Medicina y Patología Oral / Oral Medicine and Pathology P53 y proliferación en leucoplasia oral / P53 and proliferation in oral

tion in oral leucoplakia

Expresión proteica de p53 y proliferación celular en leuco-

plasias orales
Antonio Santos García (1), M. Mar Abad Hernández (2), Emilio Fonseca Sánchez (3), Juan Jesús Cruz
Hernández (4), Agustín Bullón Sopelana (5)

(1) Doctor en Medicina. Médico Estomatólogo. Ejercicio Privado de la profesión

(2) Profesora Titular del Dpto. de Biología Celular y Patología. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(3) Profesor Asociado del Dpto. Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(4) Catedrático de Oncología. Dpto. de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca
(5) Catedrático de Anatomía Patológica. Dpto. de Biología Celular y Patología. Facultad de Medicina. Universidad de Salamanca

Dirección para la correspondencia:

Antonio Santos García
Avda. Tres Cruces, 13. Entrepl. 3. 49008 Zamora
Telf. 980510247; Fax: 923219011
Indexed in:
E-mail: [email protected] -Index Medicus / MEDLINE / PubMed
-EMBASE, Excerpta Medica
-Indice Médico Español
Recibido: 6-11-2003 Aceptado: 7-3-2004 -IBECS

Santos-García A, Abad-Hernández MM, Fonseca-Sánchez E, Cruz

Hernández JJ, Bullón-Sopelana A. Expresión proteica de P53 y
proliferación celular en leucoplasias orales. Med Oral Patol Oral Cir
Bucal 2005;10:1-8.
© Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447

RESUMEN Palabras clave: Lesiones precancerosas orales, Cancerización

Objetivos: Conocer la expresión proteica de las alteraciones del campo, p53, Ki-67, Inmunohistoquímica.
genéticas que se producen en las etapas precoces de la cance-
rización del campo de cavidad oral en nuestro medio. Estudiar INTRODUCCION
la proliferación celular mediante Ki-67 y la expresión de la La prevención del cáncer de cabeza y cuello requiere diversas
proteína p53 para valorar si las alteraciones en la expresión actuaciones entre las cuales puede ser clave el estudio de las
proteica de estos marcadores suceden de forma secuencial a lesiones premalignas orales en su localización oral. Dentro
través de las distintas etapas en la cancerización del campo de de las lesiones premalignas podemos incluir en orden de fre-
la cavidad oral. cuencia: leucoplasia oral, eritroplasia, liquen plano oral, lupus
Material y métodos: Se realizó un estudio mediante técnicas de eritematoso discoide, sífilis, disfagia sideropénica, y fibrosis
inmunohistoquímica sobre 53 pacientes que presentaron lesio- oral submucosa (1,2). El nivel de riesgo de transformación
nes de leucoplasia oral, atendidos por el Servicio de O.R.L del maligna de la leucoplasia se ha asociado con el tipo de lesión
Hospital Universitario de Salamanca, desde 1.990 hasta 2000. histológica (3). La tasa global de transformación maligna para
Se incluyen en el estudio 11 muestras de epitelio normal, 15 las lesiones con diagnóstico anatomopatológico de displasia
displasias leves y moderadas, 15 carcinomas in situ, y 12 carci- varía, en los distintos estudios, del 2 al 36% y es distinta en
nomas microinvasores. Resultados: Encontramos la proliferación función del tiempo de seguimiento de las lesiones (4,5). La
celular aumentada y sobreexpresión de p53 a medida que avan- elevada frecuencia de desarrollo de segundas lesiones prema-
zamos en el grado de severidad histopatológica de las lesiones. lignas y malignas en cavidad oral y en cabeza y cuello subraya
Las alteraciones más precoces son el aumento significativo de la naturaleza “condenada” de toda la mucosa de esta región. La
la proliferación celular en displasias leves y moderadas y el teoría de cancerización del campo se ha propuesto explicar este
aumento de expresión de p53. aumento del riesgo de transformación en el tracto aéreo - diges-
Conclusión: La leucoplasia oral es un estado precanceroso que tivo superior (6-8). El desarrollo del cáncer oral lleva consigo
constituye una lesión cancerizable debido a las alteraciones ge- unos pasos previos a la progresión maligna a través de grados
néticas que intervienen en la evolución de la lesión. El estudio crecientes de displasia que son el resultado de la acumulación
inmunohistoquímico y molecular de las lesiones es un medio ruti- de diversas alteraciones genéticas. Según esta teoría, los tumores
nario que permite conocer la expresión proteica de las alteraciones crecen mediante un proceso de evolución clonal dirigida por
genéticas, que puede ayudar en el diagnóstico precoz y tratamiento mutaciones, en donde múltiples “golpes” (mutaciones) en una
de esta patología, teniendo especial relevancia el estudio de Ki-67 célula son necesarios para desarrollar el carcinoma (9). Los
en etapas iniciales y p53 en lesiones más avanzadas. modelos más recientes de génesis tumoral muestran que es un

