámetros de desempeño y criterios de

BL
BI
aceptación
6.B.A.1. Selectividad16,17,21
 Determinación de las interferencias
A. Determinación de las interferencias del diluyente: Se filtró por
jeringa de nylon de 0,45 µm y se llenó dos viales e inyectaron por
triplicado cada uno en el cromatógrafo.
12
B. Determinación de las interferencias de los excipientes del placebo:
Se midió con exactitud 5 mL de placebo, se transfirió a una fiola de 20
mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial y se llevó a ultrasonido por
5 minutos, luego se llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó.
Se filtró por filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon dos
muestras e inyectaron por triplicado en el cromatógrafo.
A
C. Determinación del preservante: Se pesó con exactitud
IC
M
aproximadamente 25,0 mg de estándar de gluconato de clorhexidina al
UI
Q
20% en una fiola de 100 mL, se agregó 10 mL de diluyente y se llevó a
O
BI
ultrasonido durante 1 minuto aproximadamente, cuando se disolvió
Y
completamente se llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se
I A
AC
midió 5 mL y se transfirió a una fiola de 20 mL, se llevó a volumen con

RM
diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon de

FA
0,45 µm. Se prepararon dos muestras e inyectaron cinco veces cada una
DE
en el cromatógrafo.
CA
Concentración teórica: 0,0125 mg/mL de gluconato de clorhexidina.

TE
D. Determinación del placebo más el estándar al 100%: Se pesó con

IO
BL
exactitud aproximadamente 25,0 mg de estándar de gluconato de

BI
clorhexidina al 20% en una fiola de 100 mL, se agregó 10 mL de
diluyente y se llevó a ultrasonido por un minuto aproximadamente,
cuando disolvió completamente se llevó a volumen con diluyente y se
homogeneizó. Se midió 5 mL, se transfirió a una fiola de 20 mL, se
agregó 5 mL de placebo, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se
llevó a ultrasonido por 5 minutos, se llevó a volumen con diluyente y se

13
homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm. Se
prepararon dos muestras e inyectaron por triplicado en el cromatógrafo.
Criterio de aceptación:
*El resultado del análisis del placebo no debe presentar una respuesta
cuantificable en los mismos tiempos de retención de la respuesta de los
A
picos principales en el cromatograma obtenido con la solución estándar.
IC
M
De ser el caso de presentar una respuesta, esta debe ser menor al 1% de
UI
Q
la respuesta de los picos principales en el cromatograma obtenido con
O
BI
la solución estándar. El resultado del análisis de la solución placebo más
Y
el estándar 100% (Recupero) debe estar comprendido entre 98% y
I A
AC
102%. Esto nos indica que los excipientes e ingrediente farmacéutico

RM
activo presentes en el placebo, no interfieren con el análisis del

FA
preservante.
DE
 Determinación de las interferencias de los productos degradados,

CA
sometiendo al preservante, la muestra y el placebo a condiciones

TE
químicas y físicas extremas.

IO
BL
A. Degradación del estándar secundario

BI
- Hidrólisis ácida: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg
de estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100
mL, se agregó 10 mL de diluyente y 1 mL de ácido clorhídrico 1N,
se sonicó hasta disolver, se llevó a volumen con diluyente y se
llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro

14
de jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon dos muestras e
inyectaron por triplicado en el cromatógrafo.
- Hidrólisis alcalina: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0
mg de estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100
mL, se agregó 10 mL de diluyente y 1 mL de hidróxido de sodio 1N,
A
IC
M
UI
Q
O
BI
inyectaron por triplicado en el cromatógrafo. Y

I A
AC
Concentración Teórica: 0,0125 mg/mL de gluconato de clorhexidina.

RM
- Oxidación: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg de

FA
estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100 mL,

DE
se agregó 10 mL de diluyente y 1 mL de peróxido de hidrógeno 10%,

CA

TE

IO
BL

BI
- Termólisis
Calor seco: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg de
estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100 mL;

15
se sometió el estándar dentro de la fiola de 100 mL a 80 °C ± 5°C
por 5 horas en la estufa de secado, se agregó 10 mL de diluyente y se
sonicó hasta disolver, se llevó a volumen con diluyente y se
A
IC
M
UI
Q
Calor húmedo: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg
O
BI
de estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100
Y
mL; se llevó a baño maría a 80 °C ± 5°C por 5 horas, se agregó 10
I A
AC
mL de diluyente y se sonicó hasta disolver, se llevó a volumen con

RM
diluyente y se homogeneizó. Se midió 5 mL, se transfirió a una fiola

FA
de 20 mL, se llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se

DE
filtró por filtro de jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon dos

CA

TE

IO
BL
- Fotólisis: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0 mg de

BI
estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de 100 mL,
se agregó 10 mL de diluyente, se sonicó hasta disolver, se llevó a
volumen con diluyente y se homogeneizo. Se midió 5 mL, se
transfirió a una fiola de 20 mL, se llevó a volumen con diluyente y
se homogeneizó. Se expuso la solución a la luz ultravioleta con
longitud de onda de 254 nm durante 5 horas. Se filtró por filtro de

16
jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon dos muestras e
B. Degradación del placebo
- Hidrólisis ácida: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se
transfirió a una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético
A
glacial, se agregó 1 mL de ácido clorhídrico 1N, se llevó a volumen
IC
M
con diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de
UI
Q
nylon de 0,45 µm. Se prepararon dos muestras e inyectaron por
O
BI
triplicado en el cromatógrafo.
Y
- Hidrólisis alcalina: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se
I A
AC

RM
glacial, se agregó 1 mL de hidróxido de sodio 1N, se llevó a volumen

FA

DE

CA
TE
- Oxidación: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se transfirió

IO
BL
a una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se

BI
agregó 1 mL de peróxido de hidrógeno 10%, se llevó a volumen con
diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon
de 0,45 µm. Se prepararon dos muestras e inyectaron por triplicado
17
- Termólisis
Calor seco: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se transfirió
a una fiola de 20 mL; se sometió la muestra a 80 °C ± 5°C por 5 horas
en la estufa de secado, se llevó a volumen con diluyente y se
prepararon dos muestras e inyectaron por triplicado en el
A
cromatógrafo.
IC
M
Calor húmedo: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se
UI
Q
transfirió a una fiola de 20 mL; se sometió la muestra a 80 °C ± 5°C
O
BI
por 5 horas en el baño maría, se llevó a volumen con diluyente y se
Y
I A
AC

RM
cromatógrafo.
FA
- Fotólisis: Se midió con exactitud 5mL de placebo y se transfirió a

DE
una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se llevó

CA
a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se expuso la solución a

TE
la luz ultravioleta con longitud de onda de 254 nm durante 5 horas.

IO
BL

BI
C. Degradación del producto
- Hidrólisis ácida: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se
glacial, se agregó 1 mL de ácido clorhídrico 1N, se llevó a volumen

18
- Hidrólisis alcalina: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se
glacial, se agregó 1 mL de hidróxido de sodio 1N, se llevó a volumen
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
- Oxidación: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se transfirió
I A
AC
a una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se

RM
agregó 1 mL de peróxido de hidrógeno 10%, se llevó a volumen con

FA
diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro de jeringa de nylon

DE
de 0,45 µm. Se prepararon dos muestras e inyectaron por triplicado

CA
TE

IO
BL
- Termólisis
BI
Calor seco: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se transfirió
a una fiola de 20 mL; se sometió la muestra a 80 °C ± 5°C por 5 horas
en la estufa de secado, se llevó a volumen con diluyente y se
cromatógrafo.
19
Calor húmedo: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se
transfirió a una fiola de 20 mL; se sometió la muestra a 80 °C ± 5°C
por 5 horas en el baño maría, se llevó a volumen con diluyente y se
A
cromatógrafo.
IC
M
UI
Q
- Fotólisis: Se midió con exactitud 5mL de muestra y se transfirió a
O
BI
una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se llevó
Y
a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se expuso la solución a
I A
AC
la luz ultravioleta con longitud de onda de 254 nm durante 5 horas.

RM

FA

DE

CA
TE
*La resolución entre los picos formados por los ensayos de

IO
BL
degradación ácida, alcalina, oxidación, termólisis y fotólisis y el

BI
pico de gluconato de clorhexidina deberá ser mayor o igual a 1. Los
picos formados deberán ser identificados y descartados con los picos
provenientes del placebo preparado en las mismas condiciones que
las muestras.
20
6.B.A.2. Linealidad 17,18,19
A. Linealidad del sistema
- Solución al 70%: Se pesó con exactitud aproximadamente 17,5
mg de estándar de gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de
100 mL, se agregó 10 mL de diluyente y se llevó a ultrasonido
durante 1 minuto aproximadamente, cuando se disolvió
A
completamente, se llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó.
IC
M
Se midió 5 mL y se transfirió a una fiola de 20 mL, se llevó a
UI
Q
volumen con diluyente y se homogeneizó. Se filtró por filtro de
O
BI
jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon tres muestras e

I A
AC
Concentración Teórica: 0,00875 mg/mL de gluconato de

RM
clorhexidina.
FA

DE

CA

TE

IO
BL

BI
Concentración teórica: 0,01000 mg/mL de gluconato de
clorhexidina.
21
A
IC
M
UI
Q
O
BI
clorhexidina. Y
I A
AC

RM

FA

DE

CA

TE

IO
BL

BI
clorhexidina.

22
100 mL, se agregó 10 mL de diluyente y llevó a ultrasonido durante
1 minuto aproximadamente, cuando se disolvió completamente, se
llevó a volumen con diluyente y se homogeneizó. Se midió 5 mL y
se transfirió a una fiola de 20 mL, se llevó a volumen con diluyente
y se homogeneizó. Se prepararon tres muestras e inyectaron por
A
IC
M
clorhexidina.
UI
Q
Criterio de aceptación
O
BI
*Coeficiente de correlación: r≥0,999
*Coeficiente de determinación: r 2 >0,990 Y

I A
AC
*Homocedasticidad: La distribución de los puntos deberá ser

RM
aleatoria y no reflejar ninguna tendencia.

