Manual de Bioquímica Clínica 2024-2

Laboratorio de Bioquímica Clínica
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDICIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUIMICA CLÍNICA
El presente manual fue elaborado por:

M. en E. Leonor Patricia Rodríguez Pascual
M. en C. Rodrigo Martínez Zúñiga
Biol. Gerardo Rodríguez Muñoz
M. en C. Ilse Jazmín Arciniega Carreón
Dr. Oscar Alberto López Canales
M. en C. Alberto Castillo Ortiz
M. en C. Edgar Hernández Martínez
Segunda Edición. Versión de febrero 2024
NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________________________
GRUPO ____________________ EQUIPO _______________
1
INDICE
ÍNDICE 2
PROLOGO 3
ORGANIZACIÓN Y SEGURIDAD DE LOS ALUMNOS EN EL LABORATORIO 4
EVALUACIÓN 5
INFORMACIÓN DE TOMA DE MUESTRA DE SANGRE 6
Práctica 1. Seguridad en el laboratorio clínico 7

Práctica 2. Desarrollo de un método espectrofotométrico para la
determinación de albúmina en suero humano 15
Práctica 3. Electroforesis de suero 27
Práctica 4. Uso de enzimas en el diagnóstico clínico: perfil cardiaco y perfil
hepático 35
Práctica 5. Glucosa en suero humano: curva de calibración 43
Práctica 6. Obtención de valores de referencia de triglicéridos y colesterol en
suero humano 52
Práctica 7. Determinación de urea, creatinina y ácido úrico 62
Práctica 8. Determinación de hormona gonadotropina coriónica 69
Práctica 9. Equipos biomédicos en el laboratorio 75
Apéndice A. Uso de las pipetas automáticas 83

Apéndice B. Elaboración de diagrama de actividades o procedimientos 85
Apéndice C. ¿Cómo escribir el reporte? 86
Apéndice D. Preparación de reactivos 90
2
PRÓLOGO
El curso de laboratorio de Bioquímica Clínica tiene como objetivo capacitar al estudiante en el

manejo de sustancias, métodos y equipos utilizados en el área de Bioquímica, de manera que al finalizar
el curso pueda desarrollar procesos bioquímicos y en el futuro pueda implementarlos en su vida
profesional.
El manual está integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del curso
teórico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este manual
fueron:
1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico.
2) Que fuera lo más simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3h.
3) Que fuera de utilidad para sus cursos posteriores y para su vida profesional.
Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo experimental de
la práctica, así como los antecedentes teóricos necesarios para la comprensión de cada uno de los
experimentos. Se pretende además que el estudiante sea capaz de analizar e interpretar el significado
de los resultados obtenidos, de una manera crítica y racional.
Para alcanzar estos objetivos es necesario que el estudiante:
a. Lea sus experimentos antes de ejecutarlos.
b. Realice cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqué de los hechos.
c. Realice observaciones minuciosas y críticas de los experimentos.
d. Anote sus observaciones y busque la explicación científica.
e. Que debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para aclarar
dudas y comprender el porqué de las operaciones que se han de ejecutar.
Con el fin de realizar análisis y discusión de sus resultados, el estudiante puede consultar las
referencias recomendada al final de cada práctica o bien la sugerida al inicio del curso.
Este manual no sustituye a la participación y guía de los profesores en el desarrollo experimental,
ni a la discusión de los resultados obtenidos.
3
ORGANIZACIÓN Y SEGURIDAD DE LOS ALUMNOS EN EL LABORATORIO

1.- Se impartirá una sesión por semana de 3 horas, cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.
2.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el alumno
adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias.
3.- La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada para la práctica, con una tolerancia de 10 min.
4.- No habrá retardos y se pondrá falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata debidamente abrochada.
En caso de llegar tarde no se permitirá la entrada.
5.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin consentimiento del profesor, se
considera que no asistió a la práctica.
6.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo práctico para
evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
7.- Después de terminada la práctica, el material deberá ser entregado limpio a la persona encargada del almacén
del laboratorio y se deberá limpiar la mesa al iniciar y terminar la práctica.
8.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o personas responsables
de él.
9.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un lugar de
trabajo.
10.- Está prohibido el uso de celular durante la práctica, por lo que se le pide al alumno que lo apague durante la
explicación, desarrollo y discusión de esta.
11.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo que visiten a los
alumnos.
12.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir bebidas y masticar chicle
dentro del laboratorio.
13.- En caso de evacuación se seguirán las indicaciones del profesor y las flechas verdes de señalamiento en el
pasillo, que indican la dirección a la derecha (hacia el segundo estacionamiento frontal).
14.- El material biológico se manejará con guantes desechables. Los RBPI se depositarán en los recipientes
asignados. Las torundas con sangre se dispondrán en los desechos orgánicos (color verde)
15.- El desecho de residuos se realizará en los contenedores colocados para tal fin: Amarillo para papel; Azul para
valorizables (Plástico, metal, etc.); Verde para orgánicos y Gris para no valorizables.
16.- El alumno deberá lavarse las manos al iniciar y finalizar cada práctica.
17.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
• Una bata limpia y con botones, de algodón y manga larga.
• Este manual de laboratorio.
• Registro de laboratorio con fotografía de tamaño infantil
• El diagrama de flujo del procedimiento a seguir. Este es requisito para permitir la entrada
18.- Por equipo deberán traer:
• El material que indique el profesor al inicio del curso
4
EVALUACIÓN
1.-El programa oficial del curso, señala que el laboratorio representa el 30% de la calificación del curso, el curso
teórico representa el 70%.
2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere se requiere un 80% de asistencia a las sesiones prácticas y
obtener un promedio mínimo de seis.
3.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero. Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en la actividad
que se realiza en esa sesión. La falta justificada no cuenta para el cómputo final de asistencias, pero la calificación
se mantiene.
4.-El laboratorio se evalúa como sigue: Trabajo en la sesión 3.5 puntos
Discusión 3.0 puntos
Reporte de la práctica 3.5 puntos
5.- Se calificará con cero cualquiera de los aspectos que no se realice.
6. En el trabajo se evalúan:
Antecedentes (Elaboración del diagrama de flujo1) 0.5 puntos. Este es necesario para ingresar.
Limpieza en todos los aspectos 0.5 puntos
Organización (para trabajar en equipo) 1.0 puntos
Habilidad 1.0 puntos
Resultados obtenidos y registrados al momento 0.5 puntos
1 elaborar y llevar el diagrama de flujo del desarrollo práctico el día de la sesión de laboratorio. Después, pegar este diagrama
firmado en el reporte de la práctica.
7.- El alumno utilizará el manual de laboratorio obligatoriamente en cada sesión, apegándose a la metodología a
seguir, así como a las instrucciones del profesor.
8.- De manera obligada, los datos obtenidos en el momento de la práctica se anotarán en el manual de laboratorio,
como bitácora de trabajo. El profesor los revisará y firmará sobre el manual al finalizar la sesión. Los resultados
anotados en el manual y firmados por el profesor, serán fotocopiados y pegados en el reporte escrito de
la práctica.
9.- En la sesión de discusión de resultados el estudiante deberá traer sus datos y los cálculos que solicite el manual.
10.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión.
11. El reporte de la práctica se elabora con tinta, en un cuaderno tamaño profesional forrado del color que indique
el profesor, con una etiqueta grande en la parte superior derecha con el equipo, y en la parte inferior con el nombre
de los integrantes del equipo, subrayando el nombre del propietario del cuaderno.
12. En el reporte se evalúa:
Objetivo y referencias 0.5 puntos
Manejo de resultados 1.5 puntos
Discusión 1.0 puntos
Conclusiones 0.5 puntos
13. Cada profesor elegirá un reporte para evaluarlo y revisará que todos los alumnos miembros del equipo hayan
elaborado el reporte. Si no es así, el alumno que no lo presente tendrá cero en el reporte.
14. La elaboración del reporte es individual, de modo que, si bien los resultados son los mismos en el equipo, el
resto del reporte no podrá copiarse entre los miembros del equipo. Copiar reportes es un acto de deshonestidad
académica, que se sanciona con cero de evaluación.
15. Se asignará un punto extra a la tercera calificación parcial de laboratorio, a los alumnos que hayan entregado
el 100% de los reportes completos.
16. En el apéndice C se dan las instrucciones para la elaboración correcta de un reporte y la forma correcta
de referenciar la bibliografía.
5
INFORMACIÓN DE TOMA DE MUESTRA DE SANGRE
¿QUÉ ES Y PARA QUÉ SIRVE?

La toma de muestras consiste en recoger una muestra de sangre de su organismo y sirve para el
diagnóstico y análisis de metabolitos de interés clínico con fines didácticos.
¿CÓMO SE REALIZA?
1. Identificar y obtener datos del paciente
2. Seleccionar el sitio de la vena donde se realizará la punción y colocar torniquete con el fin de aplicar
presión en el área.
3. Limpiar zona con alcohol e introducir aguja, formando ángulo aproximado 15 ° brazo-aguja y con
bisel hacia arriba. Colocar dispositivo Vacutainer y tubo.
4. Colectar la muestra y retirar torniquete del brazo. Se saca la aguja y se cubre el sitio con una torunda
o bandita para detener el sangrado.
Nota: Este procedimiento será enseñado por un profesor con el objetivo de que los alumnos puedan
practicar la técnica entre ellos y al término del semestre adquieran la habilitad para obtener una muestra
de sangre en cualquier laboratorio clínico.
¿QUÉ RIESGOS EXISTEN?

En ocasiones será necesario reintentar puncionar más de una vez debido a la dificultad para ubicar la
vena y en algunos casos se produce un hematoma en la zona del pinchazo o picor, que desaparece en
dos semanas sin necesitar tratamiento. Puede sufrir un leve mareo a causa del ayuno realizado para el
estudio.
Nota: La cantidad de sangre extraída normalmente no es mayor a 5 mL y se recupera en unas horas.
Después de obtener la muestra, el alumno donador puede comer un lonche (5 min) para recuperar
energía y evitar mareos.
¿ALTERNATIVAS?
En caso de que el alumno no acepte el consentimiento para obtener la muestra, se reintegrará a otro
equipo que haya aceptado o se dará material biológico (muestra de otro donante) para su trabajo
práctico.
¿BENEFICIOS?
El alumno adquirirá al término del semestre la habilidad para obtener una muestra de sangre, esta
técnica podrá aplicarla en asignaturas futuras durante el estudio de su carrera o si es de su interés
trabajar en un laboratorio clínico. También al finalizar, tendrá la capacidad para realizar un análisis
bioquímico de los datos de un estudio clínico dentro de los valores de referencia en México.
6
PRÁCTICA 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO CLÍNICO
UNIDAD I: Introducción a la bioquímica clínica y estructura celular.
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
1.1.1. Aplicar las normas y medidas de seguridad en el laboratorio clínico.
1.2. Objetivos específicos.
1.2.1. Identificar las normas mexicanas relativas a la seguridad en un laboratorio clínico.
1.2.2. Aplicar las normas en el manejo de residuos peligrosos biológicos infecciosos.
1.2.3. Aplicar las normas para evitar daños al equipo y mejorar la calidad del trabajo
2. INTRODUCCIÓN
Los hospitales y los laboratorios de análisis clínico son áreas sujetas a riesgo debido al manejo de
sustancias químicas y agentes biológico-infecciosos. La seguridad en el laboratorio clínico se refiere a
analizar y prevenir el riesgo de accidentes, enfermedad o daño a las personas, equipos e instalaciones
La Ley Federal del Trabajo en su artículo 509 señala: “En cada empresa o establecimiento se
organizarán las comisiones de seguridad e higiene que se juzgue necesarias, compuestas por igual
número de representantes de los trabajadores y del patrón, para investigar las causas de los accidentes
y enfermedades, proponer medidas para prevenirlos y vigilar que se cumplan.
¿Cuáles son las funciones de la comisión? “Establecer un programa anual de verificación para
detectar condiciones peligrosas, de acuerdo con las incidencias, accidentes y enfermedades de trabajo
y a las áreas con mayores condiciones peligrosas.” Para ello, la ley establece que la comisión tiene un
coordinador de la comisión, que funge como responsable directo de la seguridad.
La ley se ejecuta bajo el Reglamento Federal de Seguridad y Salud del Trabajo, el cual establece que
los comités de seguridad e higiene de los centros de trabajo tienen entre sus funciones:
• Determinación de cuáles son los riesgos de trabajo
• Implementación de normas, reglamentos y leyes relativas a la seguridad para evitar accidentes
de trabajo.
• Capacitación del personal en la normatividad de seguridad, manejo de equipo y material del
laboratorio
• Establecer que equipos y vestuario de protección son necesarios
• Atención de emergencias
• Control ambiental y
• Orden y limpieza de área de trabajo con el fin de minimizar riesgos
Asimismo, el Programa de Hospital Seguro de la Coordinación Nacional de Protección Civil
dependiente de la Secretaría de Gobernación, a través de la NOM-016-SSA3-2012, indica que todos los
hospitales públicos o privados deberán contar con manuales de procedimientos y de organización para
el manejo de emergencias y desastres internos o externos.
7
Como ya se mencionó, es necesaria la capacitación del personal adscrito al laboratorio sobre la

aplicación de las Normas y Procedimientos de seguridad, las fuentes y causas de riesgos y la prevención
de los mismos, Las normas relacionadas con la seguridad de los espacios de salud son varias, pero se
han seleccionado para su revisión las más relevantes y las que tienen aplicación en el laboratorio de
bioquímica clínica.
La Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente, define como residuos peligrosos
a todos aquellos residuos que, por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas,
inflamables y biológico-infecciosas, representan un peligro para el equilibrio ecológico o el ambiente;
Estos residuos serán manejados en los términos que la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos
Naturales (SEMARNAT) determine a través de las Normas Oficiales Mexicanas.
La NOM-087-ECOL-SSA1-2002 es de observancia obligatoria para los establecimientos que generen
residuos peligrosos biológico-infecciosos y los prestadores de servicios a terceros que tengan relación
directa con los mismos. Esta norma señala los procedimientos para la separación, envasado,
almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos
biológicos infecciosos que se generan en establecimientos que presten atención médica o cualquier
establecimiento que genere residuos peligrosos biológicos infecciosos.
La NOM-087 define que residuos se consideran como RPBI y cuáles no lo son. Indica cómo se
clasifican los establecimientos generadores de residuos peligrosos biológicos infecciosos por niveles.
Indica las características de los lugares destinados al almacenamiento temporal, así como el tratamiento
correcto posterior de RPBI.
Por otro lado, los centros de trabajo que manejen sustancias químicas o sus mezclas deberán
considerar al PROY-NOM-005-STPS-2017, para atender el análisis de riesgos, los procedimientos de
seguridad, plan de atención a emergencias, capacitación al personal, el procedimiento para la evaluación
de la conformidad, y además tener en cuenta las guías de referencia relativas a la compatibilidad de las
sustancias químicas peligrosas o sus mezclas. La NOM también contempla el control por código de
colores, y la realización de un análisis de riesgos, con la finalidad de identificar, evaluar y generar
alternativas de control de los riesgos significativos asociados con sustancias químicas peligrosas o sus
mezclas manejadas en el centro de trabajo. La implementación de las medidas de seguridad en el
proyecto, tienen el propósito de reducir, eliminar, neutralizar o controlar el riesgo que se puede presentar
a los trabajadores y/o al centro de trabajo por el manejo de las sustancias químicas. También se precisan
los requerimientos para conformar el plan de atención de emergencias relacionado con el manejo de
sustancias químicas.
Finalmente, el PROY-NOM-005-STPS-2017 revisa los aspectos relacionados con la capacitación y
adiestramiento que se debe proporcionar al personal ocupacionalmente expuesto.
En la NOM-018-STPS-2015, se revisa el sistema armonizado de identificación de peligros y riesgos
por sustancias químicas peligrosas y mezclas en los centros de trabajo. Proporciona la codificación para
identificar y señalizar correctamente estas sustancias a fin de evitar accidentes. Asimismo, trata sobre
la clasificación de los peligros físicos y para la salud. Señala la obligatoriedad de contar con las hojas de
seguridad de las sustancias químicas que se empleen en el centro de trabajo e indica la información que
deberá tener esta hoja.
Otro aspecto que trata la NOM-018, son las características de la señalización que debe existir en los
centros de trabajo sobre las sustancias químicas: donde se colocan las señales y que características
deberán poseer los pictogramas de señalización. También señala la necesidad de capacitación y
adiestramiento a los trabajadores sobre este sistema armonizado.
La Norma Oficial Mexicana NOM-026-STPS-2008, indica el código de identificación que deberán
emplear los laboratorios y centros de trabajo en las tuberías que conducen fluidos, excepto para las
plantas potabilizadoras de agua. Indica también las características de la señalización y los colores
empleados.
8
Y el PROY-NOM-007-SSA3-2017 trata la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos,

que es de interés particular en este curso.
La OMS en su tercera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio de 2005 alienta a los
países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos
nacionales de prácticas para la operación de los laboratorios clínicos, biológicos y químicos. En este
manual se establece una clasificación del nivel de bioseguridad de los laboratorios, basada en una
combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y
procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de
riesgo. Los niveles van desde nivel 1 al nivel 4. A continuación, se presenta un Resumen de las prácticas
y los procedimientos de laboratorio esenciales en materia de seguridad que recomienda la OMS.
Acceso
1. El símbolo y signo internacional de peligro biológico deberá colocarse en las puertas de los locales
donde se manipulen microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior.
2. Sólo podrá entrar en las zonas de trabajo del laboratorio el personal autorizado.
3. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas.
Protección personal
1. Se usarán en todo momento batas o uniformes especiales para el trabajo en el laboratorio.
2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entrañar
contacto directo o accidental con sangre, líquidos corporales o animales infectados y otros materiales
potencialmente infecciosos. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y a
continuación se lavarán las manos.
3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y animales infecciosos, así
como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio.
4. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos o manipular lentes
de contacto.
5. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo del
laboratorio.
Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación
de aerosoles.
3. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se
comunicarán al responsable de la seguridad del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos
accidentes e incidentes.
4. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
5. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes,
según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.
Zonas de trabajo del laboratorio

1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.
9
2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente

peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de
eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.
Procedimientos de Manipulación de desechos
Se considera desecho todo aquello que debe descartarse. En el laboratorio de Bioquímica Clínica de
la UPIBI se consideran varios tipos de desechos:
1. Material orgánico. Se consideran residuos de alimentos, algodones con sangre, u otros que
indiquen los docentes a cargo. El recipiente es de color verde.
2. Papel. Se puede desechar cualquier papel que pueda ser reusado o reciclado. El recipiente es de
color amarillo.
3. Materiales valorizables. Cualquier material que, después de un tratamiento pueda emplearse
nuevamente. Están considerados aquí los plásticos de PE, PET, metales, u otros. El recipiente es de
color azul.
4. Materiales No valorizables. Cualquier material que ya no pueda reusarse o reciclarse. Están
incluidos polímeros como poliuretano (unicel), poliestireno u otros. El recipiente es gris.
5. Punzocortantes. Los recipientes son de color rojo y contienen la señalización de punzocortantes.
Se disponen ahí las agujas y navajas. Bajo ningún concepto deberá desecharse otra clase de material
en estos recipientes, como pueden ser las tapas plásticas de las agujas o los algodones.
6. RBPI. Se pueden disponer en bolsas rojas con el símbolo de riesgo biológico. Son utilizadas para
disponer los tubos con las muestras de sangre venosa, cuando se haya reunido el número suficiente
para que la empresa especializada los recoja.
7. Las bolsas amarillas se emplean para disponer desechos anatómicos.
8. El otro fluido biológico que se emplea en el curso de laboratorio de Bioquímica Clínica son muestras
de orina. Estas se desecharán en el sanitario, como cualquier otra orina. Y el recipiente que la contiene
deberá ser destruido y desecharse en la basura del sanitario.
Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser eliminado
Aparte de los objetos mencionados más arriba, otro material contaminado (potencialmente infeccioso)
debe ser introducido en recipientes impermeables (por ejemplo, en bolsas de plástico que resistan el
tratamiento en autoclave marcadas con un código de color) y tratado en autoclave o incinerado antes de
proceder a su eliminación. Después de pasar por la autoclave, el material puede colocarse en recipientes
apropiados para ser transportado al incinerador o a la basura municipal.
Si es posible, el material procedente de actividades relacionadas con la atención sanitaria no debe
desecharse en vertederos, ni siquiera después de haber sido descontaminado.
Cuando se utilicen desinfectantes, los materiales de desecho deben permanecer en contacto íntimo
con éstos, es decir, durante el tiempo apropiado.
Todo lo anterior es de aplicación y competencia del laboratorio de bioquímica clínica, por lo que en
esta práctica se revisarán y aplicarán las normas en esta y otras sesiones de práctica.
10
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 MATERIAL Y EQUIPO

• NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental – salud ambiental – residuos peligrosos
biológico – infecciosos- clasificación y especificaciones de manejo.
• PROY-NOM-005-STPS-2017. Manejo de sustancias químicas peligrosas o sus mezclas en los
centros de trabajo. Condiciones y procedimientos de seguridad y salud.
• NOM-018-STPS-2015. Sistema armonizado para la identificación y comunicación de peligros y
riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.
• NOM-026-STPS-2008. Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías.
• PROY-NOM-007-SSA3-2017. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.
• Instalaciones del laboratorio y señalizaciones
• Tubos Vacutainer® con gel
• Agujas verdes para Vacutainer®
• Torundas, ligadura y adaptador
3.2 REACTIVOS
• Diferentes reactivos químicos en sus recipientes con etiquetas de seguridad.
11
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1. El profesor asignara cada una de las normas a un equipo de alumnos. Cada equipo estudiará la
norma que se le haya asignado, realizará un resumen y un Cartel a mano que incluya imágenes o
cuadros con los puntos más importantes que apliquen al laboratorio de bioquímica clínica.
4.2 Cada equipo utilizará este cartel para exponer y explicar la norma al resto del grupo, en un tiempo
de 15 minutos.
4.3 Otro equipo de alumnos elaborará un cartel a mano y explicará, haciendo uso corporal y simulado,
la forma más conveniente de obtener sangre venosa periférica con sistema Vacutainer®, así como las
precauciones que se deben tener en el procedimiento. Este equipo podrá hacer uso de otras ayudas
didácticas, como videos.
4.4 Revisar los señalamientos que se encuentran en el laboratorio en materia de almacenamiento de
los reactivos químicos y en relación al botiquín, como marca el PROY-NOM-005-STPS-2017.
4.5 Revisar los señalamientos de seguridad que tiene el laboratorio, como marca la NOM-018-STPS-
2015 y la NOM-026-STPS-2008. Determinar cuáles están y cuáles no están y anotarlos en la tabla 5.1.
4.6 Indicar si el color de las tuberías es el correcto, y que fluidos se manejan en el laboratorio, como
marca la NOM-026-STPS-2008.
4.7 Revisar el PROY-NOM-007-SSA3-2017 e indicar los puntos de la norma que competen al Laboratorio
de Bioquímica Clínica de la UPIBI. Anotar esto en la tabla 5.2.
4.8 El profesor proporcionará 4 frascos de diferentes reactivos químicos. Buscar en los frascos, el código
de rectángulo y/o el código de rombo de acuerdo a la NOM-018-STPS-2015.
4.9 Revisar las características de cada sustancia en relación a la Salud, Inflamabilidad, Reactividad y el
Equipo de Protección que debe usarse para su manipulación. Anotarlas en el cuadro 5.3, indicando a
que se refiere cada número. Si el reactivo no tiene la información, indicar en la misma tabla.
12
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