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proceso en el que median múltiples alteraciones moleculares, a de inmunodetección de Biogenex. Para Ki-67, se ha utilizado
través de las cuales, se activan protooncogenes que estimulan como anticuerpo primario MIB-1 (1/100. Master Diagnostics)
el crecimiento celular, y genes supresores de tumor que inhiben y para p53 la clona DO7 (1/200, Biogenex). La incubación fue
la proliferación celular en condiciones normales, volviéndose de 30 minutos en ambos casos. Contratinción del corte histoló-
inactivos y conduciendo a la célula hacia una transformación gico con hematoxilina de Carazzi y montaje en medio acuoso.
neoplásica (7,10,11). Los análisis de las alteraciones genéticas Control negativo: el anticuerpo primario específico se sustituye
de los loci de los cromosomas principales han demostrado in- por un tampón. Como control positivo se empleó un carcinoma
crementos en las pérdidas alélicas que progresan desde diversos de mama con alta expresión de Ki 67 y p53.
grados de displasia hacia carcinoma in situ y cáncer invasivo Valoración de la técnica inmunohistoquímica
que soportan las bases genéticas de la cancerización del campo Para Ki-67 y p53 se realiza un estudio semicuantitativo valorado
(10). Dentro de estas alteraciones, adquiere especial relevancia por dos observadores independientes. Se valoraron como posi-
el gen p53. Es un supresor de tumor que reduce la proliferación tivos los núcleos teñidos, expresando el porcentaje de tinción
celular y la replicación del DNA, ejerce un control sobre el (16) y considerando positividad si la expresión era > 20% para
ciclo celular bloqueando la progresión desde la fase G1 a la ambos marcadores.
fase S. En células normales el tipo normal de la proteína p53, Análisis estadístico:
debido a su corta vida, es normalmente indetectable por inmu- Hemos utilizado el programa estadístico NCSS para Windows.
nohistoquímica, de forma que las alteraciones en p53 debidas Realizando un estudio estadístico descriptivo: media, desvia-
a mutaciones tienen como resultado una pérdida de control del ción típica y error estándar para las variables cuantitativas y
ciclo celular (12,13). La detección de esta expresión proteica, frecuencias y porcentajes para las variables cualitativas. Los
mediante inmunohistoquímica, empleada de forma rutinaria en estudios inferenciales de comparación de tendencia central
el laboratorio, puede contribuir a la mejora del diagnóstico y el para las variables cuantitativas se han realizado utilizando un
tratamiento de las lesiones precancerosas orales. En el presente ANOVA. Cuando resultó significativo (p<0,05), se buscaron
estudio vamos a observar el comportamiento de la expresión las partes diferentes utilizando los test de Bonferroni, Tukey
proteica de la proliferación celular (Ki-67) y del gen supresor y LSD. En todos los casos se tomaron como significativos los
de tumor (p53), en lesiones precancerosas orales cuyo diagnós- contrastes con p-valores < 0,05. Hemos agrupado las muestras
tico anatomopatológico abarca desde epitelio normal, displasias, en un grupo epitelio normal, un grupo de displasias leves y
carcinomas in situ y microinvasores con el objeto de determinar moderadas, un grupo de carcinomas in situ, un grupo de carci-
