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mx

Tecnología en salud

Vol. 2, Núm. 2
Mayo-Agosto 2013

Fundamentos de la reacción en cadena pp 70-78

de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real

Tamay de Dios L,* Ibarra C,** Velasquillo C*

* Laboratorio de Biotecnología, Resumen

Centro Nacional de Investiga-
ción y Atención a Quemados. A tres décadas de su aparición, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas
Instituto Nacional de Rehabi- en inglés) es una de las herramientas tecnológicas más innovadoras para el estudio de los
litación (INR), México, D.F.
ácidos nucleicos. Se caracteriza por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y
** Unidad de Ingeniería de
Tejidos, Terapia Celular y eficiencia, que genera resultados confiables en poco tiempo y fáciles de analizar. Por ello,
Medicina Regenerativa. INR. se ha convertido en el método de elección de muchos investigadores para los estudios ge-
néticos y de biología molecular. En esta revisión nuestro objetivo es introducir al lector a los
Dirección para correspondencia: fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa, así como a la reacción en cadena
M. en C. Lenin Tamay de Dios. de la polimerasa en tiempo real; dos técnicas que parten de un principio similar, pero que
Avenida México-Xochimilco Núm.
289 Col. Arenal de Guadalupe,
son metodológicamente diferentes; la primera genera resultados cualitativos mientras la
14389, Tlalpan, México DF. segunda cuantitativos.
E-mail: [email protected]
Abstract
Este artículo puede ser consultado
en versión completa en: After three decades of discovering utility of polymerase chain reaction, its methodol-
http://www.medigraphic.com/rid
ogy has become one of the most employed tools for the study of nucleic acids. This is a
top sensitive, highly reproductible, very efficient and short time consuming technology
Palabras clave: PCR, Taq ADN
Polimerasa, PCR en tiempo that allows to obtain reliable and easy to evaluate results. Objectives of this paper deal
real, SYBR Green, Taqman. with fundamentals of both techniques standard polymerase chain reaction as well as the
polymerase chain reaction on real time. Results produced by standard polymerase chain
Key words: PCR, Taq DNA reaction are qualitative, while those produced by polymerase chain reaction on real time
Polymerase, Real Time PCR, are quantitative.
SYBR Green, Taqman.

Introducción métodos sensibles y reproducibles que les permitan

estandarizar protocolos experimentales para estudiar
La gran complejidad de los procesos biológicos en los los ácidos nucleicos. Es así como han ido apareciendo
seres vivos ha sido por años la razón por la que los diferentes tecnologías cuyos protocolos están dirigidos
investigadores han centrado su atención en descifrar al estudio del ADN; probablemente, la más importante
los mecanismos que se esconden detrás de esos pro- sea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por
cesos. Desde las primeras observaciones de Gregorio sus siglas en inglés), desarrollada por Kary Mullis1 y que
Mendel hasta la actualidad, se tiene la noción de que revolucionó la biología molecular y la forma en cómo
parte de la explicación de los diferentes fenómenos se estudiaban los ácidos nucleicos en ese momento.

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biológicos se encuentra escondida en lo más recón-
dito del genoma celular y que una de las claves para
Actualmente sabemos que la misión de la PCR
es copiar millones de veces una secuencia especí-
entender dichos fenómenos es el estudio de los ge- fica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis
nes. Uno de los descubrimientos más importantes de llevada a cabo por una enzima conocida como ADN
la historia que marcó el inicio de una nueva era en el polimerasa, de tal manera que cantidades pequeñas
estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos fue el de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmen-
de Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN1 te para analizarse con diferentes fines. El desarrollo
(ácido desoxirribonucleico). Desde entonces, varios de esta técnica permitió estudiar y manipular mejor
grupos han mostrado un gran interés por desarrollar al ADN, facilitando el establecimiento de protocolos

70 Revista de Investigación en Discapacidad

 Tamay de Dios L y cols.