5.1 Elaborar un mapa conceptual, a mano y a colores, del tamaño de una plana, con los rubros más
importantes de todas las normas expuestas que aplican al laboratorio de bioquímica clínica y
anexarlo al reporte (una hoja por todas las normas y solo las que aplican).
5.2 Elaborar un esquema de tamaño carta, a mano y a colores, de los pasos y cuidados para extraer
sangre venosa periférica con sistema Vacutainer®.
5.3 Anotar en la tabla 5.1 3 señalamientos de seguridad presentes y 3 ausentes en el laboratorio de
bioquímica clínica de la UPIBI.
Tabla 5.1
Señalamientos presentes Señalamientos ausentes
5.4 Elaborar en tamaño carta uno de los señalamientos necesarios que no se encuentren en el
laboratorio de bioquímica clínica y anexarlo al reporte.
5.5 Indicar si se cumple con la NOM-005-STPS-1998 en relación con el botiquín o que aplica para el
laboratorio de bioquímica clínica.
5.6 En la tabla 5.2, anotar los rubros que competen al laboratorio de bioquímica clínica como señala el
punto 4.7.
Tabla 5.2
Rubros de la PROY-NOM-007-SSA3-2017 que competen al laboratorio de Bioquímica

clínica de la UPIBI
5.7 Elabora un pictograma de cómo se desechan los residuos en el laboratorio de bioquímica: papel,
orgánicos, torundas con sangre, tubos con sangre, punzocortantes, plásticos, guantes de látex, pañuelos
desechables sucios, puntas con suero o sangre y puntas con reactivos.
5.8 Llenar los datos de los reactivos revisados en el punto 4.8 en la tabla 5.3.
Tabla 5.3
Nombre del Número en Número en Número en Equipo de

Reactivo Salud y Inflamabilidad y Reactividad y protección
significado significado significado
13
5.9 ¿Qué reactivo(s) no tenía el código de identificación? Investigar en la bibliografía sobre las
características del reactivo y elaborar el cuadro o rombo de identificación y clasificación para este
reactivo(s), así como anotar el equipo de protección, que debería haber tenido el frasco.
6. DISCUSIÓN
Discutir los resultados obtenidos considerando la importancia de la aplicación de las normas en el
laboratorio clínico y cuál es el papel del ingeniero biomédico en la seguridad del laboratorio clínico.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados obtenidos y la discusión que se realizó de los mismos, elaborar las
conclusiones y verificar si se cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1. MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Ley general de salud. Diario Oficial de la Federación. 7 de
febrero de 1984.
8.2. MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Reglamento de la ley general de salud en materia de control
sanitario de actividades, establecimientos, productos y servicios. Diario Oficial de la Federación. 18
de enero de 1988.
8.3. MÉXICO. SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES. Norma Oficial
Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental – Salud ambiental – Residuos
peligrosos biológico – infecciosos- Clasificación y especificaciones de manejo. NOM-087-
SEMARNAT-SSA1-2002. Diario Oficial de la Federación. 17 de febrero de 2003.
8.4. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. PROYECTO de Norma Oficial
Mexicana PROY-NOM-005-STPS-2017, Manejo de sustancias químicas peligrosas o sus mezclas
en los centros de trabajo-Condiciones y procedimientos de seguridad y salud. PROY-NOM-005-
STPS-2017. Diario Oficial de la Federación. 22 de JUNIO DE 2017.
8.5. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM-018-
STPS-2015, Sistema armonizado para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por
sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo. NOM-018-STPS-2015. Diario Oficial de la
Federación. 9 de octubre de 2015.
8.6. MÉXICO. SECRETARÍA DE TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Norma Oficial Mexicana NOM-026-
STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos
conducidos en tuberías. NOM-026-STPS-2008. Diario Oficial de la Federación. 25 de noviembre de
2008.
8.7. MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. PROYECTO DE Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-007-
SSA3-2017. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. PROY-NOM-007-
SSA3-2017. Diario Oficial de la Federación. 31 de enero de 2017.
8.8. MÉXICO. SECRETARIA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Ley Federal del Trabajo. Diario
Oficial de la Federación. 30 de noviembre de 2012.
8.9. MÉXICO. SECRETARIA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIAL. Reglamento Federal Seguridad y
Salud en el Trabajo. Diario Oficial de la Federación. 13 de noviembre de 2014.
8.10. MÉXICO. SECRETARIA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-016-SSA3-2012, que
establece las características mínimas de infraestructura y equipamiento de hospitales y consultorios
de atención médica especializada. Diario Oficial de la Federación. 8 de enero de 2013.
14
PRÁCTICA 2
DESARROLLO DE UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO
PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO
HUMANO.
UNIDAD I: Introducción a la Bioquímica clínica y estructura Celular.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno
1.1.1. Desarrolla un método espectrofotométrico para la determinación de albúmina en suero humano.
1.2 Objetivos específicos
El alumno
1.2.1. Calibra un espectrofotómetro, empleando los fundamentos teóricos de su uso y diseño.
1.2.2. Determina los factores que afectan el desarrollo de color de un método de análisis.
1.2.3. Establece las condiciones óptimas para realizar un método para determinación de proteínas en
clínica.
2. INTRODUCCIÓN
En bioquímica clínica es de suma importancia el análisis de sustancias en los pacientes, para la
determinación de estados de salud o enfermedad. Muchas enfermedades tienen su origen en
alteraciones del metabolismo celular o en la fisiología corporal y el diagnóstico de estas se apoya en
pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas son importantes en la diagnosis, prognosis y
monitorización de las enfermedades. Se entiende por prognosis a la determinación de la probabilidad de
que se desarrolle una enfermedad basándose en pruebas bioquímicas. La monitorización de una
enfermedad es el seguimiento del curso de una enfermedad.
Es por esto que una de las funciones más importantes de la Bioquímica Clínica es la de diseñar,
realizar e interpretar pruebas bioquímicas, que proporcionen información relevante y significativa en el
diagnóstico de enfermedades. Muchas de estas pruebas bioquímicas emplean métodos
espectrofotométricos para su realización.
En un análisis espectrofotométrico se aprovecha la absorción selectiva que tiene una sustancia sobre
una longitud de onda específica del total del espectro.
La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las
moléculas, y es característica para cada sustancia química. Cuando una molécula es sometida a una
radiación electromagnética, absorbe parte de la energía de la radiación y se excita, es decir aumenta su
estado energético. Del total de radiación policromática (luz de varios colores, es decir de muchas
longitudes de onda) se absorbe solo un tipo preferente de longitud de onda, que depende de la
naturaleza molecular de la sustancia, (de las partículas subatómicas, del tipo de enlaces y de la
distribución de electrones). Esta energía es después emitida con menos energía (longitud de onda
mayor). Se puede analizar el espectro de radiación que absorbe la molécula, con lo que se tendrá un
espectro de absorción, o se puede estudiar el espectro de la radiación que emite, para obtener un
espectro de emisión. Como parte de la radiación de una longitud de onda determinada se absorbe, su
intensidad disminuye, y se puede medir la cantidad de luz que ha sido absorbida.
Cuando se realiza un análisis espectrofotométrico se emplea la longitud de onda de máxima
absorción, pues así se tiene una mayor sensibilidad en el método, que se refleja en una mayor absorción.
15
La espectroscopia UV7VIS es una técnica de medición en la que se emplea la absorción o emisión

de una sustancia empleando luz UV o Visible, que es detectada y medida con un espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un equipo conformado generalmente de una fuente de radiación, un
monocromador, un contenedor de la muestra (portaceldas), un dispositivo de difracción de la luz, que
separa la radiación en las diferentes longitudes de onda; un fotodetector y el dispositivo de lectura.
Las fuentes de radiación empleadas para la región visible son filamentos incandescentes (tungsteno
halógeno o xenón) que suministran la energía radiante necesaria para el análisis y mantienen la energía
y densidad de flujo de la luz durante el tiempo de operación. Para la luz ultravioleta se emplean lámparas
de descarga de hidrógeno o deuterio, que operan a bajas presiones y voltajes reducidos (40 V aprox.) y
que trabajan muy bien en el rango de 380 – 160 nm.
Los monocromadores tienen como función proporcionar un haz de luz con un valor específico de
longitud de onda y ancho determinado de una banda del espectro. Ya que la fuente de luz emite un
ancho de banda de toda la radiación del visible, es necesario, para el análisis de muestras, el uso de luz
monocromática, es decir de una sola longitud de onda. Entre la fuente de luz y el monocromador y entre
este y el contenedor de la muestra existen un sistema de espejos que actúan de colimadores para hacer
paralelos a los haces de luz y mejorar las determinaciones. También existen filtros después del
monocromador para mejorar la definición de la longitud de onda saliente.
Una vez que sale el haz de luz monocromático, de estrecho intervalo espectral, éste incide sobre la
muestra, colocada en una celda dentro del contenedor. Las celdas empleadas son de vidrio para el uso
de luz visible y de cuarzo para el empleo de luz UV. El vidrio absorbe la radiación por abajo de 350 nm,
y por ello no debe emplearse para las determinaciones con luz UV.
Un detector es un transductor que transforma la radiación (luz) en flujo de corriente eléctrica y si se
hace necesario, amplifica esa señal. Los detectores pueden ser celdas fotovoltaicas, fotodiodos de
estado sólido, tubos fotoemisores y tubos fotomultiplicadores. Los tubos fotoemisores al vacío están
formados de un cátodo sensible a la luz como un semicilindro de metal y un ánodo de alambre situado
a lo largo del eje del cilindro, encerrado en una cubierta al vacío. Cuando la radiación incide sobre la
cubierta sensible del cátodo, se emiten electrones que son captados por el ánodo, constituyéndose una
corriente. La corriente generada se evidencia en un módulo de lectura, que puede ser analógica o digital,
y que nos permite establecer la cantidad de luz que fue absorbida por la muestra, o la de luz transmitida,
según se desee determinar absorbancia o transmitancia, y que estará en función de la concentración y
naturaleza de la muestra.
Antes de emplear un espectrofotómetro para determinaciones del laboratorio, es necesario calibrarlo,
para evitar errores en las determinaciones. El equipo puede descalibrarse por fallas en el sistema óptico,
sobre todo espejos sucios, rayados o movidos. Si la lámpara está sucia o pierde potencia, puede generar
problemas en las lecturas. El sobrecalentamiento o las variaciones del voltaje también pueden
descalibrar el espectrofotómetro.
La absorbancia (As) o densidad óptica (DO), de una luz monocromática (de una sola longitud de
onda), se define como el logaritmo decimal de la relación entre la intensidad de la radiación no absorbida
(It) y la intensidad de la radiación incidente (I0).
A = - log It / I0
¿Y de qué depende la magnitud de la absorción de radiación de una sustancia? Depende de la
cantidad de moléculas que haya. Dicho en otros términos la cantidad de luz absorbida depende de la
concentración de la muestra. Esto lo describió Beer en 1852. Pero también depende del espesor de la
capa que atraviese la luz, o la distancia que ésta recorra, como describieron Bouguer y Lambert (1730-
1760). Combinando ambos factores se obtiene lo que se conoce como la Ley Básica de
espectrofotometría o Ley de Bouguer–Beer–Lambert (BBL), la cual indica que la relación entre la
intensidad de luz incidente y transmitida depende de la concentración de la muestra (c) y el diámetro de
la celda, esto es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo (l).
16
𝑰𝒐
𝑰𝒕 = 𝑰𝟎 ∗ 𝟏𝟎−𝜶𝒄𝑰 o 𝒍𝒐𝒈 = 𝜶𝒄𝑰
𝑰𝒕
Generalmente se emplean celdas de un centímetro de paso y la concentración se expresa en moles/L;
entonces el factor α se convierte en ε o coeficiente de absorción molar.
La relación I0 / It se llama transmitancia y es representada como T, expresándose en porcentaje (%).
La relación -log I0 / It se llama absorbancia y se representa As, expresándose en numerales. Por lo tanto,
la absorbancia será proporcional al diámetro de la celda y la concentración de la muestra.
As = cl
Como el diámetro de la celda (l) generalmente es de 1cm, podemos decir que la absorción depende
de la concentración de la muestra (c). Esta relación se emplea para la determinación de concentración
de sustancias en el laboratorio clínico, y lo que hay que conocer es el coeficiente de extinción o absorción
molar.
Relacionando la longitud de onda y la intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra,
contra la de soluciones estándar es posible determinar la identidad y la concentración de los
componentes de una muestra. Los métodos de análisis basados en los principios de la absorción antes
mencionados se conocen como MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS. Las ventajas de los métodos
espectrofotométricos son varias: son rápidos, precisos, versátiles, fáciles de usar y eficientes en costo.
Por ello, la determinación de la presencia y concentración de sustancias de importancia clínica emplean
estos métodos.
La linealidad se refiere a la relación lineal entre la concentración y la absorbancia, este parámetro
también puede usarse para conocer el rango útil de concentración La especificidad se refiere a si la
reacción, el método o la λ empleada son exclusivos de la sustancia a determinar o existen varias
sustancias que se pueden medir con este método. La sensibilidad se refiere a observar una variación
en la absorbancia, cuando se presenta una variación en la concentración. La exactitud se refiere a
establecer la concentración real o verdadera de la sustancia sin temor a cometer errores, o con
márgenes confiables de determinación. La precisión tiene que ver con la concordancia que se presentan
en los valores obtenidos en diferentes ensayos o por diferentes personas; también se conoce como
reproducibilidad. La precisión está influida por el error aleatorio del método. Se determina al realizar
varias réplicas del método, y se expresa como la dispersión de los datos, o desviación estándar (s). Para
saber la significancia de este valor se tienen que analizar en función del valor medio (). Finalmente se
debe saber la estabilidad de la reacción que genera color.
Como siempre se presentan pequeñas variaciones debidas a la eficiencia de cada aparato, a
difracciones por defectos en las celdas, a errores de pipeteo en la toma de muestra, es necesario en
todo momento elaborar una curva de calibración. Una curva de calibración se elabora con varios de
tubos con concentraciones conocidas (casi siempre en orden ascendente) de la muestra, que darán
valores ascendentes en las lecturas de absorción.
Una vez que se tiene el método apropiado es necesaria una interpretación de los datos, para
determinar que pacientes pueden ser considerados “sanos”, y cuales “enfermos”, y si las diferencias
entre estos son consistentes. Todos los datos presentan cierta variación, y las variables biológicas
muestran, por lo general, una distribución Gaussiana, también llamada Normal. Se considera un intervalo
normal o de referencia aquel que se encuentra entre la media +/- dos veces la desviación estándar, la
cual abarca el 95% de los datos.
Calificar a un paciente como enfermo, depende entre otros aspectos, de la precisión y exactitud del
ensayo, así como de la variabilidad biológica natural, por lo que es necesario considerar la desviación
estándar global, que incluya tanto la biológica como la analítica.
En esta práctica se establecerá un método espectrofotométrico para determinar proteínas en suero
humano, y los parámetros que lo caracterizan. La albúmina es la más abundante de las proteínas
séricas. Su función en el cuerpo es transportar substancias tales como medicamentos, antibióticos,
17
bilirrubina y ácidos y sirve como almacén de proteínas de estructura, necesarias para el crecimiento de
los tejidos. Los niveles bajos de albúmina se presentan en enfermedades como el síndrome nefrítico,
enfermedades hepáticas, infecciones agudas y mala nutrición haciendo así a las determinaciones de
albúmina de primordial importancia. Muchos métodos han sido descritos para determinar a la albúmina
sérica. La reacción de la albúmina humana con el púrpura de bromocresol (BCP) se usa ampliamente y
se basa en la capacidad de la albúmina sérica de copularse con colorantes, en este caso con el BCP.
3.1 EQUIPO Y MATERIAL
• Espectrofotómetro visible con celdas
• Centrífuga clínica
• 1 tubo Vacutainer® con gel
• 1 aguja verde para Vacutainer®
• Torunda, ligadura y adaptador
• 12 tubos de ensaye de 13 X 100 mm
• 2 pipetas de 2 mL
• 1 micropipeta automática de 2-20 l
• Puntas para micropipeta automática de 2 - 20 l
3.2 REACTIVOS
• 40 µl de Púrpura de Bromocresol (BCP) 80 molar, pH 4.9 - 5.2.
• 20 µl de soluciones de Albúmina Humana de 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 25 mg/mL, 45 mg/mL,
60 mg/mL 90 mg/mL, 120 mg/mL, 180 mg/mL, en ssf (solución salina fisiológica).
• 20 µl de Sol. de Albúmina de huevo 60 mg/mL en ssf.
• 20 µl de Sol. de Histidina 60 mg/mL en ssf.
• 20 µl de Sol. de Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva (3:1
albúmina: aceite de oliva).
• 20 µl de Sol. de Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con detergente 1 mg/mL
(1:1 albúmina: detergente).
• 20 µl de Sol. de Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con hemoglobina (9:1,
albúmina: hemoglobina).
3.3 MATERIAL BIOLÓGICO

• Suero sanguíneo
18
PRIMERA SESION
A. OBTENCIÓN DE SUERO HUMANO.
4.1 En condiciones asépticas, obtener aproximadamente 5 mL de sangre periférica en un tubo
Vacutainer® con gel (tapa amarilla).
4.2 Dejar que se contraiga el coagulo durante 10 minutos.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm. Se empleará el suero para la determinación.
B. CALIBRACIÓN DEL ESPECTROFOTÓMETRO Y PREPARACIÓN DE LA CURVA TIPO.
4.4 Encender el espectrofotómetro 5 minutos antes de usarlo y dejar que el equipo realice la
calibración interna de manera automática (tarda unos minutos). Una vez que haya terminado,
presione el botón test para que aparezca el menú principal.
4.5 Seleccione la función deseada y los parámetros requeridos. Para esta práctica se utilizarán las
funciones de Barrido y de As / %T (Absorbancia y % de Transmitancia).
4.6 Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.1, de la Curva de calibración o Curva Tipo.
Emplear la micropipeta para tomar los microlitros (l). SOBRE EL USO DE CORRECTO DE LAS
MICROPIPETAS CONSULTAR EL APENDICE B.
Tabla 4.1. Curva Tipo

RT-Púrpura de 20L de una Solución de
Agua
Tubo bromocresol (BCP) 40 Albúmina de la
(L)
µM (mL) concentración siguiente
Blanco 2.0 - 20L
1 2.0 5 mg/mL -
2 2.0 10 mg/mL -
3 2.0 15 mg/mL -
4 2.0 25 mg/mL -
5 2.0 45 mg/mL -
6 2.0 60 mg/mL -
Este tubo se empleará como calibrador
7 2.0 90 mg/mL -
8 2.0 120 mg/mL
9 2.0 180 mg/mL -
Suero* 2.0 20l de suero -
4.7 . Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 – 30 °C) durante 5 minutos.
19
C. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. SELECCIÓN DE LA  DE As MÁXIMA.

4.8 Se utilizarán los tubos Blanco y el tubo 6 (calibrador), correspondiente a la concentración de
albúmina de 60 mg/mL.
4.9 En el menú principal del espectrofotómetro, seleccionar la opción de barrido y luego la opción
lento. Establecer el intervalo de longitud de onda,  de 450 – 650 nm (visible).
4.10 Calibrar con el tubo blanco. Para ello introducir la celda con el blanco y presionar el botón de
lectura del blanco.
4.11 Leer la As del tubo 6 en el intervalo de  de 450 – 650 nm (visible). Anotar los datos en la tabla
5.1.
NOTA: Seguir las indicaciones del docente para el uso del espectrofotómetro, ya que hay variaciones
en el manejo del espectrofotómetro según el modelo.
D. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. LINEARIDAD, SENSIBILIDAD, RANGO UTIL,
EXACTITUD Y PRECISION DEL MÉTODO.
4.12 Seleccionar en el espectrofotómetro la opción As / %T. En As, seleccionar la  de absorción
máxima que se determinó en el punto 4.12.
4.13 Introducir una celda con agua destilada para ajustar a cero de As y 100% de T, empleándola
como blanco.
4.14 Introducir otra celda con el tubo blanco y tomar la lectura de As a la  máxima seleccionada y
anotarla en el recuadro debajo de la tabla 5.2.
4.15 Después calibrar a cero de As y 100% de T con ese mismo tubo blanco (Este paso se realizará
solo para esta práctica, pues en condiciones normales, la lectura del blanco no se realiza, sino que
se ajusta directamente).
4.16 Determinar la As de cada tubo de la curva tipo preparada previamente según la tabla 4.1, a la  de
As máxima antes seleccionada. Anotar los resultados en la tabla 5.3.
4.17 Ahora determinar el % de T de cada tubo a la misma  Anotar los resultados en la tabla 5.3.
20
SEGUNDA SESIÓN
C. ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN E INTERFERENCIAS DEL MÉTODO.
4.18 Preparar una serie de tubos como marca la tabla 4.2
Tabla 4.2
Púrpura de bromocresol Agua
Tubo 20l de solución de
(BCP) (mL) (l)
Blanco 2.0 - 20
Albúmina de huevo
1 2.0 -
60 mg/mL
2 2.0 Histidina 60 mg/mL -
20l de Sol. de Albúmina
de 60 mg/mL
Emulsionada con
3 2.0 -
aceite de oliva
Emulsionada con
4 2.0 -
detergente
Emulsionada con
5 2.0 -
hemoglobina
4.19 Permitir el desarrollo de color a temperatura ambiente (18 – 30 °C) durante 5 minutos.
4.20 Determinar la As de cada tubo a la  máxima seleccionada en la sección A, empleando el blanco
para calibrar a cero de As.
4.21 El testigo positivo es el tubo 6 de la curva tipo, (calibrador 60 mg/mL) de modo que habrá que
registrar esa lectura en la tabla para este experimento.
4.22 Anotar los resultados en la tabla 5.7.
21
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

A. Selección de la  de As máxima.
5.1 Anota las lecturas de As obtenidas en la Tabla 5.1
Tabla 5.1
 As  As
5.5 Señalar la  de máxima absorbancia. De igual forma anota en el siguiente cuadro, la As del blanco
a esta longitud de onda.
 de máxima absorbancia
Absorbancia del blanco
5.6 Elabora la gráfica de barrido, poniendo la As en el eje Y (ordenadas) contra λ en el eje X (abscisas).
Se elabora una sola gráfica para ambos datos, con dos escalas (para turbo y para lento)
22
B. Linealidad, Sensibilidad, Rango útil, Exactitud y Precisión del método de Bradford.