FA
*Normalidad de los residuales: F1exp >𝐹1𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 ,𝐹2𝑒𝑥𝑝 <𝐹2𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

DE
*Test de Cochran: 𝐺𝑒𝑥𝑝 <𝐺𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

CA
*Test de verificación de la pendiente o de la linealidad (prueba

TE
IO
de t – student, coeficiente de variación, intervalo de confianza):

BL
DSR≤2%, 𝑡𝑒𝑥𝑝 >𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , el intervalo de confianza no incluirá el cero.

BI
*Test de Verificación de la variable independiente o de la
proporcionalidad (prueba de t – student, intervalo de
confianza): 𝑡𝑒𝑥𝑝 <𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , el intervalo de confianza incluirá el cero.
*Coeficiente de variación de los factores de respuesta: DSR≤2%.
23
B. Linealidad del método
A
Se midió 5 mL y se transfirió a una fiola de 20 mL, se agregó 5 mL
IC
M
de placebo, se agregó 5 mL de ácido acético glacial, se llevó a
UI
Q
O
BI

I A
AC

RM
clorhexidina.
FA

DE

CA

TE

IO
BL

BI
24
clorhexidina.
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC

RM

FA
clorhexidina.
DE

CA

TE

IO
BL

BI

25
clorhexidina.
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC

RM

FA
clorhexidina.
DE
CA
*Coeficiente de correlación: r≥0,999

TE
*Coeficiente de determinación: r 2 >0,990

IO
BL
*Homocedasticidad: La distribución de los puntos deberá ser

BI
aleatoria y no reflejar ninguna tendencia.
*Normalidad de los residuales: F1exp >𝐹1𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 ,𝐹2𝑒𝑥𝑝 <𝐹2𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
*Test de Cochran: 𝐺𝑒𝑥𝑝 <𝐺𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎
26
*Test de verificación de la pendiente o de la linealidad (prueba
de t – student, coeficiente de variación, intervalo de confianza):
DSR≤2%, 𝑡𝑒𝑥𝑝 >𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , el
intervalo de confianza no incluirá el cero.
*Test de Verificación de la variable independiente o de la
proporcionalidad (prueba de t – student, intervalo de
A
confianza): 𝑡𝑒𝑥𝑝 <𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , el intervalo de
IC
M
confianza incluirá el cero.
UI
Q
*Coeficiente de variación de los factores de respuesta: DSR≤2%.
O
BI
Y
A
6.B.A.3. Exactitud17,19
I
AC
- Solución estándar: Se pesó con exactitud aproximadamente 25,0

RM

FA

DE

CA

TE
IO

BL

BI
clorhexidina.
27
A
IC
M
UI
Q
O
BI
clorhexidina. Y
I A
AC

RM

FA

DE

CA

TE

IO
BL

BI
clorhexidina.

28
A
IC
M
UI
Q
O
BI
clorhexidina. Y
I A
AC
RM
*Los límites del porcentaje recuperado serán de 98% a 102% y su

FA
coeficiente de variación no deberá exceder a 2,0%.

DE
∗ 𝐺𝑒𝑥𝑝 <𝐺𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , para una probabilidad del 95% (p=0,05) y K = 5, n =

CA
3, se aceptará la hipótesis nula (H0 ), entonces las varianzas no serán

TE
IO
estadísticamente diferentes entre sí.

BL
* 𝑡𝑒𝑥𝑝 <𝑡𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 , no existirá diferencia significativa entre la

BI
recuperación media y 100, confirmaría la buena exactitud del
método
*Coeficiente de Variación (CV): No más de 2,0%.
29
6.B.A.4. Precisión17,18
A. Precisión del sistema (Repetibilidad del sistema)
mg de estándar gluconato de clorhexidina al 20% en una fiola de
100 mL, se agregó 10 mL y se llevó a ultrasonido por 1 minuto
aproximadamente, cuando se disolvió completamente, se llevó a
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Se prepararon dos muestras e inyectaron cinco veces cada una en
el cromatógrafo. Y
I A
AC

RM
clorhexidina.
FA
DE
*Asimetría: No más de 2,0.

CA
*C.V.: No más de 2,0%, solución estándar

TE
B. Precisión del método (Repetibilidad del método)

IO
BL
Analista 1, Día 1. Equipo HPLC CHROMASTER HITACHI.

BI

30
el cromatógrafo.
Concentración Teórica: 0,0125 mg/mL de gluconato de
clorhexidina.
- Solución muestra: Se midió con exactitud 5 mL de muestra y se
A
IC
M
glacial y se llevó a ultrasonido por 5 minutos, luego se llevó a
UI
Q
O
BI
jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon seis muestras e
inyectaron por triplicado en cromatógrafo. Y

I A
AC

RM
clorhexidina.
FA
DE
*C.V.: No más de 2,0% entre réplicas de lecturas consecutivas de

CA
la solución muestra.
TE
C. Precisión intermedia
IO
BL
Analista 2, Día 2. Equipo HPLC CHROMASTER HITACHI

BI

31
el cromatógrafo.
clorhexidina.
- Solución muestra: Se midió con exactitud 5 mL de muestra y se
A
IC
M
glacial y se llevó a ultrasonido por 5 minutos, luego se llevó a
UI
Q
O
BI
jeringa de nylon de 0,45 µm. Se prepararon seis muestras e
inyectaron por triplicado Y en el cromatógrafo.

I A
AC

RM
clorhexidina.
FA
DE
*C.V.: No más de 2,0% entre réplicas de lecturas consecutivas de

CA
la solución muestra, preparadas por el analista B.

TE
*C.V.: No más de 2,0% entre los resultados obtenidos entre la

IO
BL
precisión del método y la precisión intermedia.

BI
6.B.A.5. Robustez 17,19
A. Variación en el tiempo de vigencia de la solución muestra
(experimento1)
- Ensayo 1: Para el estudio, se utilizaron los resultados obtenidos
del análisis de la precisión del método.

32
- Ensayo 2: Muestras almacenadas durante 48 horas a temperatura
ambiente posterior a su preparación, las cuales se analizaron según
la metodología analítica de cuantificación de gluconato de
clorhexidina. Se prepararon dos estándares con cinco inyecciones y
tres muestras con tres inyecciones cada una, las cuales se inyectaron
el cromatógrafo.
A
Criterio de aceptación: El C.V. entre las 2 muestras deberá estar
IC
M
dentro del 2%.
UI
Q
B. Variación de flujo (experimento 2)
O
BI
- Ensayo 1: Para el estudio, se utilizaron los resultados obtenidos
del análisis de la precisión del método. Y

I A
AC
- Ensayo 2: Muestras analizadas según la metodología analítica de

RM
cuantificación de gluconato de clorhexidina, pero con variación de

FA
las proporciones de fase móvil a 48% de solución amortiguadora y

DE
52% de metanol HPLC.

CA
Criterio de aceptación: El C.V. entre las 2 muestras deberá estar

TE
dentro del 2%.

IO
BL
BI
6.B.A.6. Rango 17
Es el intervalo entre la concentración superior e inferior del analito
para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y
linealidad del método.
Criterio de aceptación: El método deberá ser preciso, exacto y
lineal incluyendo el nivel superior e inferior de la concentración.

33
C. ANÁLISIS DE DATOS 17
Toda la información recopilada durante el proceso de validación se sometió
a análisis estadístico (coeficiente de correlación, coeficiente de determinación,
homocedasticidad, normalidad de los residuales, test de Cochran, prueba t –
student, coeficiente de variación) para evaluar los parámetros de desempeño y
compararlos con las especificaciones establecidas por organismos
A
internacionales.
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
34
III. RESULTADOS
Tabla 1. Parámetros de selectividad – identificación por tiempos de retención

de gluconato de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.
Tiempo de retención de Gluconato de

Cromatogramas
clorhexidina
Diluyente No detectado
Placebo No detectado
A
Estándar de Gluconato de 5,28 min.
IC
clorhexidina
M
Placebo cargado con estándar 5,17 min.
UI
Q
O
BI
Tabla 2. Parámetros de selectividad - especificaciones y resultados de
Y
I A
AC
PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN RESULTADO CONFORMIDAD

RM
Gluconato de
FA
clorhexidina
DE
Desviación estándar
0,14% Cumple
relativa (DSR) DSR ≤ 2%
CA
0,24% Cumple
Check estándar Chst ≤ 2%
TE
0,00% Cumple
Respuesta del diluyente Respuesta ≤ 1%
IO
0,00% Cumple
BL
Respuesta del placebo Respuesta ≤ 1%

BI
100,9% Cumple
Placebo más el estándar al 98,0% ≤ recuperación ≤
100% 102,0%)
35
Tabla 3. Parámetros de selectividad – resultados de las degradaciones de

PARÁMETRO RESULTADO
Gluconato de clorhexidina Estándar Placebo Producto terminado
Desviación estándar relativa 0,38% 0,38% 0,38%
Check estándar 0,85% 0,85% 0,85%
A
Hidrólisis ácida (interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
IC
Hidrólisis básica (interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
M
UI
Hidrólisis oxidativa (interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
Q
O
Calor seco (interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
BI
Calor húmedo (interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
Y
A
Fotólisis(interferencia) 0,00% 0,00% 0,00%
I
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
36
Tabla 4. Parámetros de linealidad del sistema - especificaciones y resultados

Coeficiente de correlación (r) r > 0,999 0,9991 Cumple
Coeficiente de determinación r2 > 0,990 0,9981 Cumple

(r2)
Normalidad de los residuales F1tabla=2,5 (α=0,05, nn= 4, 6947,25 Cumple
A
- F1exp nd=70) (F1exp > F1tabla)
IC
M
Normalidad de los residuales F2tabla = 2,5 (α=0,05,nn=4, -2,12 Cumple
UI
- F2exp nd=70) (F2exp < F2tabla)
Q
O
Homocedasticidad Distribución de los puntos Aleatoria Cumple
BI
aleatoria
Test de Cochran – Gexp Y