experimentales en biología molecular. El progreso de el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora
esta técnica ha sido muy notable y ha ido en paralelo o buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en
con los nuevos retos para estudiar y comprender mejor tres etapas principales de las que se compone la PCR:
el rol de los genes, tanto en condiciones fisiológicas desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos
como patológicas. Es por ello que una de las formas en donde se realiza la reacción son llamados termoci-
recientes para detectar y cuantificar a los ácidos nu- cladores, los cuales están diseñados para establecer
cleicos es a través de la PCR en tiempo real, la cual un sistema homogéneo en donde las condiciones de
es una modalidad de la PCR considerada como una temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen
técnica cuantitativa. en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para
Hoy en día, la PCR se aplica en diferentes áreas de corroborar si se amplificó la secuencia blanco de
las ciencias biológicas y de la salud, formando parte interés, los productos de la PCR o también llamados
del quehacer científico de muchos laboratorios de amplicones son analizados en geles de agarosa para
investigación que la utilizan principalmente para expre- confirmar si la reacción fue exitosa. A continuación
sión génica, genotificación, detección de patógenos y se explicarán cada uno de los puntos mencionados.
análisis de mutaciones. En esta revisión se hace una
descripción de los fundamentos de la PCR conven- ¿Qué elementos químicos se necesitan?
cional o también conocida como punto final; además
se explica qué se necesita para que la reacción sea El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya natu-
exitosa, cómo se lleva a cabo y cómo se analizan los raleza química ofrece ventajas para su manipulación.
resultados. Finalmente, introducimos al lector a la PCR Para entrar en contexto, es importante recordar que la
en tiempo real con la finalidad de que comprenda las molécula de ADN está formada por tres componentes:
diferencias básicas con la PCR punto final. un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada (adenina, timina, guanina o citosina) que
Fundamentos es complementaria con la base de otra cadena (Figu-
ra 1), de tal forma, que el ADN se estructura en una
¿Qué es la PCR? doble hélice.3 La complementariedad entre las bases
está dada por puentes de hidrógeno e interacciones
La reacción en cadena de la polimerasa es una reac- hidrofóbicas, generando estabilidad a la doble hélice,
ción enzimática in vitro que amplifica millones de veces la carga eléctrica del ADN es negativa y está dada por
una secuencia específica de ADN durante varios ciclos los grupos fosfatos. En la PCR, el templado son las
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada cadenas de ADN que se separan y funcionan como
fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad molde para que la enzima sintetice las nuevas cade-
de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad nas que llevan la secuencia blanco de interés. Por su
de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de
la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, la reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN
entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4 que
ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce proviene de una bacteria termófila llamada Thermus
como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura
siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de so-
una reacción conocida como transcripción reversa y portar ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue
controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz a esta enzima bacteriana de otras ADN polimerasas
de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este de otros organismos es su capacidad para mantener

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método fue copiado de los retro virus que usan una
transcriptasa reversa para convertir su genoma de
su funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se
le considera una enzima termoestable. También hay
ARN en ADN duplicarse en millones de partículas otras enzimas que se utilizan como la Vent, obtenida
virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la ex- de la bacteria Thermococcus litoralis.5 Normalmente,
presión del ARNm de algún gen de interés. casi todas las enzimas que se venden comercialmente
Los elementos importantes en la reacción son el son eficientes y generalmente cuando fallan lo hacen
templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligo- por una manipulación incorrecta del usuario. Para que
nucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifos- la enzima funcione con alta especificidad y la reacción
fatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), transcurra exitosamente, también se necesita de los

