Este documento describe los procedimientos para aislar microorganismos de interés industrial como Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides a partir de muestras ambientales como limones, uvas, aguamiel y pulque. Incluye los objetivos, materiales, pasos y condiciones requeridas para realizar los aislamientos mediante siembra en placa y cultivo puro e identificar las colonias aisladas.
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Este documento describe los procedimientos para aislar microorganismos de interés industrial como Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides a partir de muestras ambientales como limones, uvas, aguamiel y pulque. Incluye los objetivos, materiales, pasos y condiciones requeridas para realizar los aislamientos mediante siembra en placa y cultivo puro e identificar las colonias aisladas.
Este documento describe los procedimientos para aislar microorganismos de interés industrial como Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides a partir de muestras ambientales como limones, uvas, aguamiel y pulque. Incluye los objetivos, materiales, pasos y condiciones requeridas para realizar los aislamientos mediante siembra en placa y cultivo puro e identificar las colonias aisladas.
Este documento describe los procedimientos para aislar microorganismos de interés industrial como Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides a partir de muestras ambientales como limones, uvas, aguamiel y pulque. Incluye los objetivos, materiales, pasos y condiciones requeridas para realizar los aislamientos mediante siembra en placa y cultivo puro e identificar las colonias aisladas.
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PRÁCTICA No.
1 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL
OBJETIVOS El alumno: • Aislará los microorganismos que serán utilizados en las diferentes prácticas del laboratorio. • Purificará y mantendrá viables las cepas aisladas. • Empleará el método mas adecuado para el aislamiento y purificación de las cepas en función del tipo de muestra que será utilizada.
INTRODUCCIÓN Los principales microorganismos utilizados en la obtención de productos de interés industrial son los hongos (mohos y levaduras) y algunos procariotas, particularmente del género Streptomyces. Los microorganismos industriales son especialistas metabólicos capaces de ser manipulados en cultivos a gran escala para producir uno o más compuestos con un alto rendimiento. A fin de conseguir esta elevada especialización, a menudo las cepas de microorganismos industriales sufren una manipulación genética por mutación o por recombinación, siempre con el objetivo de incrementar el rendimiento de un producto particular que una cepa determinada puede producir. Las capacidades bioquímicas de los microorganismos son vastas, y una amplia variedad de compuestos nuevos e inusuales pueden ser producidos por microorganismos. Una de las principales tareas de los microbiólogos industriales es el desarrollar procedimientos para obtener metabolitos. Existen 5 distintos pasos.
1. Screening para la producción de nuevos aislados y/o nuevos métodos de prueba.
2. Modificación química de sustancias microbianas conocidas. 3. Biotransformación, lo cual resulta de cambios en la molécula química por medio de una reacción enzimática o de la acción microbiana. 4. Fusión interespecífica de protoplastos, la cual es una forma de recombinar información genética entre cepas productoras cercanamente relacionadas. 5. Clonación de genes en la cual los genes pueden ser transferidos entre cepas o relacionadas las cuales son productoras de sustancias conocidas.
Screening de nuevos metabolitos:
No existen métodos de búsqueda universales. El éxito del programa de Screening
depende tanto de la selección de pruebas, así como de los microorganismos que serán probados.
En la actualidad más programas de Screening se enfocan en los productos de utilidad
quimioterapeútica para las siguientes áreas: ü Actividad contra cepas resistentes a antibióticos, tumores, virus. ü Búsqueda de inhibidores enzimáticos y sustancias de actividad farmacológica. ü Mejoramiento de cepas para la industria alimentaria, así como microorganismos que sean capaces de degradar sustancias químicas persistentes o dañinas. L.Q.I. LABORATORIO DE PROCESOS MICROBIOLÓGICOS INDUSTRIALES
AISLAMIENTO DE Aspergillus niger
El aislamiento de Aspergillus niger se puede realizar a partir de muestras comunes en el
medio ambiente, como lo son aire, tierra, agua estancada, frutas, etc., en el caso nuestro se utilizara para ello una muestra de limón.
MATERIAL Y REACTIVOS
1 Caja de Petri. 1 Tubo con 5ml de caldo Saboraud Dextrosa 1 Tubo con 5ml de PDA inclinado Rodajas de limón Algodón Portaobjetos
PROCEDIMIENTO 1. Colocar una cama de algodón sobre una caja de Petri y humedecer. 2. Cortar el limón en rodajas y colocarlas sobre la cama húmeda de algodón, agregando un poco de tierra sobre la superficie. 3. Exponer la preparación al aire del medio ambiente durante un lapso de 3 a 4 días. 4. Observar el crecimiento del hongo que se desarrolle sobre las rodajas de limón. La aparición de un color negro indica la posible presencia del género Aspergillus, el cual se puede verificar mediante una preparación en fresco y un microcultivo para comprobar su presencia. 5. Una vez verificada su presencia realizar un cultivo puro para su posterior identificación y utilización en la práctica de producción de Ácido Cítrico.