la relación entre la expresión proteica de estos marcadores y de nomas microinvasores.
estas lesiones potencialmente malignas.
RESULTADOS
MATERIAL Y METODOS La edad de los pacientes varía desde 38-85 años de edad. La me-
Para la realización de este trabajo se han revisado los archivos de dia de edad es de 60 años. Un 33% de los pacientes son mujeres
los Servicios de Anatomía Patológica y ORL del Hospital Clí- y un 67% son varones. La lengua es la localización más frecuente
nico Universitario de Salamanca desde el año 1990 hasta el año en estas lesiones con un 36%, seguido de trígono retromolar
2000 ambos inclusive. Seleccionando 53 muestras de pacientes 28%, encía 15%, suelo de boca 13% y paladar duro 8%.
con diagnóstico macroscópico de leucoplasia oral cuyo diag- Resultados para Ki-67: En el estudio morfológico de todas las
nóstico anatomopatológico fue de 11 casos de epitelio normal, lesiones incluidas en el estudio observamos positividad para Ki-
2 displasias leves y 13 displasias moderadas, 15 carcinomas in 67. En el epitelio poliestratificado normal, encontramos núcleos
situ y 12 carcinomas microinvasores siguiendo los criterios de teñidos en la capa basal. En displasias leves y moderadas, no es
diagnóstico anatomopatológico de estas lesiones (14,15). raro encontrarlas en el estrato medio. En los carcinomas in situ,
Técnicas Inmunohistoquímicas: además encontramos núcleos teñidos en el estrato intermedio;
Se realizan varios cortes, de 4 µ de las 53 muestras de biopsias. y de forma ocasional, incluso en el estrato superior. Asimismo,
Posteriormente se efectúa el desparafinado y rehidratación me- las mitosis son frecuentes tanto en estrato basal, como en capas
diante 4 baños de Xilol 100% de 5 minutos de duración cada altas, siendo positivas para Ki-67. En el carcinoma microinvasor
uno seguido de 3 baños de alcohol absoluto de 5 minutos de se observa una tinción similar a la del carcinoma in situ, pero
duración cada uno. El desenmascaramiento antigénico se lleva además, observamos una tinción positiva en cordones epiteliales
a cabo mediante el lavado de los portaobjetos con agua co- atípicos localizados en la zona subepitelial. Los valores para
rriente previa introducción en olla a presión con tampón citrato Ki-67 se exponen en la tabla 1, donde queda reflejado que la
a pH 6, contando de 3 minutos desde que empiece a hervir. proliferación celular es negativa en epitelio normal, es positiva
Lavándose seguidamente los portaobjetos, con agua destilada en 6 de 15 displasias leves y moderadas, aumentando en 10 de
primero, y después con PBS. Los anticuerpos utilizados son 15 carcinomas in situ, y 10 de 12 carcinomas microinvasores.
monoclonales. Encontramos diferencias significativas p < 0.05 entre el grupo
La técnica de marcaje inmunohistoquímico se ha llevado a cabo de epitelio normal y displasias leves y moderadas; entre epi-
en un inmunoteñidor automático Optimax Plus de Biogenex de telio normal y carcinomas in situ y microinvasores (Tabla 2
Menarini Diagnostics. Se ha utilizado la técnica Biotina/Es- y Fig.1).
treptavidina Amplificada (BSA) según método supersensitivo Resultados para p53: en epitelio normal no observamos posi

