TEMA 2: GENERALIDADES DE GENÉTICA VIRAL:

INTRODUCCIÓN:

La característica primordial de los virus es comportarse como

parásitos intracelulares obligados. El material genético viral
debe ingresar a la célula hospedera para que tenga lugar el
conjunto de eventos necesarios para generar nuevas partículas
virales, estos sucesos se denominan ciclo de replicación viral.

Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo que para

multiplicarlos en el laboratorio es necesario tener un cultivo
celular, de células procariotas si hablamos de bacteriófagos, o
de
células eucariotas si se trata de virus animales. Por eso, siempre ha sido difícil estudiar los ciclos de
multiplicación. Los únicos virus que se estudiaban eran los bacteriófagos porque se sabían cultivar bacterias.
Antes del desarrollo de los medios de cultivo celular, se empleaban animales de experimentación y huevos
embrionarios, pero no todos los virus se pueden mantener en estos huevos.

Curva de crecimiento vital: Podemos realizar curvas de crecimiento en un solo paso usadas para estudiar un
único ciclo de replicación de los virus y que fue
desarrollado por Delbruck para estudiar el
bacteriofago T4 de E. coli. El proceso consta de:

Se necesitan incubadores de CO2 para mantener

las células en un cultivo celular. En el caso de
cultivar una monocapa de células eucariotas en
una placa, es posible infectarlas con una alta
multiplicidad de infección (10 virus/célula (MOI)
para asegurar que todas las células sean
infectadas por al menos un agente viral). Al
agregar el virus, todos los virus introducidos
infectan simultáneamente a todas las células del
cultivo, desarrollándose de manera sincronizada.
Sin embargo, no es lo que curre en un proceso
real de infección en un organismo.

La monitorización de los cultivos infectados se realiza a lo largo del tiempo mediante técnicas de microscopía
para observar el aspecto del cultivo o tomando muestras para detectar la presencia de virus en el medio
extracelular o dentro de las células. Luego, se cuantifican los agentes virales presentes en las diferentes
muestras mediante ensayos en placa. Para estos ensayos, se realizan diluciones de la muestra que se
siembran en nuevas placas con cultivos en monocapa. Donde una partícula viral cae, se forma una zona de
lisis, infectando y destruyendo las células cercanas. Esto resulta en áreas no teñidas adecuadamente en la
placa, conocidas como calvas de lisis. Contando estas calvas, se determina el número de partículas virales en
la muestra.

De esta manera, es posible monitorear las fluctuaciones en la

presencia de partículas virales tanto extracelulares como
intracelulares, desarrollando curvas de crecimiento en un
solo paso. Este método requiere cultivos en monocapa,
infección sincronizada con una alta multiplicidad de infección
y seguimiento mediante ensayos en placa. Además, se
pueden emplear técnicas complementarias como la
cuantificación mediante PCR o la detección de proteínas
mediante Western Blot. Cuantificamos el número de partículas infectivas a lo largo del tiempo,
comprobando si son partículas infectivas, si se arman o desarman, etc, y para esto usamos los ensayos en
placa. Las calvas de lisis representan las células de la zona que se han lisado tras ser infectadas con un virus,
de manera que si realizamos un recuento de las calvas de lisis sabremos cuántas células fueron infectadas y
cuántas partículas virales infectivas había en las diluciones, siendo partículas tanto intra como extracelulares.

Si observamos la curva de crecimiento bacteriana y la curva de crecimiento viral, vemos que los virus
desaparece durante cierto lapso de tiempo. Esto se debe a que todos penetran en la célula y en el medio
extracelular no se encuentran partículas,
por lo que no las detectamos. A este
período se le denomina período de
eclipse. Este período no se da en la curva
de crecimiento bacteriana: siempre se
encuentran bacterias replicándose al no
ser un organismo que penetre en ninguna
célula.

1.-PASOS CLAVE DEL CICLO DE MULTIPLICACIÓN VIRAL:

Los pasos principales en la replicación viral son los mismos para todos los virus. La célula actúa como una
fábrica, proporcionando los sustratos, energía y maquinaria necesarios para la síntesis de proteínas virales y
la replicación del genoma. Los procesos que la célula no proporciona deben codificarse en el genoma del
virus. La manera en que cada virus realiza estos pasos y supera las limitaciones bioquímicas de la célula es
diferente para las diferentes estructuras del genoma y de la partícula viral (ya sea que esté envuelto o tenga
una cápside desnuda).

