Manual de “Prácticas de Bioquímica General” UNAP - FFB

PRÁCTICA Nº 07

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN LA SANGRE

I. GENERALIDADES
La glucosa es el hidrato de carbono más importante que se utiliza como combustible energético
para todas las células, cuando se encuentra en exceso se almacena (en el hombre) como un
polisacárido, el glucógeno, o se convierte en grasa para ser utilizados en el momento oportuno.
La patología clínica más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es
la Diabetes Mellitus, síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina que se
refleja en una tendencia a la Hiperglicemia y en una variedad de manifestaciones patológicas
metabólicas y vasculares (cetoacidosis, alteraciones vasculares, coma diabético).

Los estados de estrés, cólera, ira, provocan un aumento de glucosa en sangre de 10 a 20 mg. Los
valores de glucosa en niños son bajos y en ancianos estos aumentan. La sangre arterial posee
mayor cantidad de glucosa que la sangre venosa.

Se hace necesario definir ciertos términos como:

SUERO: Es lo que queda como sobrenadante en el tubo de ensayo después del proceso de
coagulación o de centrifugación.
PLASMA: Se denomina plasma a toda la sangre en su conjunto es decir contiene agua (90%),
proteínas, Glucosa, Lípidos, Colesterol, Enzimas, anticuerpos, etc. Aparte de lo que
comúnmente llamamos suero y Fibrinógeno.

Existen varias metodologías para determinar la concentración de glucosa en sangre o en suero:

Follin-Wu (Fosfomolíbdica): 80-120 mg/dl
Somogy–Nelson (arsenomolibdica): 60–110 mg/dL
Enzimático: Trinder: Plasma: 65 -110 mg/dL
Wienner: Plasma: 60 -110 mg/dL Suero: 70 -110 mg/dL L.C.R.: 40-74 mg/dL
Audit. Diagnostic: Suero: 65-110 mg/dL
MonlabTest: Suero o plasma: 60-110 mg/dL

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OBJETIVOS
 Determinación de glucosa en la sangre mediante el método de glucosa-oxidasa.
 Aplicación del espectrofotómetro para obtener el grado de absorbancia de la muestra.

II. MATERIAL Y METODO

MATERIALES
Micropipetas graduadas Vaso de precipitado Tubos de ensayo
Gradilla metálica Aguja hipodérmica Nº 21 algodón ligadura
EQUIPOS
Equipo de Baño María Espectrofotómetro Centrifuga
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra sanguínea
REACTIVOS
Agua destilada Alcohol
Kit de reactivos para determinar Glucosa
TRIS pH 7,4: 92 mmol/L Fenol: 0,3 mmol/L Glucosa oxidasa (GOD): 15000 U/L
Peroxidasa (POD): 1000 U/L 4 - Aminofenazona (4-AF): 2,6 mmol/L
Standard: Patrón primario acuoso de Glucosa 100 mg/dL

METODO - PROCEDIMIENTO
1. METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA
La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD; D-glucosa oxígeno l-
óxidorreductasa) a ácido Glucónico y peróxido de hidrógeno (H2O2 - agua oxigenada), este en
presencia de peroxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la
copulación oxidativa del fenol con la 4-amino fenazona (4-AF) dando lugar a la formación de
un cromógeno rojo-cereza con absorbancia máxima a 500 nm. Es decir, la determinación
enzimática de glucosa se da de acuerdo a las siguientes reacciones:

-D-Glucosa + O2 + H2O + GOD  Ácido Glucónico + H2O2

2H2O2 + Fenol + 4-AF + POD  4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona [Rojo de Quinona]
+ 4H2O

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La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la

muestra ensayada

2. OBTENSION DE LA MUESTRA:
a. Extraer la muestra de sangre a dos alumnos voluntarios previamente desinfectados.
b. Luego la sangre extraída se le lleva a centrifugar para lo cual se debe de en un casquete de la
centrifuga la sangre extraída y en el extremo opuesto se coloca otro tubo de ensayo conteniendo
agua en la misma cantidad que la muestra de sangre para contrapesar ambos tubos, el
centrifugado se lleva a cabo por 20 minutos a 1000 rpm.
c. Luego de este tiempo obtendremos en el tubo de la muestra un precipitado y una parte
sobrenadante este último es el suero con el que vamos a trabajar para determinar la
concentración de Glucosa en suero.
d. El suero obtenido debe de estar libre de hemólisis.