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Diagnóstico Anatomopatológico: Carcino-

Displasias Epitelio D. Leves y Carcinoma ma
Epitelio Carcinoma Carcinoma Normal moderadas In situ Microin-
Leves y Mo-
Normal “In situ” Microinvasor vasor
N°. de casos deradas
(11) (15) (12)
(53) (15) KI-67
KI-67
Marcadores inmunohistoquímica: KI67 (p<0,02)
Epitelio Normal (p<0,02)
(p<0,05) P53
Ki-67 % 3,90±0,83% 23,86±11,09% 36,06±20,27% 37±16,22% P53 (p<0,03)
(p<0,03)
P53 % 3,36±1,56% 15,13±11,20% 25,66±19,96% 27,25±23,21%
D. Leves y KI-67
Ki-67 (+/-) 0/11 6/15 10/15 10/12 Moderadas (p<0,05)
P53 (+/-) 0/11 5/15 7/15 10/12 KI-67
Tabla 1: Tabla de distribución según diagnóstico anatomopatológico y Carcinoma (p<0,02)
niveles de expresión en los marcadores estudiados. In situ P53
(p<0,03)
KI-67
Carcinoma (p<0,02)
Microinvasor P53
(p<0,03)
Tabla 2. Tabla de doble entrada de significación estadística entre las lesiones
estudiadas y los marcadores.

Fig. 1. Alteraciones en la expresión proteica de Ki67 y p53 en las lesiones de leucoplasia estudiadas.
Ki-67 and p53 over-expression to increase dysplasia grade in oral leukoplakia lesions.
Epitelio normal: Normal epithelium; Displasias leves y moderadas: Mild and moderate dysplasias; Ca in situ: In situ carcinoma; Carcinoma microinvasor:
Microoinvasive carcinoma

Displasia moderada, p53 Zona de transición y carcinoma in situ

Moderate dysplasia, (IHC, 100x) Transition area and in situ carcinoma (IHC, 40x)

Fig. 2. Distribución parcheada de la tinción con p53 en displasias moderadas (izda.).

Zona de transición hacia carcinoma in situ (Dcha.), donde se observa gran número de núcleos teñidos con p53. Capacidad de selección de p53 de las zonas con
mayor proliferación celular al lado de áreas menos proliferativas. Efecto campo.
Parched Distribution p53 stained in moderate dysplasia (left).Transition area toward in situ carcinoma (Right), where great Nº. Is observed of p53 stained
nuclei. Capacity of selection of p53 of the areas with more cellular proliferation to the one side of less proliferative areas. Field effect.