El ciclo replicativo en el cual hay producción de progenie viral y liberación de partículas normalmente por
lisis de la célula hospedera, se denomina ciclo lítico. Este ciclo replicativo es muy útil conocerlo para poder
diseñar distintas estrategias contra los virus.

Para comprender el ciclo de multiplicación viral, se identifican varias etapas que, en un cultivo sincrónico,
ocurren de manera independiente. Durante la fase temprana de la infección, el virus debe reconocer una
célula objetivo apropiada, adherirse a la célula, penetrar la membrana plasmática y ser internalizado por la
célula, liberar (desenvolver) su genoma en el citoplasma y, si es necesario, llevar el genoma al núcleo. La
desenvoltura del genoma de la cápside o envoltura durante la fase temprana anula su infectividad y
estructura identificable, iniciando así el período de eclipse. La fase tardía comienza con el inicio de la
replicación del genoma y la síntesis de macromoléculas virales y continúa con el ensamblaje y la liberación
viral. El período latente (que no debe confundirse con la infección latente), durante el cual no se detecta
virus infeccioso extracelular, incluye el período de eclipse y termina con la liberación de nuevos virus. Todas
estas etapas suceden simultáneamente, ya que la infección no ocurre al mismo tiempo. La curva de
crecimiento viral se segmenta en los siguientes fenómenos: adsorción, penetración, desnudamiento,
replicación y expresión del material genético, ensamblaje, maduración y liberación.
A) ADHESIÓN:

La unión de las VAPs o estructuras en la superficie de la cápside del virión a receptores en la célula
determina inicialmente qué células pueden ser infectadas por un virus. Los receptores para el virus en la
célula pueden ser proteínas o carbohidratos en glicoproteínas o glicolípidos. Los virus que se unen a
receptores expresados en tipos de células específicos pueden estar restringidos a ciertas especies (rango de
huéspedes) (por ejemplo, humano, ratón) o tipos de células específicos. Evolutivamente, los receptores
celulares son moléculas que realizan una función en la célula y que se van a encontrar siempre en la
membrana plasmática. Normalmente, son proteínas, pero también pueden ser glucoproteínas, lípidos de
superficie, etc. Una vez que el virus reconoce al receptor, se une y penetra en la célula. Recordemos el
concepto de metaestabilidad: las subunidades de la cápside deben estar lo suficientemente cohesionadas
como para proteger el material genético fuera de las células, pero una vez que penetra en ellas, tiene que
desamblarse para liberar el material genético e infectar la célula.

Otros virus detectan más de 1 receptor, dando lugar al

concepto de correceptores: para que el virus detecte a la
célula, debe unirse tanto a un receptor como a un
correceptor, ambos situados muy cercanos. Esta idea se
refiere al orden en el que se une el virus a cada uno de los
receptores, pues primero se une al receptor y después al
correceptor. Es por esto que se los denomina de esta manera.
Ejemplo: el virus de la hepatitis

La célula diana susceptible define el tropismo tisular (por

ejemplo, neurotrópico, linfotrópico). El virus de Epstein-Barr
(EBV), un herpesvirus, tiene un rango de huéspedes y tropismo
muy limitados porque se une al receptor C3d (CR2) expresado
en las células B humanas. Las glicoproteínas específicas son las
VAPs de los virus envueltos.

Existe una serie de factores que influyen sobre la adherencia

viral, ya que las condiciones ambientales influyen en esta
interacción proteína-proteína:
• Densidad de receptores
• Densidad de ligandos
• Relación virus/célula huésped
• Tª, pH, concentración iónica

Los rinovirus, por ejemplo, son capaces de infectar el tracto respiratorio superior y no el inferior por la
temperatura, porque la zona más superior tiene una temperatura ambiental que es la óptima para esta
partícula. En una zona más interna, la temperatura es mayor a la temperatura del organismo y el virus no es
capaz de infectar.

¿Cómo se descubrieron los receptores celulares para la adhesión viral? Se siguieron 3 estrategias para
demostrar lo esencial de las moleculas de superficie.