Volumen 2 Número 2 Mayo-Agosto 2013 71

 Fundamentos de PCR y PCR en tiempo real

elementos ya mencionados como primers, dNTPs, Mg 1X. También se usan otros buffers de composición
+, buffer y H2O. distinta que son fácilmente comprados en el mercado.
Los primers son secuencias de oligonucleótidos El magnesio es un cofactor enzimático que influye en
que flanquean y delimitan la secuencia blanco que la especificidad de la reacción, por eso se debe tener
se desea amplificar y son complementarios a ésta. una concentración adecuada para que no afecte el
Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su
bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% concentración oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones
de la secuencia. Si no se respetan estas reglas, existe ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene
la posibilidad de la formación de dímeros de primers, que agregar. El agua es el disolvente en la reacción y se
es decir, de productos inespecíficos. Esto repercutiría usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas
en el rendimiento de la reacción, así como en la espe- que degradan a los ácidos nucleicos.
cificidad del producto esperado. Son dos secuencias
diferentes de primers las que se utilizan en la PCR, ¿Cómo funciona la reacción?
una denominada «forward» o sentido y otra «reward»
o antisentido; ambas deben estar diseñadas para que Recordemos que cada ciclo de la PCR se lleva a
hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan cabo en tres etapas principales: desnaturalización,
ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3 hibridación y extensión (Figura 2). A continuación
(como sucede endógenamente). Con la finalidad de explicaremos qué sucede en cada una.
garantizar la formación de un complejo estable entre el Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de
templado y los primers, hoy en día existen programas ADN son calentadas y separadas a una temperatura de
informáticos para diseñar primers con alta especificidad, 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de
por lo que se evita la formación de productos inespe- la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de
rados. Incluso, hay laboratorios de biología molecular G-C es alta, será necesario más tiempo para romper
que se dedican a diseñarlos, sintetizarlos y validarlos sus uniones debido a que el apareamiento de estas
para garantizar su especificidad, facilitándole el trabajo bases está formado por tres enlaces, uno más que las
al usuario que sólo elige el de su interés y los manda bases de A-T. Además, depende de la velocidad en
a comprar. Por su parte, los dNTP’s son los ladrillos la que el termociclador aumenta la temperatura, esto
o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa varía de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta
construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores etapa tendremos las cadenas separadas que servirán
importantes que contribuyen a la especificidad de la como templado para el siguiente paso.
reacción, por ello es importante que su concentración Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean
sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la al extremo 3’ del templado previamente separado e
función de la Taq polimerasa. Normalmente, se utilizan hibridan con su secuencia complementaria. Para que
a una concentración que oscila entre 0.2 a 1.0 mM. El se forme el complejo templado-primers, es importan-
buffer es la solución amortiguadora que se usa en la te que la temperatura de hibridación o temperatura
reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila
(pH = 8) cuya concentración final de trabajo debe ser entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el co-

Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar

Figura 1.
A C T G
Base
nitrogenada www.medigraphic.org.mx Molécula de ADN de do-
ble cadena. Cada cadena
T G A C está formada por un azúcar,
un grupo fosfato y una base
nitrogenada que es comple-
Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar mentaria con otra cadena: A
= adenina, T = timina, C =
Fosfato Fosfato Fosfato citosina y G = guanina.