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ividad. En displasias leves y moderadas encontramos núcleos mutaciones puntuales, deleciones y unión con células y proteínas
teñidos para p53. La distribución en la mayor parte de los casos víricas. Un alto porcentaje de carcinomas epidermoides de cavi-
es parcheada. En carcinomas in situ y microinvasores existe dad oral tienen niveles elevados de expresión de p53 (15-60%).
una brusca separación entre epitelio normal e hiperplásico, y el Pérdidas de heterocigosidad del alelo p53 se han publicado en el
carcinoma in situ (Fig. 2). En los casos en los que existen células 22% de las lesiones precancerosas y también restructuraciones
con núcleos irregulares y con pleomorfismo llamativo suelen en la región 5´ del gen p53 (23). En condiciones fisiológicas,
ser positivas para p53. La cuantificación de p53 se muestra en la hemivida de la proteína p53 es corta (20 minutos). Sin em-
la tabla 1. En epitelio normal p53 es negativo en la totalidad de bargo p53 es imprescindible cuando se requiere la aplicación
las muestras. Hay positividad para p53 en 5 de 15 displasias de frenos de emergencia, por ejemplo, frente a radiaciones, luz
leves y moderadas. En 7 de 15 carcinomas in situ y en 10 de UV o sustancias químicas que dañen el DNA. Estos casos de
12 carcinomas microinvasores, hay sobre expresión de p53. asalto al material genético causan cambios espectaculares en la
Encontramos diferencias significativas entre epitelio normal y proteína p53 que, de lo contrario, permanece dormida. A través
carcinomas in situ y microinvasores (Tabla 2). de mecanismos todavía mal conocidos, se produce un rápido
aumento de los niveles de p53 y su activación como factor de
DISCUSION transcripción. El tipo natural de p53 acumulado se une al DNA
En las últimas décadas se ha estudiado la base molecular del y estimula la transcripción de varios genes que intervienen en
proceso de desarrollo del cáncer, y se han propuesto modelos los dos efectos principales de p53: la detención del ciclo celular
de progresión genéticos para varios tipos de tumores. Se ha y la apoptosis (23,24). Aunque en otros tipos de tumores, la
observado que la acumulación, de varias formas de alteraciones sobreexpresión de p53 es un acontecimiento tardío, en cavidad
genéticas, es la base para la progresión desde una célula normal oral se puede observar en fases más iniciales (12,17).
a una célula cancerosa, denominándose al proceso, carcinogéne- La detección de p53 en el núcleo celular es debida a una acu-
sis de múltiples pasos. El proceso de cancerización del campo mulación de proteína mutante, pero ocasionalmente, lesiones
puede definirse en condiciones moleculares, y la secuencia en el p53 positivas pueden no portar mutaciones provocando falsos
proceso de carcinogénesis de múltiples pasos puede comenzarse positivos que pueden deberse a la estabilización de p53 al unir-
a vislumbrar (17). se a mdm2 o a detección de p53 normal sobre regulada como
Los últimos avances en la biología celular vienen aclarando respuesta a daños en el DNA por radiación u otros agentes. La
los mecanismos precisos de la regulación del ciclo celular y concordancia entre mutación en el gen p53 y la acumulación
han venido mostrando que las alteraciones en la proliferación no es totalmente perfecta, aunque la inmunorreactividad es un
celular es una manifestación muy común en algunos cánceres y indicador aproximado de las lesiones con función p53 alterada
en lesiones precancerosas (17). Pero también intervienen genes (13).
supresores de tumor como pRb y p53 y otras proteínas asociadas Existen diferentes clonas de P53 para estudios inmunohistoquí-
al ciclo celular (18, 19). micos. Nosotros hemos utilizado DO7, esta clona se ha utilizado
El marcador de proliferación, MIB-1 o Ki-67 se expresa en todas ampliamente en el estudio de alteraciones de P53 en diferen-
las fases del ciclo celular excepto en G0 (20). La expresión de tes órganos y sus resultados están ampliamente contrastados
Ki-67 ha sido informada como un buen marcador de prolifera- (25-27). Actualmente se han desarrollado nuevas clonas que
ción celular en lesiones premalignas y malignas (20). El análisis permitirán, probablemente, en el futuro una mejor selección de
de la expresión de Ki-67 se usa para determinar el índice de lesiones con P53 mutada.
proliferación de las células en tejido normal y en muestras de En nuestro estudio, los niveles más elevados de p53 se localizan
tumor (16,21). En el presente estudio, para Ki-67, observamos en carcinomas in situ y microinvasores. En displasias aumenta
un incremento de expresión, en función del grado de alteración el número de núcleos teñidos y la distribución es parcheada, de
histopatológica de las lesiones. Cuanto más diferenciado es el repente hay zonas de atipia totalmente teñida por p53 al lado
epitelio menor positividad encontramos, y por el contrario, de zonas que no expresan tanto p53, como si tuviese un com-
aquellos epitelios con una gran desdiferenciación la práctica portamiento selectivo con el clon celular que parece iniciar la
totalidad de los estratos son positivos para este marcador. Por lo alteración del campo, que iniciará la progresión de las lesiones
tanto, Ki-67 es un excelente marcador de proliferación celular o la aparición de recurrencias y de segundas lesiones; lo que
y además permite tipificar con mayor certeza el grado de dis- puede explicar algunas de las hipótesis de la cancerización del
plasia. La expresión aumenta de forma marcada, a medida que campo en cavidad oral, como las que propugnan que la exposi-
avanzamos en la progresión del grado de displasia de las lesiones ción a agentes carcinógenos producen alteraciones en distintas
orales, habiendo diferencias significativas en la proliferación partes del epitelio, que con el tiempo, pueden producir lesiones
celular entre epitelio normal y displasias leves y moderadas; múltiples (17) (Figura 2). Cuanto mayor pleomorfismo y atipia
aumentando en carcinomas in situ y microinvasores. mayor positividad hemos encontrado para p53.
p53 es el gen supresor de tumor más importante, se le ha de- La tasa de transformación maligna de las leucoplasias, en nues-
nominado “guardián del genoma”, juega un papel importante tro medio, es de alrededor del 3% por año. Algunas lesiones de
en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, progresión leucoplasia pueden contener alteraciones genéticas asociadas al
del ciclo celular, diferenciación celular, reparación del DNA y carcinoma y que pueden constituir lo que Braakhuis et al., 2003
apoptosis (22). Puede ser inactivado por muchos mecanismos, definen por “campo” (17), donde p53 es una de las alteraciónes