• Retirando los receptores de la superficie celular. En

algunos casos, como en el virus de la gripe, hay una
enzima (neuraminidasa) capaz de cortar el ácido siálico.
Al tratar cultivos celulares con neuraminidasa, el ácido
siálico de la superficie desaparece. De esta manera, el
cultivo celular se vuelve resistente a la infección por el

Removal of cell surface receptors

 virus de la gripe. Este experimento demuestra que el ácido
siálico es necesario para la entrada del virus.
• Obtención de anticuerpos monoclonales que se unan al
receptor de entrada del virus y lo bloqueen. De esta
manera, no se permite la entrada del virus. También se
pueden identificar receptores de entrada mediante este
método, y el uso de anticuerpos monoclonales puede ser
beneficioso como terapia. Monoclonal antibodies block cell surface

• Células deficientes o knock-outs (células transgénicas) para

ciertas proteínas de superficie. Las células inicialmente
resistentes a la infección se modifican para volverse sensibles
a un virus específico. A través de un ensayo de transferencia
genética, se logra este cambio de resistencia, lo que permite
estudiar la función de genes específicos en la susceptibilidad a
la infección viral.

B) PENETRACIÓN:
Gene-transfer experiments
Las interacciones entre múltiples VAPs y receptores celulares inician la
internalización del virus en la célula. El mecanismo de internalización depende
de la estructura del virión, principalmente de si está recubierto o desnudo, y del
tipo de célula. Una vez que se adhieren, deben de penetrar, buscando siempre
las localizaciones donde la entrada sea potencial, es decir, en zonas donde la
célula realiza procesos celulares normales, como por ejemplo en zonas donde se
producen endocitosis. Los virus se movilizan por la superficie a la célula a la que
van a infectar hasta encontrar una zona potencial, fenómeno que se conoce como ``surfing´´, movimiento
que es posible porque se unen a receptores anclados a filamentos de actina en el córtex de la cara interna
de la membrana plasmática. Esta movilización es un fenómeno frecuente, mediante el cual se hace posible al
entrada del virus en la célula, aprovechando los mecanismos endocíticos de la propia célula huésped.

Otros virus utilizan fositas recubiertas de clatrina, que son vías

de endocitosis dependiente de clatrina. Este es uno de los
mecanismos más comunes. La clatrina es una proteína
implicada en la endocitosis que se asocia con la cara interna
de la membrana plasmática, induciendo la invaginación de la
membrana y, de esta manera, facilita la entrada del virus. Los
mecanismos de penetración difieren entre los virus envueltos
y los desnudos, y algunos son sensibles al pH, mientras que
otros no lo son. Surfing

Virus envueltos:

Los virus envueltos fusionan sus membranas con las membranas celulares para liberar el nucleocápside o el
genoma directamente en el citoplasma. Los virus envueltos fusionan su membrana con la de la célula
huésped, que conlleva la penetración de la cápside en el citoplasma de la célula. Este proceso es
independiente de pH, ya que no es necesario que se genere un cambio de pH para que ocurra dicha fusión.
La incorporación de la partícula viral deja un parche en la membrana plasmática de partículas exógenas
procedentes del virus, el cual luego desaparece..
También pueden
seguir la
estrategia de la
endocitosis
mediada por
parásito, que no deja de ser mediada por receptor. Estos procesos de endocitosis inducida por el parásito,
concretamente, por el virus, se denominan viropexis y es dependiente de pH. Se produce una interacción
ligando-receptor que induce un proceso de endocitosis, y que puede ser mediado por clatrina. La
reorganización de moléculas de la superficie interna de la membrana plasmática, como la clatrina, provoca la
formación de un endosoma, el cual contiene varias partículas virales. Estos se fusionan con lisosomas, que
tienen un pH ligeramente más ácido, acidificándose el pH del recién formado fagosoma. Posteriormente el
virus va a salir del fagosoma para infectar a la célula. En esta salida, y durante la transcripción de su material
genético, influyen proteínas virales que sufren un cambio conformacional con este cambio de pH. Es, por
tanto, esencial para que se produzca la liberación de la cápside. En la realidad, múltiples partículas virales
están asociadas a la superficie del virus, se induce la endocitosis a la vez que dará a vesículas endocíticas con
varias partículas virales.