Gtabla = 0,6838 (α=0,05, 0,6012 Cumple
A
k=5, n=3) (Gexp < Gtabla)
I
AC
Test de verificación de la DSR ≤ 2% 1,20% Cumple

RM
pendiente
FA
Test de verificación de la ttabla = 2,16 (α=0,05,n- 83,85 Cumple

DE
pendiente - texp 2=13gl) (texp > ttabla)
Test de verificación de la Intervalo no incluye al No incluye Cumple

CA
pendiente - cero al cero

TE
intervalo de confianza
IO
Desviación estándar relativa DSR ≤ 2% 1,25% Cumple

BL
de los factores de respuesta

BI
Test de verificación de la ttabla = 2,16 (α=0,05, n- 0,07 Cumple

variable independiente – texp 2=13gl) (texp < ttabla)
Test de verificación de la Intervalo incluye al cero Si incluye Cumple

variable independiente - al cero
37
Tabla 5. Parámetros de linealidad del método – especificaciones y resultados

Coeficiente de correlación (r) r > 0,999 0,9996 Cumple
Coeficiente de determinación r2 > 0,990 0,9992 Cumple

(r2)
Normalidad de los residuales F1tabla=2,5 (α=0,05, nn= 4, 16841,96 Cumple
A
- F1exp nd=70) (F1exp > F1tabla)
IC
M
Normalidad de los residuales F2tabla = 2,5 (α=0,05,nn=4, -2,22 Cumple
UI
- F2exp nd=70) (F2exp < F2tabla)
Q
O
Homocedasticidad Distribución de los puntos Aleatoria Cumple
BI
aleatoria
Test de Cochran – Gexp Y

Gtabla = 0,6838 (α=0,05, 0,5331 Cumple
A
k=5, n=3) (Gexp < Gtabla)
I
AC
Test de verificación de la DSR ≤ 2% 0,77% Cumple

RM
pendiente
FA
Test de verificación de la ttabla = 2,16 (α=0,05,n- 129,78 Cumple

DE
pendiente - texp 2=13gl) (texp > ttabla)
Test de verificación de la Intervalo no incluye al No incluye Cumple

CA
pendiente - cero al cero

TE
IO

BL
de los factores de respuesta

BI
Test de verificación de la ttabla = 2,16 (α=0,05, n- 0,75 Cumple

variable independiente – texp 2=13gl) (texp < ttabla)
Test de verificación de la Intervalo incluye al cero Si incluye Cumple

variable independiente - al cero
38
Tabla 6. Parámetros de exactitud - especificaciones y resultados de gluconato

de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.
Desviación estándar DSR ≤ 2% 0,23% Cumple

relativa del St1
Check estándar Chst ≤ 2% 0,03% Cumple
Porcentaje de recuperación 98,0% ≤ recuperación ≤ 100,02% Cumple
A
102,0%
IC
M
UI
relativa
Q
ttabla = 2,306 (α=0,05, n-1=8gl)
O
texp 0,093 Cumple
BI
(texp < ttabla)
Gexp Y
Gtabla = 0,8709 (α=0,05, 0,7369 Cumple
A
k=3, n=3)
I
AC
(Gexp < Gtabla)

RM
FA
DE
Tabla 7. Parámetros de la precisión del sistema - especificaciones y resultados

CA

TE

IO

BL
del St1
BI
Tiempo de retención DSR ≤ 2% 0,94% Cumple
Asimetría Asimetría ≤ 2 1,15 Cumple
39
Tabla 8. Parámetros de la precisión del método - especificaciones y resultados


relativa del St1
Promedio de las 06 DSR ≤ 2% 0,80% Cumple
A
muestras
IC
M
Promedio de las 06 - 84,57%. -
UI
muestras
Q
O
Límites de confianza C.V. 84,57% ± Cumple
BI
individual 1,73%
Límites de confianza - Y 84,57% ± -

A
promedio 0,71%
I
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
40
Tabla 9. Parámetros de la precisión intermedia - especificaciones y resultados de


St1
Promedio de las 06 muestras DSR ≤ 2% 0,57% Cumple
A
IC
Promedio de las 06 muestras - 85,26% -
M
UI
Límites de confianza - 85,26% ± 1,26% -
individual
Q
O
Límites de confianza - 85,26% ± 0,51% -
BI
promedio
Y
A
Promedio de las 12 muestras - 84,91%. -
I
AC

RM
de las 12 muestras
FA
DE
Tabla10. Parámetros del ensayo de robustez 1 - especificaciones y resultados

CA
de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.

TE

IO
BL

BI
(DSR)
Promedio de las muestras DSR ≤ 2% 0,33% Cumple
Promedio de las muestras - 84,96% -
41
Tabla 11. Parámetros del ensayo de robustez 2 - especificaciones y resultados

PARAMETRO ESPECIFICACIÓN RESULTADO CONFORMIDAD

(DSR)
Promedio de las muestras DSR ≤ 2% 0,30% Cumple
A
IC
Promedio de las muestras - 84,21% -
M
UI
Q
O
BI
Y
Tabla 12. Parámetro del rango – porcentaje de gluconato de clorhexidina en
I A
Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.
AC
RM
Analito Porcentaje mg/mL

FA
Gluconato de clorhexidina 70% a 130% 0,00875 mg/mL a 0,01625

mg/mL
DE
CA
TE
IO
BL
BI
42
IV. DISCUSIÓN
En la tabla 1 se evalúa el parámetro de selectividad por cromatografía líquida de
alta resolución, donde se compararon los tiempos de retención de los
cromatogramas del diluyente, placebo, estándar y placebo cargado con estándar;
observándose que en los cromatogramas del diluyente y el placebo no eluyen algún
pico cromatográfico, a diferencia del estándar y placebo cargado con estándar; por
A
IC
lo cual se infiere que los placebos a condiciones normales no producen algún tipo
M
de interferencia o alguna señal que pudieran interferir en la determinación o
UI
Q
cuantificación de gluconato de clohexidina.22,25
O
BI
Y
La selectividad vincula factores como el origen de la muestra, la optimización de
I A
la preparación, la especificidad de la medida y las condiciones instrumentales,
AC
siendo así el parámetro que más debe revisarse.17

RM
FA
De la misma forma en la tabla 2, se observa que en el resultado del análisis de la

DE
solución placebo más el estándar, se obtuvo 100,9% para el gluconato de

CA
clorhexidina, siendo así que los componentes presentes en el diluyente (fase móvil)
TE
y el placebo, no interfirieron en la respuesta obtenida por el método analítico ya

IO
BL
que no se absorbieron significativamente a la longitud de onda empleada, y las

BI
absorbancias fueron valores muy cercanos a cero, es decir no hubo materiales que
eluyan al mismo tiempo que el analito comprobándose que los excipientes o
productos de degradación no interfieren en el corrido cromatografico.22
En la tabla 3, se evalúa el parámetro de selectividad de degradación ácida, alcalina,
oxidativa, con calor seco, con calor húmedo y fotólisis, se comprobó que el
43
estándar, placebo y producto terminado no presentan degradaciones para el
gluconato de clorhexidina. En los métodos cromatográficos, el porcentaje de
interferencia tuvo un valor del 0,00% para todas las muestras, permitiendo así,
determinar la selectividad del método respecto al diluyente y matriz de la forma
farmacéutica; no obstante, para las muestras sometidas a estrés, el porcentaje de
interferencia se convierte en un indicador de degradación que pueden llegar a sufrir
A
las moléculas de interés, por lo que la selectividad del método se demuestra
IC
M
mediante el estudio de los cromatogramas obtenidos en cada una de las pruebas
UI
Q
realizadas. 22,25
O
BI
Se determina la selectividad del método analítico antes de iniciar el análisis de los
Y
A
demás parámetros de validación, debido a que ayuda a identificar de manera
I
AC
inequívoca la presencia de otras sustancias químicas que pueden estar presentes en

RM
la muestra, ya que pueden llegar a distorsionar la respuesta del analito.22

FA
DE
La linealidad se estudió desde dos puntos de vista, linealidad del sistema que evalúa
CA
al equipo a utilizar y el analista; y la linealidad del método que evalúa el desarrollo

TE
del método tal cual. Se realizó el análisis usando el estándar secundario de

IO
gluconato de clorhexidina al 20% en las concentraciones de 70%, 80%, 100%,

BL
BI
120% y 130% en base a la concentración teórica del analito en la muestra.23
En las tablas 4 y 5, se comprueba que la linealidad frente a las diferentes
concentraciones preparadas, los coeficientes de correlación y determinación están
dentro de las especificaciones; por tanto el método analítico empleado demuestra
la dependencia lineal de las variables y la fiabilidad del modelo empleado para
44
éstas. La homocedasticidad es conforme, ya que la distribución de los puntos es
aleatoria y no refleja ninguna tendencia, indicando así que la varianza de los errores
es constante a lo largo de los análisis. Además de que en el análisis de la varianza
se acepta la hipótesis nula (H0) demostrando que las varianzas no son
estadísticamente diferentes entre sí. En la normalidad de los residuales los valores
F, demuestran la linealidad entre los resultados obtenidos y la existencia de una
A
pendiente distinta de 0. En el test de Cochran al obtener un valor Gexp < Gtabla
IC
M
significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el
UI
Q
factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.23,25
O
BI
Y
I A
AC
El parámetro de linealidad permitió demostrar que los resultados obtenidos son

RM
directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de

FA
un rango establecido23.
DE
En la tabla 6, se observó que el parámetro de la exactitud para el gluconato de

CA
clorhexidina, muestra un porcentaje de recuperación de 100,0%, el cual está dentro

TE
IO
del criterio de aceptación de 98% - 102%, por lo que hay concordancia entre el
BL
valor experimental y el valor de referencia. El coeficiente de variación obtenido en

BI
la evaluación es menor al 2%, establecido como límite de aceptación. Se cumple
con el test de student, ya que el valor obtenido como texp < ttabla lo cual significa que
no hay diferencia entre las dos medias. Este valor es indicativo del error
sistemático. A menor valor entonces menor error para las mediciones repetidas que
se realizan exactamente de la misma forma.Además, en el test de Cochran se
45
obtiene un valor Gexp < Gtablas por lo que las varianzas de las concentraciones son
homogéneas, es decir, que el factor concentración no influye en la variabilidad de
los resultados.23,25
Por tanto, el parámetro de exactitud expresó la proximidad entre el valor aceptado
convencionalmente como verdadero y el valor experimental obtenido22.
A
IC
M
En las tablas 7, 8 y 9, se obtuvo que los ensayos de precisión del sistema, precisión
UI
del método y precisión intermedia dieron valores aceptables de desviación estándar
Q
O
BI
relativa, todos menores al 2%, demostrando ser precisos aun cuando existan
Y
pequeñas variaciones, las cuales se dan comúnmente dentro de un laboratorio.23
I A
AC
El parámetro precisión proporcionó resultados próximos entre sí frente a una serie

RM
de análisis efectuados sobre la misma muestra en las mismas condiciones

FA
operativas y frente a variaciones de analista y día en un mismo laboratorio, de no

DE
ser posible de equipo debido al programa de validaciones23.