5.7 Anota los resultados en la Tabla 5.3. Anotar a que longitud de onda ( en nm) se hizo la
determinación.
Tabla 5.3. Curva Tipo
Tubo Concentración de As %T
albúmina mg/mL =
Blanco -
1 5
2 10
3 15
4 25
5 45
6 60*
7 90
8 120
9 180
Suero (Calcular con la ecuación)
* Este tubo actúa como calibrador

5.8 Elaborar la curva tipo colocando en las ordenadas la Absorbancia (a la  seleccionada) y en las
abscisas la concentración de albúmina en mg/mL.
5.9 A continuación, anotar la ecuación obtenida con esta curva tipo. Determinar si la relación es Lineal
con el coeficiente de correlación r.
Ecuación de la Curva Tipo
Valor del coeficiente de correlación r
5.10 Si la curva tipo presenta linealidad, calcular la concentración de albúmina del suero Empleando la
ecuación de la curva tipo. Anotar la concentración en la misma tabla 5.3.
5.11 Para calcular la Sensibilidad del método espectrofotométrico, en la gráfica de la curva tipo, marcar
dos puntos en el eje Y de As, con una separación de 0.1 de As, e interpolar en el eje X de la gráfica
y obtener la diferencia en concentración. Esta diferencia de concentraciones señala la sensibilidad
del método. Anotar la sensibilidad obtenida en la tabla 5.5.
5.12 Con tus resultados de la curva tipo, calcular lo que se pide en la tabla 5.4
23
Tabla 5.4
Tubo Concentración de Logaritmo de la As %T Absortancia
albúmina mg/mL* concentración Estos datos ya los tienes
de la tabla anterior. (100 – %T)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5.13 Elaborar en papel milimétrico la gráfica de Ringbom, colocando en las ordenadas la absortancia y
en las abscisas el logaritmo de la concentración.
5.14 En la curva de Ringbom ubica la zona lineal y traza sobre ella una recta. Los puntos sobre la línea
recta indican los valores de concentración donde el método sigue la Ley de BBL, es decir es lineal.
Esta zona lineal indica el Rango Útil de Concentración del método. Anotar este rango en la tabla
5.5.
5.15 Empleando la ecuación de la Curva tipo (5.9), calcular la concentración empírica del calibrador
(tubo 6 de la curva tipo) y anotarla en la tabla 5.5.
5.16 Para obtener la Exactitud del método, calcular el % de desviación obtenida con la fórmula
siguiente, considerando la concentración teórica del calibrador que es de 60 mg/mL y la
concentración empírica que se calculó con la ecuación obtenida de la curva tipo.
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙

% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑥 100
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
5.17 Anotar el % de desviación en la tabla 5.5. La desviación debe ser menor al 10% para considerar el
método como exacto.
Tabla 5.5. Sensibilidad, Rango útil y Exactitud del método
Sensibilidad con la curva tipo
Rango útil de concentración del método
Concentración del calibrador obtenido con
la ecuación de la curva tipo
% de error (Exactitud)
5.18 Se usarán los datos empíricos de concentración del calibrador de todos los equipos del grupo, para
el cálculo de Precisión del método. Para ello se calculará la media (𝑥̅ ) y la desviación estándar (s)
de los valores del calibrador de todo el grupo. Anotar s la en la tabla 5.6.
5.19 Para considerar un método preciso la s no debe ser mayor al 10%.
24
Tabla 5.6. Precisión del método

Media de los datos del grupo (𝑥̅ )
Precisión. Desviación estándar de los

datos del grupo (s)
C. Especificidad de la reacción e Interferencias del método

5.20 Para determinar si el método de BCP es específico para albúmina sérica humana y las
interferencias de que se puedan presentar anotar los resultados en la tabla 5.7.
Tabla 5.7
Tubo Proteína As
Calibrador
(Tubo 6 de la C.T.) Albúmina humana 60 mg/mL
1 Histidina 60 mg/mL
2 Albúmina de huevo 60 mg/mL
Condición
3 Albúmina + lípido
4 Albúmina + detergente
5 Albúmina + Hb
5.21 Para analizar la especificidad y las interferencias del método de BCP para albúmina sérica humana,
elaborar una gráfica de barras con los datos de la tabla 5.7, colocando en las ordenadas el valor de
la As obtenida y en las abscisas el contenido del tubo.
25
6. DISCUSIÓN
Discutir los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
• Los componentes básicos de un espectrofotómetro, así como la función de cada uno.
• La importancia de la calibración de un equipo espectrofotométrico en un laboratorio clínico.
• Los cuidados que deben tenerse con un equipo espectrofotométrico para evitar que se descalibre.
• Que es un método espectrofotométrico y que características debe tener.
• Si el método empleado (BCP para determinación de albúmina sérica humana) sigue la ley de
Bouger–Beer–Lambert
• Que es una curva tipo, que características debe cumplir y cuál es su uso en el laboratorio clínico.
• Que es la linealidad de una curva tipo y como se determina.
• Explicar los parámetros del método espectrofotométrico como la precisión, exactitud, sensibilidad,
rango útil, etc.
• La especificidad del método y sus interferencias
• Los criterios a tomarse en cuenta cuando se va a implementar un método espectrofotométrico para
un análisis clínico y si el método usado en la práctica cumple con estas especificaciones.
• Consulta el artículo original (Referencias) donde se describe este método, para comparar los
resultados que obtuviste.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los objetivos, resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones de la
práctica.
8. REFERENCIAS
8.1. Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2009. Principios de análisis instrumental. 6a ed. Mc Graw-Hill
Co. México.
8.2. Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1991. Métodos Instrumentales de Análisis. 7a edición.
Grupo Editorial Iberoamericana, México.
8.3. Kaplan, L. y Pesce, A. 2002. Química clínica: Métodos. 4a. edición. Médica Panamericana. México,
8.4. Louderback, A., Mealy, E. y Taylor, NA. 1968. A new dye binding technique using bromocresol purple
for determination of albumin in serum. Clin. Chem. 14: 793.
8.5. Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2016.
Harper Bioquímica Ilustrada. 30a ed. Mc Graw Hill. México.
26
PRÁCTICA 3
ELECTROFORESIS DE SUERO.
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clínica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
El alumno
1.1.1. Desarrolla la electroforesis vertical en gel de poliacrilamida para separar las proteínas del suero
humano.
El alumno
1.2.1. Determina los principios de operación de la técnica, el equipo de electroforesis PAGE y sus
aplicaciones clínicas.
1.2.2. Determina el peso molecular de las principales proteínas que se encuentran en el suero y plasma.
1.2.3. Identifica las principales proteínas presentes en suero y plasma humanos, mediante una
comparación bibliográfica
2. INTRODUCCIÓN
Las proteínas son biomoléculas de gran importancia en clínica. Están formadas de aminoácidos y
cumplen diferentes funciones en el cuerpo. Pueden ser hormonas, enzimas, dar estructura, participar en
el movimiento, en el transporte de solutos a través de la membrana, etc. Por su papel tan importante en
el organismo, se puede monitorear su función o su concentración, y así pueden ser utilizadas como
indicadores bioquímicos. La vía más sencilla de obtener proteínas para su análisis es con la obtención
de sangre periférica.
De la fase líquida de la sangre, el 90% es agua, y del 10 % restante el 70% corresponde a proteínas.
Existen más de 100 proteínas con una función fisiológica en el plasma, que van desde el transporte
(como la Albúmina, la Apolipoproteína, o la Transferrina), función de inmunidad (Inmunoglobulinas),
mantenimiento de presión osmótica (todas, especialmente la Albúmina), inhibidores de proteasas
(Antitripsina α1), regulación del pH, etc. Algunas proteínas plasmáticas son enzimas (Renina, Factores
de coagulación) principalmente plasmáticas, pero también se encuentran de origen intracelular debido
al reciclaje celular normal, o a daño celular.
Para la determinación de la función o concentración de las proteínas se pueden emplear varios
métodos de purificación. Uno de los más importantes es la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE
por sus siglas en inglés). Se puede llevar a cabo una variante de esta técnica, donde se emplean
condiciones que desnaturalizan a las proteínas, con el fin de realizar un análisis sobre su peso molecular.
En esta versión se adiciona al gel de electroforesis, un detergente para la desnaturalización, el dodecil
sulfato de sodio (SDS por sus siglas en inglés), por lo que esta técnica se denomina SDS-PAGE.
La electroforesis es una técnica analítica que permite separar sustancias en función de su carga
eléctrica, para separar una mezcla de proteínas en muestras biológicas. Debido a que una proteína está
cargada cuando se encuentra en un pH diferente de su punto isoeléctrico (pI), ésta migrará en un campo
eléctrico de un modo dependiente de su densidad de carga.
Las principales propiedades que determinan la migración de una proteína bajo condiciones dadas en
una técnica electroforética son: tamaño, carga neta, forma e hidrofobicidad relativa). La separación es
llevada a cabo en un medio de soporte para contrarrestar los efectos de la convección y difusión que
27
ocurren durante la electroforesis, y para facilitar la inmovilización de las proteínas separadas, entre los
materiales de soporte o matrices se pueden mencionar el almidón, agarosa, acetato de celulosa, así
como poliacrilamida, cuya aplicación se denota como PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida).
La mezcla acrilamida-bisacrilamida son compuestos que polimerizan en presencia de iones
catalizadores (persulfato o TEMED), formando una malla o red con poros. El tamaño de estos poros
depende de la concentración de bisacrilamida. Por estos poros podrán pasar moléculas, como proteínas,
según su tamaño. Así el gel de poliacrilamida se comporta como un tamiz (coladera) molecular.
Figura 1. Polimerización de acrilamida-metilenbisacrilamida

Como se mencionó anteriormente, la electroforesis se puede realizar en condiciones nativas como
desnaturalizantes, la primera permite retener la actividad biológica y propiedades enzimáticos, en
contraste, la segunda implica condiciones más vigorosas, desnaturalizantes y comunes para separar
proteínas menos solubles, implica la participación del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)
y de β-Mercaptoetanol, con esto se logra la adquisición de carga negativa y una forma homogénea de
todas las proteínas presentes en la muestra así como la separación de las cadenas polipeptídicas que
forman parte de una proteína por la ruptura de los puentes disulfuro. Las proteínas tratadas de esta
manera se comportan como si tuvieran una forma similar y una relación carga/masa idéntica, lo que da
como resultado que la movilidad electroforética esté únicamente relacionada con el peso molecular de
la proteína a causa de la acción del gel como tamiz molecular.
Si una serie de proteínas de peso molecular conocido son sometidas a electroforesis, se separan en
una serie de bandas y la representación gráfica de la distancia recorrida en función del logaritmo del
peso molecular da una recta. De este modo, si una proteína de peso molecular desconocido es sometida
28
a una electroforesis de modo simultáneo con proteínas de peso molecular conocido, el de aquella se
puede calcular con una exactitud variable entre el 5 y el 10%.
La electroforesis para el fraccionamiento de proteínas ha resultado ser una valiosa técnica de
separación y cuantificación en el laboratorio clínico, para análisis de proteínas séricas o plasmáticas, así
como para el análisis de líquido cefalorraquídeo y para análisis de lipoproteínas, se puede hacer la
evaluación de las diferentes fracciones proteicas en diversos estados patológicos.
3. MATERIAL Y EQUIPO
• Baño maría a ebullición
• Cámara de Electroforesis vertical para proteínas
• Parrilla con agitador magnético
• Fuente de poder de 100 mV
• Agitador magnético
• Micropipeta de 0.5 – 10 l
• Micropipeta de 2 – 20 l
• Puntas para micropipetas de 0.5 – 10 µL y de 2 – 20 L
• Tubos Vacutainer® con gel y con EDTA
• Agujas para Vacutainer®
• 2 matraces de 125 mL
• Agitador de vidrio
3.2 REACTIVOS
• Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 8,8 (Tris HCl 1.5 M, con SDS al 0.4%)
• Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 6.8 (Tris HCl 0.5M, con SDS al 04%)
• Acrilamida- bis acrilamida (30% acrilamida-0.8% bis acrilamida)
• TEMED
• Solución buffer de fosfatos - salina pH 7.4 (PBS: NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM,
KH2PO4 1.8mM)
• Persulfato de amonio 10%
• Amortiguador de Laemmli 2x (Tris-HCl 120mM, glicerol 20%, EDTA 2 mM, azul de bromofenol
0.02%).
• Amortiguador de Laemmli desnaturalizante 2x (Tris-HCl 120mM, glicerol 20%, SDS 2.5 %, EDTA
2 mM, azul de bromofenol 0.02%, β-mercaptoetanol 0.5%).
• Fibrinógeno sérico 1 mg/mL en PBS 10 mM, pH 7.5
• Albúmina humana 1 mg/mL (usar de la práctica anterior)
• Marcador de peso molecular de proteínas para electroforesis
• Solución de Azul de Coomassie para tinción de proteínas en gel de poliacrilamida
• Solución desteñidora (metanol al 50%, ácido acético glacial al 10%)
• Buffer de corrimiento 1X. (Tris-HCl 25mM, Glicina 192mM, SDS 0.1%)
• 5 mL de sangre
29
A. ENSAMBLADO DEL EQUIPO Y PREPARACIÓN DEL GEL
4.1 Ensamblar los vidrios del equipo de electroforesis y colocarlos en el soporte, de acuerdo a las
instrucciones del profesor.
4.2 Preparar el gel separador (al 10%) en un vaso de precipitados mezclando con agitador magnético
de acuerdo a la tabla 4.1.
Tabla 4.1
Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 8,8 (1.5M) 1.5 mL
Acrilamida-bisacrilamida al 30:0.8 % 1.98 mL
H2O destilada 2.54 mL
TEMED 8.4% 30 l
Persulfato de amonio 10% (PSA) 60 l
4.3 Inmediatamente después de adicionar el PSA y homogenizar transferir la mezcla en medio de los
vidrios, con ayuda de una pipeta Pasteur. Dejar reposar 15 minutos para que gelifique.
4.4 Una vez que gelifique el gel separador, preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 4.2.
Tabla 4.2
Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 6.8 (0.5M) 0.5 mL
Acrilamida-bisacrilamida al 30:0.8 % 0.33 mL
H2O destilada 1.16 mL
TEMED 8,4% 13 l
Persulfato de amonio 10 % (PSA) 27 l
4.5 Vaciar la mezcla en el sistema de vidrios. Colocar el peine y dejar gelificar.

4.6 Ensamblar el sistema, colocando los vidrios en el soporte, e introduciendo este en el tanque que
contiene la solución del electrolito o amortiguador de corrimiento.
4.7 Retirar el peine y llenar la cámara con amortiguador de corrida.
B. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.

4.11 Luego, realizar el procedimiento de obtención de sangre usando tubo Vacutainer® con EDTA, para
obtener el plasma. Una vez que se obtenga la sangre, homogeniza lentamente para mezclar el
anticoagulante con la muestra.
C. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
4.12 Realizar una dilución 1:50 de la muestra de suero o plasma, según le corresponda al equipo de
alumnos, con la solución buffer de fosfatos (PBS).
4.13 Preparar las muestras en condiciones no desnaturalizantes) y muestras en condiciones
desnaturalizantes, como se indica a continuación:
4.14 Para condiciones no desnaturalizantes: En un tubo Eppendorf® mezclar 10l de las diluciones de
suero o plasma con 10 l de amortiguador de Laemmli. Homogenizar suavemente con la micropipeta
cuidando de no hacer espuma.
30
4.15 Realizar el mismo procedimiento con: a) 10l de fibrinógeno más 10l de amortiguador de Laemmli
y b) con 10l de albúmina humana más 10l de amortiguador de Laemmli. Homogenizar con la
micropipeta cuidando de no hacer espuma.
4.16 Para condiciones desnaturalizantes: En un tubo Eppendorf® mezclar 10l de las diluciones de
suero o plasma con 10 l de amortiguador de Laemmli conteniendo mercaptoetanol. Homogenizar
suavemente con la micropipeta cuidando de no hacer espuma. Calentar en baño maría a ebullición
durante 5 minutos.
4.17 Repetir el procedimiento de Laemmli con mercaptoetanol con el fibrinógeno y la albúmina humana.
4.18 Usar las muestras para cargar el gel de poliacrilamida.
D. CARGADO DEL GEL Y CORRIMIENTO

4.19 Con ayuda de la pipeta automática empleando una punta por muestra, colocar las muestras según
indica la tabla 4.3
Tabla 4.3
No desnaturalizantes Desnaturalizantes
Carril 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Marcador Fibrinógeno Albúmina Suero* Plasma* Fibrinógeno Albúmina Suero* Plasma* Marcador
PM PM
Muestra 8 l 5 l 5 l 5 l 8 l 5 l 5 l 5 l
8 l 8 l
*Dilución 1:50
4.20 Las muestras se cargan introduciendo la punta de la micropipeta con la muestra en cada pozo,
cuidando de que no se salga o contamine el pozo contiguo. (Ver Figura 2).
Fig. 2. Sistema de electroforesis vertical y aplicación de la muestra.

4.21 Colocar la tapa de la cámara de electroforesis y conectar las terminales a la fuente de poder.
4.22 Aplicar un voltaje de 100 V
4.23 La corriente se mantendrá hasta que el frente del colorante del amortiguador de Laemmli alcance
hasta un centímetro antes del final del gel, cuando pase esto apagar la fuente, y retirar el gel
siguiendo las instrucciones del profesor.
E. TINCIÓN DEL GEL
4.24 Colocar el gel en la solución de azul de Coomassie, y dejarlo en agitación suave durante 30
minutos.
4.25 Desteñir el gel agitando en la solución de Metanol 30% y ácido acético al 10% poniendo en agitación
de una a dos horas.
4.26 Finalmente, enjuagar con abundante agua destilada, y conservar el gel en bolsa de plástico, para
evitar que se seque.
31

5.1 Tomar una fotografía nítida del gel en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes
(electroferograma) e imprimirlas de preferencia en tamaño carta.
5.2 Empleando una regla, en el carril uno, donde se colocó la mezcla de proteínas que funcionan como
marcador de peso molecular. medir la distancia de cada banda desde el inicio del gel, hasta el centro
de la banda, Anotar estas mediciones en la tabla 5.1. En la misma tabla anotar el peso molecular de
las proteínas del marcador. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada banda.
Tabla 5.1
Carril 1 Peso Molecular Distancia recorrida
log PM
(KDa) en cm
Banda 1
Banda 2
Banda 3
Banda 4
Banda 5
(resto de
bandas)
Un ejemplo de cómo deberán verse las bandas del marcador de peso molecular en el gel de
electroforesis se muestra en la figura 3
Fig. 3. Electroferograma de marcador de peso

molecular, indicando los pesos moleculares de
cada proteína
5.3 Con estos datos elaborar una gráfica donde se coloque el log peso molecular de cada una de las
proteínas que componen al marcador de peso molecular en el eje y contra la distancia recorrida en
cm en el gel, en el eje de las x.
5.4 De esta gráfica realizar la regresión lineal, y obtener la ecuación, donde el eje y es el log del PM y la
distancia recorrida por cada proteína (banda) en cm es el eje x. Anota la ecuación obtenida a
continuación
Ecuación de la recta
5.5 Puedes repetir los cálculos con los datos del carril 10, donde también se colocó el marcador de PM.
32
5.6 Ahora, en la misma impresión de la foto, medir la distancia recorrida de cada banda de cada uno de
los carriles (carriles 2 al 10). Anotar estos datos en la tabla 5.2. (Si en el carril hay más de 3 bandas,
anotar los datos en filas añadidas).
5.7 Empleando la ecuación obtenida y anotada en el punto 5.4, calcular el peso molecular de cada banda
de cada carril, y anotarlo también en la tabla 5.2.
5.8 Consultando la bibliografía sobre las proteínas presentes en suero y plasma, y empleando los datos
de Peso Molecular que se obtuvieron de las bandas, realizar una presunción sobre que proteína
podría corresponder cada banda y anotarlas en la tabla 5.2
Tabla 5.2. Distancias y PM de las bandas del gel desnaturalizante
Distancia recorrida Cálculo del Peso Correspondencia de la
Carriles Bandas
en cm Molecular en KDa proteína según el peso
Carril 2 Banda 1
Fibrinógeno
No desnaturalizante
Carril 3 Banda 1
Albúmina
No desnaturalizante
Carril 4 Banda 1
Suero
No desnaturalizante Banda 2
Banda 3
Banda 4
Carril 5 Banda 1
Plasma
No desnaturalizante Banda 2
Banda 3
Banda 4
Carril 6 Banda 1
Fibrinógeno
Desnaturalizante Banda 2
Banda 3
Carril 7 Banda 1
Albúmina
Desnaturalizante
Carril 8 Banda 1
Suero
Banda 3
Banda 4
Carril 9 Banda 1
Plasma
Banda 3
Banda 4
33
5.9 En los carriles donde se colocó la albúmina (carriles 3 y 7) determina el peso molecular de la misma
usando la regresión previamente calculada. ¿Es la misma que la teórica? ¿A qué se debe esta
diferencia?
5.10 Este mismo procedimiento realízalo en el carril donde se cargó fibrinógeno, comparando la diferencia
entre las condiciones nativas y las desnaturalizantes ¿A qué se atribuyen estas diferencias?
5.11 Comparar los resultados en el gel del carril de suero y plasma, en condiciones desnaturalizantes y
no desnaturalizantes ¿Se observa el mismo número de bandas?, ¿A qué se atribuyen estas
diferencias?
6. DISCUSIÓN
Para elaborar la discusión de la práctica considera los siguientes puntos:
• ¿Qué es la electroforesis en gel para proteínas y en que sustrato se realiza?
• ¿Las condiciones que se utilizaron en el gel y la función de los reactivos empleados, causan diferencia
en los resultados obtenidos entre suero y plasma? y ¿qué significan estas diferencias?
• La función de usar una muestra de fibrinógeno y albumina
• La importancia de la electroforesis en poliacrilamida, las condiciones nativas mencionando su
aplicación tanto en el área clínica como en la investigación biomédica con ejemplos reales y
específicos.
• Los equipos biomédicos empleados para electroforesis de proteínas. ¿Como podrías construir una
cámara de electroforesis? Menciona los componentes
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, el análisis y la discusión, los objetivos de la práctica y a la
bibliografía consultada elaborar las conclusiones de esta práctica.
8. REFERENCIAS
8.1. Hames, B. D. and D. Rickwood. 1990. Gel Electrophoresis of Proteins. 2ª ed. Irl Press. New York,
USA.
8.2. Nelson, D. L., M. M. Cox. 2018. Lehninger Principios de Bioquímica. 7ª ed. Omega. Barcelona,
España.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28ª ed. Mc Graw Hill. México.
8.4. Coligan, J.E., Dunn, B.M., Speicher, D.W. y Wingfied, P.T. 2018. One dimensional electrophoresis
using non denaturing conditions. Current protocols in protein science.
34
PRÁCTICA 4
USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO: PERFIL
CARDIACO Y PERFIL HEPÁTICO
Unidad II. Aminoácidos, proteínas y enzimas.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno
1.1.1. Determina los niveles séricos de las enzimas empleadas en el diagnóstico cardiaco y hepático.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno
1.2.1. Ensaya métodos espectrofotométricos cinéticos para determinar actividad enzimática.
1.2.2 Realiza la determinación cuantitativa de las enzimas ALT y AST, LDH y CK en suero humano
haciendo uso de un kit de diagnóstico clínico.
1.2.2. Evalúa la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguíneas procesadas en la
determinación de las enzimas y su contribución en las pruebas de laboratorio para la
determinación de afecciones cardiacas y hepáticas.
2. INTRODUCCIÓN
La enzimología encuentra aplicación práctica en el laboratorio clínico, en la medición de los niveles
enzimáticos y de las concentraciones de sustrato en plasma y tejidos de los pacientes para la
determinación de los estados de salud. Los cambios en los niveles enzimáticos en el plasma reflejan
alteraciones en un tejido u órgano específico.
Las enzimas plasmáticas son de dos tipos: las que están presentes en altas concentraciones en el
plasma y tienen una función específica, como las enzimas asociadas a la coagulación de la sangre
(trombina, plasmina, etc.) y las que se encuentran normalmente en muy bajas concentraciones y no
tienen una función en el plasma. Estas son importantes en la determinación de las enfermedades de los
tejidos y los órganos ya que un proceso patológico puede provocar cambios en la permeabilidad de la
membrana celular o incrementar la muerte celular, lo que da origen a la liberación de enzimas
intracelulares en el plasma. Las enzimas citosólicas aparecen en el plasma antes que las enzimas
mitocondriales y cuanto sea mayor la cantidad de tejido dañado, mayor será el incremento en la sangre.
En el diagnóstico de un proceso patológico sería ideal poder identificar enzimas específicas para cada
órgano, aunque el metabolismo de todos los tejidos es muy parecido. Sin embargo, la concentración de
diferentes enzimas varía de tejido a tejido, y la cinética de aparición y desaparición de determinadas
enzimas en el plasma, permite un diagnóstico de un órgano específico. Como ejemplos, la enzima
creatina fosfoquinasa (CPK) se encuentra en el músculo cardiaco, esquelético y cerebro, la enzima
lactato deshidrogenasa (LDH) en el músculo cardiaco, esquelético e hígado, y la enzima aspartato
aminotransferasa (AST o TGO) en el hígado y corazón, lo que implica que la alteración de cualquiera de
estos órganos o tejidos provocará una alteración de los niveles de las enzimas plasmáticas
mencionadas.
En esta práctica se realizarán los ensayos enzimáticos de las principales enzimas involucradas en el
infarto al miocardio y en la lesión hepática, en lo que constituye el Perfil Cardiaco y Perfil Hepático.
El infarto del miocardio es la muerte celular de las miofibrillas, causada por falta de aporte sanguíneo
a una zona del corazón, que es consecuencia de la oclusión (taponamiento) aguda y total de la arteria
35
que irriga dicho territorio. La causa de la oclusión coronaria, en la mayoría de los casos, es debida a la
trombosis (coágulo) consecutiva a la fractura de una placa de ateroma. También puede ocurrir cuando
existe una obstrucción significativa de una arteria coronaria por una placa de ateroma y los cambios de
tono normales de la arteria pueden obstruirla completamente, con o sin ruptura de la placa.
La isquemia (falta de oxígeno) aguda y total o casi total comienza a producir áreas de necrosis en el
tejido cardiaco dentro de la primera hora posterior a la falta de sangre en la región. Después de las
primeras 3 horas posteriores a la oclusión coronaria comienzan a aparecer extensiones de la necrosis
hacia el tercio medio de la pared en la región isquémica. La figura 1 muestra la cinética de liberación de
enzimas cardiacas después de un infarto al miocardio. Este perfil permite establecer cuándo ha tenido
lugar el ataque y si el tratamiento es efectivo.
Fig. 1. Cinética de liberación de enzimas cardiacas después de un infarto
El síntoma característico del infarto es el dolor retro esternal (85% de los casos), opresivo, intenso,
con sensación de muerte inminente, que se proyecta hasta el cuello, hombros, maxilar inferior, brazo
izquierdo o ambos brazos. Habitualmente dura más de 30 minutos, puede prolongarse por varias horas.
No se alivia ni con el reposo ni con los vasodilatadores. Las mujeres tienden a experimentar síntomas
marcadamente distintos que los de los hombres. Los síntomas más comunes en las mujeres son la
disnea, debilidad, fatiga e incluso somnolencia, por lo que el dolor de pecho puede ser menos predictivo
de una isquemia coronaria que en los hombres. Sin embargo, existen otras enfermedades en las que se
presenta dolor torácico, como en la pericarditis aguda, el reflujo gastroesofágico, y otras, por lo que son
necesarias pruebas específicas para cada enfermedad. Estas pruebas son: electrocardiograma, revisión
de síntomas clínicos, y el uso de marcadores bioquímicos de daño al músculo cardiaco.
La determinación de estos marcadores bioquímicos es lo que se conoce como Perfil Cardiaco. La
elevación en la concentración de las enzimas creatina fosfoquinasa (CPK), la transaminasa glutámico
oxaloacética o aspartato aminotransferasa (TGO, AST) y la deshidrogenasa láctica (LDH), y proteínas
como la Troponina son las que tienen valor diagnóstico.
La enzima que se eleva primero es la CPK, lo hace en las primeras 8 horas, alcanza su máximo a las
24 horas y regresa a las cifras normales de 48 a 72 horas. Sin embargo, esta enzima también se eleva
en miopatías, diabetes, intoxicación etílica, trauma muscular, ejercicio exagerado e infarto pulmonar. Se
eleva incluso por la administración de inyecciones intramusculares. De ahí que sea más específica la
medición de la fracción miocárdica (MB) de la CPK, o CPK-2 que es una isoenzima de la CPK, presente
en el corazón. La actividad de la fracción CK-MB se encuentra entre 6 -25% de la actividad total de la
CK.
La LDH se eleva en el suero a las 24 o 48 horas alcanzando su máximo a los 4 o 6 días descendiendo
a cifras normales en 1 o 2 semanas después del infarto.
La troponina es un componente del aparato contráctil del músculo, y los niveles arriba de lo normal
son un buen marcador de daño cardiaco en enfermedades como infarto, miocarditis, angina y cirugía
36
cardiaca. Sus niveles aumentan a las 4-6 horas después del infarto, con un pico a las 24 h, y permanecen
altos por 7-10 días dando un margen más amplio que la CK-MB para determinar daño cardiaco.
El perfil hepático es un conjunto de exámenes de sangre que indican si el hígado está funcionando
normalmente. El hígado se encuentra en el abdomen y está ubicado cerca del estómago. Es un órgano
muy importante, porque descompone y almacenas sustancias como azúcares, grasas y vitaminas. El
hígado también remueve las drogas y otros químicos del cuerpo. La ictericia (piel y ojos amarillos) casi
siempre es causada por problemas en el hígado. Una lista común de exámenes incluye la búsqueda de
enzimas hepáticas que provienen de los tejidos hepáticos dañados. Otras pruebas pueden buscar las
sustancias producidas o cambiadas por el hígado, como la bilirrubina.
Las Aminotransferasas o transaminasas, son las enzimas más útiles en reconocer la enfermedad
hepática aguda. La Aspartato aminotransferasa AST (GOT) se localiza en mitocondria y citoplasma del
hepatocito y en otros tejidos (corazón y músculo). La Alanina aminotransferasa ALT (GPT), con vida
media más corta, sólo en citoplasma, y es indicador más sensible y específico de daño hepatocelular.
Las pruebas bioquímicas realizadas para el diagnóstico de enfermedad hepática incluyen otras como:
• Enzimas de necrosis: ALT, AST, LDH.
• Enzimas de colestasis: FA, GGT.
• Enzimas de masa ocupante: GGT, LDH.
• Enzimas de síntesis: CHE
• Enzimas de fibrinogénesis: GGT
Estudio metabólico:
• Proteico: Albúmina, IgG, Alfafetoproteína.
• Lipídico: Colesterol, TG, Bilirrubina y Ácidos biliares.
• Coagulación: Factores dependientes de vitamina K, (IP) Fibrinógeno.
La utilidad es la detección de una lesión hepática, aunque sea leve, y establecer un diagnóstico
específico, dar seguimiento a la enfermedad, hacer una evaluación del tratamiento, determinación de la
gravedad y pronóstico. Ninguna prueba cubrirá todos los aspectos, siendo precisa la utilización conjunta
de varias de ellas.
Un buen ensayo enzimático se basa en el control de temperatura y pH, así como de las
concentraciones saturantes de sustratos, y cofactores. Para obtenerse esto último debe de conocerse
la Km, y las condiciones de pH y fuerza iónica, que van a utilizarse en el ensayo. Se recordará que la Km
es la concentración de sustrato a mitad de la velocidad máxima (1/2 Vmáx), para asegurarse que el
sistema está saturado, la concentración de sustrato se incrementa entre 5 y 10 veces sobre la K m. Con
la saturación de la enzima por el sustrato, la reacción es de orden cero. En estas condiciones los cambios
de velocidad son proporcionales a la concentración de la enzima. En el laboratorio clínico las condiciones
de ensayo se optimizan de manera rutinaria para las determinaciones enzimáticas. En estos análisis las
enzimas que utilizan a las coenzimas NAD+, NADP+ y FAD (reacciones acopladas) son fáciles de medir
gracias a sus propiedades ópticas. El NADH presenta un máximo de absorción a 340 nm y el FAD
absorbe fuertemente a 450 nm.
Fundamento de los métodos de determinación de enzimas y metabolitos empleados en clínica.
En bioquímica clínica la determinación de enzimas y metabolitos puede llevarse a cabo mediante dos
métodos básicos:
• Métodos químicos colorimétricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un

compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse espectrofotométricamente,
ya que la intensidad del color será directamente proporcional a la concentración de la sustancia
a determinar. La reacción general sería:
Metabolito + Reactivo cromógeno Producto colorido
37
Estas reacciones pueden ser de:

o punto final, si la reacción ocurre y se concluye en un solo momento
o cinéticos, si se lee a diferentes tiempos.
• Métodos enzimáticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen

productos. Estos métodos también pueden ser de punto final, o cinéticos.
Enzima
Sustrato 1 + Sustrato 2 Producto 1 + Producto 2
La determinación de los productos puede ser:
o colorimétrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto
para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las más usadas.
o espectrofotométricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el
producto.
o reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reacción
enzimática (es decir actúa como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por métodos colorimétricos o
espectrofotométricos.
Enzima 1
Sustrato Producto 1
Enzima 2
Producto 1 Producto 2
La reacción que cataliza la AST es la siguiente:
ASAT
α-Cetoglutarato + Aspartato Glutamato + Oxalacetato
Valores de referencia*: Hombres hasta 19 U/L, Mujeres hasta 16 U/l a 25°C
La reacción que cataliza la ALT es la siguiente:

ALAT
L-Alanina + 2-Oxoglutarato Piruvato + L Glutamato
Valores de referencia*: Hombres hasta 22 U/L, Mujeres hasta 18 U/l a 25°C
La reacción que cataliza la LDH es la siguiente:
LDH
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD +
Valores de referencia*: 120-240 U/l a 25°C
La reacción de la CK es como sigue:

CPK
Fosfocreatina + ADP Creatina + ATP
Valores de referencia*: CK: Hombres hasta 80U/l, Mujeres hasta 70U/L a 25°C
CK-MB > 10U/L a 25°C
*Estos valores deberán servir solamente como guía. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio intervalo de
valores normales ya que existen diferencias entre instrumentos, laboratorios y población local.
38
La actividad de estas enzimas se determinará por alguno de los métodos arriba descritos. En el caso
de la CPK, se determinará la fracción CK-MB, y para determinar ésta se empelan anticuerpos que
inhiben la actividad de las otras fracciones. Generalmente se emplean los métodos enzimáticos
• Espectrofotómetro UV – VIS con celdas
• Baño María a 25 -30 °C
• Aguja para Vacutainer®
• Gradilla para tubos
• Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
• Pipetas serológicas de 1 mL
• Micropipetas de 20 - 200 L
• Micropipetas de 2 - 20 L
• Puntas para micropipeta de 20 - 200 L y de 2 - 20 L
3.2 REACTIVOS
• Kit Spinreact ALT/GPT
• Kit Spinreact AST/GOT
• Kit Spinreact LDH.
• Kit Spinreact CK
• Kit Spinreact CK-MB

39
A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.

B. DATOS DEL PACIENTE

4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1, antes de tomar la muestra.
C. PERFIL CARDIACO: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS LACTATO

DESHIDROGENASA (LDH) Y CREATINA FOSFOQUINASA (CK)
PERFIL HEPÁTICO: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST), ALANINA

AMINOTRANSFERASA (ALAT)
4.5 Para la determinación se empelará un kit de diagnóstico clínico para cada una de estas enzimas.
[Dependiendo de la marca del Kit que se utilice para la práctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar].
4.6 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados para su uso. Esto lo realizará el profesor previo a la práctica.
4.7 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que serán proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.7.1 Como se prepara el blanco de reactivos
4.7.2 La temperatura del ensayo
4.7.3 A que longitud de onda (λ) se realiza la determinación
4.7.4 El volumen de Reactivo de trabajo (RT) y de suero que se empleará (el volumen señalado
en el Kit puede modificarse en la práctica).
4.8 Calibrar el espectrofotómetro con agua destilada.
4.9 La determinación de la absorbancia se realizará a 340 nm, cada minuto, durante 5 minutos, sin
tiempo de incubación, según las instrucciones del profesor.
4.10 Anotar los resultados en la tabla 5.2
4.11 En los mismos insertos de cada enzima revisar:
4.11.1 El fundamento de las reacciones para la determinación de cada enzima
4.11.2 Como se define una unidad de enzima para cada caso
4.12 Seguir las instrucciones del profesor para el manejo de resultados y el cálculo de las unidades
enzimáticas por litro (U/l).
40
A. DATOS DEL PACIENTE

5.1 Anotar los datos del paciente en la tabla 5.1
Tabla 5.1
Sexo
Edad
Condición de salud o fisiológica
Toma algún medicamento (cuál)
Ayuno
B. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS AST, ALT, LDH, CK

5.2 Anotar los resultados obtenidos desde tiempo 0 a 5 minutos en la tabla 5.2 y calcular el
ΔAs/minuto obtenido.
Tabla 5.2
As 340 nm
Tiempo (min) AST ALT LDH CK
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Δ As/minuto
5.3 Elaborar las gráficas de As contra tiempo en minutos para cada enzima.
5.4 Para cada curva determinar la zona que se comporta de forma lineal y delimitarla. De esa zona,
determinar la ecuación y anotar la pendiente en la tabla 5.3
Tabla 5.3. Ecuaciones obtenidas con cada enzima y pendiente
Tiempo (min) AST ALT LDH CK
Ecuación de la recta
Valor de la pendiente
5.5 Calcular las unidades de enzima empleando la pendiente de la ecuación obtenida por el factor que
indica el inserto del kit.
𝑈𝐼
𝑑𝑒 𝐴𝑆𝑇 𝑜 𝐴𝐿𝑇 = 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑡𝑎 × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝐿
5.6 Ahora realizar el cálculo usando el A/min que se calculó en la tabla 5.2
𝑈𝐼 ∆𝐴𝑠
𝑑𝑒 𝐴𝑆𝑇 𝑜 𝐴𝐿𝑇 = × 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝐿 𝑚𝑖𝑛
41
5.7 Anotar los valores de Unidades Internacionales de cada enzima, obtenidas con ambos métodos:
con el A/min y con la pendiente de la recta, en la tabla 5.4
Tabla 5.4
AST ALT LDH CPK

UI/L de la enzima calculadas
con la Pendiente de la gráfica
UI/L de la enzima calculadas
con la A/min
5.8 Indicar si existieron diferencias en los valores de U/l calculados con ambos métodos (pendiente y
A/min).
5.9 Escribir las reacciones que se llevan a cabo en los métodos empleados para la determinación de
actividad de cada enzima e indicar cuál es el principio en el que se basa esta detección (químico,
enzimático, punto final, cinético, espectrofotométrico o colorimétrico).
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
Si hubo diferencias obtenidas en los niveles de enzimas calculadas con los dos métodos utilizados o son
similares y explica porque según el caso.
Analiza los valores obtenidos en relación con los valores de referencia y su significado clínico en relación
al perfil cardiaco y al perfil hepático.
La importancia del uso de las enzimas en el diagnóstico clínico y las diferentes patologías que permite
diagnosticar el perfil hepático y el perfil cardiaco, u otras patologías.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, el análisis y la discusión de los mismos y con base en los objetivos de
la práctica y la investigación bibliográfica, elaborar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Henry J. B. 2007. El laboratorio en el diagnóstico clínico. Edición homenaje a Tood-Sanford &
Davidsohn. 1ª ed. Marban. Madrid, España.
8.2. Devlin. T. M. 2015. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 4ª ed.
Reverté. España.
Harper Bioquímica Ilustrada. 28ª ed. Mc Graw Hill. México.
8.4. Canto JG, Goldberg RJ, Hand MM. 2007. Symptom presentation of women with acute coronary
syndromes: myth vs. reality. Arch. Intern. Med. 167 (22): 2405–13.
42
PRÁCTICA 5
GLUCOSA EN SUERO HUMANO: CURVA DE CALIBRACIÓN
Unidad III. Carbohidratos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno
1.1.1. Elabora una Curva de Calibración para la determinación de glucosa en sangre.
1.2 Objetivos particulares:
El alumno
1.2.1. Emplea un método enzimático para la cuantificación de glucosa en sangre.
1.2.2 Evalúa la importancia de los resultados obtenidos de las muestras sanguíneas y su contribución
en las pruebas de laboratorio para la determinación de patologías como la diabetes.
2. INTRODUCCIÓN
La glucosa es la principal fuente de energía de todos los organismos, la cual es utilizada para el
sostenimiento de todos los procesos vitales del individuo, así como para su perpetuación.
En los seres humanos la concentración de glucosa en sangre considerada normal se encuentra entre
los valores de 70 a 100 mg/dl. Los valores por fuera de estos límites se deben a y provocan alteraciones
en la fisiología del organismo propios de la hipoglucemia (valores bajos) o de la hiperglicemia (valores
altos). La hipoglicemia puede convertirse en un problema grave, e inclusive puede ser mortal si los
niveles descienden por debajo de los 50 mg/dl. Sin embargo, la hiperglicemia, es la condición más común
en la población mundial y sus efectos sobre quien la padece son más severos a largo plazo, ya que es
una condición de tipo crónico-degenerativa.
La enfermedad es conocida como diabetes y es una alteración metabólica que afecta a varios órganos
y tejidos del cuerpo, por lo que la cuantificación de la glucosa en sangre es primordial para establecer
un diagnóstico o para evaluar la efectividad del tratamiento aplicado. El diagnóstico temprano de la
enfermedad es de suma importancia para evitar problemas crónicos y efectos secundarios muchos de
los cuales terminan con la vida del paciente.
Se tiene diabetes cuando la concentración de la glucosa del plasma en ayunas es mayor que, o igual
a 126 mg/dl y se tiene una concentración de glucosa del plasma casual (tomada a cualquier hora del
día) igual o mayor a 200 mg/dl, según la NOM-015-SSA2-2010. El valor del examen oral de la tolerancia
a la glucosa (sus siglas son OGTT) es mayor que, o igual a 200 mg/dl cuando se mide en un intervalo
de dos horas. El OGTT es dado sobre un periodo de tres horas. Los niveles entre 100 y 126 mg/dl se
denominan como alteración de la glucosa en ayunas o prediabetes.
Las causas de la diabetes no están bien definidas, es posible que alteraciones genéticas y los factores
ambientales, como pueden ser las malas costumbres de las personas (alimentación, sedentarismo,
obesidad, estrés) sean la causa de que una tolerancia normal a la glucosa se convierta en patológica,
desarrollando la diabetes.
Si bien es posible hacer el análisis en plasma, es más común realizarlo en suero. La determinación
de glucosa en suero puede llevarse a cabo por métodos químicos o enzimáticos, sin embargo, los
métodos químicos han caído en desuso en la mayoría de los laboratorios de análisis clínicos y los
métodos enzimáticos han tomado su lugar, e incluso se han automatizado lo que permite
determinaciones rápidas. Los métodos enzimáticos son altamente específicos y se emplean diferentes
43
enzimas, con reacciones acopladas, en las que la determinación del analito es indirecta pues lo que
propiamente es evaluado por el aparato es el producto final de la reacción que puede ser una sustancia
colorida o no, pero que tiene una absorción específica a cierta longitud de onda.
En el método de la glucosa-oxidasa, esta enzima reacciona sobre la glucosa para transformarla en
ácido glucónico y producir peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno reacciona con un aceptor
de oxígeno cromogénico (por ej. la aminofenazona) en una reacción catalizada por la peroxidasa.
Glucosa Oxidasa No enzimático

Glucosa + O2 D- Gluconolactona + H2O2 Acido glucónico
Peroxidasa
2 H2O2 + p - hidroxibenzoato + 4-Aminofenazona Quinominina colorida
Este aceptor cambia de color y la intensidad del mismo se puede determinar por el espectrofotómetro,
siendo el color directamente proporcional a la concentración de glucosa presente al inicio de esta cadena
de reacciones. El método tiene algunas interferencias como sería la presencia de ácido úrico, creatinina,
ácido ascórbico y sustancias reductoras en general. El método del electrodo de glucosa oxidasa-oxígeno
determina la concentración de la glucosa mediante un electrodo, en el que el peróxido generado se
elimina por reacción con etanol y yodo, lo que evalúa el electrodo es la tasa de consumo de oxígeno. El
método es preciso y lineal y carece de interferencias.
Todo análisis químico requiere ciertas consideraciones antes de realizarlo, entre otras; las
condiciones de obtención de la muestra para el análisis, el tratamiento de la muestra, la preparación de
materiales y la utilización de estándares de referencia.
Para tener la certeza que el método dará el resultado correcto, el método se prueba con muestras en
composición similar y con un contenido de analito exactamente conocido.
Curva tipo, Curva estándar o Curva de Calibración

La determinación de cualquier sustancia puede ser evaluada utilizando un equipo o instrumento. En
el laboratorio de análisis clínicos el instrumento más comúnmente usado es el espectrofotómetro el cuál
determina la Transmitancia (%T) o la Absorbancia (As). El % de T o la As obtenida son proporcionales
a la cantidad o concentración de x presente en la muestra (𝐶𝑥). Esto se expresa en la ecuación 4.1:
𝐴𝑠 𝑜 % 𝑇 = 𝐾 𝐶𝑥 + 𝑏 Ec. 4.1
Donde 𝐾 es una constante de proporcionalidad, indicada por la pendiente de la recta, que entre mayor
sea, indica una mayor sensibilidad del método. Es muy posible que aún si la concentración de x (𝐶𝑥) es
igual a cero de todos modos se genere una respuesta, aunque muy pequeña (es la respuesta en blanco
b). Es claro que el aparato no da valores de 𝐶𝑥 sino que da valores de As o %T, por lo que para conocer
𝐶𝑥 se deben emplear estándares de referencia o patrones.
Los estándares de referencia que contienen la sustancia X se preparan en las mismas condiciones
que la muestra de tal manera que cubran el rango que se supone para 𝐶𝑥 en la misma. Además, se
incluye un blanco que contiene todos los reactivos empleados en la prueba, excepto la sustancia X. El
instrumento se ajusta a cero con agua destilada (blanco) y determina la As o el %T para la serie de
patrones. Un paso previo al ajuste del instrumento es la selección de la longitud de onda (λ), que debe
ser aquella que proporcione los resultados con la máxima absorbancia, para asegurar una mayor
sensibilidad.
Con los resultados obtenidos a partir de los estándares se construye una gráfica de 𝐶𝑥 vs As (o %T)
ó Curva de calibración y se debe obtener una ecuación como la 4.1. A partir de la ecuación y una vez
calculadas las constantes m y b, podemos despejar el valor de 𝐶𝑥:
𝑏
𝐶 𝑥 = 𝐴𝑠 − Ec. 4.2
𝑚
44
Una curva estándar ideal es aquella donde los puntos de la gráfica se encuentran en una línea recta,
sin desviación y con una b igual a cero. Las curvas estándar o de calibración reales deben encontrarse
cerca de este ideal, para lo cual se determina el coeficiente de correlación r y el valor de b. El coeficiente
de correlación determina la relación lineal entre dos variables, en este caso entre As y la concentración
de nuestro analito, la glucosa y es un indicativo de la desviación de cada punto de la recta ideal. Un r
igual a 1.0 indica una correlación perfecta entre ambas variables, y si una varia, la otra lo hace en la
misma proporción. Si r es 0 (cero) no existe correlación. Para nuestros fines se busca lo más cercano a
este ideal y que sería un r cercano a 0.995 y una b cercana a 0.
En esta práctica construiremos una curva tipo de glucosa y se empleará en la determinación de
glucosa en sangre mediante una técnica enzimática.
• Espectrofotómetro VIS con celdas
• Baño María a 37°C
• Agujas para Vacutainer®
• 9 tubos de ensaye de 13x100
• 1 micropipeta 100 – 1000 uL
• 1 micropipeta de 0.5 - 10uL
• Puntas para Micropipeta de 0.5 - 10uL
3.2 REACTIVOS
• Kit para determinación de glucosa, por el método de glucosa oxidasa (GOD).
• Serie estándares de referencia de glucosa de 40 mg/dl, 60 mg/dl, 80 mg/dl, 100 mg/dl, 120 mg/dl
y 140 mg/dl.
• Control o Patrón de glucosa de 100 mg/dl (incluido en el kit por el fabricante)

45

Vacutainer® con gel.
4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm.
B. ELABORACIÓN DE LA CURVA TIPO DE GLUCOSA.