Virus desnudos:

Siguen un mecanismo similar al de endocitosis mediada por parásito. Después de

unirse a su receptor de superficie, los virus pueden desplazarse a lo largo de
filamentos de actina, lo que desencadena el proceso de endocitosis. Se forman
vesículas recubiertas por clatrina y se engloban en un endosoma. Sin embargo,
las vesículas recubiertas de clatrina son altamente frágiles; una vez que se forma
la vesícula, la clatrina se degrada y el endosoma queda expuesto a la fusión con
lisosomas para su acidificación. A veces, la desorganización de la cápside es
dependiente de pH, pero hay otros mecanismos, como la concentración de calcio.

Una vez que penetran, se pueden movilizar de distintas maneras hacia las
superficie donde se produce la transcripcion y traduccion o bien hacia el núcleo
de la célula. De nuevo, tienen que usar la maquinaria celular para moverse por su
interior.

C) DESNUDAMIENTO O DESCAPSIDACIÓN:
Una vez internalizado, el nucleocápside con el genoma viral debe ser transportado al sitio de replicación
dentro de la célula, en las que se producirá la expresión del material genético (esto ocurre al mismo tiempo
que se va eliminando la cápside), así como la cápside se debe ser eliminar (mediante una serie de procesos:
acidificación, bajas concentración de calcio en el citosol, por acción del proteosoma, etc). Algunas proteínas
de la cápside no se destruyen, sino que, mediante cambios en el pH,
experimentan un cambio conformacional que les confiere una función
diferente, como el paso de ser proteínas estructurales a actuar como
factores de transcripción. El genoma de los virus de ADN, excepto los
poxvirus, debe ser entregado al núcleo, mientras que la mayoría de los
virus de ARN permanecen en el citoplasma.

Debido a que el medio intracelular es un medio muy denso por la

presencia de los componentes que lo conforman, un virus necesita
moverse por la célula utilizando estrategias. Así, los endosomas se
movilizan por proteínas de transporte por los microtúbulos, penetrando
en núcleo a través de los poros nucleares. Los virus denudos también se
pueden unir directamente a estas proteínas sin formar parte de un
endosoma. Esto es lo que tenemos representado en la imagen (el color verde representa los microtúbulos y
el rojo las vesículas con la partícula viral).

Al finalizar este proceso, la cápside desaparece y solo queda el material

genético del virus dentro de las células. En este momento, no se
encuentran partículas virales, marcando el inicio de la fase de eclipse,
donde los viriones desaparecen del cultivo durante el tiempo de
expresión del material genético.

Es importante destacar que pueden no darse las condiciones

intracelulares para que se produzca la descapsidación, por lo que la célula
puede ser permisiva a la entrada del virus pero no a su desnudamiento y
no ser infectada por el agente infeccioso.

D) REPLICACIÓN: En este punto, el genoma viral está a disposición de las polimerasas, lo que permitirá su
expresión. La expresión del material genético del virus siempre confluye en la aparición de un ARN
mensajero que será traducido por la maquinaria traduccional de la célula.Depende de cada grupo de la
clasificación de Baltimore y lo veremos más adelante en otros temas. Lo más importante que hay que saber
es que ocurren dos eventos críticos para la infección viral:
1. Producción de proteínas estructurales y enzimas virales
2. Replicación del genoma viral

E) ENSAMBLAJE:
Es el paso en el que todos los componentes virales se ensamblan en una partícula inmadura. Ocurre de
forma localizada en lugares específicos de la célula como el citoplasma, el núcleo o la superficie interna de la
membrana plasmática, sitios denominados factorías virales, y que son visibles al microscopio óptico. Son
macrosestructuras necesarias para el ensamblaje y a partir de la cual surgen múltiples particulas virales
completas y ya ensambladas. Se da la biogénesis de membranas entre otros procesos y normalmente son
estructuras asociadas a mitocondrias, pues requiere un gasto energético para favorecer todo este proceso
de ensamblaje. Se visualizan como puntos más densos o focos dentro de células infectadas. Recordemos que
todos los componentes virales se ensamblan de manera automática (Autoensamblaje) en una partícula
inmadura cuando existe concentración idónea de proteína virales y ácidos nucléicos virales. Los cambios
conformaciones de estos componentes vuelven a la partícula viral madura.