CA
TE
En la tabla 10, se presentan los resultados obtenidos para la robustez 1, en la cual

IO
se realizó una comparación entre los resultados obtenidos almacenando las

BL
muestras preparadas a temperatura ambiente por 48 horas con los resultados

BI
obtenidos en la precisión del método. Se obtuvo una valoración de 84,96% para
gluconato de clorhexidina, el cual es conforme con respecto al valor de la precisión
del método (84,57%). El coeficiente de variación entre los dos resultados es 0,33%,
el cual está dentro del criterio de aceptación.23
46
En la tabla 11, se presenta los resultados obtenidos para la robustez 2, en la cual se
realizó una comparación de los resultados variando el porcentaje de fase móvil
(metanol HPLC : solución amortiguadora) de (55:45) a (58:42) con los resultados
obtenidos en la precisión del método. Se obtuvo una valoración de 84,21% para
gluconato de clorhexidina, el cual es conforme con respecto al valor de la precisión
del método (84,57%). El coeficiente de variación entre los dos resultados es 0,30%,
A
el cuales está dentro del criterio de aceptación.23
IC
M
UI
El parámetro robustez permitió medir la capacidad del método analítico para
Q
O
permanecer inalterado frente a pequeñas variaciones en ciertos parámetros
BI
permitiendo su fiabilidad durante su empleo en rutina.23
Y
I A
AC
En la tabla 12, se determina el rango, el cual permitió definir el intervalo entre la

RM
concentración superior e inferior del analito para el cual se ha demostrado la

FA
correcta precisión, linealidad, exactitud y robustez del método analítico. Siendo así,
DE
el rango de trabajo de 70% a 130%, es decir a concentraciones de 0,00875 mg/mL

CA
a 0,01625 mg/mL para el gluconato de clorhexidina, el cual se evaluó tomando

TE
como punto de partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo

IO
con la experiencia, el conocimiento analítico del método empleado y en función de

BL
BI
las especificaciones.23
47
V. CONCLUSIÓN
De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que:
1. El método analítico por cromatografía líquida de alta resolución demuestra
ser selectivo, lineal, exacto, preciso y robusto para la cuantificación de
A
IC
2. Los valores obtenidos de los parámetros de validación: selectividad,
M
UI
Linealidad, Exactitud, Precisión, Robustez y Rango cumplen con los
Q
O
criterios establecidos por la United States Pharmacopeia (USP).
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
48
VI. REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS
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A
IC
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Q
O
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BI
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Y
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Químico Farmacéutico]. Facultad de Farmacia y Bioquimica de la Universidad
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49
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A
IC
profesionales para optar el título de Quimico Farmaceutico]. Facultad de
M
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O
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TE
Performance+Liquid+Chromatography+(HPLC)-
IO
Based+Detection+and+Quantitation+of+Cellular+c-di-GMP
BL
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O
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AC
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BL
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farmacia y Bioquímica de la universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. 2012.
A
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M
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Q
O
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22. Y
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I A
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AC
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FA
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DE
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CA
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BL
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Bioquimico]. Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional
de Trujillo. Trujillo. 2016
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
53
ANEXOS
ANEXO 1. ESTADÍSTICA DE LA SELECTIVIDAD
Determinación de interferencias de los excipientes (placebo):
Pesos (mg) Diluciones Factor de Dilución Pot % Conc. (mg/mL)

St 1 24.88 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.012751 mg/mL
St 2 26.40 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013530 mg/mL
CV % ( ≤ 2% )
A
Áreas del Estándar 1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar
IC
St 1 3729747 3735734 3740234 3729438 3740073 3735045 5295.95 0.14%
St 2 4006402 4015663 4008994 4004847 4012565 4009694 4435.43 0.11%
M
Chk St
0.22% 0.27% 0.24% 0.22% 0.26% 0.24%
UI
( ≤ 2% )
Q
O
BI
y
Conc.
Muestra Áreas (área (mg) Teórico Diluciones Factor
Calculada
Y
prom)
0.0125
A
Diluyente 1 0 0 0 0 0 ´1 1 0.00%
mg/mL
I
AC
0.0125
Diluyente 2 0 0 0 0 0 ´1 1 0.00%
mg/mL Máximo
≤ 1%
RM
0.0125
Placebo 1 0 0 0 0 0 ´5/20 4 0.00%
mg/mL
0.0125
FA
Placebo 2 0 0 0 0 0 ´5/20 4 0.00%

mg/mL
0.0125 Wst
Recupero 1 3962284 3970848 3975380 3969504 26.21 400 100.88% Rango
DE
mg/mL /100*5/20
98.0% -
0.0125 Wst
Recupero 2 3935457 3953551 3944706 3944571 26.05 400 100.87% 102%
mg/mL /100*5/20
CA
TE
Determinación dela pureza del analito del principio activo y los excipientes
IO
(placebo):
BL
Porcentaje de Pureza del pico (%)

BI
Promedio CV % ( ≤
Estándar 1 2 3 4 5 Desv. Estándar
% 2% )
St 1 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
St 2 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
Muestra Porcentaje de Pureza del Pico (%) Promedio % Desv. Estándar CV %

Diluyente 1 0 0 0 0 0.00 0.00%
Diluyente 2 0 0 0 0 0.00 0.00%
Placebo 1 0 0 0 0 0.00 0.00%
Placebo 2 0 0 0 0 0.00 0.00%
Recupero 1 100 100 100 100 0.00 0.00%
Recupero 2 100 100 100 100 0.00 0.00%
54
ANEXO 2. ESTADISTICA DE LA SELECTIVIDAD DEL PLACEBO
Determinación de interferencias de los excipientes:

St 1 25.96 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013305 mg/mL
St 2 25.82 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013233 mg/mL
Áreas del Estándar 1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2% )

St 1 3974339 3962390 3936270 3959703 3972100 3960960 15135.37 0.38%
St 2 4108119 4104102 4106153 4095391 4101052 4102963 4976.06 0.12%
A
Chk St
0.88% 0.86% 0.87% 0.81% 0.84% 0.85%
IC
( ≤ 2% )
M
UI
Q
Determinación de productos de degradación del placebo:
O
BI
y Resolución
Presencia de Tiempo de Conc.
Muestra Áreas (área (mg) Teórico Diluciones Factor (Especific. ≥
prom)
Y Picos Retención
1)
Calculada
A
0.00
Hid. Ácida (M1) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
I
mg/mL
AC
0.00
Hid. Ácida (M2) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
mg/mL
RM
Hid. Alcalina 0.00

0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
(M1) mg/mL
FA
Hid. Alcalina 0.00

0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
(M2) mg/mL
Hid. Oxidativa 0.00
DE
0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%

(M1) mg/mL
Hid. Oxidativa 0.00
0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
CA
(M2) mg/mL
0.00
Calor Seco (M1) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
mg/mL
TE
0.00
Calor Seco (M2) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
mg/mL
IO
Calor Húmedo 0.00

0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
BL
(M1) mg/mL
Calor Húmedo 0.00
0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
BI
(M2) mg/mL
0.00
Fotólisis (M1) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
mg/mL
0.00
Fotólisis (M2) 0 0 0 0 0 5/20 4 No N.A. N.A. 0.00%
mg/mL
Determinación de pureza de pico del estandar:
Porcentaje de Pureza de Pico (%)

Estándar 1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2% )
St 1 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
St 2 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
55
Determinación de la pureza del pico en la degradación del placebo:
Muestra Porcentaje de Pureza de Pico (%) Promedio % Desv. Estándar CV %

Hid. Ácida (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Hid. Ácida (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Hid. Alcalina (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Hid. Alcalina (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Hid. Oxidativa (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Hid. Oxidativa (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Calor Seco (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Calor Seco (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
Calor Húmedo (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
A
Calor Húmedo (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
IC
Fotólisis (M1) 0 0 0 0 0.00 0.00%
M
Fotólisis (M2) 0 0 0 0 0.00 0.00%
UI
Q
O
𝐴𝑚𝑝 𝑥 𝑊𝑆𝑡 𝑥 5 𝑥 𝑃𝑜𝑡. 𝑆𝑡. 𝑥 20
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝐶𝑙𝑜𝑟ℎ𝑒𝑥𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 (𝑚𝑔 / 𝑚𝐿) =
BI
𝐴𝑆𝑡 𝑥 100 𝑥 20 𝑥 𝑉𝑚
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
56
ANEXO 3. ESTADISTICA DE LA SELECTIVIDAD DEL ESTANDAR