4.4 Rotular una serie de 9 tubos de ensayo de 12 x 70 como indica la tabla 4.1
4.5 Adicionar los reactivos en el orden que señala la tabla.
Tabla 4.1
Reactivo de Trabajo (RT)
Tubo Adicionar 10 μl de:
(mL)
1 Estándar de glucosa de 40 mg/dl 1
7 Patrón del kit de 100 mg/dl 1
8 Muestra de suero 1
9 Blanco (agua) 1
* El reactivo de trabajo, es el que contiene el kit de determinación de glucosa usando la glucosa oxidasa y 4 –
aminofenazona. Consultar el inserto para revisar la reacción de desarrollo de color.
4.6 Colocar los tubos en Baño María a 37°C durante 10min o permitir el desarrollo de color a
temperatura ambiente durante 30 minutos.
4.7 Dejarlos enfriar y leer la absorbancia a 505nm en el espectrofotómetro. Ajustar a cero de As con el
blanco.
4.8 Registrar los resultados en la tabla 5.1
46

5.1 Anotar los resultados de la curva de calibración o curva tipo de los otros equipos en la tabla 5.1.
Tabla 5.1
Concentración del estándar As 505 nm

de glucosa en mg/dl
40
60
80
100
120
140
5.2 Elaborar la curva de calibración en papel milimétrico, colocando en el eje de las X (abscisas) el valor
de concentración de los estándares -variable independiente- y en el eje de las Y (ordenadas) la
Absorbancia obtenida a 505 nm (variable dependiente).
5.3 Calcular la ecuación de esa recta y el coeficiente de calibración y anotarlos en la tabla 5. 4.
5.4 Ahora anotar los resultados de la curva de calibración o curva tipo de los otros equipos del grupo en
la tabla 5.2.
Tabla 5.2
Equipo As 505 nm
1 2 3 4 5 6
40 mg/dL 60 mg/dL 80 mg/dL 100 mg/dL 120 mg/dL 140 mg/dL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
𝑥̅
s
5.5 Calcular la media y la desviación estándar de las As obtenidas para cada concentración de glucosa
y anotarlos en la misma tabla 5.2.
47
5.6 Con estas medias calculadas, elaborar una nueva curva de calibración en papel milimétrico,
colocando en el eje de las X (abscisas) el valor de concentración de los estándares -variable
independiente- y en el eje de las Y (ordenadas) la Absorbancia (variable dependiente).
5.7 Calcular la ecuación de esa recta y el coeficiente de correlación y anotarlos en la tabla 5.4.
5.8 Para estos datos se debe realizar la prueba de Q según el siguiente procedimiento:
5.9 Ordenar los datos de cada conjunto de valores de menor a mayor (x1, x2, …, xn). Para este caso, los
tubos de la misma concentración de la curva tipo en los diferentes equipos suponen un conjunto de
valores.
5.10 Determinar el valor de QR para los valores extremos (el primer valor, es el de menor valor: x1, y el
último valor es el valor más alto: xn) en cada conjunto de datos, mediante las siguientes ecuaciones:
Para 𝑥1 (primer valor)
𝑥1+𝑖 − 𝑥1
𝑄𝑅 =
𝑥𝑛 − 𝑥1
Donde i puede tomar un valor de 1 o 2, dependiendo de la cantidad de datos que conformen el

conjunto.
Para 𝑥𝑛 (el último valor)
𝑥𝑛 − 𝑥𝑛−𝑖
𝑄𝑅 =
𝑥𝑛 − 𝑥1
5.11 El valor sospechoso es aquel dato que está muy alejado del promedio, por ello se prueban primero
los extremos de cada conjunto. El QR se debe comparar con los valores críticos de Q que se
encuentran en la tabla 5.6, estableciendo los grados de libertad (tamaño de la muestra) dependiendo
del número de veces que se midió una misma concentración y el nivel de confianza, la probabilidad
de que el parámetro a estimar se encuentre en el intervalo de confianza. Los niveles de confianza
más usuales son: 90%; 95% y 99%.
Si QR < Q el valor sospechoso pertenece a la muestra, por lo tanto, se mantiene para el análisis, es
decir se acepta. En el caso de que QR > Q el dato no pertenece a la muestra, por lo tanto, se rechaza.
5.12 Calcular los valores de QR para el resto de los datos, utilizando la primera ecuación, sustituyendo
el primer valor, 1 por el segundo (2), el tercero (3) y así sucesivamente. Los datos rechazados se
marcarán en rojo.
5.13 Anotar solamente los datos aceptados en una nueva la tabla global del grupo 5.3. Con estos datos
aceptados, calcular una nueva media (𝑥 ) y desviación estándar (s) para cada concentración y anotar
los resultados en la misma tabla.
48
Tabla 5.3
Equipo As 505 nm
1 2 3 4 5 6
40 mg/dL 60 mg/dL 80 mg/dL 100 mg/dL 120 mg/dL 140 mg/dL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
𝑥̅
s
5.14 Con estos promedios (𝑥̅ ) de los datos aceptados elaborar en papel milimétrico una tercera curva
de calibración colocando en el eje de las X (abscisas) el valor de concentración promedio de cada
concentración de los estándares y en el eje de las Y (ordenadas) el valor promedio de As.
5.15 Mediante regresión lineal determinar la ecuación y el coeficiente de correlación que describe la
mejor curva tipo y anotarlos en la tabla 5.4,
Tabla 5.4
Datos Ecuación r
Solo del equipo
Grupal sin procesar
Grupal con datos aceptados
5.16 Calcular el valor de la concentración del patrón de glucosa y de la concentración de glucosa en la

muestra de suero (muestra problema) y empleando cada una de las ecuaciones y comparar los
diferentes valores con los obtenidos en la tabla 5.5.
Tabla 5.5
Ecuación Concentración real Concentración del Concentración de Glc.
del patrón de Glc. patrón de Glc. obtenida en la muestra de suero
Solo del equipo
Grupal
Grupal con datos
aceptados
49
5.17 Calcular el % de error que se tuvo en la concentración de glucosa del patrón con la siguiente
ecuación, y reportarla.
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 = 𝑥 100
𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
Tabla 5.6 Valores críticos de Q para el Test de Dixon
en función del número de determinaciones y el nivel de confianza.
n CL 70% 80% 90% 95% 98% 99% 99,50%
SL 30% 20% 10% 5% 2% 1% 0,50%
Α 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 0,005
4 0,7351 0,8226 0,9105 0,955 0,982 0,991 0,9955
5 0,5244 0,6147 0,7281 0,8064 0,8762 0,912 0,9376
6 0,4208 0,502 0,6098 0,6916 0,7722 0,8185 0,8544
7 0,3589 0,4328 0,5332 0,6111 0,6918 0,7399 0,7812
8 0,3177 0,3858 0,4793 0,5539 0,6321 0,6808 0,7226
9 0,2883 0,3519 0,4404 0,5114 0,5876 0,6346 0,6757
10 0,266 0,326 0,4102 0,4778 0,5509 0,5972 0,6375
11 0,2483 0,3054 0,3857 0,451 0,5215 0,5663 0,6055
12 0,2341 0,2886 0,366 0,4291 0,4977 0,5412 0,5796
13 0,2223 0,2747 0,3496 0,4111 0,478 0,5208 0,5581
14 0,2125 0,2632 0,3357 0,3955 0,4605 0,5026 0,5396
15 0,2039 0,253 0,3236 0,3819 0,4456 0,4868 0,5229
16 0,1965 0,2443 0,3129 0,3698 0,4322 0,4723 0,508
17 0,19 0,2365 0,3037 0,3594 0,4204 0,4595 0,4945
18 0,1843 0,2297 0,2952 0,35 0,4102 0,4495 0,4845
19 0,1791 0,2235 0,2878 0,3418 0,401 0,4395 0,4734
20 0,1744 0,2178 0,281 0,334 0,3926 0,4303 0,4639
21 0,1703 0,2128 0,2747 0,3271 0,3847 0,422 0,4551
22 0,1664 0,2083 0,2692 0,3207 0,3776 0,4143 0,4472
6. DISCUSIÓN
• Que es una curva de calibración o curva tipo
• Las características que debe poseer una curva tipo
• La importancia de la curva tipo en los análisis clínicos, y con los equipos automatizados. Cuál es
el objetivo de hacer un análisis estadístico en esta práctica, y cuál es su importancia en el
laboratorio clínico.
• Definir que es un patrón en las determinaciones de bioquímica clínica, mencionando las
características que debe tener y su importancia.
• Plantear la importancia del blanco en la elaboración de la curva tipo.
• Analizar las diferencias de concentración en los patrones y en el suero obtenidas con las
diferentes ecuaciones, su significado e importancia.
50
• Explicar que es un error sistemático y que un error aleatorio. Da ejemplos tanto de errores
sistemáticos como aleatorios en los experimentos realizados.
• Analizar el porcentaje de error obtenido con las diferentes curvas tipo, considerando todas las
posibles causas de error en los resultados experimentales y como disminuir ese error.
• Fundamentos del método de determinación de glucosa y sus características.
• La importancia de las determinaciones de glucosa en suero, para la prevención y tratamientos
de las hiperglicemias o diabetes.
• Cuál es el criterio para establecer que un paciente padece diabetes y que tipos de esta
enfermedad son los más frecuentes. Para ello revisar la NOM-015-SSA2-2010
• Cuáles son las consecuencias de la diabetes.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar si se
cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1. Bernard H, John. 1988. Todd-Sanford-Davidson: Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el
Laboratorio. Tomo I. 8ª ed. Salvat Editores. Barcelona, España.
8.3. Day R. A. and Underwood A. L. 1997. Química Analítica Cuantitativa. 5a ed. Prentice Hall
Latinoamérica. México.
8.4. Ramette W, Richard. 1983. Equilibrio y Análisis Químico. Fondo Educativo Interamericano. E.U.A.
8.5. Dean, R.B. y Dixon, W. J. 1951. Simplified statistics for small number of observations. Analytical
chemistry. 23: 4, 636-638.
8.6. MÉXICO. SECRETARIA DE SALUD. NOM-015-SSA2-2010, Para la prevención, tratamiento y
control de la diabetes mellitus. NOM-015-SSA2-2010. Diario oficial de la federación. 23 de
noviembre de 2010.
8.7. Spinreact. Glucosa. Trinder. GOD-POD. Consultado el 28-01-2020. Disponible en
http://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/1001190.pdf
51
PRÁCTICA 6
OBTENCION DE VALORES DE REFERENCIA DE
TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD IV: Lípidos y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
El alumno
1.1.1. Determina experimentalmente valores de referencia de triglicéridos y colesterol.
El alumno
1.2.1. Realiza el análisis enzimático de triglicéridos y colesterol en suero humano
1.2.2. Obtiene valores de referencia con base en las determinaciones realizadas
1.2.3. Analiza la relación entre los valores obtenidos y las hiperlipidemias, definidas en la NOM-037-
SSA2-2012
2. INTRODUCCIÓN
Los lípidos son un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas compuestas principalmente por
carbono, hidrógeno y oxígeno, y cuya característica principal el ser hidrofóbicas o insolubles en agua y
solubles en solventes orgánicos como el benceno, cloroformo, éter, etc.
Los lípidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales están las siguientes:
1.- Estructural.
2.- Reserva energética.
3.- Transporte de algunos compuestos energéticamente activos (lipoproteínas)
4.- Vitaminas (vitamina D) y hormonas (progesterona, testosterona, estrógenos, corticoides).
5.- Aislante térmico y como protección alrededor de ciertos órganos.
Los ácidos grasos se almacenan como triglicéridos (TG). Para utilizar la energía de los ácidos
grasos, primero deben ser liberados de los triacilgliceroles (TAG), y después ser transportados de los
tejidos periféricos a las mitocondrias para su degradación metabólica. El catabolismo se realiza por la
vía de la β-oxidación, que es un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA. Este compuesto
posteriormente continúa su degradación en el ciclo de Krebs.
Otro lípido importante es el colesterol, el cuál es un esteroide presente en las células de los tejidos
animales, hidrofóbico, poco soluble en medio acuoso, donde se puede encontrar libre o esterificado con
ácidos grasos. Se une a diversas proteínas formando las lipoproteínas plasmáticas. La determinación
de la concentración plasmática de colesterol tiene gran interés clínico, pues está demostrada la relación
entre los niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y cardiopatía isquémica.
Los lípidos se transportan en la sangre como complejos lipoproteícos, los cuales se componen de
proteínas específicas y de combinaciones de triacilglicéridos, colesterol y ésteres de colesterol,
denominadas lipoproteínas o apolipoproteínas. Los lípidos y las proteínas están asociados como
complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoproteínas se clasifican en:
Quilomicrones: Estas lipoproteínas son las menos densas y se componen de 98 a 99% de lípidos,
principalmente de TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa de proteínas
52
y lípidos polares. Estos se ensamblan en el intestino con los lípidos de la dieta y se absorben al torrente
sanguíneo para ser transportados a los tejidos periféricos. Ahí, una lipoproteína lipasa libera los ácidos
grasos de los TAG.
Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL): Son agregados moleculares que se forman en el
hígado con los TAG que ahí se sintetizan, su función es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos
periféricos para ser almacenados o para utilizarse como fuente de energía. Los ácidos grasos se liberan
por acción de la lipasa.
Lipoproteínas de baja densidad (LDL): Estas partículas son las principales transportadoras de
colesterol en la sangre, movilizan a los ésteres de colesterol del hígado donde se sintetizan, hacia los
tejidos periféricos. Los lípidos predominantes son los ésteres de colesterol que contiene un ácido graso
poliinsaturado (ácido linoleico).
Lipoproteínas de alta densidad (HDL): Éstas son las que tienen mayor contenido de proteínas de
todas las lipoproteínas (55% de proteína, 45% de lípidos) por lo que son más densas. Los principales
lípidos que transportan son el colesterol y ésteres de colesterol, y a diferencia de las LDL, movilizan al
colesterol en dirección contraria, es decir, desde el tejido periférico hacia el hígado. Durante su recorrido
por el torrente sanguíneo atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hígado. A las HDL, se les conoce
como el colesterol “bueno” porque disminuyen los niveles plasmáticos de este.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades físicas y composición de las principales
lipoproteínas:
Tabla 1
Composición (% peso)
Lipoproteína Densidad Diámetro Proteínas Colesterol Fosfolípidos Triacilglicéridos
(g/mL) (Å) TAG
Quilomicrones <0.95 800-5000 2 4 9 85
VLDL 0.95-1.0 300-800 10 20 20 50
LDL 1.0-1.063 180-280 25 45 20 10
HDL 1.063-1.2 50-120 55 17 24 4
Implicaciones clínicas.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en
exceso es potencialmente dañino. Su transporte por las lipoproteínas y la captura por las células está
regulado. El proceso de captación inicia con la unión de las LDL que contienen colesterol con lugares
de unión específicos en las células, conocidos como receptores proteicos de la membrana plasmática.
Las LDL se invaginan en la membrana plasmática y se fusionan como parte de ella para formar una
vesícula endocítica. Dentro de la célula, la vesícula se fusiona con los lisosomas, y las enzimas
lisosomales catalizan la hidrólisis de los ésteres de ácido graso dejando al colesterol libre para la
construcción de membranas.
Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles elevados de colesterol sanguíneo hasta de 700
mg/100 mL) es un defecto genético donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y
desarrollan el síndrome conocido como hipercolesterolemia familiar. El colesterol se deposita como
placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias). Muchas de las personas
que padecen esta enfermedad mueren jóvenes y ataques cardiacos.
La aterosclerosis es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. Existe una
correlación entre los niveles de colesterol sanguíneo y la concentración de lipoproteínas. Los individuos
con altos niveles séricos de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor incidencia de ataques
cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor concentración de
HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
53
Determinación de lípidos y valores de referencia.

Los valores de referencia es la herramienta de toma de decisiones médicas más utilizada. Es central
para la determinación del estado de salud de un individuo y para la toma de decisiones médicas.
Para establecer los valores de referencia de un indicador bioquímico, se debe realizar un diseño
clínico que defina con precisión la población sobre la que se realizarán los estudios, considerando edad,
sexo, condición de salud, incluyendo grupos de pacientes sanos asintomáticos y los declarados
enfermos, los criterios de exclusión de pacientes, los consentimientos informados, el tamaño de la
muestra y la técnica de realización del análisis bioquímico.
Los valores de referencia biológicos dependen de la población de referencia. Esta cuestión es
importante, ya que es posible que, los valores de referencia biológicos de indicador bioquímica de
individuos sanos mexicanos pueden ser diferentes de los observados en individuos sanos de los
países mediterráneos. Por otro lado, los valores de referencia biológicos también dependen del
procedimiento empleado para la medida de esta. Un laboratorio clínico puede establecer sus propios
valores de referencia o emplear los reportados en estudios clínicos o por agencias gubernamentales.
Una vez que se colecten los datos, se realizará un análisis estadístico de los datos obtenidos sobre
pacientes sanos para establecer los límites confiables en cada caso.
Una vez obtenidos los valores de referencia biológicos, hay que eliminar, si los hay, los valores
aberrantes. Un valor aberrante es un valor extremadamente alto o bajo que se sitúa fuera de un
intervalo de tolerancia definido con todos los valores del conjunto.
Las variables biológicas muestran por lo general, una distribución Gaussiana, también llamada
Normal. Se considera un intervalo normal o de referencia aquel que se encuentra entre la media +/- dos
veces la desviación estándar, la cual abarca el 95% de los datos, de los pacientes sanos asintomáticos.
Fig. 1 Distribución Gaussiana
Se toman los cuantiles 0,025 y 0,975 como los límites de referencia biológicos poblacionales de los
valores de referencia biológicos. La estimación paramétrica de los cuantiles 0,025 y 0,975 se basa
en la propiedad que tiene las distribuciones de Laplace-Gauss de que el intervalo definido por 𝑥̃
±1,96 s contiene el 95% central de los valores y que, por lo tanto, 𝑥̃ - 1,96 s y 𝑥̃ + 1,96 s coinciden
con los cuantiles citados. Así, cuando la distribución de los valores de referencia biológicos, o los
de una transformada matemática de estos, sigue la ley de Laplace-Gauss, la estimación de los
límites de referencia biológicos queda reducida esencialmente al cálculo de la 𝑥 ̃y la s de los valores
de referencia biológicos.
Un resultado fuera de este intervalo indica la probabilidad de enfermedad, pero existe un 2.5% de
los valores de personas sanas que pueden caer fuera del límite, a estos se les conoce como falsos
positivos. Por otro lado, la enfermedad tiene su propia distribución normal, que puede traslaparse al
intervalo de referencia, a estos se les conoce como falsos negativos.
54
Fundamentos de los métodos empleados:

Los métodos empleados para la determinación de Triglicéridos (TG) y Colesterol (CHL) son en
general:
• Métodos enzimáticos: emplean enzimas para la detección de estos metabolitos
Sustrato + Enzima Producto
• Punto final, es decir, la reacción ocurre y se concluye en un solo momento
Y la determinación de los productos, es:
o Colorimétrica, del tipo Trinder
Los primeros métodos para la determinación del colesterol se basaban en la formación de
compuestos coloridos mediante reacciones químicas del colesterol. No obstante, debido a los líquidos
corrosivos que utilizan, estos métodos actualmente no se suelen emplear para los análisis de rutina, y
se prefieren los métodos enzimáticos, específicos, de fácil manejo y de gran sensibilidad.
En estos métodos enzimáticos, la primera reacción consiste en la hidrólisis de los ésteres de
colesterol por acción de esterasas bacterianas inespecíficas con respecto al ácido graso esterificado; a
continuación, se produce la oxidación del colesterol (el formado en la reacción anterior y el preexistente,
o colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, produciéndose H2O2, el cual con la
participación de peroxidasa da lugar a la formación de un compuesto colorido. El esquema de las
reacciones acopladas es el siguiente:
CHE CHOD
Ésteres colesterol Colesterol + O2 4-Colestenona + H2O2
POD
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona + 4H+ Quinonimina (Compuesto colorido)
CHE: Colesterol esterasa CHOD: Colesterol oxidasa POD: Peroxidasa
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la

muestra ensayada.
La lipoprotein lipasa (LPL) hidroliza a los triglicéridos, liberando glicerol y ácidos grasos libres. El
glicerol es fosforilado por la acción de la enzima glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato
(G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido
de hidrogeno (H2O2) por GPO. Al final, el peróxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4-aminofenazona
(4-AF) y p-clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja, cuya
intensidad es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra:
LPL
Triglicéridos + H2O Glicerol + Ácidos grasos libres
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP G3P+ ADP
GPO
G3P + O2 H2O2+ DAP
POD
H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol + H Quinona (Complejo de color rojo)
LPL: Lipoproteín lipasa GPO: Glicerol -3- oxidasa POD: Peroxidasa
55
• Espectrofotómetro UV-VIS con celdas
• Tubo Vacutainer® con gel.
• 1 gradilla
• 5 tubos de 13 x 100 mm
• 1 pipeta de 1 mL
• 1 micropipeta de 2 - 20uL
• Puntas para Micropipeta de 2 - 20uL
3.2 REACTIVOS
• Kit para la determinación de Triglicéridos en suero.
• Kit para la determinación de Colesterol en suero.

56
A. OBTENCIÓN DE SUERO HUMANO.

Para estas determinaciones el paciente deberá guardar ayuno de al menos 6 horas, y evitar el
consumo de grasas durante 24 horas previas.
4.1 En condiciones asépticas, obtener aproximadamente 5 ml de sangre periférica en un tubo

4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
B. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL Y TRIGLICÉRIDOS EN SUERO.

Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.
4.5 En los kits, el sustrato y las enzimas y reactivos usados se encuentran liofilizados y deben ser
reconstituidos, es decir solubilizados, para su uso. Esto lo realizará el profesor previo a la práctica.
4.6 Seguir las instrucciones que indique el inserto de cada uno de los kits que serán proporcionadas
por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 cómo preparar el blanco de reactivos
4.6.2 cómo se procesará la muestra de suero obtenida y la temperatura de reacción
4.6.3 a que longitud de onda se realizará la lectura
4.6.4 cómo se calcula la concentración de Triglicéridos (TGL) y Colesterol (CHL) en el suero
4.6.5 el fundamento de las reacciones que se usan en la determinación
4.6.6 interferencias, precisión y exactitud del método
4.8 Tomar la lectura de acuerdo a las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados del equipo en la tabla 5.2
4.10 Se emplearán los datos obtenidos por todos los equipos del grupo, y datos de años anteriores
para el análisis estadístico, los cuáles serán proporcionados por el profesor.
57

Tabla 5.1
Sexo
Edad
Ayuno
IMC
B. DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL

5.2 Anotar los resultados de las lecturas de As en la tabla 5.2.
Tabla 5.2
Tubo As 505 nm para As 505 nm para
TGL CHL
Patrón
Muestra de suero
5.3 Calcular la concentración de colesterol y triglicéridos en la muestra empleando las fórmulas

correspondientes. Anotar el resultado en la tabla 5.3
Tabla 5.3
Tubo Concentración de Concentración de
triglicéridos mg/dl colesterol mg/dl
Muestra de suero
5.4 Anotar los resultados obtenidos de cada equipo del grupo en la tabla 5.4 y realizar el cálculo de la
media x y la desviación estándar s
Tabla 5.4
TGL mg/mL CHL mg/mL
Valores del equipo 1
̅
𝒙
s
58
5.5 En función de estos resultados anotar los valores promedio que se obtuvieron para TGL y para CHL
en el grupo:
TGL en mg/dl
CHL en mg/dl
5.6 El profesor proporcionará los datos de los alumnos de bioquímica clínica de años anteriores, con el
fin de aumentar el tamaño de muestra y hacer un análisis estadístico confiable. Determina la
frecuencia de todos los datos (pasados y presentes) en los intervalos señalados en la tabla 5.5.
Tabla 5.5
Colesterol Triglicéridos
Intervalo Frecuencia Intervalo Frecuencia Intervalo Frecuencia Intervalo Frecuencia
de valores de valores de valores de valores
0-9.9 110-119.9 0-9.9 110-119.9
10-19.9 120-129.9 10-19.9 120-129.9
20-29.9 130-139.9 20-29.9 130-139.9
30-39.9 140-149.9 30-39.9 140-149.9
40-49.9 150-159.9 40-49.9 150-159.9
50-59.9 160-169.9 50-59.9 160-169.9
60-69.9 170-179.9 60-69.9 170-179.9
70-79.9 180-189.9 70-79.9 180-189.9
80-89.9 190-199.9 80-89.9 190-199.9
90-99.9 90-99.9 200-209.9
100-109.9 100-109.9 210-219.9
5.7 Una vez agrupados, realizar un histograma de frecuencias. Calcular la media (𝑥̅ ) y la desviación
estándar (s), así como la mediana. Anota estos valores en la tabla 5.6.
Tabla 5.6. valores de media y desviación estándar calculados
Triglicéridos Colesterol
Media (𝑥̅ )
desviación estándar (s)
5.8 Sobre la gráfica del histograma, marcar la media (𝑥̅ ) de los datos y señalar dos veces la desviación
estándar (s) a ambos lados de la media. Con estos puntos representar la forma de la curva normal.
Estos son los que se consideran los valores de referencia calculados.
5.9 Los datos que queden fuera de esta curva se considera que no pertenecen a la población de
personas “sanas” por lo que deben descartarse para la determinación de los valores de referencia,
tomando únicamente los datos que queden dentro de la curva determina la media y el intervalo de
referencia, solo que ahora para la población de alumnos de la UPIBI.
5.10 Anotar los valores de referencia calculados a partir de los datos y los valores de referencia
reportados en la NOM-037-SSA2-2012. Para la prevención, tratamiento y control de las dislipidemias,
la tabla 5.7.
59
Tabla 5.7. Valores de referencia calculados y referenciados en la NOM