3. DETERMINACION DE LA GLUCOSA EN SUERO:

a. Preparar el siguiente sistema. Previamente es necesario recordarle que para proceder a extraer
el suero se debe de realizar con mucho cuidado usando una pipeta graduada y tratando de que
no absorba la parte de la sangre coagulada.

BASAL (1) ESTÁNDAR (2) MUESTRA (3)

REACTIVO 1ml 1ml 1ml
MUESTRA --------- -------- 10ul
STANDAR ------ 10ul --------

b. Mezclar y después llevar a incubar a baño maría todos los tubos por espacio de 5 minutos a
temperatura de 37°C.
c. Leer las absorbancias de cada tubo en un espectrofotómetro a una longitud de onda () de 505
nm, utilizando cubeta de 1 cm paso de luz.
d. Leer la absorbancia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es
estable como mínimo 30 minutos.

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CALCULOS
ABSORBANCIA = % de luz que es absorbida
[Glucosa] mg/dl = [(A Muestra - A Blanco)/(A Estándar – A Blanco)] X 100 (Conc. del patrón)
=> reemplazando:
DO Muestra Desconocida
[Glucosa] mg/dl = X 100mg/dl
DO Standard

III. RESULTADOS

IV. DISCUSIÓN

V. RESUMEN Y CONCLUSIONES

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DESARROLLE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS.

El alumno deberá completar el informe desarrollando los siguientes puntos:
1) Describa el fundamento del método utilizado para la determinación de la glicemia. Realice
las reacciones químicas producidas.
2) Con los siguientes valores de absorbancia: Muestra: 0.428; Stándar: 0.357 (ya descontando
el blanco)
a) Encuentre el valor de la glicemia.
b) Cual sería su probable diagnóstico, explique.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA:
https://www.monlab.es/document/Bioquimica/Bioquimica%20rutina/Substratos/IFU%20Gluc
osa%20monlabtest.pdf

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PRÁCTICA Nº 08

ACCIÓN DE LAS SALES Y ÁCIDOS BILIARES SOBRE LOS

LÍPIDOS

I. GENERALIDADES
Los Lípidos ingeridos con los alimentos no sufren modificaciones en la boca, pues la saliva
carece de enzimas que actúan sobre ellos. Al llegar al duodeno se mezclan con la bilis y el jugo
pancreático iniciándose el ataque hidrolítico de la lipasa pancreática, que es activada por las
sales biliares. La acción combinada de la lipasa pancreática, una isomerasa y la lipasa intestinal
dan como resultados ácidos grasos libres, monoglicéridos y glicerol formas en que son
absorbidas. Como la grasa neutra original y los ácidos grasos son insolubles en agua, es
necesario, mecanismos que permitan su emulsificación y faciliten su digestión y absorción, ello
se logra en el intestino por la presencia de sales biliares y ácidos biliares.

Contenidos de la bilis: que a causa del acentuado poder que tienen o para disminuir la tensión
superficial de las soluciones, favorecen la emulsión ayudando en gran parte a la digestión y
absorción de las grasas en el intestino y probablemente por combinaciones análogas,
intervengan en la absorción de la colesterina, vitaminas liposolubles y otras sustancias.

OBJETIVOS
 Demostrar el efecto emulsificante de las sales biliares sobre las grasas.
 Demostrar la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos contenidos en el aceite
vegetal.
 Demostrar la presencia de lipasa en el extracto pancreático.