St 1 25.96 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013305 mg/mL
St 2 25.82 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013233 mg/mL
A
CV % ( ≤ 2% )
IC
Áreas del Estándar 1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar
St 1 3974339 3962390 3936270 3959703 3972100 3960960 15135.37 0.38%
M
St 2 4108119 4104102 4106153 4095391 4101052 4102963 4976.06 0.12%
UI
Chk St ( ≤ 2% ) 0.88% 0.86% 0.87% 0.81% 0.84% 0.85%
Q
O
Determinación de productos de degradación del estándar:
BI
Y
Resolución
IA
y Presencia Tiempo de Conc.
Muestra Áreas (mg) Teórico Diluciones Factor (Especific.
(área prom) de Picos Retención Calculada
≥ 1)
AC
Hid. Ácida (M1) 4027317 4025541 4020930 4024596 26.03 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 101.33%
M
Hid. Ácida (M2) 4034310 4035032 4038141 4035828 25.98 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 101.81%
R
FA
Hid. Alcalina
4000556 4006047 4017763 4008122 26.05 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 100.84%
(M1)
Hid. Alcalina DE
4012859 4032374 4032717 4025983 26.10 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 101.10%
(M2)
Hid. Oxidativa
CA
4141125 4116233 4111385 4122914 26.59 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 101.62%
(M1)
Hid. Oxidativa
TE
4093594 4083619 4101328 4092847 26.63 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 100.73%
(M2)
IO
Calor Húmedo
3858683 3854755 3836127 3849855 25.75 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 97.99%
(M1)
BL
Calor Húmedo
3836237 3864164 3846533 3848978 25.81 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 97.74%
(M2)
BI
Calor Seco (M1) 3714365 3696803 3696574 3702581 25.63 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 94.68%
Calor Seco (M2) 3703513 3723531 3708201 3711748 25.55 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 95.21%
Fotólisis (M1) 3708328 3703433 3692797 3701519 25.36 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 95.66%
Fotólisis (M2) 3699382 3703325 3704319 3702342 25.28 0.0125 mg/mL Wst/100*5/20 400 No N.A. N.A. 95.99%
57
Determinación de pureza de pico del estandar:

St 1 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
St 2 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
Determinación de la pureza del pico en la degradación del estándar:
A
IC
M
Hid. Ácida (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%
UI
Hid. Ácida (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
Q
Hid. Alcalina (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%
O
Hid. Alcalina (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
BI
Hid. Oxidativa
100 100 100 100 0.00 0.00%
(M1)
Hid. Oxidativa
100 100 100 Y 100 0.00 0.00%
A
(M2)
I
Calor Seco (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%
AC
Calor Seco (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%

RM
Calor Húmedo (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%

Calor Húmedo (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
FA
Fotólisis (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%

Fotólisis (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
DE

CA
TE
IO
BL
BI
58
ANEXO 4. ESTADISITICA DE LA SELECTIVIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO
Determinación de interferencias de los excipientes:

St 1 25.96 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013305 mg/mL
A
St 2 25.82 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013233 mg/mL
IC
M
UI
Áreas del Estándar 1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2% )
Q
St 1 3974339 3962390 3936270 3959703 3972100 3960960 15135.37 0.38%
O
St 2 4108119 4104102 4106153 4095391 4101052 4102963 4976.06 0.12%
BI
Chk St
0.88% 0.86% 0.87% 0.81% 0.84% 0.85%
( ≤ 2% )
Y
IA
Determinación de productos de degradación del producto terminado:
AC
M
Resolución
y Presencia Tiempo de Conc.
R
Muestra Áreas (mg) Teórico Diluciones Factor (Especific. ≥
(área prom) de Picos Retención Calculada
FA
1)
Hid. Ácida (M1) 3150671 3144716 3148723 3148037 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 84.59%
Hid. Ácida (M2) 3126838 3129991 3124820
DE
3127216 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 84.03%
Hid. Alcalina (M1) 3185297 3180662 3188166 3184708 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 85.58%
CA
Hid. Alcalina (M2) 3125110 3126507 3116344 3122654 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 83.91%
Hid. Oxidativa
TE
3163729 3150196 3136576 3150167 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 84.65%
(M1)
IO
Hid. Oxidativa
3195235 3184120 3181567 3186974 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 85.64%
(M2)
BL
Calor Húmedo
3121951 3133562 3132155 3129223 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 84.09%
BI
(M1)
Calor Húmedo
3111300 3123629 3125353 3120094 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 83.84%
(M2)
Calor Seco (M1) 3122660 3114465 3115011 3117379 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 83.77%
Calor seco (M2) 3164058 3166518 3145234 3158603 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 84.88%
Fotólisis (M1) 3086129 3100227 3084516 3090291 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 83.04%
Fotólisis (M2) 3119580 3114830 3108878 3114429 - 0.0125 mg/mL 5/20 4 No N.A. N.A. 83.69%
59
Determinación de pureza de pico en los productos de degradación:

St 1 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
St 2 100 100 100 100 100 100 0.00 0.00%
Determinación de la pureza del pico en la degradación del producto:
A
IC
Hid. Ácida (M1) 99 100 100 100 0.58 0.58%
M
Hid. Ácida (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
UI
Hid. Alcalina (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%
Q
Hid. Alcalina (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
O
Hid. Oxidativa (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%
BI
Hid. Oxidativa (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
Calor Seco (M1) 100 100 100
Y 100 0.00 0.00%
A
Calor Seco (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
I
AC
Calor Húmedo (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%

Calor Húmedo (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
RM
Fotólisis (M1) 100 100 100 100 0.00 0.00%

Fotólisis (M2) 100 100 100 100 0.00 0.00%
FA
DE

CA
TE
IO
BL
BI
60
ANEXO 5. ESTADISTICA DE LA LINEALIDAD DEL SISTEMA
Dilucion del St de Trabajo St

[st] mg/mL
al 70%:
g Dilución de
LS-1-70% 0.01751 17.51 mg 'Wst/100*5/20 0.0089739
<> Estándar:
g Factor de dilución de
LS-2-70% 0.01704 17.04 mg 400 0.0087330
<> Estándar:
g
LS-3-70% 0.01737 17.37 mg 0.0089021
<>

[st] mg/mL
al 80%:
A
g Dilución de
IC
LS-1-80% 0.02039 20.39 mg 'Wst/100*5/20 0.0104499
<> Estándar:
M
LS-2-80% 0.01994 19.94 mg 400 0.0102193
<> Estándar:
UI
g
LS-3-80% 0.02002 20.02 mg 0.0102603
Q
<>
O
BI
[st] mg/mL
al 100%:
Y
g Dilución de
LS-1-100% 0.02521 25.21 mg 'Wst/100*5/20 0.0129201
<> Estándar:
A
I
LS-2-100% 0.02492 24.92 mg 400 0.0127715
AC
<> Estándar:
g
LS-3-100% 0.02653 26.53 mg 0.0135966
<>
RM

FA
[st] mg/mL
al 120%:
g Dilución de
LS-1-120% 0.03052 30.52 mg 'Wst/100*5/20 0.0156415
DE
<> Estándar:
g Factor de dilución
LS-2-120% 0.03089 30.89 mg 400 0.0158311
<> de Estándar:
CA
g
LS-3-120% 0.03092 30.92 mg 0.0158465
<>
TE

IO
[st] mg/mL
al 130%:
BL
g Dilución de
LS-1-130% 0.03442 34.42 mg 'Wst/100*5/20 0.0176403
<> Estándar:
BI
g Factor de dilución
LS-2-130% 0.03453 34.53 mg 400 0.0176966
<> de Estándar:
g
LS-3-130% 0.03370 33.70 mg 0.0172713
<>
61
Elaboración de Tabla:
x yij (área
Áreas xy x2 y2 yij-yprom f(yij/x) Σ yi,ni(Ri) Desv. Est. Variancia (s2) (yij-ӯi)
(mg/mL) prom)
0.0089739 2651095 2654419 2658867 2654794 23823.79 0.000081 7047929412573.44 -1195315.71 295835819.72 29593.67
A
0.0087330 2638812 2639764 2642471 2640349 23058.17 0.000076 6971442841801.00 -1209760.38 302341577.92 7875600.00 6237827.42 38910490948478.00 15149.00
IC
M
0.0089021 2579351 2586237 2575784 2580457 22971.55 0.000079 6658760049153.78 -1269652.04 289869815.73 -44742.67
UI
0.0104499 3011563 3016455 3018098 3015372 31510.26 0.000109 9092468298384.00 -834737.38 288555796.12 8806.67
Q
0.0102193 3017062 2978733 3018807 3004867 30707.49 0.000104 9029227690933.78 -845242.04 294039908.34 9019696.00 2806994.32 7879217098202.37 -1698.00
O
BI
0.0102603 2997871 3001462 2999037 2999457 30775.18 0.000105 8996740295211.11 -850652.71 292337581.12 -7108.67
Y
0.0129201 3746614 3724712 3749576 3740301 48325.15 0.000167 13989849077067.10 -109808.71 289494154.79 -75884.00
IA
0.0127715 3736552 3725053 3744873 3735493 47707.84 0.000163 13953905462720.40 -114616.71 292486604.29 11448554.00 1648089.74 2716199788589.05 -80692.00
AC
0.0135966 3992810 3957472 3968000 3972761 54016.14 0.000185 15782827314613.80 122651.29 292187264.61 156576.00
M
0.0156415 4547859 4576826 4580357 4568347 71455.80 0.000245 20869797357973.80 718237.96 292065807.84 -97957.67
R
0.0158311 4672559 4677592 4694737 4681629 74115.46 0.000251 21917653214727.10 831519.96 295723098.22 13998915.00 3809970.91 14515878298057.80 15324.33
FA
0.0158465 4743654 4751878 4751283 4748938 75254.05 0.000251 22552415293802.80 898828.96 299683736.68 82633.33
0.0176403 5186348 5166180 5168990 5173839 91267.82