Valores de referencia calculados en esta Valores de referencia según la NOM-037-
práctica para SSA2-2012 para
Triglicéridos Colesterol Triglicéridos Colesterol
5.11 Compara ambos datos, y discute las semejanzas o diferencias.
6. DISCUSIÓN
• Como se define un valor de referencia.
• Cuál es el uso e importancia de un valor de referencia.
• La metodología y criterios para establecerlos en una población.
• Analizar los valores de referencia que se obtuvieron con los datos proporcionados, en relación a
con qué tipo de población se obtuvieron, y si esos datos pueden emplearse en el diagnóstico de
la población en general.
• Asimismo, analizar si el diseño del estudio clínico empleado en esta práctica cumple con los
criterios establecidos para determinar los valores de referencia.
• Por qué es importante que cada laboratorio establezca sus valores normales y qué tomarías en
cuenta para calcular estos valores.
• Investigar los valores de referencia de la población mexicana y compararlos con los resultados
que se obtuvieron en esta práctica. Existen otros factores que se utilizan para la determinación
de estos valores de referencia
• La importancia de las determinaciones de TGL y CHL en clínica, los métodos empleados en
esas determinaciones y su uso en equipos automatizados.
• Investiga que son y para que se determinan las HDL, LDL y VLDL
• Investiga si existe correlación entre el IMC y los valores de TGL y CHL obtenidos
• Los valores promedio de TGL y CHL en el grupo y que significado clínico tienen. Al final
comparar esos valores del grupo, con los de la población estudiada (de UPIBI).
• La sensibilidad y especificidad en la prueba para determinar TGL y CHL y compara estos valores
con otras enfermedades.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la práctica y la
investigación bibliográfica, elaborar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Berg, J. M., Tymozko, J. L. y Stryer, L. 2013. Bioquímica. Con aplicaciones clínicas. 7° ed. Ed.
Reverté. Barcelona.
8.2. Devlin. T. 2004. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4ª. Ed. Reverté S.A.,
España.
8.3. McPherson R.A., Pincus M.R. 2011. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods. Todd-Sanford. 22ª. ed. Saunders. United States.
Harper Bioquímica Ilustrada. 22ª. ed. Mc Graw Hill. México.
60
8.5. MÉXICO. SECRETARIA DE SALUD. Norma Oficial mexicana NOM-037-SSA-2012, Para la

prevención y tratamiento de las dislipidemias. NOM-037-SSA2-2012. Diario oficial de la federación.
13 de julio de 2012.
8.6. Clinical and Laboratory Standards Institute. Defining, establishing, and verifying reference
intervals in the clinical laboratory; proposed guideline—Third Edition CLSI document C28-P3.
Wayne: CLSI; 2008.
61
PRÁCTICA 7
DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y ACIDO URICO.
UNIDAD V: Compuestos nitrogenados y su metabolismo.
UNIDAD V: Compuestos nitrogenados y su metabolismo.
1. OBJETIVOS
El alumno
1.1.1. Realiza la determinación cuantitativa de urea, creatinina y ácido úrico en suero humano mediante
el empleo de kits de diagnóstico clínico.
El alumno
1.2.1. Realiza el diagnóstico clínico de las muestras sanguíneas procesadas a través del análisis de los
resultados obtenidos.
2. INTRODUCCIÓN
Existen en circulación en la sangre más de 15 compuestos nitrogenados no proteicos diferentes,
como aminoácidos, urea, ácido úrico, creatinina y amoniaco.
La urea es el principal compuesto nitrogenado no proteico del plasma (45% del total) y es el metabolito
resultante del metabolismo de las proteínas. Se forma en el hígado a partir de la destrucción de las
proteínas. Durante la digestión, las proteínas son separadas en aminoácidos; éstos contienen nitrógeno
que se libera como ion amonio, y el resto de la molécula se utiliza para generar energía en las células y
tejidos. El amonio se une a pequeñas moléculas para producir urea, la cual aparece en la sangre y es
eliminada por la orina. Si el riñón no funciona bien la urea se acumula en la sangre y se eleva su
concentración.
Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en:
• Dietas con exceso de proteínas
• Enfermedades renales
• Fallo cardiaco
• Hemorragias gastrointestinales
• Hipovolemia (quemaduras, deshidratación)
• Inanición
• Obstrucciones renales (piedras, tumores)
Puede aparecer la urea disminuida en:
• Dieta pobre en proteínas
• Fallo hepático
• Embarazo
• Exceso de hidratación
• Malnutrición
La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, que es un componente de los músculos
y no es reutilizable en el metabolismo del cuerpo. La creatinina puede ser transformada en ATP que es
una fuente de alta energía para las células. La formación de la creatina es constante, y los niveles suelen
62
ser muy estables, teniendo una relación directa con la masa muscular por lo que en varones su
concentración es mayor que en mujeres. La creatina se filtra libremente por los glomérulos en el riñón y
de modo normal no se reabsorbe. Actualmente se emplea la determinación de nitrógeno ureico y
creatinina para evaluar la función renal.
Puede aparecer la creatinina elevada en sangre en:
• Deshidratación
• Distrofia muscular
• Eclampsia
• Glomerulonefritis
• Neuropatía diabética
• Obstrucciones renales (piedras, tumores)
• Pielonefritis
• Problemas cardiacos
Puede aparecer la creatinina disminuida en:
• Distrofia muscular avanzada
• Miastenia gravis
El ácido úrico es el principal producto de degradación de las purinas (partes de DNA y RNA). La
mayor parte de la formación de ácido úrico se lleva a cabo en el hígado y se excreta por el riñón, y un
poco por el sistema intestinal
Los valores normales de ácido úrico varían ampliamente por diversos factores tales como edad,
orígenes raciales, sexo, sociales y geográficos, además del método analítico utilizado. Igualmente,
numerosas enfermedades y alteraciones fisiológicas modifican la concentración de ácido úrico en la
sangre, siendo el aumento más significativo lo que se denomina hiperuricemia. Cuando aumenta la
destrucción de los tejidos (como en diversos tipos de cáncer) el ácido úrico aparece elevado en sangre,
aunque la causa más común de su elevación es la gota.
Puede aparecer el ácido úrico elevado en sangre (hiperuricemia) en:
• Dieta rica en purinas (carnes rojas, vísceras de animales, embutidos, mariscos, frutos
secos)
• Eclampsia en el embarazo
• Fallo renal
• Diabetes mellitus
• Gota
• Hipoparatiroidismo
• Alcoholismo
• Quimioterapia del cáncer
Puede aparecer el ácido úrico disminuido (hipouricemia) en:
• Dietas bajas en purinas (proteínas)
• Síndrome de Fanconi
• Enfermedad de Wilson
Fundamento de los métodos de determinación de metabolitos.
En bioquímica clínica la determinación de metabolitos como la UREA, la CREATININA y el ACIDO

ÚRICO puede llevarse a cabo mediante dos métodos básicos:
• Métodos químicos colorimétricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un

compuesto para producir un derivado colorido que pueda detectarse espectrofotométricamente,
ya que la intensidad del color será directamente proporcional a la concentración de la sustancia
a determinar. La reacción general sería:
63
Metabolito + Reactivo cromógeno Producto colorido

Estas reacciones pueden ser de:
o punto final, si la reacción ocurre y se concluye en un solo momento,
o cinéticos, si se lee a diferentes tiempos.
• Métodos enzimáticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen
productos. Estos métodos también pueden ser de punto final, o cinéticos.
Enzima
Sustrato 1 + Sustrato 2 Producto 1 + Producto 2
La determinación de los productos puede ser:
o colorimétrica, en donde el producto de la enzima se hace reaccionar con un compuesto
para dar un derivado colorido. Las reacciones tipo Trinder son las más usadas.
o espectrofotométricos, donde generalmente se emplea la luz UV para detectar el
producto.
o reacciones acopladas, en donde el producto de la enzima se acopla a otra reacción
enzimática (es decir actúa como sustrato de otra enzima, para dar el producto 2). En
estos casos, lo que se detecta es el producto 2, ya sea por métodos colorimétricos o
Enzima 1
Sustrato Producto 1
Enzima 2
Producto 1 Producto 2
• Espectrofotómetro UV –VIS con celdas
• Tubo Vacutainer® con gel.
• 1 gradilla
• 9 tubos de 13 x 100
• 3 pipetas serológicas de 1 mL
• Micropipeta de 2 -20 µl
• Micropipeta de 20 – 200 µl
• Puntas para micropipeta de 2 -20 µl y de 20 – 200 µl
3.2 REACTIVOS
• Kit para determinación de Urea (BUN) en suero.
• Kit para determinación de Creatinina en suero.
• Kit para la determinación de Ácido úrico en suero.
64

4.3 Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm, para obtener el suero.
4.4 Anotar los datos generales del paciente en la tabla 5.1
C. DETERMINACIÓN DE UREA (BUN), CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO EN SUERO.
Dependiendo de la marca del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y
condiciones de las reacciones pueden variar.
4.5 En los kits, los reactivos y/o enzimas usados se encuentran liofilizados y deben ser reconstituidos,
es decir solubilizados, para su uso. Esto lo llevará a cabo el profesor previo a la práctica.
4.6 Seguir las indicaciones del profesor, así como las instrucciones que indique el inserto de cada uno
de los kits que serán proporcionadas por el profesor, y revisar en ellos:
4.6.1 cómo se prepara el blanco de reactivos
4.6.2 cómo se procesará la muestra de suero obtenida, el tiempo y la temperatura del ensayo
4.6.3 a que longitud de onda (λ) de realiza la determinación
4.6.4 cómo se realizarán los cálculos para determinar la concentración del metabolito
4.6.5 De qué tipo son las reacciones que se llevan a cabo en la determinación de estos metabolitos
4.6.6 las interferencias, precisión y exactitud del método
4.6.7 la estabilidad del color desarrollado
4.8 Tomar las lecturas según las instrucciones del inserto y las indicaciones del profesor.
4.9 Anotar los resultados en la tabla 5.2, 5.3 y 5.4
65
5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Tabla 5.1
Sexo
Edad
Ayuno
Toma medicamento (cuál)
B. DETERMINACIÓN DE UREA (BUN).

Tabla 5.2
Tubo As 340 nm a As 340 nm a Δ As
30 s 90 s
Patrón
Muestra de suero
5.3 Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de urea. Con ella calcular la
concentración y anotarla en la tabla 5.5. Anotar aquí los cálculos realizados para la determinación
de urea.
5.4 Anotar las reacciones que se llevan a cabo en la determinación de urea (BUN).
5.5 Anotar los valores de referencia de urea para población mexicana en la tabla 5.5
C. DETERMINACIÓN DE CREATINA.
Tabla 5.3
Tubo As 492 nm a As 492 nm a Δ As
30 s 90 s
Patrón
Blanco
Muestra de suero
5.7 Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de creatinina. Con ella calcular
la concentración y anotarla en la tabla 5.5. Anotar aquí los cálculos realizados para la determinación
de creatinina.
5.8 Anotar la reacción que se lleva a cabo en la determinación de creatinina.
5.9 Anotar los valores de referencia de Ácido Úrico para población mexicana en la tabla 5.5
66
D. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO

Tabla 5.4
Tubo As 520 nm
Patrón
Muestra de suero
5.11 Anotar la fórmula que indica el inserto para calcular la concentración de Ácido úrico. Con ella
calcular la concentración y anotarla en la tabla 5.5. Anotar aquí los cálculos realizados para la
determinación de ácido úrico.
5.12 Anotar las reacciones que se llevan a cabo en la determinación de ácido úrico.
5.13 Anotar los valores de referencia de Ácido Úrico para población mexicana en la tabla 5.5
Tabla 5.5
Valores obtenidos en suero Valores de referencia

Metabolito
mg/dl (para población mexicana)
Urea
Creatinina
Ácido Úrico
67
6. DISCUSIÓN
• Explica cuál es el origen metabólico de la Urea, el Ácido Úrico y la Creatinina que aquí se
determinaron.
• Que significado tienen los valores obtenidos.
• La importancia de estas determinaciones en el diagnóstico clínico y en que patologías se alteran
los valores de estos metabolitos. Utiliza ejemplos de patologías para cada determinación.
• Analiza los valores obtenidos, al compararlos los valores de referencia para la población
mexicana.
• Qué relación hay con el sexo y el estado de salud o fisiológico
• Discute si estos métodos pueden automatizarse e investiga los modelos y cómo funcionan los
equipos automatizados para la determinación de metabolitos nitrogenados.
• Investiga las interferencias que se pueden presentar en estos métodos.
• Discutir si existe relación entre los valores obtenidos para urea, ácido úrico y creatinina y explica
de qué forma se relacionan.
7. CONCLUSIONES
7.1 Con los resultados obtenidos, análisis y discusión y con base a los objetivos de la práctica y la
investigación bibliográfica, elaborar las conclusiones.
8. REFERENCIAS
8.1. Davidson I., Henry J. B. Todd-Sanford. 2010. Diagnóstico clínico en el laboratorio. 20ª ed.
Marbán. Barcelona.
8.2. Devlin, T. M. 2004. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 4ª ed. Reverté S.A.,
España.
8.3. Sampson, E.J., Baird, M.A., Burtis, C.A., et al.: A coupled equilibrium method for measuring urea in
serum: Optimization and evaluation of AACC Study Group on urea candidate reference method. Clin.
Chem., 26, 816-826, 1980.
68
PRÁCTICA 8
DETERMINACIÓN DE HORMONA GONADOTROPINA
CORIÓNICA.
1. OBJETIVOS
El alumno
Determina la presencia de la hormona gonadotropina coriónica (hGC) en orina humanas.

El alumno
1.2.1 Conoce el uso de anticuerpos como una herramienta para identificar sustancias.
1.2.2. Realiza la determinación cualitativa y semicuantitativa de la hormona hGC en orina a través de
una prueba rápida y sensible basada en un inmunoensayo.
1.2.3. Evalúa el uso de la determinación de hormonas para el diagnóstico clínico.
2. INTRODUCCIÓN
Las hormonas son moléculas producidas por las glándulas y que tienen como función la regulación
del metabolismo corporal. Desde el punto de vista de su naturaleza química, las hormonas pueden ser
lípidos esteroides, derivados de aminoácidos, péptidos o proteínas. Son muchas las glándulas que las
producen, como las suprarrenales, las gónadas (ovarios y testículos), hipófisis, páncreas, tiroides, etc.
En general estas glándulas se encuentran reguladas por el hipotálamo en el encéfalo.
Dado el papel de regulación del metabolismo que juegan las hormonas, la alteración en sus niveles
trae consecuencias patológicas. Por ello en el laboratorio clínico se realiza la determinación de los
niveles hormonales en el diagnóstico de patologías o ciertos estados fisiológicos.
La Gonadotropina coriónica humana hGC es una hormona proteica producida por la hipófisis y por
las células trofoblásticas de la placenta durante el embarazo. La hGC es un dímero de peso molecular
aproximadamente de 28.000 kDa, compuesto de subunidades, α y β. En varones su función consiste en
estimular la producción de espermatozoides en los testículos. En las mujeres tiene como función
favorecer la ovulación y la implantación del embrión al interior de la matriz. Durante el embarazo, la
hormona es producida por la placenta y tiene como función evitar la destrucción del cuerpo lúteo y
mantener los niveles de progesterona para mantener el embrión implantado y asegurar su nutrición y
aporte de oxígeno.
Los niveles normales de hGC en hombres son de 8 -10 mIU/mL y en mujeres no embarazadas son
de 10 -15 mIU/mL. Sin embargo, durante el embarazo los niveles pueden aumentar de 20 mIU/mL en la
primera semana de embarazo, hasta 250 000mIU/mL en la 13ava. Es por esto que la hormona se emplea
para el diagnóstico de embarazo. Como la hormona se excreta en orina, se acostumbra a realizar la
determinación en esa muestra y así evitar sangrar a la paciente.
Además de esta condición, la hGC es secretada por varios tumores cancerosos, como teratomas,
cáncer de testículo, en coriocarcinomas y en la mola hidatíforme, de manera que en estos casos la
detección se realiza en orina y en sangre, lo cual además es un indicador de la eficiencia del tratamiento
de quimioterapia, pues la concentración de la hGC disminuye cuando el tumor desaparece. En los
últimos años, y bajo la sospecha o antecedentes de defectos en el nacimiento, se realiza una prueba a
las 15 – 20 semanas de embarazo conocida como triple test, donde se miden los niveles de alfa-
fetoproteina (AFP), de hGC, y de un estrógeno (estriol no conjugado uE3) y que permite al clínico estimar
la probabilidad de defectos en el recién nacido. Esta prueba ya se realiza en México.
69
Los niveles de hGC en orina y en suero correlacionan, como se ve en la fig. 1.
Fig. 1 Niveles de hGC en orina y en suero
Los niveles de esta hormona con respecto al tiempo de embarazo pueden observarse en la tabla 1,
donde también se observa que las variaciones de la hormona son muy amplias, por lo que no puede
emplearse para calcular el tiempo de embarazo, sin embargo, si se tiene establecido las semanas de
embarazo, y el valor de esta hormona esta fuera de los limites puede señalar problemas en el embarazo.
Tabla 1
Semana de la última Niveles de hGC en mU/mL
menstruación
3 5 – 50
4 5 – 426
5 18 – 7,340
6 1.080 – 56 500
7-8 7 650 – 229 000
9-12 25 700 – 288 000
13-16 13 300 – 254 000
17 – 24 4 060 – 165 400
25 – 40 3 640 – 117 000
• No embarazadas: <5.0 mIU/mL Postmenopaúsicas: <9.5 mIU/mL
En cerca del 85% de los embarazos normales, los niveles de hGC se duplican cada 48-72 h en las
primeras semanas. Después, lo hacen cada 96 h. Alcanza su máximo a las 8-11 semanas, declina un
poco y después se mantiene constante el resto del embarazo.
El método más usado actualmente para detectar la hormona es el de inmunoensayo. En esta prueba
se usa una tira de papel (fase sólida) cubierta de látex y que ha sido tratada con anticuerpos, en tres
zonas diferentes de la tira. Para hacer el ensayo, un extremo de la tira se sumerge en la orina o se le
gotea la orina, y entonces el líquido recorre la tira por capilaridad y llega a la primera banda La primera
banda contiene anticuerpos anti hGC (cadena a) y que van a unir a las moléculas de hCG presentes en
la orina. Este Ac anti hCG se encuentra unido a un colorante. Esta banda también contiene IgG como
control para asegurar que la tira trabaje correctamente. Después el líquido conteniendo los Ac unidos a
la hCG de la orina continúa ascendiendo por capilaridad y llegan a la segunda banda. En ella se
encuentra otro anticuerpo anti hCG (cadena b) que también se une a la hCG formando un “sándwich”, y
70
entonces el colorante cambia de color, dando como respuesta una banda colorida. Luego la IgG continúa
ascendiendo y llega a la tercera banda donde se encuentra una Ac anti-IgG, y en donde también
aparecerá una banda colorida en la ventana de control.
Si en la tira se observan dos bandas coloridas (una de la banda de prueba y otra de la banda de
control) la prueba es positiva, y si la tira se emplea para la detección de embarazo, significa que la
paciente está embarazada. Si solo aparece una banda (en la banda control) la prueba de embarazo es
negativa. Si no aparece ninguna banda en la zona de control, la prueba no se realizó correctamente y
deberá repetirse.
La sensibilidad de la prueba es de 10 – 50 mUI de hGC/mL. Con esta prueba es posible detectar los
niveles de HGC que se encuentran normalmente en las mujeres embarazadas a partir del 8º día de la
menstruación esperada en adelante. También detecta la presencia de los tumores de los que se habló
antes, y se usa de manera cualitativa para seguimiento de la quimioterapia.
Otro sistema de inmunoensayo para la determinación de hGC es el de aglutinación en placa, esta
prueba de embarazo se basa en la aglutinación rápida de partículas de látex sensibilizadas por
anticuerpos monoclonales específicos con la hGC presente en la muestra.
La presencia de hGC en las muestras urinarias conduce a una aglutinación que se diferencia
visualmente de la no aglutinación del control negativo.
Este método requiere de valores superiores a 200 mUI/mL para obtener un resultado positivo, es
decir un resultado positivo asegura que en la muestra hay al menos 200 mUI/mL de hGC. Este sistema
nos permite la realización de un procedimiento semicuantitativo en la determinación de hGC mediante
dilución de la muestra de orina, lo que permite a la vez hacer una estimación del momento de la gestación
en que se encuentra la embarazada.
• 1 centrífuga
• 1 pipeta Pasteur
• 1 placa plástica para prueba
• 1 gradilla
• 3 tubos de 13 x 100 mm
• 1 pipeta de 1 mL
• Pipeta automática de 20-200 µl
3.2 REACTIVOS
• Prueba casera comercial para la determinación de hCG
• Kit para la determinación de hCG-Látex, el cual contiene:
Suspensión de partículas de látex cubiertas con anticuerpo
Látex
monoclonal anti-hCG humana. Azida sódica 0.95 g/L
Control + Orina humana con una concentración de hCG > 1600 UI/L.
Tapón rojo Azida sódica 0.95 g/L.
Control –
Suero animal. Azida sódica 0.95 g/L.
Tapón azul

• Muestra de orina de mujer embarazada.
71
A. OBTENCIÓN DE LA ORINA
4.1 Utilizar un contenedor nuevo para recolectar la orina. Se puede utilizar orina recolectada hasta con
24 horas de anticipación. Las muestras de orina pueden ser refrigeradas (2 - 8 °C) y almacenadas
hasta por 72 horas antes de ser evaluadas. Se requiere un volumen pequeño de la misma.
Anotar el tiempo de gestación (en semanas) de la donadora.
B. REALIZACIÓN DE LA PRUEBA CASERA
4.2 Adquirir una prueba casera e investigar el fundamento del método usado en la misma.
4.3 Tanto la prueba casera, como la muestra de orina recolectada deberán estar a temperatura ambiente
(20-30 °C) antes de llevar a cabo la prueba.
4.4 Sacar la tira de su empaque y seguir las instrucciones del fabricante para la determinación.
4.5 Anotar el resultado obtenido en la tabla 5.1.
C. DETERMINACIÓN EN PLACA DE hGC

4.6 Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. La sensibilidad del ensayo
disminuye a temperaturas bajas.
4.7 Depositar 50 µL de la muestra (una gota) a ensayar y una gota de cada uno de los controles Positivo
y Negativo, sobre círculos distintos de una placa de prueba.
4.8 Homogeneizar suavemente el reactivo de hCG-látex antes de usar. Tomar una gota (50 µL) y
colocarla junto a cada una de las gotas anteriores.
4.9 Mezclar las gotas con un palillo, procurando extender la mezcla por toda la superficie interior del
círculo. Emplear palillos distintos para cada muestra.
4.10 Agitar de manera rotatoria durante 2 minutos y observar.
4.11 Examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.
4.12 Anotar los resultados en la tabla 5.1.
C. PRUEBA SEMICUANTITATIVA
4.13 Si la prueba en placa resultó positiva, prepare las siguientes diluciones de la muestra con agua
destilada, en tubos limpios y secos: 1:4, 1:10, 1:400, 1:1200
4.14 De manera secuencial, con cada dilución repita el procedimiento en placa con el hGC-látex, hasta
llegar a la dilución donde la prueba resulte negativa. Anote los resultados en la tabla 5.2.
4.15 Al terminar la prueba enjuague la placa con agua corriente y secar al aire libre.
D. REALIZACIÓN DE LA PRUEBA RÁPIDA “UN PASO”.