Existen distintas estrategias de ensamblaje:

• El virus expresa de forma independiente cada uno de los capsómeros

que conforman la cápside, es decir, son proteínas individualizadas
que se traducen independientemente. Conforman los protómeros al
unirse unas a otras cuando se alcanza la concentración idónea de
dichas proteínas.
• A partir de un precursor poliproteico: Se traduce un único ARNm que
codifica para una única proteína de gran tamaño que contiene la
información para múltiples proteínas individuales. Estas proteínas
individuales se unen unas a otras y forman los capsómeros. Esta
poliproteína se puede plegar para generar un plegamiento inmaduro y, en muchos casos, las
poliproteínas deben ser escindidas por proteasas celulares o virales para dar lugar a la conformación
definitiva y, por tanto, a la partícula madura. Ejemplo: poliovirus.

• Pueden emplear la maquinaria de maduración de proteínas de la célula, como las chaperonas

celulares, para formar las subunidades de la cápside

De igual manera, el ensamblaje se puede denominar secuencial o concertado:

• Secuencial: primero se ensambla una subunidad y después otra, hasta formar la cápside.
Posteriormete, se inserta el material genético
• Concertado: al mismo tiempo que se produce la cápside se mete el material genético y el proceso se
realiza en un único paso

Ejemplos: la cápside del herpesvirus se genera dentro del núcleo, siendo una característica diferencial. El
ADN es complejo y las proteínas individuales se traducen en el citoplasma. Una vez traducidas, vuelven al
núcleo y el ambiente favorece la formación de una cápside inmadura. ¿Cómo se forma la partícula madura?
La partícula madura se forma cuando se inserta el material genético del virus una vez formada la cápside.
Por tanto, se da un ensamblaje de tipo concertado.

Otros virus acumulan todos los componentes, tales como proteínas y su material genético, en una zona de la
célula. Esta es la estrategia que sigue el virus de la gripe. Es necesaria la presencia del material genético para
que ocurra la unión de las proteínas, y durante la exocitosis se ensambla el virus.

F) MADURACIÓN:

Las partículas requieren la maduración para volverse infectivas, proceso el cual implica la participación de
diversas proteasas celulares y virales para generar la partícula infecciosa. Por ejemplo, el VIH cuenta con una
proteasa esencial entre sus proteínas. Esta proteasa desempeña un papel crucial al escindir las poliproteínas
que se desplazan hacia la cara interna de la membrana citoplásmica, donde se encuentran las proteínas de
superficie del VIH. Esta acción genera la cápside del virus, dando como resultado una partícula viral con
capacidad infectiva.

Algunos virus transportan sus propias proteasas, mientras que otros aprovechan las proteasas celulares. Por
lo general, el proceso de maduración ocurre dentro de la célula, aunque existen excepciones. En casos
donde los virus infectan células que carecen de las proteasas necesarias, la maduración puede tener lugar
fuera de la célula mediante la acción de proteasas extracelulares. Sin embargo, este proceso suele ser menos
eficiente que el intracelular.

G) LIBERACIÓN:

Para salir de la célula pueden romper o lisar la membrana (son los virus líticos),
matando a la célula (bien porque la propia infección desencadena la apoptosis
o bien por la rotura de la membrana), o por una evaginación de membrana
(burbujas o vesículas). Sin embargo, existen virus sin salida que producen la
muerte del huésped antes de poder transmitir la enfermedad. Los virus que no
salen igualmente pueden generar apoptosis en la célula a la que han infectado.

También existen virus que no producen una infección productiva, dando lugar
una infección latente. No se producen nuevos virus, sino que la célula alberga
el genoma viral en diferentes formas. Así, quedan integrados en el genoma de
la célula o circulando por el sistema, con la posibilidad de reactivarse en un
futuro.

¿Por qué los virus no quedan adheridos a los receptores de la superficie celular? Los virus han desarrollado
distintas estrategias:

a) Los virus pueden portar en su genoma información que codifique para una enzima que degrade el
receptor de entrada cuando el virus infecta a la célula, de manera que al salir este no se encuentre
 en la superficie. De esta forma, el propio virus cuando infecta a una célula del tracto respiratorio
elimina el ácido siálico para que las nuevas partículas virales que emerjan no queden adheridas a la
superficie celular.
b) Otra opción parecida es hacer que no se expresen los receptores una vez la célula ya ha sido
infectada
c) Pueden alejar los receptores de entrada justo a su salida
d) Haciendo uso del citoesqueleto de actina de la celula, forman colas o cometas de actina (filopodios,
lamelipodios…) y reorganizan el córtex de actina para facilitar su liberación a la vez que evitan la
interacción con los receptores de entrada.