72 Investigación en Discapacidad
 Tamay de Dios L y cols.

rrecto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad pesos moleculares para elegir el de nuestro interés.
y especificidad del complejo será eficiente. Finalmente, la visualización de los amplicones se
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa lleva a cabo tomando una foto digital al gel de agaro-
sobre el complejo templado-primers y empieza su sa expuesto a luz UV (Figura 3); adicionalmente un
función catalítica a una velocidad muy rápida; agre- procesador de imágenes se encarga de analizar las
ga dNTP’s complementarios para crear las cadenas bandas observadas.
completas de ADN. La extensión de las cadenas es en La combinación adecuada de todos los elementos
dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. químicos mencionados hacen posible la síntesis in
La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, vitro del ADN utilizando la PCR. Los cambios que ha
ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al sufrido la PCR como plataforma tecnológica han sido
final del ciclo, se habrán formado los amplicones con muy notables; conforme los paradigmas de estudio de
un tamaño dictado por el número total de pares de ba- los ácidos nucleicos han ido cambiando, la necesidad
ses (pb) que deberá ser conocido por el investigador. de ir mejorando la técnica se convirtió en una prioridad
para los investigadores; es por ello que la PCR ha su-
¿Cómo se analiza el producto frido modificaciones para ofrecer una tecnología más
de amplificación? innovadora apegada a los retos inherentes que implica
el estudio del ADN. Actualmente, el panorama de la
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió PCR promete estar a la altura de los objetivos de los
eficientemente, los amplicones son visualizados a investigadores, tan es así que ahora la modalidad de
través de una electroforesis en geles de agarosa.6 La la PCR en tiempo real ofrece la gran ventaja de usar
electroforesis consiste en la separación de grandes un sistema cuantitativo.
moléculas como los ácidos nucleicos a través de una
matriz sólida que funciona como un filtro para separar PCR en tiempo real: fundamentos
las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su
tamaño y carga eléctrica. Esta separación se hace Los primeros que sentaron las bases para desarrollar
bajo un buffer o tampón que puede ser TAE o TBE. la PCR en tiempo real fueron Higuchi y colaboradores,
En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les en 1992, al videograbar en tiempo real la incorpora-
proporciona la carga negativa, por lo que durante la ción de bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo
electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, de la PCR realizada bajo luz UV.7 Desde entonces, el
se prepara un gel diluyendo una cantidad de agarosa
en el buffer, se calienta hasta que la agarosa hierva
lo suficiente y posteriormente se vacía a un recipiente 3’ 5’
que sirve de base para que solidifique. Generalmente ADN o ADNc
el porcentaje al que se prepara el gel es al 1.2% aun-
Primers 5’ 3’
que, dependiendo del tamaño de las moléculas, puede
ser de hasta el 2%. Otro ingrediente que se agrega Taq Polimerasa
Desnaturalización
al gel es un compuesto conocido como bromuro de Cadena 95 oC
etidio, una molécula intercalante capaz de unirse al naciente
ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz
dNTP’s
UV emite una señal que permite la visualización de
Mg+ Hibridación
los amplicones en forma de bandas. Es importante 50-60 oC
manipular con mucho cuidado este compuesto porque
se sabe que es mutagénico y teratógeno.
5’ 3’
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Cuando los amplicones son corridos en el gel, éstos
deben ser cargados junto con un marcador molecular
que contenga un número determinado de segmentos
5’ Extensión 72 C
o
de ADN conocidos, lo que facilita la identificación 3’
de los amplicones y si su tamaño corresponde con
el esperado. El tamaño está dado por el número de
pares de pases del amplicón. El marcador de peso Ciclos siguientes
molecular es fácilmente adquirido en el mercado, ya
que se ofrece una gama de marcadores con distintos Figura 2. Pasos de un ciclo de la PCR.

Volumen 2 Número 2 Mayo-Agosto 2013 73

 Fundamentos de PCR y PCR en tiempo real

Marcador
conocido
Figura 3.
PB
Gel de agarosa. Los produc-
tos de la PCR o amplicones
500 están representados median-
400 te bandas de un tamaño es-
Este
Es te documento
doc
ocum
umen
ento eess el
eelaborado
lab
a or
o addo porr Medi
Medigraphic
d graphic
pecífico y se comparan con
300
un marcador de peso mole-
cular conocido para deter-
200 Amplicón
minar la especificidad de la
Amplicón reacción. PB = número de
100 Amplicón
pares de bases.

objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar y Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo
cuantificar las secuencias específicas de ácidos nu- real, son los mismos utilizados en la PCR punto final,
cleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes sólo que generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el
en la reacción. buffer y el sistema reportero de fluorescencia para
El principio de la técnica se basa en la PCR punto detectar los productos amplificados se venden juntos
final, sólo que la forma en cómo se detectan y anali- en una solución conocida como «Master mix», el
zan los productos de la amplificación es diferente. El agua es proporcionada por separado y también es
término en tiempo real se refiere a que la detección libre de nucleasas. Los primers deben ser diseñados
de los productos amplificados sucede en cada ciclo especialmente para garantizar una alta especificidad
de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo y para que generen amplicones de un tamaño que
hace referencia a que es posible cuantificar la can- oscile entre 100-150 pb; si éstos son más grandes, la
tidad de ADN en la muestra, a diferencia de la PCR eficiencia de la reacción disminuye considerablemente.
punto final en donde no es posible detectar en tiempo Para evitar estos problemas, una alternativa es diseñar
real ni cuantificar la secuencia blanco. Precisamente, los primers, utilizando programas informáticos dispo-
estas últimas dos características representan grandes nibles, o comprarlos ya validados de las compañías
ventajas de la PCR en tiempo real, ya que el producto de biología molecular, quienes garantizan resultados
de amplificación es monitoreado conforme transcurre altamente eficientes y satisfactorios para los usuarios.
la reacción8 sin que haya la necesidad de que sea
manipulado en un gel de agarosa para conocer si la ¿Cuáles son los métodos para detectar
reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto los productos amplificados?
final. La nomenclatura que se usa también es diferen-
te, si utilizamos ADN genómico entonces hablamos El monitoreo de los productos amplificados conforme
de una qPCR (quantitative PCR), si por lo contrario, transcurre la reacción es un paso importante en la PCR
primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, en tiempo real, para ello la estrategia tecnológica que
nos referimos a una RT-qPCR.9 ha dado buenos resultados es los sistema basados en
Actualmente, la PCR en tiempo real es el método reporteros fluorescentes. En general, estos sistemas
más sensible para detectar y cuantificar los ácidos pueden ser clasificados en dos métodos diferentes:

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nucleicos. Aun teniendo una cantidad muy pequeña
de templado, el sistema garantiza una alta sensibilidad,
específicos y no específicos.10
Los métodos no específicos se basan en el uso
especificidad y eficiencia. Una de sus aplicaciones más de moléculas intercalantes que tienen afinidad por el
usadas es para cuantificar cambios muy pequeños en la ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan
expresión génica mediante la detección de los niveles una señal fluorescente. La fluorescencia emitida es
del ARNm procedente de células o tejidos. La cantidad capturada en la etapa de extensión de cada ciclo y es
de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a proporcional al número de copias de ADN de doble
partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR, cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El reportero
punto final que necesita una mayor concentración. más usado para estos fines se llama SYBR Green,11