Prueba Semicuantitativa.
4.16 Si la prueba en placa resultó positiva, preparar las siguientes diluciones de la muestra en agua
destilada, en tubos limpios y secos: 1:4, 1:10, 1:400, 1:1200
72
4.17 De manera secuencial, con cada dilución, sacar la Tira de su empaque y sumergir verticalmente
la prueba en la orina durante 10-15 segundos; cuidar de no pasar la línea máxima (MAX). Colocar la
tira sobre una superficie no absorbente y esperar 3 minutos para leer los resultados de la prueba.
Positivo Negativo Invalido

Fig. 2. Prueba rápida de un solo paso “one step ultra hgc”
4.18 Repetir el procedimiento en la prueba rápida (Tira), hasta llegar a la dilución donde la prueba
resulte negativa.
4.19 Anotar los resultados en la tabla 5.2
73
5.1 Escribir las semanas de gestación de la paciente _________________________

5.2 Anotar el resultado de las pruebas de hGC en orina en la tabla 5.1
Tabla 5.1
RESULTADO
Prueba casera
Prueba en placa con látex
5.3 En la tabla 5.2 registrar los resultados de datos de la prueba semi cuantitativa de una muestra y
determinar entre que límites se encuentra la concentración de hGC en la muestra.
Tabla 5.2
Intervalos de concentración
DILUCIÓN RESULTADO
de hGC (mUI/mL)
1:1 (sin dilución) 0 - 200
1:4
1:10
1:400
1:1200
5.4 Indicar si los valores corresponden con las semanas de embarazo de la paciente.
6. DISCUSIÓN
Para elaborar la discusión de la práctica considera los siguientes puntos:
• El fundamento de las técnicas empleadas y como puede mejorarlas un ingeniero biomédico.
• Ventajas y desventajas, comparando el fundamento de las pruebas utilizadas.
• Si esta prueba tiene solo uso en el diagnóstico del embarazo.
• Como se determinan otras hormonas de importancia clínica y con qué equipo biomédico
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar si se
cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1. Butler, S.A., Khanlian, S.A. & Cole L.A. 2001. Detection of early pregnancy forms of human chorionic
gonadotropin by home pregnancy test devices. Clin. Chem. 47, 2131-2136.
8.2. Guyton A.C. 2011. Fisiología Médica. 10a ed. Hall John E. Editorial Elsevier España.
8.3. Iles, R.K. Purkins, E. Ehitehead, P.C., Oliver, R.T.D., Leigh, I., and Chard, T., 1990. Expression of
beta human chorionic gonadotrophin by non-trophoblastic non-endocrine 'normal' and malignant
epithelial cells. Br. J. Cancer 61, 663-666.
8.4. Velázquez N. 2014. La hormona gonadotrofina coriónica humana. Una molécula ubicua y versátil.
Parte I. Obstet. Ginecol. Venez. 74: 122-133.
74
PRÁCTICA 9
EQUIPOS BIOMÉDICOS EN EL LABORATORIO
UNIDAD VII: Equipos empleados en la clínica para el estudio del metabolismo.
1. OBJETIVOS
1.1.1. Identificar los principios de funcionamiento de diversos equipos biomédicos que se utilizan en el
laboratorio bioquímico.
1.2.1. Realizar la calibración de un potenciómetro.
1.2.2. Realizar la determinación de diferentes parámetros bioquímicos en suero con el potenciómetro, el
sistema portátil Accutrend Plus y el monitor de glucosa.
2. INTRODUCCIÓN
POTENCIÓMETRO.
El potenciómetro es un dispositivo electrónico que permite determinar la diferencia de potencial
(voltaje) entre dos terminales o componentes eléctricos, a través de una resistencia variable con tres
terminales a las cuáles se conecta el voltaje a medir. La potenciometría es una técnica analítica que se
emplea para determinar la concentración de una especie electroactiva, generalmente iones, de una
solución.
Un potenciómetro de pH o pHmetro mide la diferencia potencial que se produce entre un electrodo
de trabajo y uno de referencia, cuando ambos electrodos se introducen en una solución a la cual se
requiere medir su pH. . El electrodo de referencia tiene un potencial conocido, constante y estable, no
así el electrodo de trabajo, en donde el potencial que se desarrolla depende de la presencia y actividad
de los iones H+ presentes en la solución, ya que lo que se mide realmente es la actividad del ion, y no
su concentración. Para obtener mediciones analíticas válidas, el electrodo externo, es decir el electrodo
de referencia, deberá tener un potencial constante. Los cambios se deberán a cambios registrados en
el otro electrodo, o electrodo de trabajo. El electrodo de referencia tiene un potencial, o más bien una
fem constante, es decir que el potencial depende de una especie cuya concentración permanece
inalterada durante toda la determinación. El electrodo de referencia en la mayoría de los potenciómetros
se comporta como un ánodo.
Un electrodo de referencia está constituido por una hemicelda interna de referencia, un puente salino
o electrolito y un pequeño canal en la punta del electrodo a través del cual fluye lentamente el electrolito
del puente salino y establece el contacto entre los componentes de la celda electroquímica, es decir una
solución electrolítica de sal, para que se pueda medir la fem de la celda. Los puentes salinos pueden ser
un tubo esmerilado, un puente de agar, una mecha de asbesto u otros. Las soluciones de electrolitos
que conectaran a los dos electrodos son de alta fuerza iónica y la fem de la celda es la diferencia
algebraica de los potenciales de los dos electrodos (el de referencia y el indicador).
Los electrodos de referencia generalmente son de Calomel (Cloruro de mercurio) o de Plata (Cloruro
de plata/Plata). Las características de este tipo de electrodos son: Invariabilidad del potencial durante la
medición; Ajuste rápido y exacto y No debe alterarse con la temperatura.
Existen electrodos de trabajo de distinto tipo útiles para distintos cationes o aniones. Cada vez son
más usados los electrodos selectivos de iones (ESI) o electrodos de membrana, como es el caso del
electrodo de pH (un electrodo de vidrio). Estos electrodos contienen un metal sumergido en una solución
con iones de la misma especie, y generalmente son de plata sumergidos en nitrato de plata y mercurio.
75
Un electrodo de trabajo debe tener las siguientes características: Alta sensibilidad a la especie que va a
ser determinada; Alto grado de reproducibilidad y Respuesta rápida a las variaciones de concentración
de la especie que se va a determinar.
El potencial 𝛆 de cualquier electrodo está dado por la ecuación de Nernst:
𝐑𝐓 [𝑨𝒊𝒏𝒕 ]
𝛆=− 𝐥𝐧
𝐧𝑭 [𝑨𝒆𝒙𝒕 ]
en donde R es la constante de los gases (8.31 V/K), T es la temperatura en grados Kelvin, n es el
número de electrones transferidos en la reacción del electrodo, F es la constante de Faraday (96, 485.33
Coloumbs/mol) y [𝑨𝒊𝒏𝒕 ] es la concentración del ion al interior de la membrana, y [𝑨𝒆𝒙𝒕 ] la
concentración en el exterior. Si en la ecuación las actividades se sustituyen por la concentración en
moles, y se insertan valores numéricos en lugar de constantes, usando además logaritmo decimal, a
una temperatura de 25 °C la ecuación se transforma en
𝟎. 𝟎𝟓𝟗𝟏𝟓 [𝑨𝒊𝒏𝒕 ]
𝛆=− 𝐥𝐨𝐠
𝐧 [𝑨𝒆𝒙𝒕 ]
Es muy importante mantener el electrodo sumergido en agua, regulador diluido o KCl, de modo que
se forme una capa de cohesión entre el vidrio y la solución que se va a determinar, y evitar retrasos en
la determinación por el transporte de iones, o una caída del voltaje por la resistencia del medio. El
electrodo de pH tiene un electrodo de referencia interna de plata (Ag/AgCl) sumergido en un regulador
de sales de Cl- (pH = 7.0) con una membrana de vidrio (Fig. 1).
Fig. 1
La determinación de pH en clínica tiene relevancia para el diagnóstico de ciertos estados patológicos.
El pH de la sangre tiene un muy estrecho margen de variación, entre 7.34 y 7.45 lo que indica que existen
controles muy rigurosos de este parámetro. El control tiene que ver con permitir el funcionamiento de las
enzimas del metabolismo y con su regulación. Como consecuencia de los procesos metabólicos, se
producen constantemente sustancias ácidas como el ácido carbónico (el que se produce en mayor
cantidad), ácido láctico y muchos cetoácidos como metabolitos intermediarios.
La regulación del pH puede darse por 4 procesos: amortiguación extracelular, amortiguación
intracelular, amortiguación respiratoria y la excreción renal de la carga de H+. En la amortiguación
extracelular, es decir de la sangre, el HC03- juega el papel más importante, ya que posee una gran
capacidad para evitar cambios bruscos en el pH de la sangre arterial. En la amortiguación respiratoria
se incrementa la ventilación alveolar, y como resultado, la PC02 descenderá para volver el pH a la
normalidad. El riñón desempeña un papel crítico en el equilibrio ácido-básico a través de la regulación
del HCO3- plasmático a través de la reabsorción de este ion.
La acidosis metabólica es un trastorno clínico caracterizado por un descenso en el pH arterial y en la
concentración de HCO3- esta acidosis metabólica se produce de dos maneras: por la adición de ácido o
76
por la pérdida de HCO3-. Las causas son insuficiencia renal o cetoacidosis metabólica. También la
ingesta de anticongelantes provoca un tipo de acidosis.
La alcalosis metabólica es un trastorno en el cual el pH sanguíneo aumenta. Puede deberse a
retención de HCO3- o pérdida gastrointestinal o renal de H+, por ejemplo, en vómito y succión gástrica.
También por el uso de diuréticos, la ingestión excesiva de alcalinos y se encuentra asociada al
hipercorticismo.
En esta práctica se determinará el pH del suero humano.
SISTEMA ACCUTREND PLUS.
El sistema Accutrend es un dispositivo portátil utilizado en la determinación de parámetros
metabólicos claves como colesterol, triglicéridos y lactato en sangre capilar, utilizando tiras reactivas y
bajo el principio de fotometría de reflectancia, también conocida como reflectometría o fotometría de
remisión. La determinación utiliza el principio de la química seca, o tiras reactivas, donde ocurre la
reacción de detección del metabolito.
La reflectometría es una técnica analítica que utiliza la reflexión de la luz en una superficie e interfaces
para medir características como la intensidad del color, el grosor de película y el índice de refracción.
Este principio es empleado por los equipos denominados reflectómetros.
Estos equipos poseen una fuente de luz, comúnmente una LED de larga duración de longitudes de
onda específicas que se concentrarán en la superficie de la tira que contiene la muestra a través de un
sistema de lentes y la luz reflejada se mide mediante detectores.
Los reflectómetros están diseñados para medir las características físicas de las superficies, como los
cambios de color en una tira reactiva. Cuando un haz de luz incide en una superficie, la luz es reflejada
por dicha superficie, produciendo 2 tipos de reflexión: la reflexión especular y la reflexión difusa o
reflectancia. Ésta última es la utilizada por los espectrofotómetros de reflexión.
La reflectancia (R) es la relación entre la intensidad de la luz reflejada (Ir) y la intensidad de la luz
incidente (Io). Se expresa como % de reflectancia.
𝑰𝒓
𝑹=
𝑰𝒐
𝑰𝒓
%𝑹= × 𝟏𝟎𝟎
𝑰𝒐
Estas ecuaciones son similares a las descritas en la espectroscopia de absorción para la
transmitancia, sin embargo, en realidad se utilizan ecuaciones mucho más complejas como lo son las
de Kubelka-Munk y Williams-Clapper.
A continuación, se describen los componentes del espectrofotómetro de reflexión
- Fuente de radiación: Lámparas de espectro luminoso continuo de haluro de tungsteno o, lámparas
de espectro luminoso discontinuo como el arco de xenón o los LED.
- Sistemas ópticos o esfera de Ulbricht: Conjunto de espejos y lentes en forma de esfera, cuyo fin es
dirigir el haz de luz reflejada al detector para su lectura.
- Sistemas reactivos en fase sólida: También llamados de química seca, son tiras reactivas o películas
multicapa o slides.
- Detector y procesador de datos: Puede leer sobre la superficie al usar tiras reactivas, mientras que
se lee por el reverso de la superficie para sistemas que utilizan capas.
77
Sistemas reactivos para química seca.

Estos sistemas son unidades de reacción con una fase sólida que posee en forma deshidratada todos
los reactantes para la identificación del analito de interés y se clasifican en:
- Sistema Seralyzer (Ames): Es una matriz de celulosa impregnada en reactivos secos que se une a
una lámina o soporte de plástico, sobre ella lleva un código para ser leído al introducirse en el
instrumento.
- Sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): Es un sistema reactivo dividido en 2 zonas, permite
preincubar la muestra y/o eliminar interferencia. Las 2 partes se ponen en contacto para realizar la
reacción por presión.
-Tiras reactivas: Constituidas por un soporte de plástico con una matriz de celulosa que contiene los
reactivos. Son las más usadas en clínica y las que utiliza este sistema Accutrend. Estas tiras están
conformadas por películas multicapas o slides, es decir, por varias capas muy finas con diferentes
funciones como a continuación se describe y además se muestra en la figura 2:
- Capa difusora: es una capa porosa que permite distribuir uniformemente la muestra además de
funcionar como filtro, ya que no deja pasar moléculas como proteínas, lípidos, hemoglobina, o bilirrubina.
Sirve también como pantalla para la reflexión de la luz.
- Capa de reacción: contiene sustancias que pueden ser enzimas o cualquier sustancia química, que
se encuentra en condiciones muy controladas que intervienen en la reacción.
- Capa indicadora: contiene el colorante para formar un complejo colorido, que será proporcional a la
concentración del analito, la cual se cuantifica por espectrofotometría de reflexión.
- Capa de soporte: es la base de la laminilla donde están depositadas las demás capas. Está fabricada
con un material de plástico transparente que permite que pase la luz para que la reacción pueda ser
medida.
78
Figura 2. Conformación en capas de las tiras reactivas

Existen en el mercado diferentes tipos de tiras reactivas, a saber:
- Colorimétricas: en la cual se hace una reacción bioquímica de punto final, ya que hace la medición
una vez terminada la reacción.
- Enzimáticas: en la cual se hace una determinación empleando enzimas, que pueden ser simples o
de enzimas conjugadas, que llevan a cabo reacciones secuenciales,
- Potenciométricas: se mide la diferencia de potencial entre la muestra y el fluido de referencia, por
medio de un electrodo de ion selectivo. Permite medir la concentración de electrolitos.
La reflectometría se utiliza comúnmente en diversas aplicaciones además del área clínica ya que es
un método rápido y sensible para cuantificar una amplia variedad de parámetros orgánicos e inorgánicos
en agua, de alimentos, bebidas y muestras medioambientales, y otros. En esta práctica se hará la
determinación de colesterol en suero con este sistema empleando tiras enzimáticas.
GLUCÓMETRO PORTÁTIL.
Estos equipos son también fotómetros de reflectancia que utilizan tiras reactivas del tipo enzimático
para la detección de glucosa en suero. Los principios de reflectancia y química seca son los mismos que
se han explicado anteriormente.
Han tenido una gran distribución debido a que son económicos, fáciles de usar y les permiten a los
pacientes monitorear de manera aceptable sus niveles de glucosa, para un manejo efectivo de su
padecimiento de diabetes. Esta clase de equipos emplea sangre capilar que se obtiene mediante
punción con lanceta, por lo que se consideran poco invasivos. De ahí su importancia e impacto social
actual.
En esta práctica se hará la determinación de glucosa en suero empleando uno de estos equipos y
con tiras reactivas del tipo enzimático.
79
• Potenciómetro con electrodo de pH
• Centrífuga clínica.
• Equipo Accutrend
• Glucómetro portátil
• Tubo Vacutainer® de 5 mL tapa amarilla
• Torundas, ligadura y adaptador.
• Vaso de precipitados de 10 mL
• Lancetas
• Capilares
3.2 REACTIVOS
• Tiras reactivas para Colesterol y para Glucosa
• Solución calibradora de pH 4.0
• Solución calibradora de pH 7.0
• 5 mL de suero sanguíneo
• Sangre capilar
80
A. CALIBRACIÓN DEL POTENCIOMETRO.

4.1 En el laboratorio se utilizan diversos potenciómetros, es importante que recibas las instrucciones del
profesor antes de operarlo.
4.2 Tomar el potenciómetro y lavar el electrodo con agua destilada, para eliminar la solución de KCl que
contiene. Con ayuda de un papel suave, secar el exceso de agua de la punta del electrodo, sin
frotarlo, ni meter el papel dentro del electrodo, únicamente dejando que el papel absorba el agua.
4.3 Realizar la calibración del equipo con dos reguladores (2 puntos) acorde al instructivo según el
modelo de potenciómetro que sea asignado, ya sea de pH 4.0 y pH 7.0, o de pH 10.0 y pH 7.0,
registrar las soluciones reguladoras usadas.
4.4 Lavar nuevamente el electrodo con agua destilada y secar. El equipo está ahora listo para las
determinaciones de pH.
B. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.

4.5 Obtener con jeringa 10 mL de sangre periférica.
4.6 Una gota de esta muestra se usará para la determinación de colesterol, del punto C.
4.7 Colocar el resto de la sangre en dos tubos Vacutainer® con gel (5 ml en cada uno).
4.10 Con ayuda de una pipeta Pasteur, recuperar el suero, colocarlo en un vaso de precipitados de 10
mL y medir el pH de forma directa, y registrarlo en la tabla 5.1.
C. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL CON SISTEMA ACCUTREND.

4.11 Encender el equipo Accutrend de Roche y permitir la calibración interna.
4.12 Introducir la tira con el código para colesterol como indican las flechas.
4.13 Introducir la tira para colesterol en el equipo en la dirección que señalan las fechas de la tira.
4.14 Ahora el equipo señala que se abra la tapa y una vez abierta aparece en pantalla la imagen de
una gota, para indicar que se coloque la gota de sangre.
4.15 Colocar la gota de sangre obtenida con jeringa en el punto 4.5, en la tira cuidando de cubrir
perfectamente el cojinete, para evitar errores en la determinación.
4.16 Esperar 180 segundos a que aparezca el valor en la pantalla y anotarlo en la tabla 5.2. El valor
máximo que puede registrar el equipo son 300 mg/dL.
D. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA CON GLUCÓMETRO PORTÁTIL.

4.17 Encender el equipo glucómetro portátil. En este caso es el modelo Accu check active.
4.18 Insertar el chip del equipo.
4.19 Coloque la tira reactiva para glucosa en el equipo como marcan las flechas hasta que se inserte
correctamente.
4.20 Limpiar la yema de un dedo con una torunda de etanol de 96°.
4.21 En la zona desinfectada, pinchar con una lanceta y presionar suavemente el dedo para obtener la
gota de sangre, procurando no contaminar ni la sangre ni la zona de punción.
4.22 Colocar la gota de sangre en el cojinete de la tira, procurando cubrirla totalmente.
4.23 Esperar 5 s a que aparezca el valor de glucosa en sangre y anotar el resultado en la tabla 5.1.
81
CUIDADOS DEL POTENCIOMETRO DE pH.

Almacenamiento.
• Los electrodos de pH se deberán guardar siempre en un medio líquido, nunca secos.
• En el caso de los electrodos de pH combinados en un electrolito de referencia o solución
saturada de sales.
Limpieza del electrodo.
• Si se realizan mediciones sistemáticas de disoluciones de HCl u otros con KCl en baja
concentración, puede precipitarse el AgCl. Debe entonces introducirse el electrodo en NH3
concentrado toda una noche y se lava con agua destilada.
• Después de cada lectura puede hacerse una lectura rápida con agua destilada.
• Pueden emplearse soluciones limpiadoras comerciales.
• Si se ha empleado agar, puede enjuagarse inmediatamente con agua destilada caliente.

5.1 Anotar los valores de pH del suero y los valores de colesterol y glucosa obtenidos en la tabla 5.1
Valores obtenidos Valores de referencia
Valor de pH suero
Nivel de colesterol
Nivel de glucosa
5.2 Estos parámetros de emplean como indicadores bioquímicos de enfermedad. Indica en que
padecimientos se determinan.
5.3 Realiza esquemas de:
a) Estructura interna del potenciómetro y del electrodo de pH
b) Estructura de los fotómetros de reflectancia
c) Composición de las tiras para determinación de colesterol, con todos los elementos
d) Composición de las tiras para determinación de glucosa con todos sus elementos
5.4 ¿Que función tiene el chip que se inserta en el glucómetro?
5.5 ¿En qué casos se debe determinar el valor de pH del suero de un individuo?
5.6 ¿Cuál es la importancia metabólica y fisiológica de regular el pH de la sangre? y ¿qué sistemas utiliza
el cuerpo humano para regular el pH?
5.7 ¿Cuáles son los cuidados del potenciómetro de pH?
5.8 ¿Cómo se puede automatizar la determinación de pH de sangre?
5.9 ¿Cuáles son los cuidados de los equipos portátiles de detección de metabolitos?
5.10 Enlista en una tabla 3 ventajas y 3 desventajas de los equipos biomédicos portátiles para detección
de metabolitos.
6. DISCUSIÓN
Discute los resultados obtenidos considerando los siguientes aspectos:
• La importancia de los equipos biomédicos en el laboratorio clínico
• La importancia de los equipos biomédicos en la detección de patologías y en el cuidado de la
salud de los pacientes.
• El uso de biosensores en los equipos portátiles o de uso doméstico.
82
• Investiga al menos 4 equipos biomédicos de uso en el laboratorio clínico en unidades de medicina

familiar y en hospitales de 3er. Nivel.
• Investiga equipos biomédicos del laboratorio bioquímico que están automatizados, y para que
detecciones se emplean.
• Investiga y describe cuáles son las tendencias actuales en el diseño de equipos biomédicos y
técnicas para la determinación de parámetros bioquímicos empleados en el diagnóstico clínico.
• Investiga que otros 2 equipos biomédicos portátiles de uso en la vida diaria.
7. CONCLUSIONES
7.1 En función de los resultados y la discusión que se realizó, elaborar las conclusiones y verificar si
se cumplieron los objetivos planteados.
8. REFERENCIAS
8.1 Devlin, T. 2004. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. Vol. 1 y 2. 4a. ed. Reverté.
Barcelona, España.
8.2 Skoog, D., Holler, J. y Crouch, S. 2006. Principios de análisis instrumental. 6a. ed. Mc Graw-Hill
Co. México.
8.3 Murray, R. K., Bender, D. A., Botham, K. M., Kennedy, P. J., Rodwell, V. M. y Weil, P. J. 2010. Harper
Bioquímica Ilustrada. 28a. ed. Mc Graw Hill. México.
8.5. Willard, H., Merritt, L., Dean, J. y Settle, F. 1991. Métodos Instrumentales de Análisis. 7a. ed.
Iberoamericana. México.
8.6. Roche Diagnostics. 2023.. Accutrend® Plus System. Consultado en
https://diagnostics.roche.com/global/en/products/instruments/accutrend-plus-ins-754.html
8.7. Roche diagnostics. 2023.Accutrend Cholesterol cobas. Consultado en:
https://cdn.gdar.com.mx/archivos/SFE990525KB1-637813040884046747-11418262012.pdf
8.8. Roche diagnostics. 2023. Accu check active. Consultado en: https://www.accu-chek.com.mx/
8.9. Roche diagnostics cobas. 2007. ¡Rápido! ¿Quién necesita una prueba de detección de riesgo
cardiovascular? Accutrend Plus: Exactitud inmediata. Consultado en:
https://www.kabla.mx/descargas/glucometros/accutrend_Plus_fichatecnica.pdf
83
APÉNDICE A
USO DE LAS PIPETAS AUTOMÁTICAS
Las pipetas automáticas son instrumentos delicados y costosos, que deben cuidarse dado que de ellos depende
gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy precisas si se las utiliza correctamente. Existen varios
tipos de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes rangos de volúmenes. Cada pipeta está rotulada
en el émbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento la mayoría tiene características análogas. A
continuación, se ejemplifican dos tipos de pipetas.
Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible

preguntar lo mismo veinte veces antes que romper una
pipeta.
Juego de pipetas tipo A
Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l.
Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l.
Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l o 0,2 y 1,0 mL.
Para poder tomar líquido con estas pipetas, deben tener en sus extremos las puntas plásticas descartables (tips),
amarillas para P-20 y P-200, y azules para P-1000.
Antes de utilizar la pipeta asegúrese conocer cómo fijar el volumen. La P-20 mide hasta la décima de microlitro.
En la P-20 los dos números superiores indican el volumen en microlitros, en tanto que el número inferior es la
cantidad fraccional La P-200 y P-1000 miden hasta el microlitro, por lo tanto, el número superior de la P-200
nunca debe superar el 2.
Por ejemplo:
En una p20 equivalen En una p200 En una p1000

a 3,8l equivalen a 38l equivalen a 380l
Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen solamente debe bajar hasta el
primero, y cuando baje el volumen hágalo hasta el primer tope, en caso de que aun quede solución en el tips puede
bajar hasta el segundo tope.
“NUNCA”
1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide más de lo establecido y
descalibrará o romperá la pipeta.
2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la décima parte de su nombre. No es precisa.
3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul.
4- Nunca utilice la pipeta con soluciones ácidas concentradas. Los vapores pueden oxidar las partes metálicas
interiores de la pipeta.
84
APÉNDICE B
Elaboración de Diagrama de Actividades o Procedimientos
El diagrama de procedimientos o diagrama de actividades es la representación gráfica de un proceso. Se

utiliza en procesos industriales y en el laboratorio. El proceso entero está representado en una sola cuartilla y
puede apreciarse de una sola mirada mucho más rápido que leyendo el texto, lo que facilita su comprensión, aun
para personas no familiarizadas. Los diagramas nos permiten observar todos los pasos de un sistema o proceso
sin necesidad de leer notas extensas, permite observar las actividades o pasos principales y la correcta
identificación de actividades, de manera simplificada.
Las siguientes son acciones previas a la realización del diagrama de flujo:
• Identificar las ideas principales al ser incluidas en el diagrama de flujo.

• Definir qué se espera obtener al final del procedimiento.
• Establecer el nivel de detalle requerido.
Los pasos a seguir para construir el diagrama de flujo son:
• Establecer el comienzo y el final del diagrama.