Figura 1.1 Forma correcta de colocar las rodajas de limón
Realización de cultivo puro
1. Tomar una asada del hongo que creció sobre el limón y sembrar por agitación en caldo Saboraud Dextrosa y por estría en el tubo con PDA inclinado. 2. Incubar a 28 0C / 24-48h 3. Observar las características del crecimiento y realizar una preparación en fresco con azul de metileno.
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a) b)
Figura 1.2 a) Siembra por estría en un tubo de PDA inclinado; b) Siembra por agitación en un tubo con caldo Saboraud Dextrosa en condiciones de asepsia.
Reporte Dibujos de los campos observados
Muestra: ______________________________ Características de las colonias: _____________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ Preparación: ___________________________ Objetivo: ______________________________ Morfología microscópica: _________________ ______________________________________ ______________________________________
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AISLAMIENTO DE Saccharomyces cerevisiae y Leuconostoc
mesenteroides
El aislamiento de Saccharomyces cerevisiae se realiza a partir de una muestra de uvas,
las cuales se maceran y se dejan fermentar para que se incremente su población, y posteriormente se realiza su aislamiento e identificación, para su posterior utilización en las prácticas de Biomasa y Cerveza.
El aislamiento del Leuconostoc mesenteroides se realiza a partir de muestras ricas en
azúcares como lo son el aguamiel y el pulque, utilizándose para ello un medio rico en sacarosa y triptona, dicho aislamiento se realiza por medio de la técnica de dilución y siembra en placa y posteriormente se realiza un cultivo puro para su identificación y utilización en la práctica de producción de dextranos.
Este método clásico de dilución y siembra en placa, ofrece al igual que los otros una serie de ventajas y desventajas, pero resulta práctico y al alcance de la mayoría de los laboratorios, consiste en efectuar una serie de diluciones a partir de la muestra con la finalidad de facilitar el aislamiento de las colonias que se desarrollen sobre la superficie del medio cultivo.
Hay que tomar en cuenta que las muestras más contaminadas van a requerir de un número mayor de diluciones para la realización de un aislamiento apropiado. Se recomienda marcar cada uno de los tubos de dilución y las cajas de Petri, con las diluciones que habrán de contener. Tenga la precaución de cambiar la pipeta cada vez que maneje una dilución distinta.
MATERIAL Y REACTIVOS
Muestras: Aguamiel o pulque y uvas.
1 MEM de 250ml con 100 ml de Agar Nutritivo 1 MEM de 250ml con 100ml de PDA 6 Tubos con 9 ml de disolución salina estéril (NaCl 0.85 %). 8 Cajas de Petri estériles. 8 Pipetas de 1 ml estériles. 1 Tubo con 5ml de caldo Saboraud Dextrosa 1 Tubo con 5ml de caldo Nutritivo 1 Tubo con Agar Nutritivo inclinado 1 Tubo con PDA inclinado Portaobjetos Cubreobjetos Colorantes. (Tinción de Gram).
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PROCEDIMIENTO
1. Ponga a fundir el agar y manténgalo entre 45-50 0C.
2. Desenvuelva las cajas de Petri y colóquelas cerca del mechero.
3. Marque los tubos con disolución salina y las cajas de Petri de acuerdo a la dilución que van a contener.
4. Agite vigorosamente la muestra, asegurando que la muestra sea uniforme.
5. A partir de la muestra y con ayuda de una pipeta estéril (Pipeta No.1), coloque 1ml de la misma en la primera caja de Petri (Caja No.1) y 1ml en el primer tubo (tubo No.1) de dilución para obtener así la dilución de (1:1)
6. Agite cuidadosamente este tubo (dilución 1:10), y utilizando otra pipeta estéril (Pipeta No.2), coloque 1ml de la muestra diluida en la segunda caja (Caja No.2) y 1ml en el siguiente tubo (Tubo No.2).
7. Proceda en igual forma para el último tubo de dilución y las dos cajas de Petri restantes, para obtener así diluciones 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000.
8. Vierta en condiciones de asepsia el agar dentro de las cajas de Petri y mezcle
cuidadosamente las muestras con el agar, haciendo girar suavemente la caja en forma de 8 sobre la superficie de la mesa de trabajo. Evite que el agar salga por encima del borde de la caja.
9. Deje solidificar las placas sobre una superficie plana.
10. Incubar en posición invertida a 37 °C/24-48 h (L. mesenteroides) y a 28°C/3 días
(S. cerevisiae).
11. Observe el crecimiento de las colonias.
Las colonias de Leuconostoc mesenteroides son colonias mucoides y pegajosas, las de
Saccharomyces cerevisiae son blancas y umbilicadas.