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constitutes a canzerisable lesion due to the genetic alterations

más precoces que inician el desarrollo celular en parches que al that mediate in the evolution of lesion. Routine Immunohis-
crecer se transformarán en “campos”. Una célula “stem” adquie- tochemical and molecular study of these lesions allow us to
re una (o más) alteraciones genéticas y forma un parche con know the protein expression of genetic alterations that can help
las células hijas genéticamente alteradas. Como resultado de in the early diagnosis and treatment of this pathology, having
alteraciones genéticas subsecuentes, las células “stem” escapan special relevance the study of Ki-67 in early stages and p53 in
al control del crecimiento normal, adquiriendo una ventaja de advanced lesions.
crecimiento y desarrollando un clon, que va creciendo trans-
formándose en un “campo” que desplaza de su localización al Key words: Oral precancerous lesions, field cancerization, p53,
epitelio normal (17). Solamente una parte de estos “campos” son Ki-67, immunohistochemistry.
clínicamente reconocibles, por ello es urgente el desarrollo de
técnicas, lo más rutinarias posible, que ayuden en el diagnóstico INTRODUCTION
de estos “campos” como la tinción con azul de toluidina (Ora- Study of oral premalignant lesions can be a clue among the
Test) y la fluorescencia (17,28), así como el estudio rutinario actions required for head and neck cancer prevention. Prema-
de las biopsias mediante inmunohistoquímica, pueden contri- lignant lesions include, from more to less frequent ones: oral
buir a disminuir las recurrencias de las lesiones primarias y la leukoplakia, erythroplakia, oral lichen plane, discoid lupus
aparición de segundas lesiones a distancia. Cuanto mayor es el erythematosus, syphilis, sideropenic dysphagia, and oral sub-
número de células preneoplásicas que proliferan en campos, es mucous fibrosis (1,2).
probable que aumente el riesgo de cáncer dramáticamente. El Risk scores for malignant transformation of leukoplakia has
estudio de modelos de progresión de las alteraciones genéticas been related to the kind of hystologic lesion (3). Global rate
o de su expresión proteica que permitan detectarlos, puede jugar of malignant transformation for lesions accompanied by an
un papel clave en la prevención del cáncer oral. pathologic diagnosis of dysplasia varies, depending on the stud-
ies, from 2% to 36% and, moreover it is different as a function
of follow up time (4,5). “Damned” nature of mucous tissue at
this level is enhanced by a high frequency in the development
of second premalignant lesions in oral cavity, head and neck.
Proteic expressión of p53 and Field cancerization theory has been proposed as a explanation
cellular proliferation in oral for the increased risk a transformation in upper airway- diges-
tive tract (6-8). Oral cancer development involve several steps
leukoplakias previously to malignant progression through increasing levels
SANTOS-GARCÍA A, ABAD-HERNÁNDEZ MM, FONSECA -SÁNCHEZ E, of dysplasia as a result of the accumulation of diverse genetic
CRUZ HERNÁNDEZ JJ, BULLÓN-SOPELANA A. PROTEIC EXPRESSIÓN alterations. Following this theory, tumors grow on the basis of
OF P53 AND CELLULAR PROLIFERATION IN ORAL LEUKOPLAKIAS.MED a clonal evolution process leaded by mutations, able to cause
ORAL PATOL ORAL CIR BUCAL 2005;10:1-8. carcinoma after multiple cell mutation episodes (9). More recent
models in tumoral genesis evidence the mediation of multiple
ABSTRACT molecular disturbs in the activation of cell-growth stimulating
OBJECTIVES: We intend to know the protein expression of proto-oncogenes as well as the inactivation of tumor suppressor
genetic alterations that take place in the early stages in the field genes leading cells to a neoplasic transformation (7,10,11).
cancerization of oral cavity in our means as well as to study the Analysis of genetic changes in loci of main chromosomes have
cellular proliferation by means of Ki-67 and the protein pro- showed increases in allelic losses varying from several grades
duct expression of p53 to value if the alterations in the protein of dysplasia to carcinoma in situ and invasive cancer supporting
products expression of these markers happen in a sequential field cancerization theory (10). Specially relevant is p53 gene,
pathway through the different stages in the field cancerization a tumor supressor gene that reduces cell proliferation and DNA
of oral cavity. replication by means of an impaired progresión from G1 to S
MATERIALS AND METHODS: A study was made by immu- phase of cell mitosis cycle. In normal cells, natural type of p53
nohistochemistry on 53 patients that presented lesions of oral protein is usually undetectable by means of immunohistochemi-
leukoplaquia, assisted by the ENT service at University Hospital cal technics due to its short life. Since p53 disturbs lead to a loss
of Salamanca, from 1.990 up to 2000. 11 samples of normal epi- in cell cycle control (12,13), routine immunohistochemical de-
thelium, 15 mild to moderate dysplasias, 15 in situ carcinomas tection of this proteic expression would contribute to a improved
and 12 microinvasive carcinomas are included in the study. diagnosis and treatment of oral premalignant lesions. In this
RESULTS: we find an increased cellular proliferation and p53 study we are going to observe the behavior of cell proliferation
over-expression as we advance in the grade of severity histo- proteic expression (Ki-67) and tumor supressing gene (p53)
pathologic of these lesions. The most early alterations are a in oral precancer lesions with anatomo-patologyc diagnosis
significant increase of cell proliferation in mild and moderate including normal epithelium, dysplasia, carcinoma in situ and
dysplasias and an increased p53 over-expression. microinvasive cancer, with the aim of determining wether they
CONCLUSIONS: Oral leukoplaquia is a precancerous stage that are related or not.