II. MATERIAL Y METODO

MATERIALES
Aceite vegetal Emulsión de aceite vegetal Buffer Fosfato 0.1 M pH 7
solución sales biliares solución extracto pancreático equipo de a baño maria
Fenolftaleina NaOH 0.1 N

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METODO - PROCEDIMIENTO
1. DIGESTION DE LIPIDOS Y ACCIÓN DE LAS SALES BILIARES:
Preparar el siguiente sistema con tubos de ensayo.

COMPONENTES TUBOS I II III IV V

Aceite vegetal 3 ml 3 ml
Emulsión de aceite vegetal 3 ml 3 ml 3 ml
Buffer Fosfato 0,1 M pH 8 6ml 4ml 4 ml 2 ml 4 ml
solución sales biliares 2ml 2ml 2ml
solución extracto pancreático 2ml 2ml

Agitar fuertemente los tubos I y II. Dejar en reposo. Y observar los resultados.
Mezclar los tubos III y IV luego llevar a Baño Maria a 37ºC por 30´ agitando de vez en cuando.
Agregar a cada tubo IV gotas de fenolftaleina mezclar bien y titular.
De una pipeta graduada de 1 ml dejar caer gota a gota NaOH 0,1 N en el fondo de cada tubo del
sistema, hasta la aparición de un color rosado tenue, anotar el gasto de NaOH en ml; de cada
uno de los tubos.
La actividad de la lipasa esta dada por los ml de NaOH 0,1N gastados menos el blanco.
Anotar los resultados.

III. RESULTADOS

IV. DISCUSIÓN

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V. RESUMEN Y CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DESARROLLE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS.

El alumno deberá completar el informe desarrollando los siguientes puntos:
1) Esquematice mediante reacciones el proceso de saponificación de los lípidos.
2) Explique cómo se liberan y actúan las sales biliares y la lipasa pancreática en nuestro
organismo.
3) Describa las reacciones producidas en el proceso de digestión de los lípidos
4) Para que usamos el NaOH 0,1 N.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA:
https://www.redalyc.org/pdf/776/77617786013.pdf
https://www.udocz.com/apuntes/222784/digestion-de-lipidos

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PRÁCTICA Nº 09

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SANGRE

I. GENERALIDADES
El colesterol es una sustancia cérea que aparece en la sangre y tejidos de los animales. Es un
esteroide necesario para el buen funcionamiento del organismo, en funciones tan importantes
como la formación de la vitamina D o las hormonas. Sin el colesterol nuestro organismo sería
incapaz de absorber grasas. Sin embargo, un exceso del mismo (Hipercolesterolemia) lleva
consigo un deterioro de la salud. La acumulación de colesterol en las paredes arteriales
(Hipercolesterolemia) es una de las causas de la aterosclerosis. Altos niveles de colesterol
suponen un mayor riesgo de sufrir alguna enfermedad vascular, como infartos o hemorragias
cerebrales.

Tenemos que tener en cuenta que hay dos tipos de colesterol: el llamado colesterol " malo" que
va relacionado con la LDL, o lipoproteina de baja densidad. (en inglés: Low-density lipoprotein)
y el HDL, el colesterol " bueno", relacionado con la lipoproteina de alta densidad (en inglés:
High-density lipoproteins ) Las lipoproteínas son las encargadas del transporte del colesterol a
través de la corriente sanguínea. Es bueno que la cantidad de las segundas sea alto porque no
esta indicando que el colesterol que arrastran va a ser eliminado del cuerpo, pero un número alto
de lipoproteínas de baja densidad es síntoma de que el colesterol va a circular por la sangre y
finalmente se va a depositar en las arterias, bloqueándolas y endureciéndolas.