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1 ml 1 ml 1 ml
Tubos con 9 ml de sol´n salina estéril
Muestra 1mL 1 ml 1 ml 1 ml
Figura 1.3. Procedimiento para realizar la dilución y siembra en placa en condiciones
de asepsia
Observe las características de las colonias aisladas (forma, tamaño, color); haga esto sin quitar la tapa de la caja.
Seleccione una colonia de cada medio de cultivo y realice un preparación en fresco con azul de lactofenol para S. cerevisiae y una tinción Gram para L. mesenteroides y observe al microscopio la morfología.
De las colonias seleccionadas, tomar una asada y sembrar por agitación en un tubo con medio líquido.
Tomar otra asada y sembrar por estría en un tubo con agar inclinado.
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a) b)
Figura 1.4 a) Siembra por estría en un tubo de Agar inclinado; b) Siembra por agitación en medio líquido en condiciones de asepsia.
Incube a 37 0C / 24-48 h, de esta forma tendrá un cultivo puro de la bacteria de interés.
Incube a 28ºC/3 días, de esta forma obtendrá un cultivo puro de levaduras.
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AISLAMIENTO DE Aspergillus oryzae
El aislamiento de Aspergillus oryzae se realiza a partir de muestras comunes en el medio
ambiente tales como lo son la tierra, agua, aire, entre otras.
El método más utilizado para su aislamiento es la inoculación y transferencia que al igual
que el método anterior, sirve para aislar microorganismos a partir de cultivos mixtos, basándose también en la obtención de colonias aisladas y en las diferentes características de las mismas, difiere de la dilución y siembra en placa en que el medio de agar es inoculado mientras aún está líquido, en forma tal que las colonias se desarrollan en todo el medio.
El primer problema que debe resolverse en éste método, es la obtención de
concentraciones apropiadas de células microbianas en las placas, debe evitarse la obtención de placas con una gran cantidad de colonias, como placas sin ninguna colonia, las cuales no serían útiles para nuestros fines. Por lo cual deben prepararse siempre varias diluciones de la muestra.
La utilización de una asada de la muestra para inocular el primer tubo, proporciona por lo general placas con un número apropiado de colonias.
MATERIAL
Muestra: Tierra 3 Tubos de 15 ml de PDA 1 Tubo con PDA inclinado 1 Tubo con caldo Saboraud Dextrosa 3 Cajas de Petri estériles Portaobjetos Cubreobjetos Colorantes
PROCEDIMIENTO
1. Funda en baño de agua 3 tubos con 15 ml de PDA y déjelos enfriar hasta 45 0C. 2. Tome ahora una asada de la muestra e inocule el primer tubo de PDA, que se habrá marcado previamente, mezcle bien el inóculo, por rotación o golpeando el tubo con el dedo índice. 3. Esterilice el asa y tome dos asadas del tubo inoculado para transferirlas al segundo tubo y repita la agitación. 4. Esterilice el asa y transfiera ahora tres asadas del tubo número dos al tercero, mezcle bien, los pasos anteriores deben ser realizados con rapidez para evitar que el medio solidifique en los tubos.
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5. Vierta en condiciones de asepsia cada uno de los tubos inoculados en la caja Petri correspondiente, distribuya uniformemente y deje solidificar. 6. Incube las tres placas en posición invertida durante 3 a 5 días a 28°C. 7. Observe las características de las colonias desarrolladas, en cuanto a forma, tamaño, color, y localización en el medio de cultivo, haga esto sin destapar la caja Petri, si la abre hágalo cerca de la flama del mechero. 8. Seleccione dos colonias aisladas de diferente tipo, haga una preparación en fresco con azul de lactofenol. 9. A partir de las colonias anteriores siembre de una de las colonias por estría en PDA inclinado, y otra en tubo con caldo Saboraud Dextrosa, incube de 3 a 5 días a 28°C, de esta forma tendrá un cultivo puro del hongo de interés.
a) b)
Figura 1.5 a) Siembra por estría en un tubo de PDA inclinado; b) Siembra por agitación en un tubo con caldo Saboraud Dextrosa en condiciones de asepsia.
Reporte Dibujos de los campos observados
Muestra: ______________________________ Características de las colonias: _____________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ Preparación: ___________________________ Objetivo: ______________________________ Morfología microscópica: __________________ ______________________________________ _______________________________________
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Tubos con 15 mL de medio fundido y manteniendo a 45°C
1 Asada 2 Asadas 3 Asadas
Tubo #1 Tubo # 2 Tubo # 3
Cultivo en caldo, Verter en las cajas Petri después de haber mezclado bien la bien mezclado muestra en el tubo con PDA fundido
Dilución # 1 Dilución # 2 Dilución # 3
Observación microscópica
Figura 1.6. Procedimiento para realizar la técnica de Inoculación y Transferencia en condiciones