• Identificar y listar las principales actividades/subprocesos que están incluidos en el proceso a describir y
su orden cronológico.
• Si el nivel de detalle definido incluye actividades menores, listarlas también.
• Construir el diagrama respetando la secuencia cronológica y asignando los correspondientes símbolos.
• Asignar un título al diagrama y verificar que esté completo y describa con exactitud el proceso elegido.
Debe incluirse también el nombre y grupo del alumno.
• Muchas actividades pueden representarse mediante un esquema
Algunos diagramas usan una simbología específica, como óvalos, rectángulos, círculos, triángulos, que indican
inicio y final del proceso, conexiones, decisiones, etc. Pueden ser verticales u horizontales.
Otros diagramas se centran en los procesos o métodos utilizados y se emplea una simbología para cada equipo
o proceso realizado. En el laboratorio de bioquímica clínica se deberán realizar diagramas de los procedimientos
que se efectuarán en cada práctica, puedes usar el modelo que más se acomode, siempre y cuando incluya todo
el desarrollo experimental, y los puntos más relevantes. Asimismo, deberá contener número y título de las
prácticas, nombre del alumno y equipo.
85
APÉNDICE C
¿CÓMO ESCRIBIR EL REPORTE?
“Si un hombre puede organizar sus ideas, entonces él puede escribir"
Robert Louis Stevenson (1850-1894)
Son varios los elementos de los cuales se conforma un reporte, y en el caso de los laboratorios de la
academia de BIOQUÏMICA se incluyen los siguientes:
PRÁCTICA No. #
Título de la Práctica
UNIDAD: Unidad de aprendizaje a la cual pertenece la práctica

1. OBJETIVOS:
1.1.1. El principal objetivo que se busca al realizar la práctica
1.2.1 Son los objetivos parciales que nos llevan a concluir el objetivo general
1.2.2
1.2.3
A continuación, se describe más detalladamente cada una de las secciones.
OBJETIVO:
En el campo de la educación, podemos decir, que un objetivo es el resultado que se espera logre el alumno
al finalizar un determinado proceso de aprendizaje, es decir, que un objetivo es el resultado que se espera logre el
alumno al finalizar un determinado proceso de aprendizaje.
Los objetivos se dividen en Objetivo General y Objetivo Específicos. El Objetivo General es el resultado
final que se quiere llegar. El Objetivo General, para ser llevado a cabo, usualmente puede y tiene que ser
desglosado en una serie de acciones o actividades particulares menores, sustancialmente diferentes unas de otras.
Estos son los Objetivos Específicos. Son como las dos, tres o cuatro partes básicas en que se divide la
investigación. Aunque este ya se encuentra impreso en la práctica, debes considerar que debe tener congruencia
con el título, y que verdaderamente se estén cumpliendo con el trabajo experimental.
INTRODUCCIÓN:
Esta sección le indica al lector cuál es el problema, así como por qué y cómo se ha planeado la práctica.
Te proporciona el marco teórico necesario para que puedas enriquecer los experimentos a realizar, y poder lograr
los objetivos.
EN EL REPORTE QUE SE SOLICITA EN EL LABORATORIO NO SE INCLUYE LA INTRODUCCIÓN,
LA CUÁL YA ESTÁ INCLUIDA EN CADA PRÁCTICA.
MATERIAL Y MÉTODOS:
En esta sección se responde a la pregunta de "cómo se ha hecho el estudio". La sección de material y
métodos debe ser lo suficientemente detallada como para que puedas realizar los experimentos de forma
independiente.
Una vez más esta se encuentra ya escrita dentro de tu práctica, por lo que NO es necesario que lo copies,
pero debes tenerla muy presente a la hora de elaborar tu reporte, incluyendo las modificaciones que se hayan
realizado durante la realización de la práctica, porque van a ser muy importantes durante los resultados, discusión
y las conclusiones.
86
RESULTADOS:
Los resultados deben cumplir dos funciones:
1. Expresar los resultados de los experimentos descritos en Material y Métodos.
2. Presentar las pruebas que apoyan tales resultados, sea en forma de figuras, tablas, gráficas o en el mismo texto.
Los resultados deben poder ser vistos y entendidos de forma rápida y clara. Es por ello por lo que la
construcción de esta sección debe comenzar por la elaboración de esquemas, las tablas y figuras, así como
gráficas, las que, por sí solas, deben poder expresar claramente los resultados de todos los experimentos
realizados en la práctica. Recuerda que en el manual ya se encuentran tablas para poder organizar tus resultados,
utilízalas en el reporte.
Las gráficas deben de llevar título, unidades y la escala debe ser congruente, las figuras y esquemas deben
de llevar un pie de figura indicando de lo que se trata, los esquemas deben ser de tipo biológico
También se incluye en esta sección un Cuestionario, el cual debes de contestar apoyándote en bibliografía,
que además de irte guiando en todos los resultados que debes presentar, estas preguntas te servirán para centrar
tus resultados dentro del marco teórico.
ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Esta sección incluye lo más importante del reporte, por lo que es la sección más compleja de elaborar y
organizar. Aquí es donde se interpretan los resultados, se califican, y se les pone dentro del contexto del trabajo.
Guía al lector de forma que siga el proceso mental que se siguió para llegar a las conclusiones. Algunos puntos
específicos que se deben resaltar son:
1. Cualquier experimento realizado debe ser discutido. Básate en como expresaste los resultados, analiza los
esquemas, tablas y gráficas. ¿Cómo se relacionan los datos dentro de una tabla? ¿En qué se diferencian?
¿Cómo debería interpretarse en una gráfica? ¿Cuál es el significado biológico de la forma de la gráfica,
pendiente, puntos de inflexión, máximos, mínimos o donde se interceptan las líneas?
2. ¿Cómo se ajustan los resultados a las expectativas? Por ejemplo, ¿las mediciones concuerdan con las
predicciones teóricas o con las mediciones de otros experimentos? ¿Cuál es la explicación para estas
diferencias?
3. ¿Cuáles son las fuentes de error para el análisis o para la recolección de datos? ¿Los resultados están dentro
del intervalo aceptable de error ya establecido? No debe decirse que los resultados están dentro del error
esperado, a menos que se haya efectuado un análisis de error. Si algo salió mal no se trata de que digas que
“salió mal” sino que debes analizar todo el proceso y encontrar cuales son todas las fuentes probables de ese
error, y como podrías identificar cual es la que verdaderamente falló y como corregirla.
4. No olvides siempre tratar de contextualizar esta discusión dentro de tu carrera, y las aplicaciones que le podrás
dar al conocimiento adquirido en tu área.
En cuanto a la redacción ten siempre en mente a un lector específico, El reporte deberá reflejar un sólido
entendimiento de lo que en él se presenta, y debería ser objetivo, por lo que nunca deben de expresarse opiniones.
Use lenguaje simple, preciso y familiar. El uso incorrecto del vocabulario y de los términos técnicos
únicamente evidencia que no tienes un buen conocimiento de los conceptos. Trata de ligar los párrafos
para que no se lean de manera inconexa, cada uno se debe de ir ligando y finalmente te deben llevar a las
conclusiones.
CONCLUSIONES:
La sección de conclusiones es la culminación de tu reporte, tus objetivos señalan adonde deberías llegar,
los resultados son la forma en que puedes llegar, la discusión te permite, junto con tus resultados, el proceso para
que cumplas con los objetivos, en esta parte del reporte debes de expresar a que llegaste de manera concisa.
Las conclusiones se inician con una o dos oraciones que recuerden los objetivos. Dado que se pueden
sacar varias conclusiones de un estudio, una lista numerada es útil frecuentemente. Cada conclusión debería
constar de una oración breve y clara. Las conclusiones deben estar relacionadas con los objetivos.
Las conclusiones solo pueden ser de aquello que experimentaste, discutiste y que por lo tanto ya
deben estar claras en la persona que lee el informe, solo las debes de puntualizar.
REFERENCIAS:
Se deben incluir las referencias a todo el material que consultaste para la realización de la práctica, ya sea
para contestar el cuestionario, para buscar datos específicos, o para buscar los datos teóricos, no debes copiar
aquella que presenta el manual, y que fue la usada para la elaboración de la introducción, a menos que incluyas
datos nuevos.
87
A continuación, se presenta las diferentes fuentes que puedes usar en la bibliografía y la forma correcta
de citarlas de acuerdo a normas internacionales como son la norma ISO 690-1987 y su equivalente UNE 50-104-
94 para citar literatura convencional, y la norma ISO 690-2 especifica los elementos que hay que incluir en las citas
bibliográficas de los documentos electrónicos.
* Los elementos señalados con un asterisco son opcionales.
** Los elementos señalados con dos asteriscos son obligatorios para los documentos en línea.
LIBROS
APELLIDO(S), Nombre. Título del libro. Mención de responsabilidad secundaria (traductor; prologuista; ilustrador;
coordinador; etc.) *. Nº de edición. Lugar de edición: editorial, año de edición. Nº de páginas*. Serie*. Notas*.
ISBN
Ejemplo:
BOBBIO, Norberto. Autobiografía. Papuzzi, Alberto (ed. lit.); Peces-Barba, Gregorio (prol.); Benitez, Esther (trad.).
Madrid: Taurus, 1988. 299 p. ISBN: 84-306-0267-4.
ARTÍCULOS DE REVISTAS
APELLIDO(S), Nombre. "Título del artículo". Responsabilidad secundaria. Título de la publicación seriada. Edición.
Localización en el documento fuente: año, número, páginas.
Ejemplo:
HARUTA S., Nakayama T., Nakamura K., Hemmi H., Ishii M., Igarashi Y., Nishino T. “Microbial diversity in
biodegradation and reutilization processes of garbage”. J. Biosci. Bioeng. 2005 99(1):1-11.
LEGISLACIÓN
País. Título. Publicación, fecha de publicación, número, páginas.
Ejemplo:
México. Ley Orgánica del Instituto Politécnico Nacional. Diario Oficial de la Federación. 29 de diciembre de 1981.
13p
NORMAS
ENTIDAD RESPONSABLE DE LA NORMA. Título. Nº o código de la norma. Edición. Lugar de publicación:
editorial, año de publicación.
Ejemplo:
MÉXICO. SECRETARÍA DE SALUD. Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, que establece las
especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. NOM-065-SSA1-1993. Diario Oficial de la
Federación. 27 de febrero de 1995.
CONGRESOS
APELLIDO(S), Nombre. Título. Responsabilidades secundarias*. Nº de edición. Lugar: editorial, año de
publicación. No. de páginas o volúmenes*. ISBN
Ejemplo:
Actas del I Congreso de Historia de la Lengua Española en América y España: noviembre de 1994-febrero de
1995. M. Teresa Echenique, Milagros Aleza y M. José Martínez (eds.). València: Universitat, Departamento de
Filología Española, 1995. 564 p. ISBN: 8480022698.
TESIS NO PUBLICADAS
APELLIDO(S), Nombre. "Título de la tesis". Dirección. Clase de tesis. [Tipo de documento]. Institución académica
en la que se presenta, lugar, año.
Ejemplo:
LASCURAIN SÁNCHEZ, María Luisa. "Análisis de la actividad científica y del consumo de información de los
psicólogos españoles del ámbito universitario durante el período 1986-1995". Director: Elías Sanz Casado.
Universidad Carlos III de Madrid, Departamento de Biblioteconomía y Documentación, 2001.
DOCUMENTOS ELECTRÓNICOS
TEXTOS ELECTRÓNICOS, BASES DE DATOS Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS
Responsable principal. Título [tipo de soporte]. Responsables secundarios*. Edición. Lugar de publicación: editor,
fecha de publicación, fecha de actualización o revisión, [fecha de consulta]**. Descripción física*. (Colección)*.
Notas*. Disponibilidad y acceso**. Número normalizado*
Ejemplo (en norma ISO 690-2):
88
CARROLL, Lewis. Alice's Adventures in Wonderland [en línea]. Texinfo ed. 2.1. [Dortmund, Alemania]: WindSpiel,
November 1994 [ref. de 10 de febrero de 1995]. Disponible en Web:
<http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice.html>. Igualmente, disponible en versiones PostScrip y ASCII en
Internet: <ftp://ftp.Germany.EU.net/pub/books/carroll/>
ARTÍCULOS Y CONTRIBUCIONES EN PUBLICACIONES ELECTRÓNICAS SERIADAS
Responsable principal (del artículo). "Título (del artículo)". Título (de la publicación principal) [tipo de soporte].
Edición. Designación del número de la parte. Fecha de actualización o revisión [fecha de consulta]**. Localización
de la parte dentro del documento principal. Notas*. Disponibilidad y acceso**. Número normalizado
STONE, Nan. The Globalization of Europe. Harvard Business Review [en línea]. May-June 1989 [ref. de 3
septembre 1990]. Disponible en BRS Information Technologies, McLean (Virginie).
BOLETINES DE NOTICIAS, LISTAS DE DISCUSIÓN
Título [tipo de soporte]. Responsable(s) secundario(s). Lugar de publicación: editor, fecha de publicación [Fecha
de consulta]**. Notas*. Disponibilidad y acceso**
PACS-L (Public Access Computer Systems Forum) [en línea]. Houston (Tex.): University of Houston Libraries,
Junio 1989- [ref. de 17 mayo 1995]. Disponible en Internet: <[email protected]>.
89
APÉNDICE D
Preparación de Reactivos
Nota: Elaborar las cantidades necesarias de reactantes con base al número de equipos de trabajo total por 1.5.
PRÁCTICA 1. SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
No se emplean soluciones o reactivos preparados
PRÁCTICA 2. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE BIOMOLÉCULAS.

2.1 Solución Stock del reactivo BCP 40 mM
0.54 g de Púrpura de bromocresol grado reactivo en 15 mL de etanol absoluto. Disolver y aforar a 25 mL en
etanol absoluto. Almacenar en frasco ámbar a 4°C. El reactivo es estable 3 meses en la obscuridad y en
refrigeración.
2.2 Sol. Estándar de ácido acético
150 mL de ácido acético glacial en 1 L de agua destilada.
2.3 Reactivo de trabajo de BCP 40 μM
10 g de acetato de sodio 3H2O en 800 mL de agua. Adicionar 10 mL de la solución estándar de ácido acético
y 1 mL del reactivo BCP 40 mM. Ajustar el pH a 5.2 (con acético o con NaOH; intervalo entre 4.9 – 5.2). Aforar
a 1 L con agua destilada. El reactivo debe ser de color amarillo verdoso. Esta solución de trabajo es estable
una semana en obscuridad a temperatura ambiente.
2.4 Soluciones de Albúmina Humana
Las soluciones se preparan con solución de albúmina humana para transfusión que tiene una concentración
de 25% (25 g en 100 mL).
NOTA: Guardar el sobrante de albúmina de esta práctica para emplearlo en la siguiente (Electroforesis)
2.5 1 mg/mL en solución salina fisiológica.
Solución salina fisiológica (SSF)
0.85 g de NaCl en 100 mL de agua destilada
2.6 Albúmina de huevo 60 mg/mL en SSF.
60 mg de albúmina de huevo disolverlos en 1 mL de SSF.
2.7 Histidina 60 mg/mL en SSF.
60 mg de histidina disolverlos en 1 mL de SSF.
2.8 Solución de albúmina humana 60 mg/mL emulsionada con aceite de oliva.
Mezclar 0.5 mL de la solución de albúmina de 120 mg/mL adicionarle 0.5 mL de aceite de oliva. Mezclar en
vórtex 15 segundos antes de usarse.
2.9 Solución de albúmina humana 60 mg/mL con detergente a 50 mg/mL.
Disolver 50 mg de detergente en 1 mL de solución de albúmina de 60 mg/mL.
2.10 Solución de albúmina humana 60 mg/mL con hemoglobina.
Tomar 0.25 mL de sangre entera y agregarles 0.25 ml de agua destilada para romper eritrocitos. Mezclar con
0.5 mL de la solución de albúmina de 120 mg/mL.
PRÁCTICA 3. ELECTROFORESIS DE SUERO

3.1 Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 8.8 (Tris HCl 1.5 M)
Pesar 18.16g de Tris-base, agregar 80 mL de agua bidestilada, adicionar 2.0ml de SDS al 20% y ajustar el
pH a 8.8 con HCl concentrado (aproximadamente 1 mL) aforar a 100 mL con agua bidestilada y filtrar por filtro
Millipore 0.45
3.2 Amortiguador 4X Tris HCl – SDS, pH 6.8 (Tris HCl 0.5 M)
Pesar 0.075g de Tris- base, 3.85 g de Tris-HCl y disolverlo en 50 mL de agua bidestilada, adicionar 2.0ml de
SDS al 20% y ajustar el pH a 6.8, aforar a 100 mL con agua bidestilada y filtrar por filtro Millipore 0.45
3.3 Acrilamida –Bisacrilamida 30:0.8 %
Pesar 30g de acrilamida y 0.8 g de bisacrilamida, disolver en 100 mL de agua destilada, filtrar con papel
Wathman No 1.
3.4 Persulfato de amonio 10 %
Pesar 100 mg de persulfato de amonio y disolverlo en 1 mL de agua bidestilada. Prepararlo siempre fresco a
la hora de preparar el gel.
3.5 Fibrinógeno sérico
Pesar 1 mg de fibrinógeno y disolverlo en 1 mL de regulador de fosfatos (PBS) 10 mM, pH 7.5
Nota: En el gel no cargar más de 100 µg totales de fibrinógeno
90
3.6 Albúmina humana 1 mg/ mL

Usar la albúmina de concentración 4 mg/mL de la práctica anterior. Diluir 1:4 ssf
3.7 Amortiguador de Laemmli 2x

Componentes Volumen (mL) Concentración final
Tris- HCl 1M pH 6.8 1.2 120 mM
Glicerol 2 20 %
Azul de bromofenol
0.2 0.02%
(1%)
EDTA 0.5 M 0.04 2mM
Agua bidestilada 2.56 -
3.8 Amortiguador de Laemmli Desnaturalizante 2x

Componentes Volumen (mL) Concentración final
Tris- HCl 1M pH 6.8 1.2 120 mM
Glicerol 2 20 %
SDS 10 % 2 2%
Azul de bromofenol
0.2 0.02%
(1%)
-mercaptoetanol 2 0.2 M
EDTA 0.5 M 0.04 2mM
Agua bidestilada 2.56 -
3.9 Solución de azul de Coomasie para teñir

Solución madre: Pesar 2.5 g de azul de Coomasie R-250 y disolverlo en 450 mL de metanol, 100 mL de ácido
acético glacial y 450 mL de agua bidestilada caliente. Filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco
ámbar a temperatura ambiente.
Solución de trabajo: Agregar 31.3 mL de la solución madre de azul de Coomasie, 125 mL de metanol, 25 mL
de ácido acético glacial y 68.7 mL de agua bidestilada. Mezclar bien, llevar a un volumen final de 250 mL,
filtrar con papel Wathman No.1 y conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.
3.10 Solución desteñidora
Mezclar 300 mL de metanol, 100 mL de ácido acético glacial y 600 mL de agua bidestilada.
3.11 Buffer de corrimiento 1x
Componentes Pesar (g) Concentración final
Tris- base 3 25 mM
Glicina 14.4 192mM
SDS 1 0.1%
Disolver en 900ml de agua bidestilada, ajustar el pH a 8.3 y aforar a 1 L con agua bidestilada, cuidando no
hacer espuma
3.12 Solución Buffer de fosfatos salina de pH 7.4 (PBS)
PBS puede prepararse como solución 1X o 10X, para preparar 1L disuelve en 800 mL de agua destilada los
reactivos como se muestran en la siguiente tabla:
Reactivo Cantidad Concentración Cantidad Concentración
(para 1X) Final (1X) (para 10X) Final (10X)
NaCl 8g 137 mM 80 g 1.37 M
KCl 0.2 g 2.7 mM 2g 27 mM
Na2HPO4 1.44 g 10 mM 14.4 g 100 mM
KH2PO4 0.24 g 1.8 mM 2.4 g 18 mM
Ajustar el pH a 7.4 (o 7.2 si es requerido) con HCl, y aforar a 1L con agua bidestilada. Se recomienda alicuotar
y esterilizar en autoclave por 20 minutos a 15lb o por filtración. Almacenar a temperatura ambiente.
PRÁCTICA 4. USO DE ENZIMAS EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO: PERFIL HEPÁTICO Y PERFIL CARDIACO.

Se emplean kits de diagnóstico. Seguir las instrucciones del kit de cada lote.
91
PRÁCTICA 5. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO HUMANO

5.1. Solución Patrón de glucosa de 100 mg/ dl. Ya está incluido en el kit por el fabricante.
5.2. Solución stock de glucosa de 200 mg/dl
Pesar 100 mg de glucosa (dextrosa) y disolver en 50 mL de agua destilada
5.3. Estándares de referencia de glucosa
140 mg/dl: Tomar 7 mL de la solución stock y aforar a 10 mL con agua destilada
5.4. Se requieren 9 mL de RT del kit de glucosa por equipo
PRÁCTICA 6. OBTENCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN
SUERO HUMANO.
PRÁCTICA 7. DETERMINACIÓN DE UREA, CREATININA Y ÁCIDO ÚRICO.

PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE HORMONA GONADOTROPINA CORIÓNICA

Solución salina fisiológica (0.85%): ver práctica 2
PRÁCTICA 9. EQUIPOS BIOMÉDICOS EN EL LABORATORIO

9.1. Solución calibradora de pH 4.0 y solución calibradora de pH 7.0: Se emplean las comerciales.
9.2. Tiras reactivas para determinación decolesterol, sistema Accutrend Roche
9.3. Tiras reactivas para determinación de glucosa, sistema Accu check Roche
92

Manual de Bioquímica Clínica 2024-2

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de Bioquímica Clínica 2024-2

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual de Bioquímica Clínica 2024-2

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Laboratorio de Bioquímica Clínica

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDICIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

El presente manual fue elaborado por:

Segunda Edición. Versión de febrero 2024

NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________________________

GRUPO ____________________ EQUIPO _______________

Práctica 1. Seguridad en el laboratorio clínico 7

Apéndice A. Uso de las pipetas automáticas 83

El curso de laboratorio de Bioquímica Clínica tiene como objetivo capacitar al estudiante en el

ORGANIZACIÓN Y SEGURIDAD DE LOS ALUMNOS EN EL LABORATORIO

INFORMACIÓN DE TOMA DE MUESTRA DE SANGRE

¿QUÉ ES Y PARA QUÉ SIRVE?

¿QUÉ RIESGOS EXISTEN?

UNIDAD I: Introducción a la bioquímica clínica y estructura celular.

Como ya se mencionó, es necesaria la capacitación del personal adscrito al laboratorio sobre la

Y el PROY-NOM-007-SSA3-2017 trata la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos,

Zonas de trabajo del laboratorio

2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente

3.1 MATERIAL Y EQUIPO

5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Señalamientos presentes Señalamientos ausentes

Rubros de la PROY-NOM-007-SSA3-2017 que competen al laboratorio de Bioquímica

Nombre del Número en Número en Número en Equipo de

UNIDAD I: Introducción a la Bioquímica clínica y estructura Celular.

La espectroscopia UV7VIS es una técnica de medición en la que se emplea la absorción o emisión

3.3 MATERIAL BIOLÓGICO

Tabla 4.1. Curva Tipo

Suero* 2.0 20l de suero -

C. MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO. SELECCIÓN DE LA  DE As MÁXIMA.

5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Absorbancia del blanco

B. Linealidad, Sensibilidad, Rango útil, Exactitud y Precisión del método de Bradford.

* Este tubo actúa como calibrador

Valor del coeficiente de correlación r

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙

Tabla 5.6. Precisión del método

Precisión. Desviación estándar de los

C. Especificidad de la reacción e Interferencias del método

UNIDAD VII: Equipos empleados en la clínica para el estudio del metabolismo.

Figura 1. Polimerización de acrilamida-metilenbisacrilamida

4.5 Vaciar la mezcla en el sistema de vidrios. Colocar el peine y dejar gelificar.

B. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.

D. CARGADO DEL GEL Y CORRIMIENTO

Fig. 2. Sistema de electroforesis vertical y aplicación de la muestra.

5. MANEJO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Fig. 3. Electroferograma de marcador de peso

Unidad II. Aminoácidos, proteínas y enzimas.

Fig. 1. Cinética de liberación de enzimas cardiacas después de un infarto

Fundamento de los métodos de determinación de enzimas y metabolitos empleados en clínica.

• Métodos químicos colorimétricos: En ellos el metabolito se hace reaccionar con un

Metabolito + Reactivo cromógeno Producto colorido

Estas reacciones pueden ser de:

• Métodos enzimáticos: en estos, la enzima reacciona con el sustrato (s) y se obtienen

La reacción que cataliza la ALT es la siguiente:

La reacción de la CK es como sigue:

3.3 MATERIAL BIOLÓGICO

A. OBTENCIÓN DEL SUERO HUMANO.

B. DATOS DEL PACIENTE

C. PERFIL CARDIACO: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS LACTATO

GRUPO ______ EQUIPO _