DE
0.000311 26768613447147.10 1323729.96 293297392.80 37547.44
CA
0.0176966 5185403 5187971 5205929 5193101 91900.36 0.000313 26968297996201.00 1342991.62 293451491.46 15408875.67 839520.64 704794911036.95 56809.11
0.0172713 5039876 5043163 5042767 5041935 87080.53 0.000298 25421111905515.10 1191825.96 291926486.70 -94356.56
TE
0.1967539 57751641 803969.59 0.002739 236021039657825.00 13670906345039.50 70222834042.30

IO
BL
BI
62
ESTADÍSTICA DE LA LINEALIDAD DEL SISTEMA
Grafica:
Linealidad
5500000
A
n= 15
5000000
IC
4500000
M
b= 293792260.7
UI
a= -3541.7 4000000
Q
3500000 y = 3E+08x - 3541.7
O
y= 293792260.7x + 3000000
- (3541.7) R² = 0.9981
BI
2500000
Y
r= 0.9991
2000000
IA
r2= 0.9981 0.0070000 0.0090000 0.0110000 0.0130000 0.0150000 0.0170000 0.0190000
AC
M
Cálculo de la variancia residual y Normalidad de los residuales:
R
FA
Suma de cuadrados
DEGrados de Variancia
(SC) libertad(gl) (V)
CA
Regresión SCREG= 1.36E+13 1 VREG= 1.36E+13 F1= 6947.25

TE
Residual SCRES= 2.55E+10 13 VRES= 1.96E+09

IO
BL
Falta de ajuste SCCA= -4.47E+10 k-2=3 VFA= -1.49E+10 F2= -2.12

BI
SCExp= 7.02E+10 Σni-k=10 VEXP= 7.02E+09

Error experimental
i
Σni-1=14
Total SCT= 1.37E+13 V T= 9.76E+11
i
63
Homocedasticidad:
x yt Res
0.00897 2632913 -21880 Homocedasticidad
0.00873 2562146 -78203
0.00890 2611834 31376
A
0.01045 3066551 51179
IC
0.01022 2998795 -6072 80001
M
0.01026 3010840 11384 60001
UI
0.01292 3792291 51990 40001
Q
0.01277 3748626 13134 20001
O
1
0.01360 3991042 18281
BI
-19999
0.01564 4591810 23463 -39999
Y
0.01583 4647520 -34109 -59999
IA
0.01585 4652037 -96901 -79999
AC
0.01764 5179027 5188 -99999
0.0070 0.0090 0.0110 0.0130 0.0150 0.0170
M
0.01770 5195590 2489
R
0.01727 5070618 28683
FA
DE
Test de Cochran (Homogeneidad de variancias):
CA
TE
Gexp= 0.6012
IO
BL
Gtabla= 0.6838 (α=0.05, k=5, n=3)

BI
Gexp < Gtablas significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el factor concentración no influye en la variabilidad de los
resultados.
64
Test de Verificación de la pendiente o de la linealidad:
s2y,x= 1.96E+09
s2 b= 1.24E+13
Max. Valor
sb= 3524795.9552
permitido
sbrel%= 1.20% < 2%
Test de t:
texp= 83.35 ttablas= 2.16 (α=0.05, n-2=13 gl)
Cumple con el test de Student de la pendiente ya que texp > ttablas .
A
IC
Intervalos de Confianza:
M
UI
293792260.7 ± 7613559.26
Limite Superior: 301405819.919956
Q
Límite Inferior: 286178701.393666
O
Este intervalo no incluye el cero
BI
Cálculo del coeficiente de variación de los factores de respuesta:
Y
I A
fprom= 293553102.42
AC
sf= 3678192.73 Max. Valor permitido

RM
CV= 1.25% ≤ 2%
FA
Test de Verificación de la variable independiente o de la proporcionalidad:

DE
CA
s2y,x= 1964140981
s2a= 2268570260
TE
sa= 47629.5
sarel%= -1344.83%
IO
BL
Test de t:
BI
texp= 0.07
ttablas= 2.16 (α=0.05, n-2=13 gl)
Cumple con el test de Student de la variable independiente ya que texp < ttablas.
-3541.7 ± 102879.74
Límite Inferior: -106421.4
Este intervalo incluye al cero.
65
ANEXO 6. ESTADISTICA DE LA LINEALIDAD DEL METODO
Dilucion del St de Trabajo St al

[st] mg/mL
70%:
g Dilución de
LM-1-70% 0.01730 17.30 mg 'Wst/100*5/20 0.0088663
<> Estándar:
LM-2-70% 0.01737 17.37 mg 400 0.0089021
<> Estándar:
g
LM-3-70% 0.01818 18.18 mg 0.0093173
<>
A
[st] mg/mL
80%:
IC
g Dilución de
LM-1-80% 0.02054 20.54 mg 'Wst/100*5/20 0.0105268
M
<> Estándar:
UI
LM-2-80% 0.01986 19.86 mg 400 0.0101783
<> Estándar:
Q
g
LM-3-80% 0.02031 20.31 mg 0.0104089
<>
O
BI
[st] mg/mL
100%:
LM-1-100% 0.02508
g
25.08 mg
Dilución deY 'Wst/100*5/20 0.0128535
A
<> Estándar:
I
AC
LM-2-100% 0.02507 25.07 mg 400 0.0128484

<> Estándar:
g
RM
LM-3-100% 0.02544 25.44 mg 0.0130380

<>
FA

[st] mg/mL
120%:
DE
g Dilución de
LM-1-120% 0.03112 31.12 mg 'Wst/100*5/20 0.0159490
<> Estándar:
Factor de
g
CA
LM-2-120% 0.03121 31.21 mg dilución de 400 0.0159951

<>
Estándar:
TE
g
LM-3-120% 0.03145 31.45 mg 0.0161181
<>
IO

BL
[st] mg/mL
130%:
g Dilución de
BI
LM-1-130% 0.03321 33.21 mg 'Wst/100*5/20 0.0170201

<> Estándar:
Factor de
g
LM-2-130% 0.03317 33.17 mg dilución de 400 0.0169996
<>
Estándar:
g
LM-3-130% 0.03275 32.75 mg 0.0167844
<>
66
Elaboración de Tabla:
x
yij (área Desv.
(mg/mL Áreas xy x2 y2 yij-yprom f(yij/x) Σ yi,ni(Ri) Variancia (s2) (yij-ӯi)
prom) Est.
)
0.00886 26883 26681 26717 267607 23726.7 0.0000 7161395246136. 301827529
-1247730.76 -59194.78
63 96 26 13 8 8 79 11 .49
A
0.00890 27037 27038 26770 269488 23990.1 0.0000 7262380010986. 302723263 8205819. 1229895. 1512642430316
IC
-1228928.76 -40392.78
21 46 72 23 0 6 79 78 .64 33 29 .82
M
0.00931 28129 28643 28272 283486 26413.1 0.0000 8036434999413. 304259375
-1088948.42 99587.56
UI
73 61 41 80 1 1 87 78 .53
0.01052 31781 31950 31976 319025 33583.0 0.0001 1017773759921 303061882
Q
-733552.42 78293.56
68 67 03 00 7 3 11 1.10 .03
O
0.01017 30627 30523 30578 305764 31121.4 0.0001 9349199061316. 300409795 9335889. 3212050. 1031726523221
-866163.09 -54317.11
BI
83 25 82 31 6 9 04 00 .40 33 00 9.80
0.01040 30949 31002 30688 308798 32142.4 0.0001 9535661653511. 296668628
-835822.42 -23976.44
Y
89 27 02 31 7 7 08 11 .13
0.01285 38660 38608 38708 386591 49690.4 0.0001 1494525755082 300767080
IA
-57899.42 -8358.78
35 88 18 23 0 7 65 6.80 .30
AC
0.01284 38620 38514 38333 384897 49453.0 0.0001 1481459058874 299568830 11622805 649554.2 421920748165.
-74836.42 -25295.78
84 49 73 96 3 4 65 7.10 .04 .33 7 97
M
0.01303 39029 39035 39172 390792 50951.5 0.0001 1527186217392 299733317
-15886.09 33654.56
80 76 53 40 3 0 70 9.00 .99
R
0.01594 47365 47599 47612 475256 75798.7 0.0002 2258690893138 297985370
FA
828759.58 -41016.11
90 00 93 13 9 2 54 1.80 .03
0.01599 47989 48037 48202 480764 76898.8 0.0002 2311340877978 300569121 14380754 1297087. 1682437230244
DE 883831.58 14055.89
51 49 10 63 1 1 56 7.10 .32 .33 98 .89
0.01611 48374 47959 48282 482054 77698.1 0.0002 2323765409702 299076040
896735.91 26960.22
81 01 48 86 5 5 60 5.00 .17
CA
0.01702 51004 50881 51080 509889 86783.9 0.0002 2599877101220 299580584

1175089.91 -5057.00
01 49 53 95 9 0 90 1.00 .75
TE
0.01699 51070 51218 51014 511010 86869.8 0.0002 2611316970428 300601023 15311868 2327831. 5418798800968
1186295.58 6148.67
96 13 21 80 5 6 89 8.40 .06 .00 35 .49
IO
0.01678 51099 51099 50886 510286 85648.3 0.0002 2603922440440 304024685

1179055.24 -1091.67
BL
44 64 73 56 4 9 82 5.40 .66
0.19580 588571 810769. 0.0026 2436436558131 1269948932246 29222067424
BI
58 36 88 98 67.00 0.80 .74
67
Gráfica:
Ecuación de la recta: Linealidad

n= 15 6000000
A
5000000
IC
b= 298823659.6
M
a= 23049.7 4000000
UI
y = 3E+08x + 23050
Q
y= 298823659.6x + 3000000 R² = 0.9992
O
(23049.7)
2000000
BI
r= 0.9996 0.0070000 0.0090000 0.0110000 0.0130000 0.0150000 0.0170000 0.0190000
Y
r2= 0.9992
IA
AC
M
Cálculo de la variancia residual y Normalidad de los residuales:
R
FA
Suma de Grados de Variancia
DE
cuadrados (SC) libertad(gl) (V)
Regresión SCREG= 1.27E+13 1 VREG= 1.27E+13 F1= 16841.96
CA
Residual SCRES= 9.79E+09 13 VRES= 7.53E+08