74 Investigación en Discapacidad
 Tamay de Dios L y cols.

la cual es una molécula cargada positivamente que, mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco.
mientras esté en solución sin unirse al ADN de doble Cuando hibrida, ocurren cambios conformacionales en
cadena, prácticamente no emite fluorescencia; sin el reportero y el quencher, lo cual permite que la acti-
embargo, cuando se une al surco menor del ADN in- vidad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa
crementa hasta 1,000 veces su fluorescencia (Figura esta unión, logrando que la fluorescencia emitida por
4). Aunque el SBYR Green es uno de los reporteros el reportero sea liberada y capturada por el equipo.
fluorescentes más utilizados por los investigadores Estos métodos son muy seguros, ya que mientras no
debido a su bajo costo, la principal desventaja es que haya unión de la sonda a su blanco, no habrá am-
puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble plificación y tampoco señal de fluorescencia; es por
cadena, incluyendo dímeros de primers. Muchos la- eso que la especificidad es muy alta. Un ejemplo de
boratorios, para evitar esta situación, optimizan sus estos sistemas son las sondas comerciales conocidas
reacciones realizando una «curva melting» o «curva como TaqMan12 (Figura 5), aunque existen otras en
de disociación» al final de la reacción, cuya función el mercado.
es la de evaluar si se formó un producto único o si Los métodos por hibridación consisten en una
hay presencia de dímeros de primers. Hoy en día la sonda unida a un reportero fluorescente que está en
mayoría de los software de los termocicladores ofrecen estrecha proximidad con un aceptor fluorescente unido
esta función que es fácil de aplicar y analizar. a otra sonda. Tanto el reportero como el aceptor pre-
Los métodos específicos parten de principios dis- sentan un espectro de excitación y de emisión similar,
tintos a diferencia de los no específicos y tienen en de tal forma que cuando las dos sondas hibriden a su
común la señal de fluorescencia emitida para detectar templado blanco, el reportero es excitado y la señal
los productos amplificados. Estos métodos siguen el emitida es transferida al aceptor, generando un incre-
principio conocido como «transferencia de energía de mento en la cantidad de fluorescencia. Un ejemplo de
resonancia fluorescente» (FRET, por sus siglas en este método son las sondas molecular Beacons13 que
inglés) para generar la señal; este método consiste también son comerciales.
en transferir energía desde un donador o reportero Los métodos específicos son más costosos que los
fluorescente a un aceptor o «quencher». Para ello, no específicos, pero son más eficientes al garantizar la
existen dos métodos específicos, éstos son: pruebas especificidad de la reacción, evitando la formación de
basadas en hidrólisis y por hibridación. Los primeros productos inespecíficos. Cualquiera que sea el método
se basan en sondas fluorescentes de oligonucleóti- que se aplique, se pueden adquirir fácilmente, ya que
dos etiquetados con un reportero fluorescente y un la gama de sondas para desarrollar, tanto los métodos
«quencher», ambos se encuentran en estrecha unión específicos como los no específicos, es amplia.

3’ 5’
ADN o ADNc
Primers Hibridación
Cadena naciente R Q
SYBR Green ADN o ADNc
5’ 3’
Primers 3’ 5’ Hibridación
Energía de excitación
Cadena
Energía naciente 5’ 3’
de emisión
R Q Sonda Taqman
SYBR Green R Q
fluorescente 480
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520 Extensión
Taq Polimerasa
Energía R Q
de emisión
Extensión

Figura 4. Método no específico. Cuando el SYBR Green

está unido al ADN de doble cadena, es excitado a una
longitud de onda de 480 nm, mientras que la longitud Figura 5. Método específico mediante la utilización de
de onda de emisión corresponde a 520 nm. las sondas Taqman.

Volumen 2 Número 2 Mayo-Agosto 2013 75

 Fundamentos de PCR y PCR en tiempo real

¿Cómo se captura la señal de fluorescencia? ¿Cómo se analizan los resultados?

Cualquiera de los métodos que se utilicen para No es suficiente con detectar la amplificación en
detectar los productos amplificados en cada ciclo tiempo real y capturar la fluorescencia de cada
de la reacción necesita de la tecnología incluida en muestra, el análisis de la reacción es el paso final
los termocicladores de PCR en tiempo real para: a) para determinar la cuantificación génica. Para ello,
excitar al reportero, b) capturar la señal de emisión los termocicladores están proveídos de una PC con
del mismo y c) realizar el análisis cuantitativo. En el un software que generalmente son fáciles de usar.
mercado existen diferentes tipos de termocicladores Este software genera una serie de gráficas en donde
para esta finalidad, cuyas diferencias principales son se muestran todos los datos necesarios para conocer
la fuente de energía que utilizan para la excitación. si la reacción fue exitosa. Una de estas gráficas es la
En general son tres las fuentes: las lámparas de de amplificación (Figura 6) que muestra el curso y el
luz, diodos de emisión de luz (LED, por sus siglas progreso de la reacción, otra gráfica es la curva de
en inglés) y láseres. Cualquiera que sea la fuente, disociación o curva melting (Figura 7) que muestra
primero el reportero es excitado y su señal de emi- información sobre la especificidad de la reacción.
sión colectada a través de un filtro que permite el Otro paso importante del análisis es elegir el tipo de
paso de la longitud de onda correspondiente que cuantificación que se usará para determinar la ampli-
llega hasta un fotodetector que captura la informa- ficación precisa del blanco génico; este procedimiento
ción proveniente de la muestra para su análisis en depende de los intereses del investigador. Para ello
el software del equipo. Otros rasgos característicos existen dos tipos de cuantificación: la absoluta y la
son las velocidades para incrementar o disminuir relativa. La primera generalmente se utiliza para
las temperaturas en cada etapa de la reacción, el conocer el número exacto de copias amplificadas
número de muestras que puede soportar, los con- del blanco o la concentración precisa de ácidos
sumibles para la reacción y los kits que se utilizan nucleicos en una muestra. En la práctica, este tipo
para la amplificación; en algunos casos sólo se usan de cuantificación se usa para medir la carga viral
reactivos del proveedor del termociclador, es decir, o bacteriana en diferentes tejidos. La segunda se
son sistemas cerrados y en otros casos, se pueden aplica cuando se desean evaluar los cambios en la
utilizar reactivos de diferentes proveedores, es decir, expresión de genes en distintos estados fisiológicos.
son sistemas abiertos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del