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Pathologic Diagnóstic:
MATERIAL AND METHODS
Mild and
In this study we make a revision of the archives from Patho- Normal
Moderate
“In situ” Microinvasive
logic anatomy and Ear Nose and Throat (ENT) services from N°. (53) Epithelium Carcinoma Carcinoma
Dysplasias
(11) (15) (12)
a Hospital (Hospital Universitario de Salamanca/ Salamanca (15)
University Hospital) within the 1990-2000 period. 53 patient Immunohistochemical markers:
specimens with macroscopic diagnosis of oral leukoplakia Ki-67 % 3,90±0,83% 23,86±11,09% 36,06±20,27% 37±16,22%
were detected. Their pathologic diagnosis included 11 normal P53 % 3,36±1,56% 15,13±11,20% 25,66±19,96% 27,25±23,21%
epithelium cases, 2 mild and 13 moderate dysplasias, 15 in situ Ki-67 (+/-) 0/11 6/15 10/15 10/12
cancers and 12 micro-invasive cancers, following diagnostic P53 (+/-) 0/11 5/15 7/15 10/12
criteria for this lesions (14,15). Table 1: Distribution Table as pathologic diagnostic and expresión levels in
Immunohistochemical technics studied markers.
Firstly, 4 µm slices are obtained from the 53 biopsy specimens.
Afterwards deparafination and rehidratation are performed us-
ing 5 minutes Xilol 100% baths up to four times followed by Mild and In situ
Epitelium Microinvasive
Moderate Carcinoma
other three baths in absolute alcohol of 5 minutes each. An- Normal Carcinoma
Dysplasias
tigenic unmasking is performed by washing slides with non
KI-67
treated water before putting them into a pressure pot together Epitelium KI- (p<0,02) KI-67 (p<0,02)
with citrate buffer (pH 6) up to 3 minutes after boiling starts. Normal 67(p<0,05) P53 P53 (p<0,03)
Afterwards slides are washed using distilled water and then PBS. (p<0,03)
Monoclonal antibodies are used. Mild and
Moderate KI-67(p<0,05)
Immunohistochemical marking technic has been performed
Dysplasias
using an authomatic device for inmunologic staining, Opti- In situ Carci- KI-67 (p<0,02)
max Plus ® from Biogenex, Menarini Diagnostics. Amplified noma P53 (p<0,03)
Biothine/Estreptavidine technic (BSA) following supersensitive Microinvasi-
KI-67 (p<0,02)
inmunodetection method from Biogenex has been used. The ve Carcino-
P53 (p<0,03)
Primary antibody used for Ki-67 was MIB-1 (1/100, Master ma
diagnostics) and clone DO7 (1/200, Biogenex) was chosen for Table 2: Double entry table of estadístic signification between studied lesions
p53. Incubation time was 30 minutes for both of them. and markers.
The tissue was stained with Carazzi´s Hematoxylin and then
assembled in a watery mean.
In Negative controls primary specific antobodies were substi- The tongue was the most frequent localization in these lesions
tuted by a buffer solution. A high ki67 and p53 expression breast with 36%, followed by retromolar trigon 28%, gingiva 15%,
cancer tissue was used as Positive control. floor of mouth 13% and hard palate 8%.
Inmunohistochemical scoring Results for Ki-67: In the morphological study of all the lesions
For Ki-67 and p53, a semiquantitative study was carried out included in the study we observed positives for Ki-67. In normal
by two independent pathologist. Nuclear staining was valued oral squamous epithelium, we could find stained nuclei in the
as positive, scoring staining percentage (16) and categorized basal layer. In mild and moderate dysplasias, it is not strange to
as positivity if expression rates were more than 20% for both find middle stratum cells stained. In carcinomas in situ, we also
markers. found nuclear staining in the intermediate stratum; and occasio-
Statistical analysis: nally, even in the upper stratum. The mitoses are also frequent in
We used statistical program NCSS for Windows. Carrying out basal stratum, as well as in high layers, being positive for Ki-67.
a descriptive statistical study: average, typical deviation and In microinvasive carcinoma a similar staining is observed in the
standard error for quantitative variables and frequencies and “in situ” carcinoma, but we also observe a positive staining in
percentages for the qualitative variables. Inferencial studies atypical epithelial cords located in subepithelial area. Quantifi-
of central tendency comparison for the quantitative variables cations for Ki-67 are exposed in Table 1. They show that cellular
were performed using an ANOVA. When it was significant (p < proliferation is negative in normal epithelium, positive in 6 out
0,05), the different parts were looked for using the Bonferroni, of 15 mild and moderate dysplasias, increasing up to 10 out of 15
Tukey and LSD test. In all cases we considered as significant the carcinomas in situ, and 10 out of 12 carcinomas microinvasive.
contrasts with p-value < 0,05. We have contained the samples We found significant differences between the group of normal
in a normal epithelium group, a group of mild and moderate epithelium and mild and moderate dysplasias; between normal
dysplasias, a group of “in situ” carcinomas and a group of mi- epithelium and in situ and microinvasive carcinomas (p < 0.05)
croinvasive carcinomas. (See Table 2 and Fig.1).
Results for p53: in normal epithelium no positives were found.
RESULTS In mild and moderate dysplasias we found nuclear staining for
The age of the patients ranged from 38-85 years. Mean age was p53. The distribution in most of the cases was patched. For in
60 years. 33% of the patients are women and 67% are male. situ and microinvasive carcinomas an abrupt separation exists