TE
IO
-
Falta de ajuste SCCA= k-2=3 VFA= -6.48E+09 F2= -2.22
1.94E+10
BL
BI
SCExp= 2.92E+10 Σni-k=10 VEXP= 2.92E+09

Error experimental
i
Ftabla= 2.5 (α=0.05, nn=4, nd=70)
68
Homocedasticidad:
x yt Res
0.00887 2672495 -3583 Homocedasticidad
0.00890 2683215 -11665
0.00932 2807264 -27596
A
IC
0.01053 3168692 -21565
70000
M
0.01018 3064552 6906
50000
UI
0.01041 3133468 45481
30000
Q
0.01285 3863980 -1930
O
0.01285 3862448 13475 10000
BI
0.01304 3919113 11190
0.01595 4788988 36420
-10000
Y
0.01600 4802771 -4869 -30000
IA
0.01612 4839527 18982
AC
-50000
0.01702 5109066 10167
-70000
M
0.01700 5102940 -7165
0.0070 0.0090 0.0110 0.0130 0.0150 0.0170
R
0.01678 5038618 -64246
FA
DE
CA
Test de Cochran (Homogeneidad de variancias):

TE
Gexp= 0.5331
IO
BL
Gtabla= 0.6838 (α=0.05, k=5, n=3)

BI
Gexp < Gtablas significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el factor concentración no influye en la variabilidad de los
resultados.
69
Test de Verificación de la pendiente o de la linealidad:
s2y,x= 7.53E+08 Max. Valor permitido

s2b= 5.30E+12 < 2%
sb= 2302600.8388
sbrel%= 0.77%
Test de t:
texp= 129.78
A
ttablas= 2.16
IC
(α=0.05, n-2=13 gl)
Cumple con el test de Student de la pendiente ya que texp > ttablas .
M
UI
Intervalos de Confianza
Q
298823659.6 ± 4973617.81
O
BI
Límite Inferior: 293850041.829744
Y
Este intervalo no incluye el cero. A
Cálculo del coeficiente de variación de los factores de respuesta:
I
AC
fprom= 300723768.50
RM
sf= 2146405.55 Max. Valor permitido

CV= 0.71% ≤ 2%
FA
DE
Test de Verificación de la variable independiente o de la proporcionalidad:
s2y,x=
CA
753457082
s2a= 953683715
TE
sa= 30881.8
sarel%= 133.98%
IO
BL
Test de t:
BI
texp= 0.75
ttablas= 2.16
(α=0.05, n-2=13 gl)
Cumple con el test de Student de la variable independiente ya que texp < ttablas .
23049.7 ± 66704.62
Límite Inferior: -43654.9
Este intervalo incluye el cero.
70
ANEXO 7. ESTADISTICA DE LA EXACTITUD
Porcentaje de Recuperación y Coeficiente de Variación
Pesos (mg) Diluciones Factor de Dilución Pot % Concentración (mg/mL)

St 1 25.68 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013161 mg/mL
St 2 25.06 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.012843 mg/mL
Áreas del
A
1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2%)
Estándar
IC
St 1 3973656 3972336 3973278 3960911 3953212 3966679 9204.03 0.23%
M
UI
St 2 3868482 3855330 3865198 3864026 3870649 3864737 5877.64 0.15%
Q
O
Chk St
0.01% 0.08% 0.03% 0.04% 0.00% 0.03%
( ≤ 2% )
BI
Y
A
Dilución del estándar de
[St] mg/mL
I
Trabajo al 70%:
AC
< Dilución de
EX-1-70% 0.01730 17.30 mg Wst/100*5/20 0.008866250
> Estándar:
RM
< Factor de dilución de

EX-2-70% 0.01737 17.37 mg 400.00 0.008902125
> Estándar:
FA
<
EX-3-70% 0.01818 18.18 mg 0.009317250
>
DE

[St] mg/mL
CA
Trabajo al 100%:
EX-1- < Dilución de
0.02508 25.08 mg Wst/100*5/20 0.012853500
TE
100% > Estándar:

EX-2- < Factor de dilución de
0.02507 25.07 mg 400.00 0.012848375
IO
100% > Estándar:

EX-3- <
0.02544 25.44 mg 0.013038000
BL
100% >
BI

[St] mg/mL
Trabajo al 130%:
EX-1- < Dilución de
0.03321 33.21 mg Wst/100*5/20 0.017020125
130% > Estándar:
EX-2- < Factor de dilución de
0.03317 33.17 mg 400.00 0.016999625
130% > Estándar:
EX-3- <
0.03275 32.75 mg 0.016784375
130% >
71
Conc.
[St] y (área Teórico Porcentaje de Desv. Variancia
Áreas Diluciones Factor calculada f (y/x) Promedio
mg/mL prom) P.A. Recuperación Estándar (s2)
mg/mL
0.00886625 2688396 2668126 2671713 2676078 0.00875mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0088789 100.14% 301827529.5
0.00890213 2703746 2703872 2677023 2694880 0.00875mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0089413 100.44% 302723263.6 302936722.9 1229895.29 1.51E+12
0.00931725 2812961 2864341 2827280 2834861 0.00875mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0094058 100.95% 304259375.5
0.01285350 3866088 3860818 3870823 3865910 0.01250mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0128267 99.79% 300767080.3
A
0.01284838 3862049 3851473 3833396 3848973 0.01250mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0127705 99.39% 299568830.0 300023076.1 649554.27 4.22E+11
IC
0.01303800 3902976 3903553 3917240 3907923 0.01250mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0129661 99.45% 299733318.0
M
UI
0.01702013 5100449 5088153 5108095 5098899 0.01625mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0169176 99.40% 299580584.7
Q
0.01699963 5107013 5121821 5101480 5110105 0.01625mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0169548 99.74% 300601023.1 301402097.8 2327831.35 5.42E+12
O
0.01678438 5109964 5109973 5088656 5102864 0.01625mg/mL Wst/100*5/20 400 0.0169307 100.87% 304024685.7
BI
Promedio %
Y
0.116630 - - - 35140493 - - - 98.0% - 100.02% 301299885.6 - - -
102%
IA
AC
Desvest (s) 0.6146
CV (%)
M
Máximo ≤ 0.61%
R
2.0%
FA
t de Student:
DE
texp= 0.093 Cumple con el test de Student ya que texp < ttablas significa que no hay diferencia entre las dos medias.
CA
ttablas= 2.306
(α=0.05, n-1=8 gl)
TE
IO
Test de Cochran:
BL
Gexp= 0.7369 Gexp < Gtablas significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el factor concentración no
BI
influye en la variabilidad de los resultados.

Gtabla= 0.8709
(α=0.05, k=3, n=3)
72
ANEXO 8. ESTADISITICA DE LA PRECISION DEL SISTEMA
Precisión del Sistema:
Estándar al 100% con seis inyecciones consecutivas.
X 1 2 3 4 5 6 Promedio CV % ( ≤ 2 % )
y (Área) 3932413 3952847 3945222 3962370 3960424 3957211 3951748 0.29%
TR (min) 5.15 5.11 5.15 5.05 5.08 5.04 5.10 0.94%
Asimetría 1.16 1.16 1.14 1.15 1.12 1.14 1.15 No más de 2.0
A
IC
Estándar en tres niveles de concentración, con tres inyecciones cada una.
---
M
Tiempo Platos
UI
Teorico Lectura CV Asimetría
x% Conc. 1 2 3 DE de teóricos
p.a. promedio (……………..) (………….)
retención (………...)
Q
--- --- --- --- --- -- -- --
O
--- --- --- --- --- --- -- -- -- -- -- --
BI
--- --- --- --- --- -- -- --
--- --- --- --- --- -- -- --
--- --- --- --- --- --- --
Y -- -- -- -- --
A
--- --- --- --- --- -- -- --
I
--- --- --- --- --- -- -- --
AC
--- --- --- --- --- --- -- -- -- -- -- --

--- --- --- --- --- -- -- --
RM
No
LEYENDA: Aplica --- -- -- -- -- --
Aplica
FA
-- -- -- --
-- -- -- --
DE
Precisión del Método:

CA
TE
Pesos (mg) Dilución Factor de Dilución Pot % Concentración (mg/mL)

IO
St 1 25.54 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013089

BL
St 2 25.82 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013233

BI
Áreas del
1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2% )
Estándar
St 1 3932413 3952847 3945222 3962370 3960424 3950655 12245.08 0.31%
St 2 4011018 4005366 4005234 4001481 3995733 4003766 5635.97 0.14%
Chk St
0.43% 0.29% 0.28% 0.19% 0.04% 0.25%
( ≤ 2% )
73
Coeficiente de Variación CV %
Concentración
Muestra Teórico Factor Áreas
Calculada
0.05 mg/mL 4 3240825 85.90%
Muestra 1 0.05 mg/mL 4 3188628 84.52%
0.05 mg/mL 4 3187879 84.50%
0.05 mg/mL 4 3208765 85.05%
Muestra 2 0.05 mg/mL 4 3195201 84.69%
0.05 mg/mL 4 3186712 84.47%
0.05 mg/mL 4 3222649 85.42%
A
Muestra 3 0.05 mg/mL 4 3205582 84.97%
IC
0.05 mg/mL 4 3202239 84.88%
0.05 mg/mL 4 3183798 84.39%
M
Muestra 4 0.05 mg/mL 4 3187554 84.49%
UI
0.05 mg/mL 4 3186565 84.46%
Q
0.05 mg/mL 4 3196472 84.72%
O
Muestra 5 0.05 mg/mL 4 3207937 85.03%
BI
0.05 mg/mL 4 3194192 84.66%
0.05 mg/mL 4 3143740 83.33%
Muestra 6 0.05 mg/mL 4 Y 3143034 83.31%
A
0.05 mg/mL 4 3147971 83.44%
I
AC
Promedio % 84.57%
RM
Desvest (s) 0.67

CV % ( ≤ 2%) 0.80%
FA
DE
Límites de confianza
CA
Intervalo de Confianza Individual:

TE
μ= 84.57% ± 1.73%
ttabla= 2.571 (α=0.05, n-1=5)
IO
BL
BI
Intervalo de Confianza del Promedio:
μ= 84.57% ± 0.71%
74
Precisión del Intermedia.