8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
Fluorescencia

4.5
4.0
3.5 Figura 6.
3.0
2.5
2.0
www.medigraphic.org.mx
www
w.meddigrapphic.org.mxx Curva de amplificación. En el
eje «Y» se muestra la cantidad
de fluorescencia y en el eje
1.5 «X» los ciclos de la reacción.
1.0 La amplificación se detecta
0.5 en cada ciclo de la reacción,
midiendo el incremento de la
5 10 15 20 25 30 35 fluorescencia que es propor-
Ciclos cional al aumento de ADN.

76 Investigación en Discapacidad
 Tamay de Dios L y cols.

Melting Peaks

1.384
1.284
1.184
-(d/dT) Fluorescencia (530)

1.084
0.984
0.884
0.784
0.684
0.584
0.484
0.384
0.284
0.184
0.084
-0.016

50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Temperatura (°C)
Figura 7. Se puede observar un único pico de amplificación que corresponde a la curva de disociación o curva mel-
ting que indica la especificidad de la reacción, es decir, que los amplicones que se formaron son del tamaño espera-
do. La línea de abajo corresponde al control negativo, el cual no amplificó.

gen blanco comparados con un gen de referencia confiables y reproducibles. Por todo ello, difundir los
(gen housekeeping) que no cambia su expresión a fundamentos de la PCR es un primer paso para cono-
pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen cer una de varias herramientas tecnológicas con las
por diversas causas. Los datos son expresados que se cuenta para el estudio de los ácidos nucleicos.
como relativos al gen de referencia y generalmente
son referidos como el número de veces en el que Bibliografía
aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm
o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que 1. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain
sea el tipo de cuantificación que se elija, casi todos reaction. Sci Am. 1990; 262: 56-61.
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ción biomédica nos abren la posibilidad de conocer Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in PCR
nuevas herramientas tecnológicas para afrontarlos determined by denaturing gradient gel electrophoresis.

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experimentalmente. Es por eso que la PCR es una de Nucleic Acids Res. 1991; 19: 4193-4198.
esas herramientas que se ha desarrollado para ofrecer 6. Lee PY, Costumbrado J, Hsu CY, Kim YH. Agarose gel
una alternativa para el estudio de los ácidos nucleicos. electrophoresis for the separation of DNA fragments. J
Vis Exp. 2012; 62: 3923.
Tal fue su impacto en la comunidad científica que hoy
7. Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. Simul-
en día es una técnica que se usa a diario en muchos taneous amplification and detection of specific DNA
laboratorios y que se incrementó cuando apareció sequences. Biotechnology. 1992; 10: 413-417.
la modalidad de PCR en tiempo real, permitiendo el 8. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic
establecimiento y la aplicación de nuevos protocolos PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification
experimentales más precisos que generan resultados reactions. Biotechnology. 1993; 11: 1026-1030.

Volumen 2 Número 2 Mayo-Agosto 2013 77

 Fundamentos de PCR y PCR en tiempo real

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