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Medicina y Patología Oral / Oral Medicine and Pathology P53 y proliferación en leucoplasia oral / P53 and proliferation in oral leucoplakia

between normal and hiperplasic epithelium, and the in situ car- However p53 is indispensable when the application of emer-
cinoma (Fig. 2). Positive results for p53 appeared frequently for gency controls is required, for example, in front of radiations,
those cases in which cells with irregular nuclei and notorious UV-radiation or chemical substances which damage the DNA.
pleomorfism were present. P53 quantification is shown in Ta- These cases of assault to the genetic material cause spectacular
ble 1. In normal epithelium p53 was negative in all samples. changes in protein p53 that, otherwise, remains asleep. Through
There was positivity for p53 in 5 out of 15 mild and moderate mechanisms not well-known yet, a quick increase of the p53
dysplasias. In 7 out of 15 carcinomas in situ and in 10 out of 12 levels and their activation as transcription factor takes place.
carcinomas microinvasive, there was p53 overexpression. We The wild type of cumulative p53 unites to the DNA and stimu-
found significant differences between normal epithelium and lates the transcription of several genes that mediate in the two
“in situ” and microinvasive carcinomas (Table 2). main effects of p53: the arrest of the cell cycle and apoptosis
(23,24). Although in other kind of tumors p53 overexpression
DISCUSSION is a late event, in oral cavity it can be observed in more initial
In the last decades the molecular basis in the development of phases (12,17).
cancer have been studied, and genetic progression models have p53 detection in cell nucleus is due to an accumulation of
intended for several types of tumors. It has been observed that the mutant protein, but occasionally, p53-positive lesions may not
accumulation, in several pathways, of genetic alterations is the present mutations and be false positives that can be caused by
basis in the progression from a normal cell to a cancerous cell, the p53 stabilization when united to mdm2 or detection of wild
being the process, denominated multi-step carcinogenesis. The type overregulated p53 as an answer to damages in the DNA by
process of “field cancerization” can be defined at a molecular radiation or other agents. The concordance between mutation
level, and we can now be glimpsing the sequence in the process in the gene p53 and the accumulation is not completely perfect,
of multi-step carcinogenesis (17). although immunorreactivity is an approximate indicator of the
The last advances in cellular biology help us clarifying the pre- lesions with altered function p53 (13).
cise mechanisms regulating the cell cycle and show that abnor- There exist different clones of p53 for immunohistochemical
malities in cell proliferation are a very common manifestation in studies. We have used DO7. This clone has been used thoroughly
some cancers and precancerous lesions (17). Nevertheless tumor in the study of alterations of p53 in different organs and their
suppressor genes, like pRb and p53, and other proteins associated results are broadly contrasted (25-27). At the moment new clones
to the cell cycle also mediate in this sequence (18, 19). have been developed that will probably, allow a better selection
Proliferation marker, MIB-1 or Ki-67 is expressed in all the of lesions with p53 mutated, in the future.
phases of the cellular cycle excepting G0 (20). The expres- In our study, the highest levels of p53 belonged to “in situ” and
sion of Ki-67 has been informed as a good marker of cellular microinvasive carcinomas. In dysplasias the number of stained
proliferation in premalignant and malignant lesions (20). The nuclei increased and the distribution was patched. Suddenly we
analysis of Ki-67 expression is used to determine proliferation found areas of completely stained atypia of p53 beside areas
index of cells in normal and tumor samples (16,21). In our study, that didnʼt express so much p53, as if it had a selective behavior
we observe an increased Ki-67 expression, as a function of the with the cellular clone that seems to begin field alteration that
grade of histopathologic abnormalities in lesions. The more will initiate the progression of the lesions or the appearance of
differentiated the epithelium is the smaller positivity we find, recurrencies or second lesions; this could explain some of the
and on the other hand, in those poorly differentiated epithelia hypotheses of “field cancerization” in oral cavity, as those that
nearly all strata are positive for this marker. Therefore, Ki-67 is propose that the exhibition to carcinogenic agents produces
an excellent marker of cell proliferation and also allows to typify abnormalities in different parts of the epithelium which as time
dysplasia grades more accurately. The expression increases in goes through, can produce multiple lesions (17) (it Figures 2).
a marked way, as we advance in the progression of dysplasia The biggest pleomorfism and atypia, the biggest positivity
grade from oral lesions, with significant differences in the ce- we´ve found for p53.
llular proliferation between normal epithelium and mild and The rate of malignant transformation in leukoplakias, in our
moderate dysplasias; larger differences are present for in situ environment, is of around 3% per year. Some leukoplakia lesions
and microinvasive carcinomas. can contain genetic alterations associated to carcinoma that can
p53 is the most important tumor suppressive gene, and has been constitute what Braakhuis et al., 2003 defined as “field” (17),
denominated “genomic guardian”. It plays an important role in where p53 is one of the most early alterations that begin cellular
the maintenance of genomic stability, progression of cell cycle, “patched” development constituting areas that once grown up
cell differentiation, DNA repair and apoptosis (22). It can be will become “fields.” One “stem” cell acquires one (or more)
inactivated by many mechanisms, point mutations, deletions and genetic alterations and forms a “patch” with the genetically
union with cells and viral proteins. A high percentage of oral altered stem cells. As a result of subsequent genetic alterations,
squamous cell carcinomas show high levels of p53 expression “stem” cells escape from the control of normal growth, acquiring
(15-60%). Heterocigosity allelic losses of p53 have been pu- an advantage of growth and developing a clone which grows be-
blished in 22% of precancerous lesions as well as restructured coming a “field” displacing normal epithelia from their location
5´ regions of p53 gene (23). Under physiologic conditions, (17). Only a part of these “fields” are clinically recognizable.
the mean life of p53 wild type protein is short (20 minutes). Therefore it is urgent the development of routine technics that

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Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005;10:1-8. P53 y proliferación en leucoplasia oral/ P53 and proliferation in oral leucoplakia

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