Médicamente, se considera que unos niveles de colesterol inferiores a 200 miligramos por
decilitro de sangre son los que se deberían tener para evitar el riesgo de enfermedades
vasculares. Por encima de 200 la persona se encuentra en riesgo. El riesgo, además de los niveles
altos de colesterol general, depende también de los niveles concretos de HDL y LDL (Niveles
por encima de 60 de HDL protegen contra las enfermedades vasculares, aunque los niveles de
LDL sean altos. Niveles por debajo de 40 pueden considerarse peligrosos). Además de estos
factores hay que tener en cuenta otros parámetros como la edad, el consumo de tabaco, el peso
corporal, los antecedentes familiares, posibles problemas cardíacos, etc. para determinar el nivel

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de riesgo. Por todo ello es mejor consultar con el especialista la situación en que se encuentra
cada paciente y el tratamiento adecuado a seguir.

El colesterol es elaborado en el hígado para las funciones normales del cuerpo, incluyendo la
producción de hormonas, el ácido biliar y la vitamina D. El colesterol es transportado a través
de la sangre a todas partes del cuerpo para su utilización.

OBJETIVOS
 Determinar y cuantificar la cantidad de colesterol total en suero sanguíneo Conocer la
importancia de.

II. MATERIAL Y METODO

MATERIALES
Tubos de ensayo micropipetas Gradilla Agua destilada
Reactivo para determinar Colesterol Reactivo Standard de colesterol
Centrífuga Espectrofotómetro Baños Maria Refrigerador Sangre.

METODO - PROCEDIMIENTO
1. METODO DEL COLESTEROL OXIDASA
El colesterol presente en la muestra origina un compuesto coloreado según las siguientes
reacciones:
Esteres de Colesterol + H2O + CHE  Colesterol + Ácidos Grasos
Colesterol + O2 + CHOD  4-Colestenona + H2O2
4H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona + POD  4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona
[Rojo de Quinona] + 4H2O

2. EXTRACION DE LA MUESTRA:
Proceder a extraer sangre de uno de los presentes aproximadamente 5 cm de sangre en el tubo
de ensayo, antes previamente lavarnos las manos con alcohol y limpiar la zona donde se
procederá a picar con alcohol y algodón también.
Luego la sangre extraída pasará a ser centrifugada, durante 20 minutos a 1000 rpm.

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Extraer el suero con una pipeta graduada tratando de que no absorba la parte de la sangre
coagulada.
3. DETERMINACION DE LA COLESTEROL EN SUERO:
Preparar el siguiente sistema. Previamente es necesario recordarle que para proceder a extraer
el suero se debe de realizar con mucho cuidado usando una pipeta graduada y tratando de que
no absorba la parte de la sangre coagulada.

BLANCO STANDAR DESCONOCIDO

REACTIVO (ml) 1 1 1
ESTÁNDAR (ml) 0.01
MUESTRA (ml) 0.01

Mezclar e incubar 10 minutos a 37ºC a 20 minutos o temperatura ambiente (20 a 25 ºC)

Leer las absorbancias a 505 nm llevando a cero el espectronic con el blanco de reactivo. El
color resultante es estable a por lo menos 30 minutos.

CALCULOS
ABSORBANCIA = % de luz que es absorbida
[Colesterol] mg/dl = [(A Muestra - A Blanco)/(A Estándar – A Blanco)] X 200 (Conc. del
patrón)
=> reemplazando:
DO Muestra Desconocida
[Colesterol] mg/dl = X 200mg/dl
DO Standard

III. RESULTADOS

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IV. DISCUSIÓN

V. RESUMEN Y CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DESARROLLE LAS SIGUIENTES PREGUNTAS.

El alumno deberá completar el informe desarrollando los siguientes puntos:
1) Realice un mapa mental sobre los aspectos importantes del colesterol y las lipoproteínas.
2) Calcule los valores de Colesterol total, HDL encontrados tomando en cuenta los siguientes
valores de absorbancia: CT: B=0.05 Mst=0.23 St=0.22 [St]=200.00; HDLc: B=0.015
Mst=0.305 St=0.335 [St]=40.00
3) Que es índice aterogénico? En base a los resultados anteriores determine el índice
aterogénico.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA:
https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/resultados-de-un-analisis-bioquimico-12160
https://books.google.com.ec/
https://themedicalbiochemistrypage.org/es/

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