St 1 25.20 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.012915
St 2 25.34 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.012987
Áreas del
1 2 3 4 5 Promedio Desv. Estándar CV % ( ≤ 2% )
Estándar
St 1 3824009 3825717 3837245 3813681 3828620 3825854 8500.15 0.22%
St 2 3822738 3836929 3832038 3820522 3827854 3828016 6701.90 0.18%
Chk St
0.63% 0.26% 0.39% 0.69% 0.50% 0.50%
( ≤ 2% )
A
IC
M
UI
Muestra Teórico Factor Áreas Concentración Calculada
Q
0.05 mg/mL 4 3197297 86.35%
O
Muestra 1 0.05 mg/mL 4 3166599 85.52%
BI
0.05 mg/mL 4 3153826 85.17%
0.05 mg/mL 4
Y 3130367 84.54%
A
Muestra 2 0.05 mg/mL 4 3127639 84.46%
I
0.05 mg/mL 4 3131962 84.58%
AC
0.05 mg/mL 4 3162450 85.40%

RM
Muestra 3 0.05 mg/mL 4 3156845 85.25%

0.05 mg/mL 4 3156354 85.24%
FA
0.05 mg/mL 4 3165543 85.49%

Muestra 4 0.05 mg/mL 4 3179495 85.86%
DE
0.05 mg/mL 4 3155466 85.22%

0.05 mg/mL 4 3148278 85.02%
CA
Muestra 5 0.05 mg/mL 4 3144083 84.91%

0.05 mg/mL 4 3141627 84.84%
TE
0.05 mg/mL 4 3162957 85.42%

Muestra 6 0.05 mg/mL 4 3169594 85.60%
IO
0.05 mg/mL 4 3175787 85.76%

BL
Promedio % 85.26%
Desvest (s) 0.49
BI
CV % ( ≤ 2%) 0.57%
75
Límites de confianza
Intervalo de Confianza Individual: ttabla= 2.571 (α=0.05, n-1=5)

μ= 85.26% ± 1.26%
Intervalo de Confianza del Promedio:
μ= 85.26% ± 0.51%
C.V. ENTRE ANALISTA "A" Y ANALISTA "B"

Promedio % 84.91%
Desvest (s) 0.6775
CV % ( ≤ 2%)
A
0.80%
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
76
ANEXO 9. ESTADISTICA DE LA ROBUSTEZ

Modificación del método a validar:
Experimentos:
…. PRECISIÓN DEL METODO
1 TIEMPO DE VIGENCIA DE LA SOLUCION MUESTRA (48 horas)
2 VARIACIÓN DE PROPORCIONES DE FASE MÓVIL: Solución amortiguadora y Metanol HPLC (48:52)
Resultados de los experimentos

Experimento TIPO DE ROBUSTEZ RESULTADOS Observaciones
…. PRECISIÓN DEL METODO 84.57% TR 5.11 minutos
1 TIEMPO DE VIGENCIA DE LA SOLUCION MUESTRA (48 horas) 84.96% TR 5.12 minutos
VARIACIÓN DE PROPORCIONES DE FASE MÓVIL: Solución
2 84.21% TR 7.83 minutos
A
amortiguadora y Metanol HPLC (48:52)
IC
Cálculo de la diferencia entre promedios:
M
N° Valor máximo permitido
UI
Conc. Calculada. % C.V.%
Experimento de variación.
…. …. ….
Q
84.57%
1 84.96% 0.33 ≤ 2%
O
2 84.21% 0.30 ≤ 2%
BI
Y
A
Modificación del método a validar:
I
AC
Experimentos:
N° 01 TIEMPO DE VIGENCIA DE LA SOLUCION MUESTRA (48 horas)
RM
FA
Factor de
Pesos (mg) Dilución Pot % Concentración (mg/mL)
Dilución
DE
St 1 25.75 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013197

St 2 25.64 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013141
CA
TE

IO
St 1 3886287 3890067 3890938 3883105 3885273 3887134 3297.21 0.08%

St 2 3888921 3899332 3892234 3897934 3889646 3893613 4770.52 0.12%
BL
Chk St
0.48% 0.74% 0.56% 0.71% 0.49% 0.60%
( ≤ 2% )
BI
Muestra Teorico Factor ÁREA Lec. Promedio
0.05mg/mL 4 3128518 84.97%
Muestra 1 0.05mg/mL 4 3098624 84.16%
0.05mg/mL 4 3103935 84.30%
0.05mg/mL 4 3128022 84.96%
Muestra 2 0.05mg/mL 4 3145589 85.43%
0.05mg/mL 4 3142973 85.36%
0.05mg/mL 4 3138335 85.24%
Muestra 3
0.05mg/mL 4 3137257 85.21%
77
0.05mg/mL 4 3130398 85.02%

Promedio % 84.96%
Desvest (s) 0.45
CV %
0.53%
Máximo ≤ 2%
Experimentos:
N° 02 VARIACIÓN DE PROPORCIONES DE FASE MÓVIL: Solución amortiguadora y Metanol HPLC (48:52)

St 1 25.62 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013130
A
St 2 25.54 mg Wst/100*5/20 400 20.5% 0.013089
IC
M
UI
St 1 3869250 3845562 3853180 3845675 3846310 3851995 10158.55 0.26%
Q
St 2 3891972 3881803 3897523 3906323 3910114 3897547 11334.71 0.29%
O
Chk St
1.35% 1.09% 1.50% 1.73% 1.83% 1.50%
BI
( ≤ 2% )
Y
A
I
AC
Muestra Teorico Factor ÁREA Lec. Promedio

0.05mg/mL 4 3110144 84.81%
RM
Muestra 1 0.05mg/mL 4 3094505 84.39%

0.05mg/mL 4 3093559 84.36%
FA
0.05mg/mL 4 3068383 83.67%

Muestra 2 0.05mg/mL 4 3062310 83.51%
0.05mg/mL 4 3071035 83.75%
DE
0.05mg/mL 4 3096798 84.45%

Muestra 3 0.05mg/mL 4 3100352 84.55%
CA
0.05mg/mL 4 3094062 84.37%

Promedio % 84.21%
TE
Desvest (s) 0.45

CV %
0.53%
Máximo ≤ 2%
IO
BL

BI

78
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
78
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
I A
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
78

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Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE BACHILLER EN

NUÑEZ HERNANDEZ, Jordy Michael

RODRIGUEZ TORRES, George Gustavo Armando

Dr. CASTILLO SAAVEDRA, Ericson Felix

A Dios por iluminarnos y

muchas metas por lograr.

A nuestros hermanos por

A nuestros abuelos por cuidarnos

siempre, por enseñarnos e

inculcarnos los buenos valores.

A nuestra familia por guiarnos y

Jordy Michael Nuñez Hernandez

George Gustavo Armando Rodríguez Torres

sus enseñanzas y dedicación brindada al desarrollo de este informe.

Señores miembros del jurado:

En cumplimiento con lo dispuesto al reglamento de Grados y Títulos de la

Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de La Libertad –

obtener el grado de Bachiller en Farmacia y Bioquímica. Y

Aprovechamos esta oportunidad para expresar nuestro sincero

agradecimiento y gratitud a los señores miembros del jurado, quienes con su

capacidad y dedicación han contribuido a nuestra formación universitaria.

JORDY M. NUÑEZ H. GEORGE G. A. RODRÍGUEZ T.

Dr. ERICSON CASTILLO SAAVEDRA

Mg. RUBEN JESUS ARO DÍAZ

El presente informe tuvo como objetivo presentar evidencia documentada,

que los resultados producidos son confiables, consistentes y reproducibles en las

condiciones establecidas; teniendo en cuenta que la validación es un requisito

imprescindible para el cumplimiento de las buenas prácticas de Laboratorio. Se

realizó la validación del método analítico por cromatografía líquida de alta

dado que no se evidenció interferencia de productos degradados o de los excipientes

en el análisis del ingrediente farmacéutico activo, es lineal porque se obtuvo un

coeficiente de correlación r = 0,9996; es preciso ya que presento valores aceptables

de desviación estándar relativa, todos menores al 2%, es exacta con una

recuperación global de 100,02 %, es robusto por obtener un C.V. dentro del 2% de

concluye que el método analítico por cromatografía liquida de alta resolución

demuestra ser selectivo, lineal, exacto, preciso y robusto para la cuantificación de

gluconato de clorhexidina en Hipromelosa 0,3% solución oftálmica.

Palabras clave: validación, gluconato de clorhexidina, cromatografía.

good laboratory practices. The validation of the analytical method by high

performance liquid chromatography was performed for the quantification of

evidence of interference of degraded products or excipients in the analysis of the

active pharmaceutical ingredient, it is linear because a correlation coefficient r =

0.9996 was obtained; it is necessary since I present acceptable values of relative

100.02%, it is robust to obtain a C.V. within 2% of acceptable variation and that

method by liquid chromatography of high resolution proves to be selective, linear,

exact, precise and robust for the quantification of chlorhexidine gluconate in

Hipromelose 0.3% ophthalmic solution.

Keywords: Validation, clorhexidine gluconate, chromatography.

II. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………….9

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFIAS……………………………49

La cromatografía liquida de alta performance (HPLC), es una técnica de separación

El análisis por HPLC, de productos farmacéuticos son una necesidad y de uso

para monofármacos o asociaciones de dos o más principios activos por separado lo

Por ello el aseguramiento de la calidad en los distintos productos que desarrolla la

realizar una inspección completa al proceso de la producción, aplicando normas

un óptimo efecto terapéutico.1

Una parte importante de esta seguridad, radica en que la producción del

Precisión SI* SI* NO SI*** NO